專利名稱：：基于染色技術的細胞形態(tài)學鏡檢裝置和方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及細胞分析領域，尤其是涉及基于染色技術的細胞形態(tài)學鏡檢裝置。
背景技術：
：現(xiàn)有的血液分析儀可以提供豐富的數(shù)據(jù)，大大提高了臨床血液學檢驗的質量和速度，減輕了檢驗人員的工作量。然而，它們只能作為血液常規(guī)分析過程中的過篩手段，當自動化血球計數(shù)儀顯示異常結果時或對結果進行了"標記"時一定要作全血涂片染色檢查，血涂片染色鏡檢是提供鑒別診斷和提示進一步必要檢查的重要工具，特別是在快速診斷某些特異性感染方面(如瘧原蟲、黑熱病原蟲及絲蟲病等)，血涂片染色鏡檢有其重要作用。傳統(tǒng)的方式是采用手工制作，先在一張載玻片上進行血液推片，然后干燥、染色、干燥、觀察。人工方式勞動強度大、速度慢，不適合大批量的血樣處理。Coulter,Sysmex，Abbott等公司陸續(xù)開發(fā)出了自動推片染色機，對需要復檢的樣本進行自動推片染色，用以減少部分復檢工作量。此類設備都是按照標準的方法，需要復雜的機械手進行推片、烘干、染色等處理；染色后的血液細胞樣本固定在載玻片上送入顯微光學系統(tǒng)；在二維掃描平臺的帶動下，血片按照設定的掃描規(guī)律分區(qū)域掃描成像?，F(xiàn)有的自動推片染色機主要存在以下一些問題實現(xiàn)結構復雜，體積龐大，價格昂貴；多幀圖像獲取過程中需要二維機械掃描，獲取速度慢；圖像中細胞數(shù)量過多，容易出現(xiàn)扎堆現(xiàn)象，很難采用圖像處理的方法進行細胞識別和分割，即使人工計數(shù)也容易導致計數(shù)誤差；還存在故障率高、血涂片質量不穩(wěn)定等缺點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是克服傳統(tǒng)自動染色機的缺點，實現(xiàn)一種基于染色技術的細胞形態(tài)學快速鏡檢裝置和方法。本發(fā)明的技術路線簡介如下在本發(fā)明中擯棄了載物板，直接將采集到的微量細胞樣本和試劑在反應池充分混合，經(jīng)一段時間反應后送入顯微光學系統(tǒng)進行鏡檢。在顯微光學系統(tǒng)內(nèi)，細胞樣本以流水線的方式通過，通過快速攝像技術可以在短時間內(nèi)拍攝大量的顯微照片。本發(fā)明的一方面是提供一種基于染色技術的細胞形態(tài)學鏡檢裝置，包括反應池、測量室、液路單元、以及顯微光學系統(tǒng)。其特征在于，所述液路單元包括細胞樣本接口和至少一種試劑接口；所述液路單元至少與所述反應池和所述測量室之一連通；所述反應池和所述測量室之間連通；所述測量室同時位于所述顯微光學系統(tǒng)的內(nèi)部。本發(fā)明的另一方面是提供一種基于染色技術的細胞形態(tài)學鏡檢方法，其特征在于液路單元將細胞樣本和至少一種試劑注入反應池混合在一起；經(jīng)過一段時間，反應池內(nèi)的細胞樣本被注入測量室；在測量室內(nèi)部流動的細胞樣本被顯微光學系統(tǒng)成像。采用本發(fā)明還可以在反應池內(nèi)對細胞樣本進一步稀釋，雖然經(jīng)過稀釋后單幀圖像拍攝到的細胞數(shù)量相對傳統(tǒng)技術要少的多，但本發(fā)明可以在單位時間內(nèi)拍攝大量的圖像，因而拍攝的細胞總體數(shù)量并不會減少，甚至還可以更多，保證了測量結果的統(tǒng)計性和可靠性。相對于傳統(tǒng)的技術，本發(fā)明具有如下優(yōu)點細胞樣本和染色液充分混合，有利于提高染色質量，加快染色速度；由于不要復雜的機械結構進行推片、染色、烘干以及在顯微系統(tǒng)下的二維掃描，可以實現(xiàn)緊湊、可靠的自動化檢驗裝置；另外一方面，單幀圖像中細胞圖像越稀疏，越有利于采用圖像處理技術實現(xiàn)細胞圖像的自動化分割、識別、統(tǒng)計和分類。