專利名稱：檢測y染色體微缺失的實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測Y染色體微缺失的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有15 %的夫婦患有不育(孕)癥，其中50 %以上由男方所致。近年來研究表明30%以上的男性不育是由于遺傳因素引起的生精障礙，通常表現(xiàn)為男性Y染色體長臂(q臂)11區(qū)上無精因子基因家族(Azoospermia factor, AZF)多個(gè)位點(diǎn)的缺失突變，其中任何一個(gè)座位的微缺失都可導(dǎo)致生精障礙，而對于因Y染色體微缺失引起的男性不育是無法治療的。在胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)輔助生育治療前檢測Y染色體微缺失可以為臨床治療提供指導(dǎo)，減少不必要的經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)。目前歐洲、美國及我國相關(guān)學(xué)會(huì)已經(jīng)建議將檢測Y染色體微缺失列為男性不育的篩查項(xiàng)目。 目前檢測基因微缺失的方法很多，最常用的PCR-RFLP法，另外還有反向點(diǎn)雜交法、等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)、直接測序法等。后者是所有方法的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其費(fèi)用昂貴，未廣泛使用。而PCR-RFLP法雖然費(fèi)用較低，操作簡單，但特異性和敏感性都不太理想，其檢測通量小，對于樣本量較大的臨床檢測不適用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種能夠有效減少時(shí)間和成本的用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒及方法。本發(fā)明提供一種用于檢測Y染色體微缺失的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，包括盒體、PCR反應(yīng)液及至少一個(gè)引物探針組合，所述引物探針組合選自用于檢測SY84位點(diǎn)的SY84引物探針組合、用于檢測SY86位點(diǎn)的SY86引物探針組合、用于檢測SY127位點(diǎn)的SY127引物探針組合、用于檢測SY134位點(diǎn)的SY134引物探針組合、用于檢測SY254位點(diǎn)的SY254引物探針組合及用于檢測SY255位點(diǎn)的SY255引物探針組合，其中，SY84引物探針組合的上游引物如SEQ ID NOiTSEQ ID NO:8中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:9 SEQ ID NO: 14中之一所示，其熒光探針如SEQ IDN0:15 SEQ ID NO: 22中之一所示；SY86引物探針組合的上游引物如SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:28中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:29 SEQ ID NO:30中之一所示，其熒光探針如SEQ ID N0:31 SEQ IDNO:39中之一所示；SY127引物探針組合的上游引物如SEQ ID N0:4(TSEQ ID NO: 51中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:52 SEQ ID NO:54中之一所示，其熒光探針如SEQ ID N0:55 SEQ IDNO:58中之一所示；SY134引物探針組合的上游引物如SEQ ID N0:59 SEQ ID NO:61中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:62 SEQ ID NO:69中之一所示，其熒光探針如SEQ ID N0:70 SEQ IDNO:74中之一所示；
SY254引物探針組合的上游引物如SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 76中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:77 SEQ ID NO:85中之一所示，其熒光探針如SEQ ID N0:86 SEQ IDNO:87中之一所示；SY255引物探針組合的上游引物如SEQ ID N0:88 SEQ ID NO:90中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:9Tseq ID NO:94中之一所示，其熒光探針如SEQ ID N0:95 seq idNO: 101中之一所示。不同的引物探針組合用于檢測Y染色體AZF區(qū)域的不同位點(diǎn)，可以根據(jù)需要選擇檢測其中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，對應(yīng)的，選擇與該位點(diǎn)對應(yīng)的引物探 針組合。Y染色體的AZF區(qū)域由AZFa區(qū)域、AZFb區(qū)域和AZFc區(qū)域組成。所述試劑盒還包括用于檢測男性性別決定基因SRY的SRY引物探針組合，所述SRY引物探針組合的上游引物如SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 107中之一所示，其下游引物如SEQID NO: 108 SEQ ID NO: 109 中之一所示，其熒光探針如 SEQ ID NO: IlO^SEQ ID NO: 112 中之一所示。