專(zhuān)利名稱：一種靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微流控技術(shù)、材料化學(xué)、組織工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組織工程及再生醫(yī)學(xué)是現(xiàn)在醫(yī)學(xué)、生物領(lǐng)域最為關(guān)注的熱點(diǎn)之一，而在體外模擬再生人體的功能組織在解決病人組織損傷、器官移植等問(wèn)題中具有較大的潛力。近年來(lái)，在體外模擬再生人體的功能組織主要有兩種思路1、通過(guò)定向誘導(dǎo)克隆的方法使干細(xì)胞直接分化為特定組織器官；2、按照原始組織器官內(nèi)細(xì)胞的空間分布，直接將細(xì)胞排列成相應(yīng)組織的形狀。而細(xì)胞模塊(cell block)概念的出現(xiàn)，為第二種思路通過(guò)了一個(gè)有效可行的技術(shù)平臺(tái)。細(xì)胞模塊是指具有特定形狀三維支架并且在其內(nèi)部或表面附著有細(xì)胞，將這些細(xì)胞模塊拼裝在一起，便可以體外模擬組織器官?，F(xiàn)在產(chǎn)生細(xì)胞模塊的方法主要有兩種水凝膠定點(diǎn)曝光法及模具法。水凝膠定點(diǎn)曝光法是指將水凝膠類(lèi)聚合物通過(guò)定點(diǎn)曝光的方法使其固化，形成特定形狀的模塊，再用于細(xì)胞培養(yǎng)(Yanan Du、Edward Lo elt. PNAS2008vol. 105no. 289522-9527)。但該方法的缺陷在于支架使用的材料有限，并且水凝膠類(lèi)聚合物的生物相容性及可降解性與蛋白類(lèi)材料相比較差。模具法即是指利用特定形狀的模具通過(guò)鑄模的方法得到相應(yīng)形狀的模塊，但此方法的缺陷在于細(xì)胞模塊中常使用的材料機(jī)械強(qiáng)度較軟，其在模具中固化成型后難以完整的釋放出來(lái)。所以實(shí)際應(yīng)用中，模具法產(chǎn)生的模塊形狀都比較簡(jiǎn)單，如果要產(chǎn)生復(fù)雜模塊，則常常要選擇機(jī)械強(qiáng)度高但生物相容性略差的聚合物材料(Wonjae Lee and Jon ParkAdv. Mater. 2012vol. 24No. 395339-5344)。本發(fā)明涉及以一種可以主動(dòng)釋放模具中細(xì)胞模塊的方法，用于廣泛材料的、形態(tài)復(fù)雜的細(xì)胞模塊的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法及應(yīng)用，該方法解決了現(xiàn)有模具法細(xì)胞模塊生成過(guò)程中材料可選擇范圍小、模塊完整性保持及釋放困難等問(wèn)題；并且在體外組織重建及臨床組織修復(fù)中具有應(yīng)用潛力。本發(fā)明提供了一種靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，該方法的具體步驟如下——利用常規(guī)軟光刻的方法，產(chǎn)生具有特定通道結(jié)構(gòu)的PDMS塊并且在通道結(jié)構(gòu)的中間打孔，同時(shí)，將一塊彈性薄膜(10-100微米厚)與上述帶有結(jié)構(gòu)的PDMS塊不可逆封接，作為模具的下層；—將一塊無(wú)結(jié)構(gòu)的PDMS塊兩端打孔為加樣液池，作為模具上層，并通過(guò)PDMS聚合物間靜電力與下層模具可逆封接，形成完整模具；——在模具上層的加樣液池中加入膠體溶液；——在模具下層的氣孔中施加0. 02-0. 04MPa負(fù)壓，使夾在中間的PDMS薄膜產(chǎn)生形變，從而在模具上下兩層之間形成了而形成了空腔并產(chǎn)生負(fù)壓，負(fù)壓將兩端液池中的膠體溶液吸到通道中并注滿整個(gè)模具；
—模具空腔內(nèi)的膠體溶液通過(guò)紫外曝光(用于水凝膠)、37度加熱(用于膠原)、 真空干燥(用于明膠)等方式固化，形成特定形狀的膠體模塊；
—將上層PDMS模具揭開(kāi)，并且將下層模具氣路內(nèi)的負(fù)壓變?yōu)镺.03MPa正壓，使 PDMS薄膜向上凸起，將已固化的膠體模塊從通道中釋放出來(lái)；
——將膠體模塊作為細(xì)胞支架進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，生成細(xì)胞模塊。
本發(fā)明提供的靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，所述模具材料為PDMS，模具中的氣控薄膜材料為PDMS膜，保鮮膜、醋酸纖維素膜等彈性薄膜。其中，PDMS膜可以通過(guò)甩膠操作(1000-5000轉(zhuǎn)/分鐘，30秒)獲得；保鮮膜、醋酸纖維素膜可以從公司購(gòu)買(mǎi)。PDMS 模具上的微結(jié)構(gòu)由常規(guī)軟光刻方法制成；模具上微結(jié)構(gòu)的樣子與尺寸決定了細(xì)胞模塊的形狀及尺寸。
