專利名稱：一種檢測結核桿菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學、免疫學和蛋白檢測技術領域。更具體地，涉及一種檢測結 核桿菌的方法。
背景技術：
肺結核病是由結核桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病，是目前單一傳染性細 菌致人死亡的主要因素。近年來，隨著艾滋病的流行、多種惡性腫瘤患者的增多以及多重抗 藥性菌株的出現(xiàn)，更是增加了結核菌感染癥防治上的困難。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界有結核病 菌感染者20億(占總人口 1/3)，每秒鐘感染一人，全球結核病菌每年新感染800萬人，如 果不立即采取防擴散措施，結核病將在今后10年內奪去3000多萬人的生命。我國全國結 核病感染者3. 3億，結核病人600萬，每年因結核病死亡的病人高達25萬，為各類傳染病死 亡總和的兩倍，因此我國已將結核病由丙類傳染病升為乙類傳染病，列入嚴格管理范疇。據(jù) WHO統(tǒng)計，全世界每年有5千萬至一億人感染結核，約三百萬人死于結核病，其中80 %以上 在發(fā)展中國家。因此，如何快速盡早地診斷并治療成為控制結核病擴散和傳播的關鍵環(huán)節(jié)。目前，肺結核的診斷除了一般胸部X光檢查外，主要是靠取痰液檢查，包括抗酸桿 菌痰涂片染色鏡檢與結核桿菌培養(yǎng)，結核桿菌的細菌學檢查是確診肺結核的重要依據(jù)?？?酸桿菌涂片檢查敏感性低，特異性差，并且無法確定細菌死活。結核桿菌培養(yǎng)通常是將待檢 標本接種至改良的羅氏培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20 60天，待細菌生長后再依據(jù)生物學特征及生 化反應多項指標綜合判斷。由于結核菌的菌體結構復雜，富脂質，疏水性，使得肺結核桿菌 生長速度緩慢，每隔十二 二十四小時才分裂一次。所以，利用培養(yǎng)方法來偵測結核菌的存 在，往往需要三 八周的時間才可以得到結果，耗費時間長，而且操作繁瑣，無法滿足快速 確診肺結核的需要，經(jīng)常延誤治療的時機且敏感性不高(陽性率不過40%左右)。最近幾年，噬菌體快速擴增法利用恥垢分枝桿菌的快速生長特性以及D29噬菌體 的相對專一性，進行結核桿菌的快速檢測。該方法的核心內容是a.用樣品處理液室溫處理待檢樣品30分鐘，離心去上清；b.用增菌液37°C增菌24小時；c.加入D29分枝桿菌噬菌體37°C溫育1小時，感染結核桿菌菌體；d.用中止液滅活未侵入結核桿菌的噬菌體，室溫作用10分鐘以中止感染；e.取步驟d所得的待測液，滴于恥垢分枝桿菌預包被的瓊脂菌落培養(yǎng)皿上，37°C 溫育15-20小時；f.根據(jù)菌落培養(yǎng)皿上噬菌斑的形成情況判定結果。該方法的試劑盒特異性強、結果明晰，無需特殊儀器，可用于各種待檢樣品中活的 結核桿菌菌體快速鑒定；但是整個測試至少需要48小時才能完成，而且操作較復雜，靈敏 度也不夠高。近年來，隨著分子生物學技術、抗原純化技術及單克隆抗體技術的日益成熟，一些 快速的檢驗方法相繼問世，如聚合酶鏈反應法(polymerase chain reaction，PCR)、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、斑點免疫金滲濾法(dot immuno-gold filtration assay, DIGFA)及免疫層析法(immunochormatiographic test, ICT)。多聚酶鏈反應是由一對特定的寡核苷酸引物介導待檢標本中結核桿菌DNA特定 序列片段的體外酶促擴增技術，通過三個不同溫度、數(shù)十個變性、復性、延伸的循環(huán)，特定靶 序列可被擴增數(shù)百萬倍，而顯示其快速、高靈敏度、可定量分析以及理論上的高特異性等特 點。不過該方法操作比較復雜，對操作設備和人員的技術要求較高，實驗室易產生污染。酶聯(lián)免疫吸附法、斑點免疫金滲濾法和免疫層析法均是基于血清免疫學發(fā)展起來 的檢測方法。這些方法均是以結核桿菌的特征性抗原為捕獲物，以標記的抗人免疫球蛋白 或葡萄球菌蛋白A (Staphylococci Protein A，SPA)等為指示系統(tǒng)，檢測患者體內存在的抗 結核分枝桿菌的循環(huán)抗體，間接地對病人的患病情況進行診斷。酶標法需要專業(yè)的儀器及 高操作技能的專業(yè)人員。免疫滲濾法及免疫層析法均不需要任何儀器，檢測所需時間也大 為縮短，操作簡便，結果直觀。但上述方法共同的問題是靈敏度以及特異性很難達到要求， 并且不能區(qū)分曾經(jīng)感染已經(jīng)治愈的病例；有的產品甚至不能區(qū)分注射過卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)的病例。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種檢測結核桿菌的方法，該方法可以快速識別 結核桿菌噬菌體，進而反映結核桿菌的數(shù)量，因為簡化了檢測步驟，所以大大地縮短了檢測 時間。