SRY引物探針組合用于質(zhì)控，其可以根據(jù)檢測要求選擇采用或不采用。所述引物探針組合由SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、和SY255引物探針組合組成，所述引物之間Tm值相差波動(dòng)于2-4°C，所述探針之間Tm值相差波動(dòng)于2_4°C，引物探針之間Tm值相差為10°C左右。引物包括針對各位點(diǎn)的引物和針對基因SRY的引物。探針包括針對各位點(diǎn)的探針和針對基因SRY的探針。所述PCR反應(yīng)液還包括含MgCl、KCl、Tris的10倍緩沖液(10*Buffer)、含dATP、dCTP、dGTP、dUTP 的 dNTP 及 rTaq 酶。其中，MgCl濃度為 I. 5mM, KCl 濃度為 60mM、Tris 濃度為 12mM。其中，dNTP濃度為 O. 2mM。其中，合成引物濃度為300uM、探針濃度為100uM。一種用于檢測Y染色體微缺失的方法，包括如下步驟a)從人抗凝血中提取基因組DNA ；b)以所述基因組DNA試樣為模板，利用權(quán)利要求7所述的SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探針組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測；c)根據(jù)探針熒光標(biāo)記選擇對應(yīng)探針檢測通道的顏色；d)根據(jù)擴(kuò)增曲線顏色及曲線有無判斷對應(yīng)Y染色體的AZF區(qū)域是否存在缺失。其中，該方法采用四重?zé)晒舛縋CR分兩管對Y染色體3個(gè)區(qū)域6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測。本發(fā)明的有益效果是該試劑盒和方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合Taqman探針對Y染色體微缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測，實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過PCR擴(kuò)增對每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號進(jìn)行實(shí)時(shí)收集，從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析，該方法操作簡單、快速、檢測通量高且敏感性特異性高，能夠有效減少時(shí)間和成本。


圖1-10是表明本實(shí)施方式檢測結(jié)果的熒光擴(kuò)增曲線圖，其中，
圖I的4條曲線分別表示SRY、SY84、SY127和SY254位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；圖2的4條曲線分別表示SRY、SY134、SY255和SY86位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；圖3的3條曲線分別表示SRY、SY127和SY254位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；圖4的3條曲線分別表示SRY、SY134和SY255位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；圖5的3條曲線分別表示SRY、SY84和SY254位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；圖6的4條曲線分別表示SRY、SY86、SY134和SY255位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；圖7的3條曲線分別表示SRY、SY86和SY255位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；圖8的4條曲線分別表示SRY、SY84、SY127和SY254位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；
圖9的3條曲線分別表示SRY、SY84和SY127位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線；圖10的3條曲線分別表示SRY、SY86和SY134位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明運(yùn)用四重?zé)晒舛縋CR分兩管對Y染色體AZFa區(qū)域的SY84位點(diǎn)和SY86位點(diǎn)、對AZFb區(qū)域的SY127位點(diǎn)和SY134位點(diǎn)、對AZFc區(qū)域SY254位點(diǎn)和SY255位點(diǎn)進(jìn)行檢測，同時(shí)檢測男性性別決定基因SRY作為質(zhì)控，以正常已育男性DNA樣本作為陽性對照，女性DNA樣本作為陰性對照，滅菌水作為空白對照防止檢驗(yàn)體系被污染。用于檢測Y染色體AZFa區(qū)域SY84位點(diǎn)的引物探針組合定義為SY84引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其上游引物如SEQ ID NOiTSEQ IDN0:8中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:9 SEQ ID NO: 14中之一所示，其熒光探針如SEQID N0:15 SEQ ID NO: 22中之一所示，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標(biāo)記5’端，其熒光標(biāo)記與SY86位點(diǎn)相同，但與AZFb、AZFc區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY84位點(diǎn)的探針、上、下游引物可隨機(jī)組合。