圖1是本發(fā)明用于血液細胞瑞氏染色的一個原理圖。圖2是測量室構件的主視圖。圖3是測量室構件的俯視圖。圖4是本發(fā)明用于血液細胞瑞氏染色的工作流程圖。具體實施例方式以血液細胞的瑞氏染色做為在本發(fā)明的一個實施例。圖1是該實施例的原理圖，一種基于染色技術的血液細胞形態(tài)學快速鏡檢裝置，包括反應池1、測量室2、液路單元3、顯微光學系統(tǒng)4以及控制單元5。其特征在于液路單元3可以向反應池1注入精確定量的血液樣本7和染色液8進行染色，注入定量的緩沖液9對染色樣本進行固定，注入稀釋液10對固定后的樣本進行稀釋，或者注入清洗液11對反應池進行清洗；測量室2分別和反應池1、液路單元3相連，同時測量室2也是顯微光學系統(tǒng)4的一個組件，位于顯微光學系統(tǒng)4的物面上。染色后的樣本由反應池1經(jīng)測量室2流入液路單元3，并在顯微光學系統(tǒng)4內(nèi)實現(xiàn)快速拍攝；為了保證染色的穩(wěn)定性和一致性，反應池1放置在一個恒溫系統(tǒng)6內(nèi)。控制單元5通過控制液路單元3、顯微光學系統(tǒng)4以及恒溫系統(tǒng)6實現(xiàn)染色、快速鏡檢、以及系統(tǒng)的清洗。液路單元3進一步包括血液操作單元301、染色液操作單元302、緩沖液操作單元303、稀釋液操作單元304、清洗液操作單元305、染色樣本驅動單元306、廢液收集單元307。其中血液操作單元301可以將微量的血液樣本7加入到反應池1內(nèi)，染色液操作單元302可以將定量的染色液8加入反應池1內(nèi)，緩沖液操作單元303可以將定量的緩沖液9加入反應池1內(nèi)，稀釋液操作單元304可以將定量的稀釋液10加入反應池1內(nèi)，清洗液操作單元305可以將定量的清洗液11加入反應池1內(nèi)，染色樣本驅動單元306用于將染色稀釋后的血液樣本由反應池1送入測量室2進行檢測，廢液收集單元307將液路系統(tǒng)中的廢液送入廢液容器12內(nèi)。液路單元3內(nèi)部的各單元之間可以是完全隔離的，也可共用一些管路、泵、閥等組件，將血液樣本7和各種試劑染色液8、緩沖液9、稀釋液10、清洗液11通過一條或多條管路送入反應池內(nèi)。顯微光學系統(tǒng)4進一步包括光源401、光源會聚透鏡402、成像透鏡403、攝像機404，測量室2也是顯微光學系統(tǒng)4的一個部件，位于顯微光學系統(tǒng)的物面位置。測量室2包括兩個端口A、B，分別和反應池1、液路單元3聯(lián)通。染色后的血液樣本在液路單元3的4驅動下由反應池1流經(jīng)測量室2并到達液路單元3。由光源401發(fā)出的光經(jīng)光源會聚透鏡202會聚到測量室2的測量區(qū)域，對流經(jīng)該區(qū)域的血液細胞進行照明，被照明的細胞經(jīng)成像透鏡403成像到攝像機404的靶面，最終由控制單元5獲取。測量室2采用透明材料加工而成，如透明塑料、有機玻璃，普通光學玻璃，石英、寶石等等。其結構如圖2、3所示，在透明材料中心形成一個扁平的通道，測量過程中，在其中流過的血液細胞樣本形成層流狀態(tài)。通道在光學軸向的高度h要足夠小，接近于成像透鏡403的景深，保證細胞在不同的位置均可以得到清晰的圖像。考慮到流速分布對測量結果的影響，通道寬度d應是成像透鏡403的視場直徑的36倍。為了便于形成穩(wěn)定的層流，通道長度1應是大于其寬度d(如4倍以上)，通道兩側應該盡可能光滑過度。染色后血液細胞樣本在測量室2內(nèi)快速通過，為了便于觀察其形態(tài)和顏色，對光源401和攝像機404提出了如下要求*高亮度、寬光譜光源；攝像機工作于幀曝光方式；如果選擇可工作于頻閃方式的光源，則攝像機404的電子快門的可以工作在較長的曝光時間模式下；如果光源只能工作于持續(xù)照明方式，則攝像機404的電子快門必須能夠調(diào)到較小的曝光時間?？