專利名稱：：一種定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域的一種定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條及制備方法。
背景技術(shù)：
：CEA是由PhilGold和Samuel0.Freedman于1965年首先在結(jié)腸癌病人的血清中發(fā)現(xiàn)的一種球蛋白，其后陸續(xù)在結(jié)腸癌，胃癌，胰腺癌，肺癌以及乳腺癌病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因其在胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生而在出生后停止，所以稱作癌胚抗原。正常成人體內(nèi)CEA的含量很低，在某些病理狀態(tài)(腫瘤或炎癥)下才會升高，癌胚抗原作為腫瘤標(biāo)志物用于診斷的主要臨床意義如下(l)原發(fā)性結(jié)腸癌患者CEA增高占45-80%。(2)除原發(fā)性結(jié)腸癌以外，腺胰癌、膽管癌、胃癌。食道癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系統(tǒng)的腫瘤陽性率也很高，一般在50-70%。(3)結(jié)腸癌患者手術(shù)切除以后，在l-3周內(nèi)血中CEA可下降到正常水平。如手術(shù)切除不完全，術(shù)后CEA還持續(xù)陽性，說明病人預(yù)后較差或癌腫發(fā)生了轉(zhuǎn)移，或者有復(fù)發(fā)的可能。(4)良性腫瘤、炎癥和退行性疾病，如結(jié)腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎和酒精性肝硬變病人CEA也有部分升高，但遠遠低于惡性腫瘤，一般小于20iig/L。所以測定CEA可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別診斷依據(jù)，正常成年非吸煙者血液CEA的含量為3.4g/L，吸煙者為4.3iig/L。目前的血液中CEA的診斷技術(shù)主要包括放射免疫法(RIA)，酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)、化學(xué)發(fā)光(CLIA)、時間分辨熒光、膠體金免疫層析等方法，但這些方法都有各自的特點及不足放射免疫法結(jié)果比較準(zhǔn)確，線性范圍較寬，但操作繁瑣，耗時長，且放射性標(biāo)記物會對操作者產(chǎn)生危害，并且會產(chǎn)生環(huán)境污染，目前已經(jīng)逐漸被其他方法所替代；ELISA和化學(xué)發(fā)光以及時間分辨熒光法原理類似，只是因為最終的檢測系統(tǒng)有所區(qū)別而在靈敏度方面有差異，目前已經(jīng)實現(xiàn)自動化、大批量、定量檢測，但是自動化檢測目前由國外大廠商所壟斷，儀器設(shè)備昂貴，并且不適合單人份和較小批量檢測用，大大限制了它們在基層醫(yī)院、診所的應(yīng)用。近年來出現(xiàn)了膠體金免疫層析法來檢測CEA，快速，便捷，單人份操作，但是缺點是只能實現(xiàn)半定量，只能指示一個大概范圍，無法實現(xiàn)精確定量，異常標(biāo)本需要使用其他方法復(fù)核檢測，無形中增加了被測試者的就醫(yī)成本，在市場推廣方面有較大難度，很難大面積使用。磁性免疫層析(MgneticImmunoChromatogr即hicTest，MICT)是近年來出現(xiàn)的的一種新一代單人份快速定量檢測技術(shù)。是以超順磁性顆粒(superPMPs)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標(biāo)記物(膠體金，乳膠顆粒等)來進行免疫層析，通過檢測結(jié)合在超順磁性納米微粒上的生化物質(zhì)來提供對生物樣品的定量檢測數(shù)據(jù)。通過檢測測量磁場強度來表達標(biāo)記在樣品區(qū)域的量，采用標(biāo)記的免疫復(fù)合物_磁場強度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而達到定量的目的。該技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相比具有下述優(yōu)勢l)分析靈敏度比各類目測快速診斷法靈敏10-100倍；2)分析速度可在15秒內(nèi)測量到多達6個分析位點的數(shù)據(jù)；3)線形范圍在4個數(shù)量級濃度范圍內(nèi)呈線3性；4)所用磁性檢測儀器采用固相元件，微型化設(shè)計自成一體，獨立運行，體積小，操作簡便；5)超順磁性納米微粒由聚合物包被，不會隨時間而衰變；獨立的快速診斷色譜卡(MARCassette)可直接插入MAR檢測儀，為目前許多快速臨床診斷試劑的整合提供了廣泛的開發(fā)空間；而且還避免了操作過程中人員或儀器可能發(fā)生的交叉污染，提高了分析和過程的安全性。