專利名稱：檢測(cè)真菌毒素的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可同時(shí)檢測(cè)多種常見重要真菌毒素的膜
基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片，可用于谷物、飼料及食品中真菌毒素的快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前已知有200多種不同的真菌毒素。由 于真菌的寄生和真菌毒素的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，降低農(nóng)產(chǎn)品和飼料品質(zhì)，造成巨 大經(jīng)濟(jì)損失。全世界每年由于真菌毒素引起的農(nóng)產(chǎn)品和工業(yè)原料的損失達(dá)數(shù)百億美元。據(jù) 調(diào)查，除糧食、飼料以外，在油料作物種子、水果、干果、蔬菜、調(diào)味品、煙草、麻類、乳和乳制 品、魚蝦、肉類、發(fā)酵產(chǎn)品等都發(fā)現(xiàn)了不同程度的真菌毒素污染。研究發(fā)現(xiàn)，人或動(dòng)物攝入 被真菌毒素污染的農(nóng)、畜產(chǎn)品，或通過吸入及皮膚接觸真菌毒素可引發(fā)多種中毒癥狀，如致 幻、催吐、出血癥、皮炎、中樞神經(jīng)受損等。 目前，常見的真菌毒素檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用分析法、 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法及膠體金免疫層析法等。高效液相色譜法和氣相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用分析 法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)，但同時(shí)也有儀器價(jià)格昂貴、操作繁瑣、樣本檢測(cè)耗時(shí)長、 不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品等缺點(diǎn)，因而其使用受到極大的限制，不適于基層廣泛使用。酶聯(lián) 免疫吸附檢測(cè)法是目前常用的大規(guī)模篩查方法，但是酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法也需要儀器的配 合，檢測(cè)時(shí)間偏長，難以滿足基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，膠體金免疫層析法作為常見的免疫 學(xué)診斷方法在農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用，它具有操作簡(jiǎn)便、快 速，不需要借助儀器檢測(cè)來判讀結(jié)果等特點(diǎn)，適宜于基層的檢測(cè)。 以上方法均不能同時(shí)檢測(cè)樣品中的多種真菌毒素，然而真菌毒素常常是混合污
染，樣品中同時(shí)污染多種真菌毒素的情況較為普遍。開發(fā)出操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)準(zhǔn)確、便捷快速
且可肉眼直接判斷的可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的檢測(cè)方法就顯得頗為重要。 近年來新興的生物芯片技術(shù)為解決這個(gè)問題提供了一個(gè)新的思路。蛋白質(zhì)芯片
技術(shù)采用基因芯片的微點(diǎn)陣技術(shù)將系列抗原或抗體密集點(diǎn)陣于介質(zhì)載體形成免疫微陣列，
沿用傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)原理通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定性或定量分
析。與微點(diǎn)陣技術(shù)相對(duì)應(yīng)的是宏陣列點(diǎn)陣技術(shù)，該技術(shù)是構(gòu)建在載體面積相對(duì)較大的一種
芯片形式，將抗原或者抗體以相對(duì)寬大的間距點(diǎn)陣于玻璃載體基質(zhì)或者硝酸纖維素膜基質(zhì)
上面，加入抗體或者酶標(biāo)記抗原，運(yùn)用生物素_親和素信號(hào)系統(tǒng)或者辣根過氧化物酶信號(hào)