蛇x用的光源包括，高亮度的白色LED，鹵鎢燈、頻閃放電管等。其中，鹵鎢燈只能工作于持續(xù)照明方式，頻閃放電管工作于頻閃方式，而LED則可以工作于兩種方式，具有更大的靈活性，但亮度要低一些。在實際應用中，攝像機404的像元尺寸和數(shù)量也是需要綜合考慮的因素；較大的像元尺寸可以獲得更多的光照能量，因此具有更好的信噪比，但是會導致像元數(shù)量減少，降低采樣圖像的空間分辨率；反之，增加像元數(shù)量提高了圖像空間分辨率，但是降低了圖像的信噪比。在本發(fā)明的設計中，成像透鏡403可以選用商品化的顯微物鏡，也可根據(jù)實際情況自行設計。控制單元5進一步包括邏輯控制單元501、液路控制單元502、溫度控制單元503、攝像機控制單元504、光源控制單元505。邏輯控制單元501依據(jù)設定的邏輯功能通過對液路單元3、恒溫系統(tǒng)6、顯微光學系統(tǒng)4的協(xié)同控制實現(xiàn)血液樣本的染色和快速鏡檢，并在鏡檢后實現(xiàn)整個系統(tǒng)的清洗，邏輯控制單元501可以是一臺PC機，也可以是含有CPU的控制板；液路控制單元502實現(xiàn)對液路單元3元件的控制，包括泵、閥、電機等組件；溫度控制單元503實現(xiàn)對恒溫系統(tǒng)6的控制；攝像機控制單元504實現(xiàn)對顯微光學系統(tǒng)4中的攝像機404的控制；光源控制單元505實現(xiàn)對顯微光學系統(tǒng)4中的光源401的控制。在本實施例中，用到的試劑如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>試劑名稱主要成分緩沖液9磷酸鹽緩沖液，PH值到6.57.0稀釋液10生理鹽水清洗液11含表面活性劑的溶液其它參數(shù)還包括，測量室2:扁平通道尺寸0.1mm(h)X2mm(w)X10mm(1);光源401:超高亮度的白色LED，工作于持續(xù)照明方式；攝像機404:微視圖像的CMOS彩色攝像機MVC1280SAC_GE27，有效像素1280X1024，像素尺寸6.7X6.7iim，快門速度8ys26ms可調(diào)(實際設定在16ys)，幀率27fps，千兆以太網(wǎng)接口；成像透鏡403:20X的顯微物鏡?！獋€典型的控制流程如圖4所示，描述如下*血液操作單元301和染色液操作單元302分別輸送一定量的血液樣本7(20y1)和染色液8(1001)到反應池1內(nèi)混合染色一段時間(約30秒)，為了保證染色的一致性，反應池1處于恒溫系統(tǒng)6內(nèi)并維持在30±0.5t:范圍內(nèi)；緩沖液操作單元303加入一定量的緩沖液9(100y1)到反應池1內(nèi)一段時間(5分鐘)，使染色后的血液細胞樣本穩(wěn)定化。稀釋液操作單元304加入一定量的稀釋液10(1.8ml)到反應池1內(nèi)對染色后的血液樣本進行稀釋。，染色樣本驅動單元306驅動染色樣本由反應池1按照一定的流速(4ii1/s)進入測量室2，同時由攝像機控制單元504啟動圖像采集程序測量一段時間(20s)。*測量完畢后，由清洗液操作單元305加入一定量的清洗液11(2.5ml)到反應池1內(nèi)對反應池進行清洗，并由廢液收集單元307將清洗后的的液體排至廢液容器12內(nèi)，此過程重復23次實現(xiàn)系統(tǒng)的徹底清洗。