該技術(shù)繼承了傳統(tǒng)免疫層析法(膠體金，乳膠顆粒等)簡便快速，單人份操作的優(yōu)點，又彌補了傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)靈敏度低，只能定性，不能定量的缺點，代表了當(dāng)今即時檢驗(PointofCareTest,P0CT)技術(shù)發(fā)展的方向和潮流，一經(jīng)問世，發(fā)展迅速，目前已經(jīng)成為替代傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)的首選。磁性免疫層析是以磁顆粒標(biāo)記抗體進行免疫反應(yīng)檢測標(biāo)本中的生物活性物質(zhì)，通過檢測磁性強度來提供對生物樣品的定量檢測數(shù)據(jù)，采用標(biāo)記的免疫復(fù)合物-磁場強度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算出待測生物樣品的量。目前常用的標(biāo)記磁顆粒為超順磁顆粒(superPMPs)，沒有外加磁場的情況下不具有任何磁性，只有在外加磁場作用下才會表現(xiàn)出磁性，商品化超順磁顆粒都經(jīng)過表面修飾，大大方便了標(biāo)記過程，標(biāo)記簡便，重復(fù)性好。生物素-親和素系統(tǒng)(BAS)是一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)，將親和素包被固相，將生物素標(biāo)記抗原或抗體，利用生物素親和素之間極高的親和力以及一個親和素結(jié)合四個生物素的特性，可以極大的提高反應(yīng)的靈敏度，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前親和素和生物素都出現(xiàn)了大量衍生物，可以根據(jù)不同的需要選用，標(biāo)記方法也很簡便，大大增加了他們的易用性。將生物素親和素系統(tǒng)引入磁性免疫層析中，在極大地提高了檢測方法的靈敏度的同時，又提供了一種極好的通用技術(shù)平臺，在規(guī)?；a(chǎn)中減少了標(biāo)記步驟，增加了工藝的通用性，減少了可變因素。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的即是將磁性免疫層析技術(shù)和生物素親和素系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用在CEA定量檢測試紙條中，將鏈親和素共價偶聯(lián)于超順磁顆粒上，將生物素化CEA抗體與之混合之后作為檢測流動相，將另一株配對的CEA抗體包被于硝酸纖維素膜上作為捕獲固相，按照常規(guī)免疫層析法的原理進行標(biāo)本的檢測，結(jié)合簡便易行的磁性檢測儀進行檢測，在實現(xiàn)高靈敏度檢測的同時又能大大縮短檢測的窗口期，可以避免前述幾種檢測方法的種種弊端，又綜合了前述幾種方法的優(yōu)勢可以單人份檢測，也可以批量檢測，并且可以即時給出定量結(jié)果，測量儀器簡單可靠，操作簡便，方便實用。為達到上述的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條，該試紙條是在底板上依次相互交錯2mm地粘貼上包被膜、結(jié)合了CEA抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊、然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成的試紙條，包被膜上預(yù)包被有CEA抗體檢測線T和質(zhì)控線C。其中所述的樣品墊是經(jīng)過樣品墊處理液預(yù)處理的纖維素膜，所述的樣品墊處理液是含有1%_5%酪蛋白(Casein)和0.1%_1%的聚乙烯醇(PVA)以及0.01-0.2%吐溫20(Tween-20)的0.02MpH7.0-7.6的磷酸鹽緩沖液(PBS)。上述定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條制備方法包括以下步驟A、抗體的處理選用單克隆抗體技術(shù)制備的商品化高效價抗CEA配對抗體(Hytest公司，cat:4CA30)，對20mM，pH7.0-7.6的PBS4。C透析過夜;B、磁顆粒的制備選用直徑為100-300nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺(EDC)和琥珀酰亞胺(NHS)共價偶聯(lián)的方式將鏈親和素標(biāo)記到磁顆粒上，選用預(yù)活化生物素進行CEA抗體的標(biāo)記，將標(biāo)記好的生物素化抗體以1:2-1:IO的分子比例(摩爾比)與鏈親和素化磁顆?；旌?，確保鏈親和素化磁顆粒過量；C、將制備好的磁顆粒使用定量噴液裝置以25iU/cm-50iil/cm的量噴涂于磁顆粒墊上；D、包被膜的制備使用包被緩沖液分別將抗CEA包被抗體以及生物素化BSA稀釋到0.5-2mg/ml濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0.5_1.Ocm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，晾干后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35度烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆?；E、樣品墊的處理將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35t:烘干8小時；F、試紙條的組裝在透明塑料底板上依次相互交錯2mm地貼上包被膜、磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜得到試紙板，根據(jù)要求寬度切割即得到試紙條。進一步，上述的步驟B包括以下三步1)鏈親和素化磁顆粒的制備使用含有0.1%Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使二者終濃度均為20mM，室溫反應(yīng)1小時，使用含有0.1%Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸鈉緩沖液充分洗滌磁顆粒后，加入鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的分子比例為5:1(摩爾比)，室溫反應(yīng)3小時，加入含有0.5XBSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室溫封閉30分鐘，用上述醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，使用含有1%PVP，1%Casein，O.5%Tween-20，5%蔗糖的50mM(pH8.2-9.0)硼酸保存緩沖液復(fù)溶磁顆粒，4t:保存?zhèn)溆茫?)生物素化CEA抗體的制備將CEA抗體對0.02M，pH7.0-7.6的PBS4。C透析過夜，調(diào)整濃度為2mg/ml，將預(yù)活化生物素使用二甲基亞砜(DMSO)溶解，終濃度為50mM，以25:1的分子比例向抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應(yīng)1小時，對O.02M，pH7.0-7.6的PBS4。C透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆茫?)生物素化抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合，以0.8ii1/mg磁顆粒的量向鏈親和素化磁顆粒溶液中加入生物素化CEA抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以1:5-1:20的比例(體積比)將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用。進一步，上述的步驟C中，磁顆粒的噴涂方法是將制備好的磁顆粒使用定量噴膜裝置以20iU/cm的量均勻噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后加入干燥劑封存?zhèn)溆谩＿M一步，上述的步驟D中，包被膜的制備方法是用包被緩沖液(0.02MpH7.2的磷酸緩沖液)將CEA抗體稀釋為0.5mg/ml，生物素化BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以liU/cm的量將二者以0.8cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液(含有0.5%BSA的0.02MPBS，pH7.0_7.6)中浸泡10分鐘后于25-35。C烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆?。與現(xiàn)有快速檢測試紙條相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)通過對試紙條的改進，首次將磁性免疫層析技術(shù)引入CEA的檢測中，結(jié)合磁性檢測儀，實現(xiàn)了CEA的單人份寬范圍定量檢測，為臨床使用提供了極大便利。2)通過引入生物素親和素系統(tǒng)，使得試紙條的制備過程大大簡化，適合大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明操作簡便，適合大規(guī)模生產(chǎn)，檢測所需的便攜式設(shè)備也已經(jīng)上市，因此能廣泛用于醫(yī)院、血站、防疫站、體檢等大批量使用單位以及一些采血現(xiàn)場、農(nóng)村和基層診所等小批量或單人份使用的單位使用。對于原發(fā)性肝癌的定量診斷有著積極的意義。圖1為本發(fā)明磁性免疫層析法定量檢測血液中癌胚抗原的試紙條結(jié)構(gòu)示意圖為進一步說明本發(fā)明磁性免疫層析法定量檢測血液中癌胚抗原的試紙條及制備方法，特舉以下的實施例進行說明，該實施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。具體實施例方式本發(fā)明所述的定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條如圖1所所示，該試紙條是在底板1)上依次相互交錯2mm地粘貼上包被膜2)、結(jié)合了CEA抗體的磁顆粒墊3)、樣品墊4)、吸水墊5)，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜6)組裝而成的試紙條，包被膜2)上預(yù)包被有CEA抗體檢測線T和質(zhì)控線C。