專利名稱：Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及染色體缺失檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種Y染色體微缺失實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)有15%的育齡夫婦患有不孕不育癥，其中男性不育的因素約占50%， 在這50%的男性不育患者中，35%以上是由于遺傳學(xué)異常引起的。Y染色體微缺失是導(dǎo) 致男性不育的主要遺傳學(xué)因素之一，因此檢測(cè)Y染色體微缺失具有重要的臨床參考價(jià)值。 1976年，Ti印lolo和Zuffardi發(fā)現(xiàn)無(wú)精癥患者有Y染色體長(zhǎng)臂(Yqll)缺失，故稱該部位 為無(wú)精子因子(azoospermia factor，AZF)。目前認(rèn)為控制精子生長(zhǎng)的基因位于Y染色體長(zhǎng) 臂遠(yuǎn)側(cè)的常染色質(zhì)區(qū)，該部位有無(wú)精子因子AZF，現(xiàn)已明確至少有3個(gè)精子生成部位(AZFa、 AZFb、AZFc)，分別位于Yqll的近端、中間和遠(yuǎn)端。Y染色體微缺失發(fā)生在Y染色體上與AZF 相關(guān)的多個(gè)基因上。雖然由于各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)象的選擇標(biāo)準(zhǔn)不同，檢出率有比較大的差異， 但各區(qū)的缺失頻率基本穩(wěn)定AZFc占總?cè)笔实?9%，AZFb占9%，AZFa+b占6%，AZFa占 3%，AZFa+b+c占3%。這些區(qū)域的微缺失將導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，少精，弱精，甚至無(wú)精。
AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)區(qū)域的STS位點(diǎn)模式圖如圖1所示。 本發(fā)明中的試劑盒分別針對(duì)其中3個(gè)STS位點(diǎn)，即sY86、sY127和sY255設(shè)計(jì)特異 的引物對(duì)進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)提供sY86、sY127和sY2553個(gè)位 點(diǎn)的陽(yáng)性對(duì)照樣品，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 Y染色體微缺失是一種常見(jiàn)的染色體異常疾病，主要是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中 染色體分離不平衡的結(jié)果。該疾病可以從正常的帶微缺失的精子傳遞下來(lái)，也可以通過(guò)正 常精子受精后在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)生Y染色體的微缺失。隨著現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)的進(jìn)展， 卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術(shù)被認(rèn)為是男性不 育癥治療上的一次革命。然而該技術(shù)可能將攜帶染色體畸形、缺失或基因突變的精子注入 到卵胞漿內(nèi)，使卵子受精，從而將上述各種遺傳缺陷傳給下一代。因此，為了確定是否需要 治療，臨床醫(yī)生建議所有精子濃度< 5X 106/mL的男性原則上都要進(jìn)行Y染色體微缺失的 分子診斷。從1999年開(kāi)始，歐洲男科學(xué)協(xié)會(huì)和歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)質(zhì)控協(xié)作網(wǎng)(EMQN)為提 高診斷質(zhì)量，出版了Y染色體微缺失分子診斷指南，并提供了客觀的質(zhì)量評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法。最 新版的實(shí)驗(yàn)室指南是根據(jù)2003年10月在佛羅倫薩舉行的"Best Practice Meeting"的成 果，在1999年版的基礎(chǔ)上修訂而成。對(duì)于Y染色體微缺失的篩查，1999年版的指南被證明 是準(zhǔn)確、靈敏和易于操作的。根據(jù)Y染色體序列和微缺失機(jī)制的最新研究進(jìn)展，1999年版的 指南能夠滿足準(zhǔn)確診斷的需要，實(shí)踐證明是非常有效和合適的。 Y染色體微缺失的分子檢測(cè)方法主要有Southern blot印跡雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)結(jié)合電泳檢測(cè)技術(shù)等，其中常規(guī)PCR電泳技術(shù)是目 前各研究中最常用、最簡(jiǎn)單和最有效的方法。然而影響常規(guī)PCR技術(shù)臨床應(yīng)用的巨大障礙
3是擴(kuò)增產(chǎn)物污染的問(wèn)題，其結(jié)果易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性。盡管采取優(yōu)化PCR條件和設(shè)立對(duì) 照安全保證(如使用女性DNA作為陰性對(duì)照)等多個(gè)嚴(yán)格質(zhì)量控制措施，PCR的擴(kuò)增仍可 能會(huì)失敗。 中國(guó)專利200410043918. 0公開(kāi)了特異性擴(kuò)增Y染色體微缺失基因STS中的sY87 和sY143的兩對(duì)引物序列；中國(guó)專利200710074317. X公開(kāi)了特異性擴(kuò)增Y染色體微缺失基 因AZF的30條引物和特異性擴(kuò)增男性特有SRY基因的2條引物。以上兩個(gè)專利都是采用 常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，該方法的不足之處是采用電泳檢測(cè)，易引起PCR產(chǎn)物的交叉感 染，增加了假陽(yáng)性結(jié)果的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種可穩(wěn)定、高效檢測(cè)Y染色體微缺失 的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 —種Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包 括 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa亞區(qū)sY86序列的引物，其堿基序列如SEQID NO : 1和2 所示；Y染色體AZFa亞區(qū)sY86位點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照樣品用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所
示序列的引物對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為插入子構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性參考品；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY127序列的引物，其堿基序列如SEQ ID N0:3和
4所示；Y染色體AZFb亞區(qū)sY127位點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照樣品用SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所 示序列的引物對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為插入子構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性參考品；