本發(fā)明提供的靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，所述的膠體溶液可以為明膠、膠原、聚乙二醇等生物相容性好并且可以在光照、加熱等特定條件下由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的膠類(lèi)聚合物。
本發(fā)明提供的靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，所述制作過(guò)程可以實(shí)現(xiàn)膠體溶液的自動(dòng)灌注與固化后膠體模塊的主動(dòng)釋放。上述操作是通過(guò)控制模具間的一層PDMS 膜形變實(shí)現(xiàn)的。模具制作完成后，及結(jié)構(gòu)分為上中下三層上層為帶有液池的PDMS蓋片； 中間層為PDMS薄膜；下層為帶有灌注通道及氣孔的PDMS底座。其中，中間的PDMS薄膜與上層PDMS蓋片間為可逆封接，且沒(méi)有縫隙；而PDMS薄膜與下層PDMS底座為不可逆封接， 且該薄膜在灌注通道處懸空，即留有空間。鑄模操作過(guò)程如下1、將膠體溶液加在上層蓋片的液池中，此時(shí)上層蓋片與中間的PDMS膜密封，液體不流動(dòng)；2、在下層底座的氣孔中施加O. 02-0. 04MPa的負(fù)壓，是中間PDMS膜發(fā)生形變并貼附在下層灌注通道上，此時(shí)，在中間 PDMS膜與上層蓋片間出現(xiàn)了一個(gè)新的灌注通道且通道中為負(fù)壓；3、膠體溶液在負(fù)壓作用下流入灌注通道；4、在特定條件下使聚合物溶液固化；5、揭掉上層蓋片；6、將底座氣孔中的負(fù)壓改為O. 02-0. 04MPa的正壓，使PDMS膜向上凸起 ，釋放出模塊。從而完成了膠體溶液的自動(dòng)灌注與固化后膠體模塊的主動(dòng)釋放。
本發(fā)明提供的靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，所述模塊可以在組織修復(fù)， 體外組織模擬中得到應(yīng)用。在膠體模塊中，可以有兩種施加細(xì)胞的方法I、模塊生成后再接種細(xì)胞，形成細(xì)胞生長(zhǎng)在外部的細(xì)胞模塊；2、在灌注模塊時(shí)直接灌注細(xì)胞膠體懸液，形成細(xì)胞生長(zhǎng)在內(nèi)部的細(xì)胞模塊。得到特定形狀的細(xì)胞模塊后，通過(guò)拼裝、組和、共培養(yǎng)等方法可以進(jìn)行組織修復(fù)，體外組織模擬等研究。
本發(fā)明提供的靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于1、操作簡(jiǎn)單快速；2、無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備；3、模具可以重復(fù)使用，降低成本；4、產(chǎn)生模塊的形狀靈活可控；5、模塊主動(dòng)釋放有利于保持其完整性；6、模塊可使用的材料廣泛；7、產(chǎn)生的模塊可以靈活的拼裝。


圖I.制作膠體模塊流程示意圖，其中，I灌注模具；2膠體固化；3、主動(dòng)釋放；
圖2.聚乙二醇為材料制成模塊的實(shí)物圖，其中，a、齒輪結(jié)構(gòu)；b、六角星結(jié)構(gòu)；C、兩個(gè)齒輪結(jié)構(gòu)進(jìn)行拼裝；
圖3.明膠為材料制成模塊的實(shí)物圖，其中，a、熒光標(biāo)記模塊實(shí)物表征圖；b、電鏡表征圖4.明膠模塊為支架外部進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，其中，a、培養(yǎng)時(shí)間一天；b_c、培養(yǎng)時(shí)間5 天;
圖5.膠原材料內(nèi)部生長(zhǎng)細(xì)胞的細(xì)胞模塊，其中，a、40倍放大視野；b、100倍放大視
圖6.以明膠為材料的細(xì)胞模塊模擬拼裝人體內(nèi)臟結(jié)構(gòu)，其中，a、明場(chǎng)照片；b、熒光照片；c_d、腦、胃局部放大照片。
具體實(shí)施方式
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。
實(shí)施例I :
靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，如圖I所示，其具體步驟如下