假定某正常成人的紅細胞數(shù)量為4X107P1，直徑在69iim范圍內(nèi)，白細胞數(shù)量為6X103/1，直徑在725m范圍內(nèi)，基于以上參數(shù)可以得到染色稀釋后的血液樣本大約被稀釋了100倍，即紅細胞濃度變?yōu)?X10ViU，白細胞為60/iU;顯微視場的區(qū)域為0.43mmX0.34mm，厚度即測量室2的厚度0.lmm，那么顯微視場對應體積為0.015iil，相應的紅細胞數(shù)量分別為600個和0.87個；如果20s內(nèi)的幀率保證在25fps，那么共可以得到500幀圖像，在這些圖像中共可以得到約3X105個紅細胞以及435個白細胞，保證了測量結果的統(tǒng)計性；在顯微圖像中，紅細胞的直徑約為1827個像素，白細胞直徑約為2175像素；*血液樣本在測量室內(nèi)的流速約為20mm/s，在攝像機的電子曝光時間(16ys)內(nèi)，樣本液移動的距離為0.32iim，在靶面上對應于0.96像素，不會造成因運動而產(chǎn)生的拖尾*在攝像機的拍攝的兩幀圖像時間間隔內(nèi)(約40ms)，樣本液移動的距離為0.8mm，大于顯微視場的區(qū)域最大邊長0.43mm，因此，攝像機每一幀圖像都是全新的圖像，沒有重復拍攝的區(qū)域。該實施例進一步表明采用本發(fā)明的裝置可以實現(xiàn)快速的血液細胞形態(tài)學鏡檢，得到大量、清晰的細胞染色圖像。以上內(nèi)容是結合具體的實施方式對本發(fā)明所做的進一步的詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術領域：
的的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明有所提交的權利要求書確定的專利保護范圍。權利要求一種基于染色技術的細胞形態(tài)學鏡檢裝置，包括反應池(1)、測量室(2)、液路單元(3)、以及顯微光學系統(tǒng)(4)，其特征在于，所述液路單元(3)包括細胞樣本接口和至少一種試劑接口；所述液路單元(3)至少與所述反應池(1)和所述測量室(2)之一連通；所述反應池(1)和所述測量室(2)之間連通；所述測量室(2)同時位于所述顯微光學系統(tǒng)(4)的內(nèi)部。2.根據(jù)權利要求1所述的鏡檢裝置，其特征在于所述的連通是指液體在兩個部件之間相互或者單向傳輸。3.根據(jù)權利要求l所述的鏡檢裝置，其特征在于所述測量室(2)是由透明材料構成的扁平流體通道，光學測量方向厚度h小于通道寬度d，通道寬度d小于通道長度1。4.根據(jù)權利要求3所述的鏡檢裝置，其特征在于所述扁平流體通道位于所述顯微光學系統(tǒng)(4)的物面位置。5.—種基于染色技術的細胞形態(tài)學鏡檢方法，其特征在于，液路單元(3)將細胞樣本和至少一種試劑注入反應池混合在一起；經(jīng)過一段時間，反應池(1)內(nèi)的細胞樣本被注入測量室(2);在測量室(2)內(nèi)部流動的細胞樣本被顯微光學系統(tǒng)(4)成像。6.根據(jù)權利要求5所述的鏡檢方法，其特征在于所述試劑包括化學染色試劑、熒光染色試劑、溶血劑、緩沖液、稀釋液、清洗液。全文摘要一種基于染色技術的細胞形態(tài)學鏡檢裝置，包括反應池、測量室、液路單元、以及顯微光學系統(tǒng)，其特征在于，液路單元包括細胞樣本接口和至少一種試劑接口；液路單元至少與反應池和測量室之一連通；反應池和測量室之間連通；測量室同時位于顯微光學系統(tǒng)的內(nèi)部。一種基于染色技術的細胞形態(tài)學鏡檢方法，其特征在于液路單元將細胞樣本和至少一種試劑注入反應池混合在一起；經(jīng)過一段時間，反應池內(nèi)的細胞樣本被注入測量室；在測量室內(nèi)部流動的細胞樣本被顯微光學系統(tǒng)成像。本發(fā)明不需要復雜的機械涂片裝置，顯微光學系統(tǒng)固定，染色后的細胞樣本以流水線的方式快速通過顯微光學系統(tǒng)，因而可以實現(xiàn)高度自動化、結構緊湊、快速的細胞形態(tài)學鏡檢。文檔編號G01N1/30GK101762585SQ200910136280公開日2010年6月30日申請日期2009年5月5日優(yōu)先權日2009年5月5日發(fā)明者孔兵申請人:孔兵