在具體實施例中，所采用CEA配對抗體為單克隆抗體技術(shù)制備的單抗。利用雙抗體夾心檢測CEA抗原的原理檢測標(biāo)本，當(dāng)待測標(biāo)本中含有CEA抗原時，抗原會先和磁顆粒上偶聯(lián)的抗體結(jié)合，隨著層析作用的進行，結(jié)合物向前移動到達CEA抗體包被線T處，抗原會再次和包被抗體結(jié)合形成雙抗體夾心復(fù)合物而聚集在T線處，另外，未結(jié)合生物素化抗體的鏈親和素標(biāo)記磁顆粒會繼續(xù)前行，到達質(zhì)控線C時，生物素化BSA會與鏈親和素結(jié)合從而在C線處同樣出現(xiàn)磁顆粒聚集。整個反應(yīng)在30分鐘內(nèi)進行完全，一般反應(yīng)十五分鐘后即可進行上機讀卡，T線以及C線都會產(chǎn)生相應(yīng)的磁性信號值，磁性免疫層析檢測儀會根據(jù)檢測卡上的二維碼信息將實際測值代入預(yù)設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出確定量的結(jié)果。整個讀卡、識別二維碼、將實測值代入預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出定量值的過程已經(jīng)完全程序化，磁性檢測儀會直接給出定量結(jié)果。本發(fā)明所述的定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條的制備方法見以下實例實施例1定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條及試紙盒的制備方法本實施例的試紙條及試紙盒的制備方法包括以下步驟A、抗體制備選用商品化的的CEA配對抗體(Hytest公司，cat:4CA30)，對20mM，pH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS4。C透析過夜備用。B、包被膜的制備包被緩沖液的配制0.02MpH7.2的磷酸緩沖液(PB)為包被緩沖液，0.22ym微孔濾膜過濾除菌后置4t:保存?zhèn)溆茫行趦芍?。封閉液的配制含0.5%BSA的0.02M，pH7.2(pH7.0-7.6均適用)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.22iim微孔濾膜過濾除菌后置于4t:保存?zhèn)溆?，有效期一周。包被膜的制備用包被緩沖液(0.02MPB，pH7.2(pH7.0-7.6均適用))將CEA抗體稀釋為O.5mg/ml，生物素化BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以1iU/cm的量將二者以0.8cm的間隔均勻噴印于3.5cm寬度硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液(含有0.5%BSA的0.02MPBS，pH7.2(pH7.0_7.6均適用))中浸泡10分鐘后于25-35度烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆?。C、磁顆粒的制備醋酸鈉緩沖液的配制用雙蒸水和醋酸鈉及冰醋酸配制pH值為4.7(pH4.5_5.0均適用)，濃度為50mM的醋酸緩沖液，加入Tween-20至終濃度為0.1%，0.22ym微孔濾膜過濾除菌后4t:保存?zhèn)溆?，有效期兩周。硼酸保存緩沖液的配制用雙蒸水，硼酸和硼砂配制pH為8.5(pH8.2-9.0均適用)，終濃度為50mM的硼酸緩沖液，加入PVP，Casine，Tween-20，蔗糖，終濃度分別為1%，1%，0.5%，5%，0.22iim微孔濾膜過濾除菌后4°C保存?zhèn)溆?，有效期一周。鏈親和素化磁顆粒的制備使用含有0.1%Tween-20的50mM，pH4.7(pH4.5-5.0均適用)醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使二者終濃度均為20mmo1，室溫反應(yīng)l小時，充分洗滌磁顆粒后，加入鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的分子比例為5:l(摩爾比)，室溫反應(yīng)3小時，加入含有0.5%BSA的0.02M，pH7.2(pH7.0_7.6均適用)的PBS室溫封閉30分鐘，使用含有0.1%Tween-20的50mM，pH4.7(pH4.5-5.0均適用)的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，使用含有1%PVP，1%Casein，O.5%Tween-20，5%蔗糖的50mMpH8.5(pH8.2-9.0均適用)硼酸保存緩沖液，復(fù)溶磁顆粒，fC保存?zhèn)溆谩Ｉ锼鼗疌EA抗體的制備方法是將CEA抗體對0.02M，pH7.2(pH7.0_7.6均適用)的PBS4t:透析過夜，調(diào)整濃度為2mg/ml，將預(yù)活化生物素使用匿SO溶解，終濃度為50mM，以25:1的分子比例向抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應(yīng)1小時，對0.02M，pH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS4"透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆?。