用于檢測Y染色體AZFa區(qū)域SY86位點(diǎn)的引物探針組合定義為SY86引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其上游引物如SEQ ID N0:23 SEQ IDNO:28中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:29 SEQ IDN0:30中之一所示，其熒光探針如SEQ ID NO:3TSEQ ID勵(lì):39中之一所示，熒光探針以？么1、冊乂、0￥5、1 ( 之一標(biāo)記5’端，其熒光標(biāo)記與SY84位點(diǎn)相同，但與AZFb、AZFc區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY86位點(diǎn)的探針、上、下游弓I物可隨機(jī)組合。用于檢測Y染色體AZFb區(qū)域SY127位點(diǎn)的引物探針組合定義為SY127引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其上游引物如SEQ ID N0:4(TSEQ IDN0:51中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:52 SEQ ID NO:54中之一所示，其熒光探針如SEQ ID N0:55 SEQ ID NO:58中之一所示，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標(biāo)記5’端，其熒光標(biāo)記與SY134位點(diǎn)相同，但與AZFa、AZFc區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY127位點(diǎn)的探針、上、下游引物可隨機(jī)組合。用于檢測Y染色體AZFb區(qū)域SY134位點(diǎn)的弓丨物探針組合定義為SY134引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman探針，其上游引物如SEQ ID N0:59 SEQ ID N0:61中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:62 SEQ ID NO:69中之一所示，其熒光熒光探針如SEQ ID N0:7(TSEQ ID NO:74 中之一所示，熒光探針以 FAM、HEX、CY5、ROX 之一標(biāo)記 5’端，其熒光標(biāo)記與SY127位點(diǎn)相同，但與AZFa、AZFc區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY134位點(diǎn)的探針、上、下游引物可隨機(jī)組合。用于檢測Y染色體AZFc區(qū)域SY254位點(diǎn)的引物探針組合定義為SY254引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其上游引物如SEQ ID N0:75 SEQ IDNO:76中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:77 SEQID NO:85中之一所示，其熒光探針如SEQ ID N0:86 SEQ ID N0:87中之一所示，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標(biāo)記5’端，其熒光標(biāo)記與SY255位點(diǎn)相同，但與AZFa、AZFb區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY254位點(diǎn)的探針、上、下游弓I物可隨機(jī)組合。 用于檢測Y染色體AZFc區(qū)域SY255位點(diǎn)的引物探針組合定義為SY255引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其上游引物如SEQ ID N0:88 SEQ IDN0:90中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:91 SEQID NO:94中之一所示，其熒光探針如SEQ ID N0:95 SEQ ID N0:101中之一所示，熒光探針以FAM、HEX、CY5、R0X之一標(biāo)記5’端，其熒光標(biāo)記與SY254位點(diǎn)相同，但與AZFa、AZFb區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY255位點(diǎn)的探針、上、下游弓I物可隨機(jī)組合。用于檢測男性性別決定基因SRY的引物探針組合定義為SRY引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其上游引物如SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 107中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:108 SEQ IDN0:109中之一所示，其熒光探針如SEQID NO: IlO^SEQ ID NO: 112中之一所示，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標(biāo)記5’端，其熒光標(biāo)記與AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域6對探針各不相同。