系統(tǒng)將信號(hào)放大，以不溶性四甲基聯(lián)苯胺為顯色底物，直接通過肉眼來判斷結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可同時(shí)檢測(cè)谷物、飼料及食品中重要真菌毒素(黃曲 霉毒素Bp玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素Bp伏馬菌素B》的 膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片。 本發(fā)明還涉及上述膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片的制備方法。
3
本發(fā)明的技術(shù)方案如下 本發(fā)明所述的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片由聚偏二氟已烯膜基片以及固定在該基片上的 點(diǎn)樣物組成。 所述的點(diǎn)樣物為黃曲霉毒素Bp玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯 醇、伏馬菌素Bp伏馬菌素B2的牛血清白蛋白偶聯(lián)物(真菌毒素全抗原)，各真菌毒素與牛 血清白蛋白的摩爾結(jié)合比為10-30 : 1; 所述的用于固定點(diǎn)樣物的穩(wěn)定物由蔗糖、甲醇及防腐劑組成，其中真菌毒素全抗
原總量與防腐劑的重量比為i : o.oi-o. 5、與蔗糖的重量比為i : 50-200、與甲醇的重量 比為i : o. oi-o. i。 本發(fā)明所述防腐劑為苯甲酸、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸丁脂、苯甲酸鈉中的任意一種。 本發(fā)明所述的黃曲霉毒素B"玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、 伏馬菌素Bp伏馬菌素B2的牛血清白蛋白偶聯(lián)物(真菌毒素全抗原)用于捕獲結(jié)合各自 對(duì)應(yīng)的真菌毒素抗體；穩(wěn)定物用于穩(wěn)定固相結(jié)合于聚偏二氟乙烯膜基質(zhì)上的真菌毒素全抗 原。 本發(fā)明所述的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片的制備方法是先將聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中
浸泡后，將膜平整放置于濾紙上端，用點(diǎn)樣儀將點(diǎn)樣物點(diǎn)于膜上，溫育后再用雜蛋白封閉膜
上沒有結(jié)合點(diǎn)樣物的多余位點(diǎn)，洗滌晾干后真空封裝。
更具體地說，本發(fā)明所述的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片的制備方法是 1)膜的前處理，將聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中浸泡5-20分鐘，用蒸餾水將膜上甲 醇洗滌干凈；2)點(diǎn)樣，將處理過的膜平整置于濾紙上端，用玻棒去除氣泡，點(diǎn)樣儀將點(diǎn)樣物 點(diǎn)于膜上，置于25-37t:中溫育2-3小時(shí)；3)封閉，將膜置于3-10% (m/v% )的脫脂奶粉 中，25-37t:中溫育2-3小時(shí)；4)洗滌，用pH為7. 2_8. 0的磷酸鹽緩沖液洗滌封閉后的膜， 晾干后真空封裝于鋁箔袋中可長期保存待用。 目前的蛋白質(zhì)芯片通常用的基質(zhì)都是玻璃載體或是氨基化、?；揎椇蟮牟Ａ?載體、硝酸纖維素膜等材料，為了更好的實(shí)現(xiàn)肉眼辨別且適合基層大規(guī)模使用，本發(fā)明選用 了聚偏二氟乙烯作為膜基質(zhì)，該膜具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸附能力，物理化學(xué)性能較好，耐酸堿 有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)，但該膜由于很強(qiáng)的疏水性，一般條件下很難將蛋白質(zhì)均勻的點(diǎn)樣于膜上， 本發(fā)明通過甲醇活化后，用水洗滌，直接將膜鋪于濾紙上，通過毛細(xì)滲透作用，將蛋白質(zhì)均 勻且牢固的點(diǎn)樣于膜上，無需額外的點(diǎn)樣緩沖液，方便而且快捷，同時(shí)選用了普通的脫脂奶 粉進(jìn)行封閉，降低了制作成本，封閉完成后的干燥及抽真空步驟都可大大增加蛋白質(zhì)芯片 的長期保存。 