專利名稱：：測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯及其所含葡萄糖醛酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥品含量的測(cè)定方法，具體涉及高效液相色譜法測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯含量，以及測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯中葡萄糖醛酸含量的方法。
背景技術(shù)：
：葡萄糖醛酸內(nèi)酯，簡(jiǎn)稱葡醛內(nèi)酯。英文名Glucurolactone、Glucurone、Guronsan?；瘜W(xué)名稱為0-(+)-呋喃葡萄糖醛酸-^-內(nèi)酯。葡醛內(nèi)酯水溶液不穩(wěn)定，室溫時(shí)水溶液中有40%的內(nèi)酯和60%的葡萄糖醛酸達(dá)到互變平衡，提高溫度以及在酸性介質(zhì)存在下加速達(dá)到這個(gè)平衡。因此往往需要測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯中葡萄糖醛酸含量。目前高效液相色譜法用于測(cè)定葡醛內(nèi)酯中的葡萄糖醛酸主要是采用氫型陽(yáng)離子交換柱，以低濃度的硫酸為流動(dòng)相的方法進(jìn)行測(cè)定。由于色譜柱具有較強(qiáng)的酸性，葡醛內(nèi)酯在色譜柱內(nèi)不斷水解生成葡萄糖醛酸，導(dǎo)致兩峰之間出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)，1%以下的葡萄糖醛酸均被此平臺(tái)掩蓋，觀察不到色譜峰，所以現(xiàn)有的方法不適用于葡醛內(nèi)酯中葡萄糖醛酸的測(cè)定。測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯中葡萄糖醛酸有兩個(gè)難點(diǎn)一是當(dāng)葡醛內(nèi)酯中葡萄糖醛酸含量很低時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)的方法較難測(cè)到這些微量的葡萄糖醛酸；二是葡醛內(nèi)酯在水中易于水解，因此需要有快速測(cè)定的方法。所以，建立一種靈敏而快速的方法檢測(cè)葡醛內(nèi)酯中的葡萄糖醛酸的方法，很有必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯含量或測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯中葡萄糖醛酸含量的方法，該方法應(yīng)靈敏而快速。本發(fā)明采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)發(fā)明人試驗(yàn)，選用烷基磺酸鹽溶液、乙腈和水組成的流動(dòng)相，達(dá)到了本發(fā)明的目的。所述流動(dòng)相的體積比是烷基磺酸鹽溶液乙腈水=58:o3:i5。所述烷基磺酸鹽中的烷基可以選用多種不同碳數(shù)的，優(yōu)選的烷基磺酸鹽為辛烷磺酸鈉或庚烷磺酸鈉。所述烷基磺酸鹽溶液優(yōu)選是水溶液，濃度是0.01%1.0%(w/v)。上述流動(dòng)相pH為2.53.5。本方法開創(chuàng)性地采用烷基磺酸鹽作為陰離子對(duì)試劑與葡萄糖醛酸的羧基形成離子對(duì)以達(dá)到分離的目的。而不是一般理論認(rèn)為的應(yīng)該用烷基銨鹽陽(yáng)離子對(duì)試劑。本方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其它測(cè)定條件可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常熟悉的高效液相色譜條件進(jìn)行，如本發(fā)明的方法進(jìn)行測(cè)定可使用以下條件色譜柱可選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫為2040。C;所述的烷基磺酸鹽溶液可用磷酸、鹽酸或硝酸等稀酸調(diào)節(jié)pH為2.53.5。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1、靈敏度高。能檢測(cè)到葡醛內(nèi)酯中低達(dá)0.01%的葡萄糖醛酸。2、快速。5分鐘之內(nèi)即可完成一次檢測(cè)。很大程度地避免了葡醛內(nèi)酯在水溶液中的水解。3、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本測(cè)定方法可得到良好的線性，精密度及準(zhǔn)確度。圖1是流動(dòng)相空白高效液相色譜圖；圖2是葡萄糖對(duì)照品高效液相色譜圖；圖3是葡萄糖醛酸鈉對(duì)照品高效液相色譜圖；圖4是葡醛內(nèi)酯對(duì)照品高效液相色譜圖；圖5是酸降解實(shí)驗(yàn)高效液相色譜圖；圖6是堿降解實(shí)驗(yàn)高效液相色譜圖；圖7是氧化降解實(shí)驗(yàn)高效液相色譜圖。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明的方法，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此實(shí)施例。除特別說明，實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)條件如下高效液相色譜儀日本島津公司SHIMADZULC-10AT;檢測(cè)波長(zhǎng)200nm;流動(dòng)相0.1%辛烷磺酸鈉(用稀磷酸調(diào)pH3.0±0.1);流速0.8ml/min;柱溫40。