上述基因SRY的探針、上、下游引物可隨機(jī)組合。上述SY84、SY86引物探針組合用于特異性檢測Y染色體的AZFa區(qū)域是否存在缺失。上述SY127、SY134引物探針組合用于特異性檢測Y染色體的AZFb區(qū)域是否存在缺失。上述SY254、SY255引物探針組合用于特異性檢測Y染色體的AZFc區(qū)域是否存在缺失。上述SRY引物探這組合用于質(zhì)控，檢測PCR過程是否正常。上述所有序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換。本實(shí)施方式用于檢測男性Y染色體微缺失的試劑盒還包括PCR擴(kuò)增所需試劑10*Buffer (含鎂離子的緩沖溶液)、dNTP (含 dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、rTaq 酶。用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒，IO^Buffer中MgCl濃度為I. 5mM,KCl濃度為60mM、Tris 濃度為 12mM。用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒，dNTP濃度為O. 2mM。所有合成引物濃度為300uM，探針濃度為100uM。所述引物之間Tm (melting temperature,寡核苷酸的解鏈溫度)值相差波動(dòng)于
2-4°C，探針之間Tm值相差波動(dòng)于2-4°C，引物探針之間Tm值相差為10°C左右。一種用于檢測Y染色體微缺失的基因檢測方法，包括以下步驟a)從人抗凝血中提取基因組DNA ；b)以步驟a所得人基因組DNA試樣為模板，利用上述的各引物探針組合對Y染色體的AZF區(qū)域及SRY進(jìn)行特異性PCR檢測；
c)設(shè)定PCR反應(yīng)條件，根據(jù)探針熒光標(biāo)記選擇對應(yīng)探針檢測通道的顏色；d)根據(jù)擴(kuò)增曲線顏色及曲線有無判斷對應(yīng)AZF區(qū)域6個(gè)位點(diǎn)否存在缺失。PCR 反應(yīng)條件為94°C 2min ；94°C 5S，52°C 45S,60°C 45S，此過程進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。本實(shí)施方式設(shè)計(jì)了 6組探針對特異性的檢測Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域微缺失，I組男性性別決定基因探針對進(jìn)行質(zhì)控，另6組探針對分屬到兩個(gè)PCR反應(yīng)中，同一條件下進(jìn)行PCR，女性DNA樣本為陰性對照，滅菌水為空白對照以防止檢驗(yàn)體系受污染。實(shí)施例I
—、材料I.儀器實(shí)時(shí)突光定量儀探針、引物設(shè)計(jì)以上述設(shè)計(jì)了 6對探針、弓丨物對特異性的檢測AZF序列，并同時(shí)設(shè)計(jì)I對探針、引物作為質(zhì)控，檢測男性性別決定基因，以檢測PCR檢測過程是否正常進(jìn)行，以正常已育男性DNA樣本作為陽性對照，女性DNA樣本作為陰性對照，滅菌水作為空白對照防止檢驗(yàn)體系被污染。2.使用下述探針引物對檢測AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域位點(diǎn)缺失。SY84 上游引物 5’-CCTATTTGTTTTAAGGTGCCATTCC-3’ (SEQ ID NO: I)SY84 下游引物 5’-GCTTGCCTGAGCATCCTACAG-3’ (SEQ ID N0:9)SY84 探針 5’-VIC-CTCTACCTCCTTCCCCCAGTGCCCA-BHQ-3’ (SEQ ID NO: 15)SY86 上游引物 5’-GGCTTCCCAGAGTTGTTACAAAG-3’ (SEQ ID NO:23)SY86 下游引物 5’-CTCAAGGACTGTGAGAATCAAGGTT-3’ (SEQ ID NO:29)SY86 探針5’-VIC-AATCCCAAAGACTGGGCCCCTTAAACA-BHQ-3’ (SEQ ID NO:34)SY127 上游引物 5’-GGCTCACAAACGAAAAGAAAAAG-3’(SEQ ID NO:42)SY127 下游引物 5，-CTTTTTGTGGGCATGAACACA-3’ (SEQ ID N0:51)SY 127 探針 5，-FAM-TAGCACCCACTGGAATCTACCAAAGCCC-BHQ-3’ (SEQ ID NO:56)SY134 上游引物 5，-GACTCACTATAGGGCGAATTGG-3’(SEQ ID NO:59)SY 134 下游引物 5，-GGTGAGGCAGACAGTTTTGTAG-3’ (SEQ ID N0:64)SY134 探針 5，-FAM-TACGGGCCCCCCCTCGAG-BHQ-3’(SEQ ID NO:69)SY254 上游引物 5’-AAGGCAAAATCGTGCCAAAC-3’(SEQ ID NO:75)SY254 下游引物 5’-CCATTGTTCATGATGTATGTTAAGGTAA-3’ (SEQ ID NO:77)SY254 探針5’-CTGTTTTTGTTGGTGGAATTGATGCTAGGG-BHQ-3’(SEQ ID NO:87)SY255 上游引物 5’-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3’(SEQ ID NO:89)SY255 下游引物 5，-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，(SEQ ID N0:92)SY255 探針 5，-R0X-TAGGTTTCAGTGTTTGGATTCCGCCA-BHQ-3’ (SEQ ID NO:95)SRY 上游引物 5’-TTTTCGGCTTCAGTAAGCATTTT-3’ (SEQ ID NO: 102)SRY下游引物5’-AATCCCAGAATGCGAAACTCA-3’ (SEQ ID NO:108)SRY 探針 5’CY5-CACTGGTATCCCAGCTGCTTGCTGATC-BHQ-3’ (SEQ ID NO: 110)3. PCR 反應(yīng)試劑10*Buffer (含鎂離子)、dNTP (含 dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、rTaq酶。