本發(fā)明由于將6種(黃曲霉毒素B工、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇、伏馬菌素Bp伏馬菌素B2)真菌毒素全抗原同時(shí)點(diǎn)樣于一張膜上，借鑒間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 原理，從而可達(dá)到在一張膜上可同時(shí)檢測(cè)6種不同的真菌毒素，只需要提取一次樣品就可 知該樣品中含有的真菌毒素種類，樣品提取完成后與6種真菌毒素抗體混勻，真菌毒素膜 基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片浸泡在混有真菌毒素抗體和待檢樣品的液體中反應(yīng)2-5分鐘后，用磷酸緩 沖液洗滌未結(jié)合及游離的真菌毒素抗體，然后再將真菌毒素膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片浸泡于辣根 過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 二抗工作液中反應(yīng)2-5分鐘，用磷酸緩沖液洗滌未結(jié)合及
4游離的二抗，加入沉淀型的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液進(jìn)行顯色，顯色完畢后用水終止顯 色，肉眼判斷結(jié)果。若樣品中不含有該項(xiàng)真菌毒素，則點(diǎn)樣有該真菌毒素全抗原的位置將顯 色，表明為陰性；反之，則不顯色，表明為陽性。 本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、方便快速、無需任何儀器設(shè)備就可一次性完成多種真菌毒素種 類的測(cè)定，并可長期保存，兼具了ELISA靈敏度高的特點(diǎn)，膠體金免疫層析技術(shù)肉眼判別的 特點(diǎn)以及生物芯片高通量檢測(cè)的特點(diǎn)，制備工藝簡(jiǎn)單，可大規(guī)?；a(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例l。制作可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片
( — )膜的前處理 1、將聚偏二氟乙烯膜浸沒于分析純甲醇溶液中，浸泡10分鐘；
2 、將膜取出，用蒸餾水沖洗5次；
3、用吹風(fēng)機(jī)將膜上水分晾干。
( 二 )點(diǎn)樣 1、將6種真菌毒素全抗原用磷酸緩沖液(pH = 7. 4)稀釋成0. 5mg/mL，待用； 2、分別取6種真菌毒素全抗原lmg，混合加入O. 5mg苯甲酸、50mg蔗糖、100iiL分
析純甲醇，混勻，置于96孔酶標(biāo)板中，制備完成6種真菌毒素點(diǎn)樣物待用； 3、將處理好的膜平鋪置于濾紙上端，用玻璃棒趕走中間氣泡； 4、用點(diǎn)樣儀各取6種真菌毒素點(diǎn)樣物3ii L，依次點(diǎn)樣于膜上，置于37t:溫箱中孵
育2小時(shí)。(三)封閉 1、稱取7.5克脫脂奶粉，加入lOOmL磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)，混勻待用；
2、將上述點(diǎn)樣完畢的膜取出，置入配好的脫脂奶粉溶液中，37t:溫育2小時(shí)；
3、溫育完畢后，用磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)沖洗4次，晾干。
(四)真空保存 1、將封閉完畢的膜置于超凈工作臺(tái)中，開啟最大風(fēng)速，吹2小時(shí)； 2、取出膜，置于鋁箔袋中，抽真空去除袋中空氣，熱封口，長期保存。 實(shí)施例2。采用可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)玉米樣品( — )真菌毒素蛋白質(zhì)芯片的制備 同實(shí)施例1 (二)玉米樣品的提取 1、稱取5克有代表性的玉米樣品，充分粉碎后置入250mL的三角燒瓶中，往瓶中加 入25mL 60%甲醇/水溶液，充分振蕩3分鐘； 2、靜置2分鐘，取上層液體2mL，加入6mL 20%甲醇/水，混勻，過濾，濾液即為樣 品提取液。(三)樣品檢測(cè) 1、取出2張膜芯片，打開真空包裝，待用； 2、取1. 5mL樣品提取液，加入1. 5mL內(nèi)含6種真菌毒素抗體的工作液，混勻，作為待檢工作液； 3、取1. 5mL 30%甲醇/水，加入1. 5mL內(nèi)含6種真菌毒素抗體的工作液，混勻，作 為陰性對(duì)照液； 4、2張膜芯片分別投入含有待檢工作液和陰性對(duì)照液的反應(yīng)盒中，浸沒，室溫反應(yīng) 5分鐘； 5、反應(yīng)完畢后，取出膜芯片，用磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)沖洗4次； 6、將2張膜分別投入含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗工作液中，浸