為解決上述技術問題，本發(fā)明一種檢測結核桿菌的方法，包括以下步驟1)將結核桿菌溫育培養(yǎng)以擴增結核桿菌；2)在結核桿菌中加入噬菌體，溫育后裂解細菌；3)用抗噬菌體的抗體標金，制備噬菌體膠體金法免疫層析測試筆，用該測試筆檢 測噬菌體。步驟3)中所述測試筆中膠體金標記的抗體為識別結核桿菌噬菌體頭部蛋白或尾 部蛋白的抗體，測試線上固定的抗體是識別結核桿菌噬菌體頭部蛋白或尾部蛋白的抗體。 即有以下四種方式A.測試筆中膠體金標記的抗體為識別結核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗 體，測試線上固定的抗體也是識別結核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體。B.測試筆中膠體金標 記的抗體為識別結核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體，測試線上固定的抗體也是識別結核桿菌 噬菌體尾部蛋白的抗體。C.測試筆中膠體金標記的抗體為識別結核桿菌噬菌體頭部蛋白的 抗體，測試線上固定的抗體是識別結核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體。D.測試筆中膠體金標 記的抗體為識別結核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體，測試線上固定的抗體是識別結核桿菌噬 菌體頭部蛋白的抗體。所述識別結核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體特異結合結核桿菌噬菌體頭部蛋白，該 結核桿菌噬菌體頭部蛋白片段具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO. 2所示的
氨基酸序列。所述識別結核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體特異結合結核桿菌噬菌體尾部蛋白，該 結核桿菌噬菌體尾部蛋白片段具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。步驟1)具體分兩步a)用4%的NaOH溶液室溫處理待檢樣品20分鐘，離心去上清；b)加入增菌液，37°C培養(yǎng)18 24小時，離心去上清，再加入增菌液重懸結核桿菌。所述增菌液由米氏7H9培養(yǎng)基5-7重量份、氯化鈣1_2重量份、氨芐青霉素25_50 重量份、兩性霉素B 25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油 酸1-2重量份和過氧化氫酶0. 1-0. 2重量份，均溶于1000重量份的純水中制備而成。和現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果用本發(fā)明的方法可以快速識別結核 桿菌噬菌體，進而反映結核桿菌的數(shù)量。因為既不需要殺滅游離的噬菌體，也不需要再加入 恥垢桿菌溫育或在瓊脂板上過夜培養(yǎng)形成噬菌斑，所以不僅簡化了檢測步驟，而且縮短了 檢測時間。
具體實施例方式以下通過實施例和對比試驗對本發(fā)明作進一步的闡述實施例1，識別結核桿菌噬菌體D29頭部蛋白的抗體的制備1，結核桿菌噬菌體D29頭部蛋白片段的合成結核桿菌噬菌體D29頭部蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，結核桿菌 噬菌體D29頭部蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。通過分子克隆的方法將含SEQ ID NO 1序列的核酸插入到pcDNA3載體(購自 Invitrogen公司)，測序鑒定后選正確克隆擴增，提取DNA后轉化大腸桿菌，表達并純化D29 頭部蛋白的片段。2，識別D29頭部蛋白片段的抗體的制備a)動物免疫將前面純化的D29頭部蛋白片段與等體積的福氏佐劑混合制成油包水乳劑，每只 小鼠腹腔注射0. 5ml上述混合液(含頭部蛋白片段100 u g)，共注射6只BALB/c小鼠。兩 周后同劑量抗原加福氏不完全佐劑加強免疫，7天后以間接ELISA檢測小鼠血清頭部蛋白 多抗的效價，效價高者頭靜脈再沖擊免疫1次，每只20 y g，3天后進行細胞融合。b)雜交瘤細胞株的建立將免疫小鼠的脾細胞懸液和SP2/0骨髓瘤細胞以5 1的比例在聚乙二醇作用下 按常規(guī)法融合，用HAT完全1640培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。以D29頭部蛋白(1 u g/ml)作為抗原包 被酶標96孔板，間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，所測的0D490 (490nm處的吸收) 比陰性對照高10倍的克隆，進行亞克隆化，并進行擴增凍存。經(jīng)過3次有限稀釋克隆化，將 分泌特異性抗體的雜交瘤細胞系大量擴增并凍存，長期傳代培養(yǎng)后，以相同的方法再次克 隆化鑒定。c)單克隆抗體腹水的制備BALB/c小鼠腹腔內分別注射0. 5ml不完全福氏佐劑，5 7天后每只小鼠腹腔內 注射0. 