C;進(jìn)樣量20iU;色譜柱Synergi4umHydro-RP250X4.6mm菲羅門公司辛烷磺酸鈉分析純，成都科龍化學(xué)試劑有限公司葡萄糖醛酸鈉對(duì)照品純度99.0%，西格瑪有限公司葡醛內(nèi)酯對(duì)照品純度99.8%，重慶華邦制藥股份有限公司實(shí)施例1葡醛內(nèi)酯中葡萄糖醛酸測(cè)定1、溶液的配制流動(dòng)相的配制稱取辛烷磺酸鈉1.0g，溶解于1000ml水中，搖勻，用稀磷酸調(diào)節(jié)其pH在2.93.1之間。對(duì)照溶液——取葡萄糖醛酸鈉對(duì)照品約45mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；取lml至50ml容量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。樣品溶液——取葡醛內(nèi)酯樣品約370mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶4解并稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。系統(tǒng)適應(yīng)性溶液——取葡萄糖醛酸鈉對(duì)照品約45mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；取2ml至50ml容量瓶中，另取葡醛內(nèi)酯對(duì)照品約370mg，精密稱定后置該容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。2、測(cè)定方法分別將對(duì)照溶液和樣品溶液各取20ii1注入高效液相色譜儀，記錄圖譜時(shí)間為葡醛內(nèi)酯峰保留時(shí)間的3.5倍，按下式計(jì)算樣品中葡醛內(nèi)酯的各相關(guān)物質(zhì)含量葡萄糖醛酸含量％=x尸sx4x0.829x100o/o4X附％式中ms——葡萄糖醛酸對(duì)照品質(zhì)量，gAs——對(duì)照品溶液中葡萄糖醛酸峰響應(yīng)值的平均值Ps——葡萄糖醛酸對(duì)照品含量mx——葡萄糖醛酸供試品質(zhì)量，gAx——供試品溶液中的葡萄糖醛酸峰響應(yīng)值0.829是葡萄糖醛酸與一水葡萄糖醛酸鈉之間的換算率(即每lg—水葡萄糖醛酸鈉相當(dāng)于O.829g葡萄糖醛酸)。3、系統(tǒng)適應(yīng)性操作步驟取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液20進(jìn)樣，計(jì)算葡醛內(nèi)酯峰與葡萄糖醛酸峰的分離度，對(duì)稱因子及理論塔板數(shù)。表1系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>結(jié)論葡醛內(nèi)酯峰與葡萄糖醛酸峰的分離度大于2.O，不干擾測(cè)定。對(duì)稱因子小于1.5，理論板數(shù)大于2000，峰面積不斷增大，表明本品溶液不穩(wěn)定，葡醛內(nèi)酯不斷轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟侨┧?。測(cè)定時(shí)應(yīng)臨用新配。4、方法專屬性操作步驟葡萄糖溶液——取葡萄糖約45mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；取lml至50ml容量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。葡萄糖醛酸溶液——取葡萄糖醛酸鈉對(duì)照品約45mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；取lml至50ml容量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。葡醛內(nèi)酯溶液——取葡醛內(nèi)酯樣品約370mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。堿降解溶液——取葡醛內(nèi)酯樣品約370mg，加0.1M氫氧化鈉溶液放置1分鐘，用鹽酸中和后，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。酸降解溶液——取葡醛內(nèi)酯樣品約370mg，加0.1M鹽酸溶液放置1小時(shí)，用氫氧化鈉中和后，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。氧化降解溶液——取葡醛內(nèi)酯樣品約370mg，加1%雙氧水溶液放置25分鐘，用鹽酸中和后，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。配制后立即使用。取流動(dòng)相和上述各樣品溶液分別進(jìn)樣，結(jié)果表明該流動(dòng)相對(duì)樣品測(cè)試無干擾，并可確認(rèn)所有降解物質(zhì)對(duì)葡醛內(nèi)酯和葡糖醛酸的測(cè)試無干擾。測(cè)試結(jié)果見表2、表3。表2專屬性測(cè)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3方法專屬性測(cè)試結(jié)果_降解<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)論主要原料及各中間體在本系統(tǒng)中不干擾葡萄糖醛酸的測(cè)定，最近雜質(zhì)峰與葡萄糖醛酸的分離度大于1.5，專屬性強(qiáng)。5、檢測(cè)限測(cè)試操作步驟配制一定濃度的葡萄糖醛酸對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，連續(xù)3次。計(jì)算主峰峰高與噪聲的比值(信噪比)，信噪比(S/N)為3:1的樣品進(jìn)樣濃度即為檢測(cè)限濃度。