泡室溫反應(yīng)5分鐘； 7、反應(yīng)完畢后，取出膜芯片，用磷酸鹽緩沖液(pH= 7.4)沖洗4次； 8、將2張膜分別投入沉淀型的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液進(jìn)行顯色1分鐘，顯色
完畢后，用蒸餾水沖洗，終止顯色。(四)結(jié)果判斷 1、若樣品中不含有該項(xiàng)真菌毒素，則點(diǎn)樣有該真菌毒素全抗原的位置將顯色，表 明為陰性； 2、若樣品中含有該項(xiàng)真菌毒素，則點(diǎn)樣有該真菌毒素全抗原的位置將不顯色，表 明為陽性； 3、投入陰性對(duì)照液中的膜芯片，膜上各點(diǎn)均應(yīng)顯色，表明反應(yīng)體系正常。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)真菌毒素的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片，其特征是由聚偏二氟己烯膜基片以及固定在該基片上的點(diǎn)樣物組成；所述的點(diǎn)樣物為黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2的牛血清白蛋白偶聯(lián)物，各真菌毒素與牛血清白蛋白的摩爾結(jié)合比為10-30∶1；所述的用于固定點(diǎn)樣物的穩(wěn)定物由蔗糖、甲醇及防腐劑組成，其中真菌毒素全抗原總量與防腐劑的重量比為1∶0.01-0.5、與蔗糖的重量比為1∶50-200、與甲醇的重量比為1∶0.01-0.1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片，其特征是所述防腐劑為苯甲酸、山梨酸、 對(duì)羥基苯甲酸丁脂、苯甲酸鈉中的任意一種。
3. 權(quán)利要求1所述的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征是先將聚偏二氟乙烯膜置 于甲醇中浸泡后，將膜平整放置于濾紙上端，用點(diǎn)樣儀將點(diǎn)樣物點(diǎn)于膜上，溫育后再用雜蛋 白封閉膜上沒有結(jié)合點(diǎn)樣物的多余位點(diǎn)，洗滌晾干后真空封裝。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是1)將聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中浸泡5-20 分鐘，用蒸餾水將膜上甲醇洗滌干凈；2)將處理過的膜平整置于濾紙上端，用玻棒去除氣 泡，點(diǎn)樣儀將點(diǎn)樣物點(diǎn)于膜上，置于25-37t:中溫育2-3小時(shí)；3)將膜置于3_10% (m/v% ) 的脫脂奶粉中，25-37t:中溫育2-3小時(shí)；4)用pH為7. 2_8. 0的磷酸鹽緩沖液洗滌封閉后 的膜，晾干后真空封裝于鋁箔袋中。
全文摘要
檢測(cè)真菌毒素的膜基質(zhì)蛋白質(zhì)芯片及制備方法，由聚偏二氟己烯膜基片以及黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2的牛血清白蛋白偶聯(lián)物等六種點(diǎn)樣物組成；將聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中浸泡后，將膜平整放置于濾紙上端，用點(diǎn)樣儀將點(diǎn)樣物點(diǎn)于膜上，溫育后再用雜蛋白封閉膜上沒有結(jié)合點(diǎn)樣物的多余位點(diǎn)，洗滌晾干后真空封裝。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、方便快速、無需任何儀器設(shè)備就可一次性完成多種真菌毒素種類的測(cè)定，并可長期保存，兼具了ELISA靈敏度高的特點(diǎn)，膠體金免疫層析技術(shù)肉眼判別的特點(diǎn)以及生物芯片高通量檢測(cè)的特點(diǎn)，制備工藝簡(jiǎn)單，可大規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101696975SQ20091018633
公開日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者何慶華, 李燕萍, 王丹, 許楊, 黃志兵 申請(qǐng)人:南昌大學(xué);