生物素化抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合，以0.8ii1/mg的量向鏈親和素化磁顆粒溶液中加入生物素化CEA抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以1:5的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用。D、磁顆粒的噴涂與凍干使用BioDot噴膜儀的專用噴頭將處理好的磁顆粒以50y1/cm的量均勻噴涂于0.8cm寬度玻璃纖維墊上，過夜冷凍干燥，加入干燥劑封存?zhèn)溆?，E、樣品墊的處理將1.8cm寬度樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35。C烘干8小時。樣品墊處理液是含有1%-5%Casein和O.1%_1%的PVA以及O.01-0.2%Tween-20的0.02M，pH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS溶液。F、試紙條的組裝及切割下述所有操作都必須在濕度小于20%，溫度20-25t:的房間內(nèi)進行。試紙板的組裝使用BioDotLM5000型組裝儀按照要求將3.5cm包被膜，2.5cm吸水紙，O.8cm磁顆粒墊，1.8cm樣品墊組裝于9.8cm寬度透明塑料底板上，覆蓋上層透明塑料蓋板，組裝成試紙板。試紙條的裁切使用BioDotCM4000型切條機將組裝好的試紙板切成0.5cm寬的成品試紙條。G、試紙卡的組裝將本發(fā)明所述的切割好的單人份試紙條置于塑料底卡上的卡槽內(nèi)，蓋上上蓋，使用壓卡機將上下兩片塑料卡壓緊，確保整個試紙條處于繃緊狀態(tài)。加入干燥劑室溫封存?zhèn)溆?。H、確定該批次的二維碼信息品名CEA定量磁性檢測卡批次試紙卡的組裝日期，格式為年/月/日，XXXX/XX/XX判讀標(biāo)準(zhǔn)的確定取CEA標(biāo)準(zhǔn)抗原原料，以國家標(biāo)準(zhǔn)品為參照標(biāo)準(zhǔn)進行標(biāo)定，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋成500ng/ml，200ng/ml，50ng/ml，15ng/ml，5ng/ml，每個標(biāo)準(zhǔn)點作10個測試，按照統(tǒng)計學(xué)方法確定每個標(biāo)準(zhǔn)點與磁性測量值的關(guān)系并建立方程使之?dāng)M合成線性，此方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可使磁性檢測儀得以確定標(biāo)本測量值。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配方20mmo1PBS，pH7.2(pH7.0-7.6均適用)，0.5%casein，0.01%NaN3。1、二維碼的打印粘貼將上述二維碼信息輸入二維碼打印機內(nèi)并打印，將二維碼粘貼于試紙卡的特定位置，使用二維碼粘貼位置檢測器隨機抽檢2%確保二維碼粘貼無誤。J、成品包裝將貼好二維碼的單人份試紙卡與一包干燥劑密封于鋁箔袋內(nèi)，100人份為一個包裝置于一個包裝盒內(nèi)，一盒一份說明書和1瓶10ml裝層析緩沖液即制成試紙盒，該試紙盒于室溫避光保存，保質(zhì)期為18個月。層析緩沖液配方為1%Tween-20，0.5%TritonX_100，1%NP_40，0.05%NaN3，20mmolPBS，pH7.2(pH7.0-7.6均適用)。實施例2除了鏈親和素化磁顆粒的制備的步驟中鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的比例為1:3，其它步驟同實施例1，實施例3除了鏈親和素化磁顆粒的制備的步驟中鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的比例為1:8，其它步驟同實施例1。實施例4除了生物素化抗原\抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合步驟中充分混勻后使用保存緩沖液以l:4的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用，其它步驟同實施例1。實施例5除了生物素化抗原\抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合步驟中充分混勻后使用保存緩沖液以l:15的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用，其它步驟同實施例1。實施例6本發(fā)明的檢測卡的使用方法1、加樣從包裝盒中取出單人份的檢測卡，撕開鋁箔帶包裝，將試紙卡置于平整桌面上，用微量移液器取50ia樣本血清加入卡上的加樣孔內(nèi)，再加入50iil層析緩沖液，等待反應(yīng)進行15分鐘。