特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY255序列的引物，其堿基序列如SEQ ID N0:5和 6所示；Y染色體AZFc亞區(qū)sY255位點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照樣品用SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所
示序列的引物對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為插入子構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性參考品。 所述試劑盒進(jìn)一步包括SYBR Green I熒光染料。 所述試劑盒進(jìn)一步包括MgCl2、 dNTPs和PCR反應(yīng)緩沖液。 所述MgCl2反應(yīng)終濃度為4mM。 所述dNTPs反應(yīng)終濃度為0. 2mM。 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR在Y染色體微缺 失檢測(cè)中的應(yīng)用。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real time fluorescence quantitative PCR)是一種新的基 因檢測(cè)技術(shù)，它通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起 始模板定量及定性的分析。該技術(shù)在PCR基礎(chǔ)上提高了檢測(cè)特異性；擴(kuò)增與自動(dòng)分析一體 化，操作方便、簡(jiǎn)單、快速；閉管操作，無(wú)需電泳，可降低PCR產(chǎn)物污染可能性；實(shí)驗(yàn)結(jié)果為實(shí) 時(shí)檢測(cè)所得動(dòng)態(tài)曲線，較終點(diǎn)檢測(cè)可靠等?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)呈現(xiàn)出取 代常規(guī)PCR技術(shù)的趨勢(shì)。
4
SYBR Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其 熒光大大增強(qiáng)。SYBR Green I在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA 相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。利用 熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過(guò)熔解曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚 體，因而可以區(qū)分非特異擴(kuò)增，進(jìn)一步地還可以實(shí)現(xiàn)單色多重測(cè)定。此外，由于一個(gè)PCR產(chǎn) 物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SYBR Green I的靈敏度很高。但是，由于SYBR Green I 與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的 假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的 影響。由熔解曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreen I得到的定量結(jié)果。
本發(fā)明首次提供了 Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒， 該試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn) 1)檢測(cè)時(shí)間短，速度快，高通量，可在4-6小時(shí)完成96個(gè)樣品的定量分析。
2)操作過(guò)程簡(jiǎn)單，從PCR反應(yīng)開(kāi)始，就是在封閉的體系中完成擴(kuò)增和實(shí)時(shí)測(cè)定，大 大降低了污染的可能性，因此也就降低了結(jié)果偏差的幾率。 3)對(duì)標(biāo)本DNA獲取的質(zhì)量要求較低，無(wú)論是石蠟組織還是新鮮組織，都能取得理 想的檢測(cè)結(jié)果。 4)熒光定量PCR法結(jié)果的判讀在閾值線以上有擴(kuò)增曲線的標(biāo)本均為陽(yáng)性標(biāo)本， 結(jié)果判讀簡(jiǎn)單、明確、直觀，若需要亦可對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。 5)檢測(cè)的靈敏度高，熒光PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了 PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技 術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。 6)利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過(guò)熔解曲線分析識(shí)別特異性產(chǎn) 物和非特異性產(chǎn)物，降低引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤擴(kuò)增引起的非特異性產(chǎn)物的 影響，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。


圖1是AZFa、 AZFb、AZFc 3個(gè)區(qū)域的STS位點(diǎn)模式圖； 圖2是陽(yáng)性對(duì)照樣品Y染色體AZFa亞區(qū)sY86位點(diǎn)、Y染色體AZFb亞區(qū)sY127位
點(diǎn)、Y染色體AZFc亞區(qū)sY255位點(diǎn)的FQ-PCR圖； 圖3、圖4、圖5是三名臨床正常已育男性樣本的FQ-PCR圖； 圖6、圖7、圖8是三名待檢測(cè)男性基因組DNA樣本的FQ-PCR圖； 圖9是pUCm-T-sY86質(zhì)粒圖譜； 圖10是pUCm-T-sY127質(zhì)粒圖譜； 圖11是pUCm-T-sY255質(zhì)粒圖譜。 附圖標(biāo)號(hào)說(shuō)明S表示樣本，P表示陽(yáng)性對(duì)照，N表示陰性對(duì)照。
具體實(shí)施方式

—、材料
1、儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，移液器，離心機(jī)。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了 3對(duì)PCR引物分別特異的擴(kuò)增AZF STSs序列，引物序列如下所示。 表l引物列表
引物名稱序號(hào)擴(kuò)增對(duì)象
sY86-F sY86-RSEQIDNO :1 SEQIDNO :2特異性擴(kuò)增Y染色 體AZFa亞區(qū)sY86序列
sY127-F sY127-RSEQIDNO :3 SEQIDNO :4特異性擴(kuò)增Y染色 體AZFb亞區(qū)sY127序列
sY255-F sY255-RSEQIDNO :5 SEQIDNO :6特異性擴(kuò)增Y染色 體AZFc亞區(qū)sY255序列 3、陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒pUCm-T-sY86、 pUCm-T_sY127和pUCm-T_sY255。
4、試劑 10XPCR buffer、MgCl2、Taq酶、dNTPs、 1000X SYBR Green I熒光染料。
二、方法 1、人類基因組DNA的提取 用蛋白酶K裂解和酚_氯仿抽提法或市售試劑盒從人類抗凝外周血白細(xì)胞中提取
基因組DNA，分別提取三名臨床正常已育男性基因組DNA、三名待檢測(cè)男性基因組DNA和一