——利用常規(guī)軟光刻的方法，產(chǎn)生具有特定通道結(jié)構(gòu)的PDMS塊并且在通道結(jié)構(gòu)的中間打孔，同時(shí)，將一塊彈性薄膜(10-100微米厚)與上述帶有結(jié)構(gòu)的PDMS塊不可逆封接， 作為模具的下層；
—將一塊無(wú)結(jié)構(gòu)的PDMS塊兩端打孔為加樣液池，作為模具上層，并通過(guò)PDMS聚合物間靜電力與下層模具可逆封接，形成完整模具；
——在模具上層的加樣液池中加入膠體溶液；
——在模具下層的氣孔中施加O. 02-0. 04MPa負(fù)壓，使夾在中間的PDMS薄膜產(chǎn)生形變，從而在模具上下兩層之間形成了而形成了空腔并產(chǎn)生負(fù)壓，負(fù)壓將兩端液池中的膠體溶液吸到通道中并注滿整個(gè)模具；
——模具空腔內(nèi)的膠體溶液通過(guò)紫外曝光(用于水凝膠)、37度加熱(用于膠原)、 真空干燥(用于明膠)等方式固化，形成特定形狀的膠體模塊；
—將上層PDMS模具揭開(kāi)，并且將下層模具氣路內(nèi)的負(fù)壓變?yōu)镺.03MPa正壓，使 PDMS薄膜向上凸起，將已固化的膠體模塊從通道中釋放出來(lái)；
——將膠體模塊作為細(xì)胞支架進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，生成細(xì)胞模塊。
實(shí)施例2
利用本發(fā)明方法進(jìn)行聚乙二醇模塊的制作。按照實(shí)施例I中操作流程，通過(guò)紫外曝光的方法使10%的聚乙二醇溶液固化(10-100%都可以實(shí)現(xiàn))，并釋放出來(lái)形成聚乙二醇模塊。如圖2所示，本方法產(chǎn)生的聚乙二醇模塊結(jié)構(gòu)完整、邊緣整齊、并且可以用于制作較為復(fù)雜的微齒輪結(jié)構(gòu)(600-1000微米)。另外制成的齒輪結(jié)構(gòu)可以在顯微鏡下(20倍視野) 進(jìn)行拼裝(圖2，C)。
實(shí)施例3
利用本發(fā)明方法進(jìn)行明膠模塊的制作。按照實(shí)施例I中操作流程，通過(guò)真空干燥溶劑揮發(fā)的方法使30%的明膠溶液固化(20-100%都可以實(shí)現(xiàn))，并釋放出來(lái)形成明膠模塊。 如圖3所示，本方法產(chǎn)生的明膠模塊結(jié)構(gòu)完整、邊緣整齊、并且可以靈活制作各種形狀的明膠模塊(模塊直徑800微米，環(huán)形邊寬100微米)。進(jìn)一步顯示出了本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)及可行性。實(shí)施例4 支架外部生長(zhǎng)細(xì)胞的細(xì)胞模塊。如圖4所示，本發(fā)明制成的明膠模塊后可以用于細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞模塊。在接種第I天時(shí)，細(xì)胞粘附在模塊表面并開(kāi)始生長(zhǎng)(圖4、a) ；5天后細(xì)胞大量增殖，在模塊外圍形成了一圈上百微米厚的細(xì)胞實(shí)體膜(圖4、b)，顯示出了明膠模塊優(yōu)秀的生物相容性。另外，從圖4、c中可以發(fā)現(xiàn)，5天后，細(xì)胞向模塊空心圓環(huán)處生長(zhǎng)，并且有將其填滿的趨勢(shì)，顯示出了該模塊在組織損傷修復(fù)研究中的潛力。實(shí)施例5 支架內(nèi)部生長(zhǎng)細(xì)胞的細(xì)胞模塊。本發(fā)明在制作膠原模塊時(shí)，在無(wú)菌條件下，直接將細(xì)胞的膠原懸液加入到模具內(nèi)，37度半小時(shí)膠原固化后形成了內(nèi)部生長(zhǎng)有細(xì)胞的細(xì)胞模塊。如圖5所示，膠原模塊內(nèi)部的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并且表現(xiàn)出了典型的三維培養(yǎng)形態(tài)。 實(shí)施例6 體外細(xì)胞模塊組裝。如圖6所示，以明膠為材料的細(xì)胞模塊模擬拼裝出人體內(nèi)臟結(jié)構(gòu)。利用本發(fā)明方法得到各種內(nèi)臟形狀的明膠模塊，并用于細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞模塊。在顯微鏡下(20倍視野)將其組裝成人體內(nèi)臟的結(jié)構(gòu)，顯示出了本方法在組織體外組裝重建中的潛力。
權(quán)利要求