2、測量及結(jié)果輸出將檢測卡插入磁性免疫層析檢測儀的插卡口，運行儀器，儀器會自行讀取卡的二維碼信息，進行測量并即時打印測量結(jié)果，陰陽性結(jié)果會在打印結(jié)果中顯示。實施例7本發(fā)明的檢測卡檢測臨床標(biāo)本的結(jié)果分析表臨床檢測結(jié)果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求一種定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條，其特征在于該試紙條是在底板上依次相互交錯2mm地粘貼包被膜、結(jié)合了CEA抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊、然后在上層覆蓋透明塑料密封膜而組裝成的試紙條，包被膜上預(yù)包被有CEA抗體的檢測線T和質(zhì)控線C。2.根據(jù)權(quán)利要求1的定量檢測血液中癌胚抗原的試紙條制備方法，其特征在于包括以下步驟抗體的制備選用單克隆抗體技術(shù)制備的高效價CEA配對抗體，使用親和層析技術(shù)純化；磁顆粒的制備1)鏈親和素化磁顆粒的制備使用含有0.1%Tween-20的50mmol，pH4.5-5.0的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入碳二亞胺和琥珀酰亞胺使二者終濃度均為20mmol，室溫反應(yīng)1小時，充分洗滌磁顆粒后加入鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的分子比為5:1(摩爾比)，室溫反應(yīng)3小時，加入含有0.5XBSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室溫封閉30分鐘，洗滌磁顆粒，使用含有1%PVP，1%Casein，O.5%Tween-20，5%蔗糖的50mmo1，pH8.2_9.0的硼酸保存緩沖液，復(fù)溶磁顆粒，fC保存?zhèn)溆茫?)生物素化CEA抗體的制備將CEA抗體對0.02MpH7.0_7.6的PBS4"透析過夜，調(diào)整濃度為2mg/ml，將預(yù)活化生物素使用二甲基亞砜溶解，終濃度為50mmol，以25:1的分子比例向抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應(yīng)1小時，對0.02M，pH7.0-7.6的PBS4"透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆茫?)生物素化抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合，以O(shè).8iU/mg磁顆粒的量向鏈親和素化磁顆粒溶液中加入生物素化CEA抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以1:5-1:20的比例(體積比)將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用；包被膜的制備使用0.02mM，pH7.0_7.6的PBS，分別將抗CEA包被抗體以及生物素化牛血清白蛋白分別稀釋到0.5mg/ml和2mg/ml的濃度，使用定量噴膜裝置以1P1/cm的量將二者以0.8cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35t:烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆?；樣品墊的處理將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35t:烘干8小時；試紙條的組裝在透明塑料底板上依次相互交錯2mm貼上包被膜，磁顆粒墊，樣品墊，吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜得到試紙板，根據(jù)要求寬度切割即得到試紙條。全文摘要本發(fā)明涉及一種定量檢測血液中癌胚抗原的磁性免疫層析試紙條及其制備方法。該試紙條是在底板上依次相互交錯2mm粘貼上包被膜、結(jié)合了CEA抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成的試紙條，包被膜上預(yù)包被有CEA抗體檢測線和質(zhì)控線，本發(fā)明將磁性免疫層析技術(shù)和生物素親和素系統(tǒng)引入到血液中CEA的定量檢測中，大大提高了檢測靈敏度，并且可以給出準(zhǔn)確的定量結(jié)果，降低了操作人員的勞動強度，使臨床醫(yī)生可以對病人進行快速診斷。文檔編號G01N33/532GK101762700SQ20091008764公開日2010年6月30日申請日期2009年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者姚洪濤,應(yīng)希堂,張坤,李強,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司