測(cè)試結(jié)果見表4表4葡萄糖醛酸檢測(cè)限數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)論葡萄糖醛酸檢測(cè)限為7.8X10—8g/ml，樣品中葡萄糖醛酸L0D為10.4iig/g。6、定量限測(cè)試操作步驟配制一定濃度的葡萄糖醛酸對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，連續(xù)3次。計(jì)算主峰峰高與噪聲的比值(信噪比)，信噪比(S/N)為10:1的樣品進(jìn)樣濃度即為定量限濃度。表5葡萄糖醛酸定量限數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)論葡萄糖醛酸定量限為2.34X10—^/ml，樣品中葡萄糖醛酸L0Q為31.2iig/g。7、驗(yàn)證范圍內(nèi)的方法精密度操作步驟選擇一批含有葡萄糖醛酸雜質(zhì)的葡醛內(nèi)酯樣品，于相對(duì)于樣品溶液配制濃度的80%、100%和120%三個(gè)濃度點(diǎn)配制樣品溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)各配制三份，按相關(guān)物質(zhì)測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)試。計(jì)算每個(gè)樣品溶液中各相關(guān)物質(zhì)的含量。計(jì)算樣品溶液中各相關(guān)物質(zhì)的含量及相應(yīng)的RSD。表6方法精密度測(cè)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>8、驗(yàn)證范圍的確認(rèn)及方法準(zhǔn)確度操作步驟按精密度測(cè)定80%、100%和120%濃度點(diǎn)的葡萄糖醛酸含量計(jì)算回收率及回收率的RSD。表7準(zhǔn)確度測(cè)試數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)論回收率均在95.0%105.0X之間，回收率RSD<2.0%，滿足方法準(zhǔn)確度要求。9、驗(yàn)證范圍內(nèi)的線性測(cè)定操作步驟取葡萄糖醛酸對(duì)照品，在驗(yàn)證范圍(定量限雜質(zhì)限度的120%)分別配制7個(gè)濃度進(jìn)行測(cè)試。以濃度對(duì)應(yīng)相應(yīng)的峰面積做回歸曲線，計(jì)算回歸方程及相應(yīng)的線性回歸系數(shù)。表8葡萄糖醛酸線性測(cè)試結(jié)果(LOQ限度的120%)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)論線性良好，符合要求。方法耐用性10、溶液穩(wěn)定性取葡萄糖醛酸鈉對(duì)照品約45.4mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；取lml至50ml容量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。按如下時(shí)間點(diǎn)測(cè)試。取葡醛內(nèi)酯樣品約375mg，精密稱定后置50ml容量瓶中，流動(dòng)向溶解并稀釋至刻度，按如下分面積法測(cè)試并計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)葡萄糖醛酸的變化，在可接受范圍確定葡醛內(nèi)酯溶液的穩(wěn)定性時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)0(初始點(diǎn))，0.5小時(shí)表9溶液穩(wěn)定性測(cè)試表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果葡萄糖醛酸對(duì)照溶液在O.5h內(nèi)穩(wěn)定，樣品溶液在O.5h內(nèi)不穩(wěn)定，從O.02%變到O.06%，葡醛內(nèi)酯不斷向葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化，測(cè)定時(shí)樣品應(yīng)臨用新配。11、對(duì)照溶液進(jìn)樣重復(fù)性取葡萄糖醛酸鈉對(duì)照品約45.4mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；取lml至50ml容量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。重復(fù)進(jìn)樣5次。表10進(jìn)樣重復(fù)性測(cè)試表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)論系統(tǒng)進(jìn)樣重復(fù)性良好。實(shí)施例2葡醛內(nèi)酯含量測(cè)定1、流動(dòng)相的配制稱取辛烷磺酸鈉1.0g，溶解于1000ml水中，搖勻，用稀磷酸調(diào)節(jié)其pH在2.93.1之間。供試品溶液的配制取葡醛內(nèi)酯樣品約50mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(臨用新配)。對(duì)照品溶液的配制取葡醛內(nèi)酯對(duì)照品(在6(TC，真空度1.5kPa2.5kPa條件下干燥至3小時(shí))約50mg，精密稱定，置于50ml容量瓶中，加流動(dòng)相超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(臨用新配)。2、測(cè)定方法分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液取20iU按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算樣品中葡醛內(nèi)酯的含量。