1.一種靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下 ——利用常規(guī)軟光刻的方法，產(chǎn)生具有特定通道結(jié)構(gòu)的PDMS塊并且在通道結(jié)構(gòu)的中間打孔，同時(shí)，將一塊彈性薄膜與上述帶有結(jié)構(gòu)的PDMS塊不可逆封接，作為模具的下層； ——將一塊無(wú)結(jié)構(gòu)的PDMS塊兩端打孔為加樣液池，作為模具上層，并通過(guò)PDMS聚合物間靜電力與下層模具可逆封接，形成完整模具； ——在模具上層的加樣液池中加入膠體溶液； ——在模具下層的氣孔中施加O. 02-0. 04MPa負(fù)壓，使夾在中間的PDMS薄膜產(chǎn)生形變，從而在模具上下兩層之間形成了而形成了空腔并產(chǎn)生負(fù)壓，負(fù)壓將兩端液池中的膠體溶液吸到通道中并注滿整個(gè)模具； ——模具空腔內(nèi)的膠體溶液通過(guò)固化，形成特定形狀的膠體模塊； ——將上層PDMS模具揭開(kāi)，并且將下層模具氣路內(nèi)的負(fù)壓變?yōu)镺. 03MPa正壓，使PDMS薄膜向上凸起，將已固化的膠體模塊從通道中釋放出來(lái)； ——將膠體模塊作為細(xì)胞支架進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，生成細(xì)胞模塊。
2.按照權(quán)利要求I所述靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，其特征在于所述特定通道結(jié)構(gòu)的PDMS塊中通道的形狀根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的需要自行設(shè)計(jì)加工。
3.按照權(quán)利要求I所述靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，其特征在于所述彈性薄膜為PDMS膜、保鮮膜、醋酸纖維素膜中的至少一種。
4.按照權(quán)利要求I或2所述靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，其特征在于所述彈性薄膜的厚度為10-100微米。
5.按照權(quán)利要求I所述靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，其特征在于所述彈性薄膜與帶有結(jié)構(gòu)的PDMS塊不可逆封接的方法有等離子體處理或PDMS膠水粘貼方式。
6.按照權(quán)利要求I所述靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，其特征在于所述的膠體為明膠、膠原或聚乙二醇水凝膠一些生物相容性好并且在特定條件由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的膠類(lèi)聚合物。
7.按照權(quán)利要求I所述靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法，其特征在于所述膠體溶液固化的方式有紫外曝光、加熱或真空干燥。
8.權(quán)利要求I所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞模塊的應(yīng)用，其特征在于每個(gè)細(xì)胞模塊都能生長(zhǎng)不同種類(lèi)的細(xì)胞并且進(jìn)行組裝，在組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用。
全文摘要
一種靈活產(chǎn)生形態(tài)各異性細(xì)胞模塊的方法及應(yīng)用，本發(fā)明以聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片上的微通道為模具，通過(guò)灌注、固化的方法產(chǎn)生明膠、膠原、聚乙二醇等具有生物相容性膠類(lèi)聚合物的模塊，并且將該模塊作為細(xì)胞生長(zhǎng)的支架應(yīng)用于組織的體外組裝及修復(fù)；同時(shí)，本發(fā)明在微模具內(nèi)引入了氣壓可控的PDMS薄膜結(jié)構(gòu)，可以將其內(nèi)部產(chǎn)生的模塊進(jìn)行主動(dòng)釋放。本發(fā)明可以簡(jiǎn)單、快速、靈活的產(chǎn)生各種形態(tài)的可固化膠類(lèi)聚合物模塊，并且使其從模具中主動(dòng)釋放，有利于保持這些模塊結(jié)構(gòu)的完整性；期望提供一種靈活可控的細(xì)胞支架生成方法，并且在組織工程及再生醫(yī)學(xué)中得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102978151SQ201210439689
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者秦建華, 張旭, 孟昭旭, 馬靜云 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所