5ml含2X 106個雜交瘤細胞的溶液，7 10天后視小鼠腹部膨脹程度收集腹水。d)單克隆抗體的純化將識別D29頭部蛋白的單克隆抗體腹水先后用50% (質量體積比)飽和硫酸銨鹽析和Protein G親和層析的方法進行純化，得到的單克隆抗體用蛋白電泳法鑒定純度。實施例2，識別結核桿菌噬菌體D29尾部蛋白的抗體的制備1，結核桿菌噬菌體D29尾部蛋白片段的合成結核桿菌噬菌體D29尾部蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，結核桿菌 噬菌體D29尾部蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。通過分子克隆的方法將含SEQ ID NO 1序列的核酸插入到pcDNA3載體(購自 Invitrogen公司)，測序鑒定后選正確克隆擴增，提取DNA后轉化大腸桿菌，表達并純化D29 尾部蛋白片段。2，識別D29尾部蛋白片段的抗體的制備a)動物免疫將前面純化的D29尾部蛋白片段與等體積的福氏佐劑混合制成油包水乳劑，每只 小鼠腹腔注射0.5ml上述混合液(含尾部蛋白片段100 yg)，共注射6只BALB/c小鼠。兩 周后同劑量抗原加福氏不完全佐劑加強免疫，7天后以間接ELISA檢測小鼠血清尾部蛋白 多抗的效價，效價高者尾靜脈再沖擊免疫1次，每只20 y g，3天后進行細胞融合。b)雜交瘤細胞株的建立將免疫小鼠的脾細胞懸液和SP2/0骨髓瘤細胞以5 1的比例在聚乙二醇作用下 按常規(guī)法融合，用HAT完全1640培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。以D29尾部蛋白(1 u g/ml)作為抗原包 被酶標96孔板，間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，所測的0D490 (490nm處的吸收) 比陰性對照高10倍的克隆，進行亞克隆化，并進行擴增凍存。經(jīng)過3次有限稀釋克隆化，將 分泌特異性抗體的雜交瘤細胞系大量擴增并凍存，長期傳代培養(yǎng)后，以相同的方法再次克 隆化鑒定。c)單克隆抗體腹水的制備BALB/c小鼠腹腔內分別注射0. 5ml不完全福氏佐劑，5 7天后每只小鼠腹腔內 注射0. 5ml含2X 106個雜交瘤細胞的溶液，7 10天后視小鼠腹部膨脹程度收集腹水。d)單克隆抗體的純化將識別D29尾部蛋白的單克隆抗體腹水先后用50 % (質量體積比)飽和硫酸銨鹽 析和Protein G親和層析的方法進行純化，得到的單克隆抗體用蛋白電泳法鑒定純度。實施例3，D29噬菌體在恥垢桿菌中的擴增和檢測1，膠體金法免疫層析測試筆(金探針用膠體金標記抗D29頭部蛋白的抗體(實施 例1制得)獲得，測試線抗體也用該抗體；或者金探針用膠體金標記抗D29尾部蛋白的抗 體(實施例2制得)獲得，測試線抗體也用該抗體)用申請?zhí)枮?00810043709. 4，申請日為 2008年8月14日，發(fā)明名稱為“一種快速檢測結核桿菌的方法和試劑盒”的中國發(fā)明專利 申請說明書中所記載的方法制備。2，在加樣孔中分別加入0. lml濃度為109個/ml、108個/ml、107個/ml、106個/ml、 105個/ml和104個/ml的D29噬菌體溶液，發(fā)現(xiàn)測試筆能檢測的最低噬菌體濃度為106個 /ml。3，分別取濃度為 107 個 /ml、106 個 /ml、105 個 /ml、104 個 /ml、103 個 /ml、102 個 / ml的恥垢桿菌1. 0ml，離心去上清，加入增菌液(將米氏7H9培養(yǎng)基7g、CaCl22g、氨芐青霉 素50g、兩性霉素B 50g、BSA 200g、葡萄糖15g、油酸2g和過氧化氫酶0. 2g溶于1L水中制備)5ml，37°C培養(yǎng)25小時，離心去上清，再加入0. 9ml增菌液重懸恥垢桿菌；4，在上述各樣品中加入濃度為106個/ml的噬菌體0. 1ml，37°C培養(yǎng)4小時，讓噬 菌體感染恥垢桿菌至裂解；5，將上述溶液取0. lml用測試筆檢測，發(fā)現(xiàn)當初始恥垢桿菌數(shù)少于100個時，無法 檢測到噬菌體，說明該方法最少只能檢測到100個恥垢桿菌。實施例4，D29噬菌體在結核桿菌中的擴增及檢測1，用4 %的NaOH溶液(樣品液NaOH液=1 4)室溫處理待檢樣品20分鐘，離 心去上清；2，加入增菌液(采用實施例3使用的增菌液)5ml，37°C培養(yǎng)25小時，離心去上清， 再加入0. 9ml增菌液重懸結核桿菌；3，在上述樣品中加入濃度為106個/ml的D29噬菌體溶液0. 1ml，37°C溫育4小時， 讓噬菌體感染結核桿菌至裂解；4，將培養(yǎng)后的溶液取0. lml用測試筆檢測，如能檢測出噬菌體說明結核桿菌數(shù)多 于100個。序列表<110>上海英伯肯醫(yī)學生物技術有限公司<120> 一種檢測結核桿菌的方法<130>NP-09-13392<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>153<212>DNA<213>人工序列<400>1aagaagtgga cccacaccct tctggacgac atcaccgagc cgatcctgaa cggcgcgaag 60gaccagaacg gtcgcccgct gttcatcgag tcgacctacg gtgaggccgc gagcccgttc 120cgttcgggcc ggatcgtcgc ccgtccgacc ate153<210>2<211>51<212>PRT<213>人工序列<400>2KKWTHTLLDD ITEPILNGAK DQNGRPLFIE STYGEAASPF RSGRIVARPT I51<210>3<211>183<212>DNA<213>人工序列<400>3