名女性基因組DNA。 2、熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng) 取PCR反應(yīng)管，在管壁上做好標(biāo)記，分別加入熒光定量反應(yīng)液9. 75ii L(包括 10XPCR Buffer 2. 5 ii L(無(wú)Mg2+) 、25mM MgCl2 4iiL、10mM dNTPs0. 5 ii L、 10 ii M上游引物 0. 5 ii L、 10 ii M下游引物0. 5 ii L、 10 X SYBR Green 11. 25 ii L、5U/ ii L酶0. 5 ii L)，已提取的 樣本基因組DNA 0. 625 y L(含基因組DNA約25ng)，最后加入無(wú)菌水至25 y L反應(yīng)總體系。 該過(guò)程需在冰上操作，每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，且每次檢測(cè)都同時(shí)設(shè)立一組 陽(yáng)性對(duì)照和一組陰性對(duì)照(女性基因組DNA)。 熒光定量反應(yīng)在ABI 7300檢測(cè)儀上進(jìn)行，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增
第一階段95。C 15min ; 第二階段94。C 30sec， 57°C 45sec (熒光收集)，72°C 30sec， 35個(gè)循環(huán);
第三階段(熔解曲線)95。C 15sec，60。C lmin，95。C 15sec，60。C 15sec。
三、結(jié)果判定 讀取檢測(cè)結(jié)果，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高 點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。
(1)樣品Ct值《30.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則表示樣本Y染色體在該位點(diǎn)沒(méi)有 微缺失；若無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，則表示樣本Y染色體在該位點(diǎn)發(fā)生了微缺失。
(2)陽(yáng)性對(duì)照Ct值《30. 0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，如圖2所示。
(3)陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。
從圖3、圖4、圖5可以看出，三名臨床正常已育男性樣本均擴(kuò)增出典型陽(yáng)性擴(kuò)增曲 線，該三名男性未發(fā)生Y染色體的微缺失。 從圖6 、圖7、圖8可以看出，三名待檢測(cè)男性基因組DNA樣本也均擴(kuò)增出典型陽(yáng)性
擴(kuò)增曲線，證實(shí)該三名男性也未發(fā)生Y染色體微缺失基因。 SEQUENCE LISTING 〈110〉深圳博睿祥暉生物技術(shù)有限公司 〈120>Y染色體微缺失基因SYBR Greenl實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒 〈130>P10922 〈160>6 <170>PatentIn version 3. 3 〈210〉1 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1 gtgacacaca gactatgctt c 21 〈210>2 〈211>20 <212>DNA <213>人工序列 〈400〉2 acacacagag ggacaaccct 20 〈210>3 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>3 ggctc3ca朋cg朋朋g朋3 20 <210>4 〈211〉20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>4 ctgcaggcag taat朋ggga 20 〈210>5
〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉5gttacaggat tcggcgtgat20〈210>6〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ctcgtcatgt gcagccac18
i兌明 書(shū) 6/6頁(yè)
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權(quán)利要求
一種Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa亞區(qū)sY86序列的引物，其堿基序列如SEQID NO1和2所示；Y染色體AZFa亞區(qū)sY86位點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照樣品用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示序列的引物對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為插入子構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性參考品；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY127序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO3和4所示；Y染色體AZFb亞區(qū)sY127位點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照樣品用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示序列的引物對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為插入子構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性參考品；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY255序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO5和6所示；Y染色體AZFc亞區(qū)sY255位點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照樣品用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示序列的引物對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為插入子構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性參考品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑 盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括SYBR Greenl熒光染料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括MgCl2、 dNTPs和PCR反應(yīng)緩沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑 盒，其特征在于，所述MgCl2反應(yīng)終濃度為4mM。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑 盒，其特征在于，所述dNTPs反應(yīng)終濃度為0. 2mM。
6. SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR在Y染色體微缺失檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種Y染色體微缺失SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以檢測(cè)Y染色體AZFa亞區(qū)sY86位點(diǎn)，Y染色體AZFb亞區(qū)sY127位點(diǎn)，Y染色體AZFc亞區(qū)sY255位點(diǎn)的基因缺失，操作方便，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101701248SQ20091010634
公開(kāi)日2010年5月5日 申請(qǐng)日期2009年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日
發(fā)明者汪朝暉 申請(qǐng)人:深圳博睿祥暉生物技術(shù)有限公司