二、方法I.基因組DNA提取購買試劑盒或按常規(guī)分子生物學(xué)方法提取基因組DNA。分別提取I例正常男性基因組DNA、4例非正常男性基因組DNA及I例女性基因組DNA。2.熒光定量PCR檢測PCR反應(yīng)前將試劑放于冰上自然溶解，取PCR管并做好標(biāo)記，分別加入滅菌水、10*Buffer、dNTP、rTaq酶、待檢測DNA樣本，每個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行2個(gè)PCR檢測，即PCR反應(yīng)液A 22. 5 μ 1+待檢測樣本DNA2. 5 μ 1，PCR反應(yīng)液Β22. 5 μ 1+同一待檢測樣本DNA2. 5 μ 1，PCR反應(yīng)體系見表2。每次檢測均設(shè)立陽性對照(正常男性基因組DNA)及陰性對照(女性基 因組DNA )，滅菌水空白對照。表IPCR反應(yīng)體系
反應(yīng)液試劑I人份(μ )
反應(yīng)液 A (總量 22.5μ1) _Tag 酶(5U/ul)__0.1
_滅菌水__10.2
IOxBuffer(含 Mg2+)__3.0
_2.5mM dNTPs__2.0
IOuM SRY 探針__0.3
_ IOuM SRY上游引物0.7權(quán)利要求
1.一種檢測Y染色體AZFa區(qū)域SY84位點(diǎn)缺失的引物探針組合，包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其特征在于所述上游引物如SEQ ID NOiTSEQ ID N0:8中之一所示，所述下游引物如SEQ ID N0:9 SEQ ID NO: 14中之一所示，所述熒光探針如SEQ IDN0:15 SEQ ID N0:22 中之一所示。
2.一種檢測Y染色體AZFa區(qū)域SY86位點(diǎn)缺失的引物探針組合，包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其特征在于所述上游引物如SEQ ID N0:23 SEQ ID N0:28中之一所示，所述下游引物如SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30中之一所示，所述熒光探針如SEQ IDno3Tseq id no:39 中之一所示。
3.一種檢測Y染色體AZFb區(qū)域SY127位點(diǎn)缺失的引物探針組合，包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其特征在于所述上游引物如SEQ ID N0:4(TSEQ ID N0:51中之一所示，所述下游引物如SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 54中之一所示，所述熒光探針如SEQ IDN0:55 SEQ ID N0:58 中之一所示。
4.一種檢測Y染色體AZFb區(qū)域SY134位點(diǎn)缺失的引物探針組合，包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其特征在于所述上游引物如SEQ ID N0:59 SEQ ID N0:61中之一所示，所述下游引物如SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:69中之一所示，所述熒光探針如SEQ IDN0:70 SEQ ID N0:74 中之一所示。
5.一種檢測Y染色體AZFc區(qū)域SY254位點(diǎn)缺失的引物探針組合，包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其特征在于所述上游引物如SEQ ID N0:75 SEQ ID N0:76中之一所示，所述下游引物如SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO:85中之一所示，所述熒光探針如SEQ IDN0:86 SEQ ID N0:87 中之一所示。
6.一種檢測Y染色體AZFc區(qū)域SY255位點(diǎn)缺失的引物探針組合，包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，其特征在于所述上游引物如SEQ ID N0:88 SEQ ID NO:90中之一所示，所述下游引物如SEQ ID N0:91 SEQ ID NO:94中之一所示，所述熒光探針如SEQ IDNO:95 SEQ ID NO: 101 中之一所示。