gaagcaggcaccgctgcaca tacgccggccgaactgaaga ccatcgacctgtccgacccg60
tcgacctggactggagccac cggctggtcgagcgtcggcc acaccagccgaggcacgctc120
cccgagttcggcttcgaggg cggcgattccgaggtcaagg gctcctggca gaagaagaag180
ctc183
<210>4
<211>61
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
EAGTAAHTPA ELKTIDLSDP STWTGATGWSSVGHTSRGTL PEFGFEGGDSEVKGSWQKKK60
L6權利要求
一種檢測結核桿菌的方法，包括以下步驟1)將結核桿菌溫育培養(yǎng)以擴增結核桿菌；2)在結核桿菌中加入噬菌體，溫育后裂解細菌；3)用抗噬菌體的抗體標金，制備噬菌體膠體金法免疫層析測試筆，用該測試筆檢測噬菌體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述測試筆中膠體金標記的抗體 為識別結核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體，測試線上固定的抗體是識別結核桿菌噬菌體頭部 蛋白的抗體。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述測試筆中膠體金標記的抗體 為識別結核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體，測試線上固定的抗體是識別結核桿菌噬菌體尾部 蛋白的抗體。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述測試筆中膠體金標記的抗體 為識別結核桿菌噬菌體頭部蛋白的抗體，測試線上固定的抗體是識別結核桿菌噬菌體尾部 蛋白的抗體。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述測試筆中膠體金標記的抗體 為識別結核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體，測試線上固定的抗體是識別結核桿菌噬菌體頭部 蛋白的抗體。
6.如權利要求2、4和5中任一項所述的方法，其特征在于，所述識別結核桿菌噬菌體 頭部蛋白的抗體特異結合結核桿菌噬菌體頭部蛋白，該結核桿菌噬菌體頭部蛋白片段具有 SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列和SEQID NO. 2所示的氨基酸序列。
7 如權利要求3-5任一項所述的方法，其特征在于，所述識別結核桿菌噬菌體尾部蛋 白的抗體特異結合結核桿菌噬菌體尾部蛋白，該結核桿菌噬菌體尾部蛋白片段具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)具體分兩步a)用4%的NaOH溶液室溫處理待檢樣品20分鐘，離心去上清；b)加入增菌液，37°C培養(yǎng)25小時，離心去上清，再加入增菌液重懸結核桿菌。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述增菌液由米氏7H9培養(yǎng)基5-7重量份、 氯化鈣1-2重量份、氨芐青霉素25-50重量份、兩性霉素B 25-50重量份、牛血清白蛋白 100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和過氧化氫酶0. 1-0. 2重量份，均溶 于1000重量份的純水中制備而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測結核桿菌的方法，包括以下步驟1)將結核桿菌溫育培養(yǎng)以擴增結核桿菌；2)在結核桿菌中加入噬菌體，溫育后裂解細菌；3)用抗噬菌體的抗體標金，制備噬菌體膠體金法免疫層析測試筆，用該測試筆檢測噬菌體。用本發(fā)明的方法可以快速識別結核桿菌噬菌體，進而反映結核桿菌的數(shù)量。因為簡化了檢測步驟，所以大大地縮短了檢測時間。
文檔編號G01N33/569GK101995464SQ20091005777
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月20日 優(yōu)先權日2009年8月20日
發(fā)明者楊揮, 胡志能 申請人:上海英伯肯醫(yī)學生物技術有限公司