含量A:wsx尸6,x4xlOO%」sxWyx(1—^(9Z))式中ms——對(duì)照品質(zhì)量，g;As——對(duì)照品溶液中主峰響應(yīng)值的平均值；Ps——對(duì)照品含量；mx-供試品質(zhì)量，g;Ax——供試品溶液中的主峰響應(yīng)值；LOD——供試品的干燥失重。3、系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)操作步驟取對(duì)照品溶液20Pi進(jìn)樣，連續(xù)6次，計(jì)算葡醛內(nèi)酯峰峰面積的RSD，對(duì)稱因子及理論塔板數(shù)。表11系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)論葡醛內(nèi)酯峰峰面積的RSD小于2.0%，理論板數(shù)大于3000，拖尾因子在0.81.5的范圍內(nèi)，滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求。4、方法專屬性操作步驟取樣品稀釋劑溶液(流動(dòng)相)進(jìn)樣，證明該稀釋劑對(duì)樣品測(cè)試無干擾。單獨(dú)配置適量濃度的主要合成原料、中間體及它們的混合溶液，以確認(rèn)各主要合成原料和中間體及各種雜質(zhì)與葡醛內(nèi)酯主峰的分離度達(dá)到1.5以上。降解試驗(yàn)詳見實(shí)例1的方法驗(yàn)證。5、葡醛內(nèi)酯定量限操作步驟配制濃度為7.5mg/ml的葡醛內(nèi)酯對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋至一定濃度進(jìn)樣，連續(xù)2次。計(jì)算主峰峰高與噪聲的比值，信噪比(S/N)為10:l的樣品進(jìn)樣濃度即為定量限濃度。測(cè)試結(jié)果表12葡醛內(nèi)酯定量限數(shù)據(jù)次數(shù)濃度(g/ml)保留時(shí)間(min)主峰峰高噪音S/N11.5X10—63.6711971910.621.5X10—63.6711861810.3結(jié)論信噪比(S/N)滿足10:1的要求，定量限濃度為1.5X10—6g/ml。6、溶液穩(wěn)定性對(duì)照品溶液取葡醛內(nèi)酯對(duì)照品約375mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。分別于0、2、4、6小時(shí)取樣測(cè)定，考察溶液穩(wěn)定性。表13溶液穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)(h)0246平均RSD葡醛內(nèi)酯面積8237578298608313388335588294710.40%結(jié)論對(duì)照品溶液在6小時(shí)內(nèi)均穩(wěn)定。7、驗(yàn)證范圍內(nèi)的方法精密度操作步驟配制相對(duì)測(cè)定方法規(guī)定進(jìn)樣濃度的80%、100%和120%三個(gè)濃度點(diǎn)供試品溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)各配制三份，按含量測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)試。計(jì)算每個(gè)供試品溶液中葡醛內(nèi)酯的含量。計(jì)算供試品溶液中葡醛內(nèi)酯含量及含量的RSD。測(cè)試結(jié)果見表14。表14方法精密度測(cè)試結(jié)果12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)論本測(cè)定方法精密度良好，符合要求。權(quán)利要求高效液相色譜法測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯含量或測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯中葡萄糖醛酸含量的方法，其特征為所用流動(dòng)相中各組分的體積比是烷基磺酸鹽水溶液∶乙腈∶水＝5～8∶0～3∶1～5；所述烷基磺酸鹽水溶液的濃度是0.01％～1.0％(W/V)。2.權(quán)利要求i所述的方法，所述烷基磺酸鹽是辛烷磺酸鈉或庚烷磺酸鈉。3.權(quán)利要求1所述的方法，所述流動(dòng)相的pH為2.53.5。4.權(quán)利要求3所述的方法，所述的烷基磺酸鹽溶液用稀酸調(diào)節(jié)pH至2.53.5。5.權(quán)利要求1所述的方法，高效液相色譜法所用色譜柱的填充劑是十八烷基硅烷鍵合硅膠。6.權(quán)利要求1所述的方法，所述色譜柱的柱溫為20°C40°C。全文摘要本發(fā)明涉及高效液相色譜法測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯含量，以及測(cè)定葡萄糖醛酸內(nèi)酯中葡萄糖醛酸含量的方法。所用流動(dòng)相由烷基磺酸鹽溶液、乙腈和水組成。本方法開創(chuàng)性地采用烷基磺酸鹽作為陰離子對(duì)試劑與葡萄糖醛酸的羧基形成離子對(duì)以達(dá)到分離的目的。本方法能檢測(cè)到葡醛內(nèi)酯中低達(dá)0.01％的葡萄糖醛酸，且5分鐘之內(nèi)即可完成一次檢測(cè)，避免了葡醛內(nèi)酯在水溶液中的水解。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本測(cè)定方法可得到良好的線性，精密度及準(zhǔn)確度。文檔編號(hào)G01N30/02GK101776648SQ20091007664公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2009年1月12日優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日發(fā)明者霍立申請(qǐng)人:重慶華邦制藥股份有限公司