7.一種檢測Y染色體微缺失的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，包括盒體、PCR反應(yīng)液及至少一個(gè)弓I物探針組合，其特征在于所述引物探針組合選自用于檢測SY84位點(diǎn)的SY84弓丨物探針組合、用于檢測SY86位點(diǎn)的SY86引物探針組合、用于檢測SY127位點(diǎn)的SY127引物探針組合、用于檢測SY134位點(diǎn)的SY134引物探針組合、用于檢測SY254位點(diǎn)的SY254引物探針組合及用于檢測SY255位點(diǎn)的SY255引物探針組合，其中， SY84引物探針組合的上游引物如SEQ ID NOiTSEQ ID NO:8中之一所示，其下游引物如 SEQ ID N0:9 SEQ ID NO: 14 中之一所示，其熒光探針如 SEQ IDN0:15 SEQ ID NO:22 ψ之一所示； SY86引物探針組合的上游引物如SEQ ID Ν0:23 SEQ ID NO:28中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30中之一所示，其熒光探針如SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 39中之一所示； SY127引物探針組合的上游引物如SEQ ID N0:4(TSEQ ID NO: 51中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 54中之一所示，其熒光探針如SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 58中之一所示； SY134引物探針組合的上游引物如SEQ ID N0:59 SEQ ID NO:61中之一所示，其下游引物如 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:69 中之一所示，其熒光探針如 SEQ ID N0:7(TSEQ ID NO: 74中之一所示； SY254引物探針組合的上游引物如SEQ ID N0:75 SEQ ID NO:76中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO:85中之一所示，其熒光探針如SEQ ID NO:86 SEQ ID NO:87中之一所示； SY255引物探針組合的上游引物如SEQ ID N0:88 SEQ ID N0:90中之一所示，其下游引物如 SEQ ID N0:91 SEQ ID NO:94 中之一所示，其熒光探針如 SEQ ID N0:95 SEQ ID NO: 101中之一所示。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測Y染色體微缺失的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，其特征在于，還包括用于檢測男性性別決定基因SRY的SRY引物探針組合，所述SRY引物探針組合的上游引物如SEQ ID N0:102 SEQ ID NO: 107中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:108 SEQ IDNO: 109中之一所示，其熒光探針如SEQID NO: IlO^SEQ ID NO:112中之一所示。
9.如權(quán)利要求7或8所述的檢測Y染色體微缺失的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述引物探針組合由SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探針組合組成，所述引物之間Tm值相差波動(dòng)于2-4°C，所述探針之間Tm值相差波動(dòng)于2_4°C，引物探針之間Tm值相差為10°C左右。
10.一種檢測Y染色體微缺失的方法，其特征在于，包括如下步驟 a)從人抗凝血中提取基因組DNA; b)以所述基因組DNA試樣為模板，利用權(quán)利要求7所述的SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探針組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測； c)根據(jù)探針熒光標(biāo)記選擇對應(yīng)探針檢測通道的顏色； d)根據(jù)擴(kuò)增曲線顏色及曲線有無判斷對應(yīng)Y染色體的AZF區(qū)域是否存在缺失。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測Y染色體微缺失的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及方法，其包括盒體、PCR反應(yīng)液及至少一個(gè)引物探針組合，所述引物探針組合選自用于檢測SY84位點(diǎn)的SY84引物探針組合、用于檢測SY86位點(diǎn)的SY86引物探針組合、用于檢測SY127位點(diǎn)的SY127引物探針組合、用于檢測SY134位點(diǎn)的SY134引物探針組合、用于檢測SY254位點(diǎn)的SY254引物探針組合及用于檢測SY255位點(diǎn)的SY255引物探針組合。該試劑盒和方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合Taqman探針對Y染色體微缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測，實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過PCR擴(kuò)增對每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號進(jìn)行實(shí)時(shí)收集，從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析，該方法操作簡單、快速、檢測通量高且敏感性特異性高，能夠有效減少時(shí)間和成本。
文檔編號C12N15/11GK102876776SQ20121032359
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者駱子義, 鄔宇美 申請人:駱子義, 鄔宇美