專利名稱：：一種野葛藤提取物hplc指紋圖譜的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，屬于中藥材的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：葛根作為臨床常用中藥，用量很大，但每年大量采挖，造成水土流失、植被破壞等嚴(yán)重的環(huán)保問題，有必要尋找新的藥用資源作為替代品。野葛藤為豆科植物野葛Pueraria/obata(Willdenow)ohwi的地上干燥藤莖，與常用中藥葛根同源。在對野葛藤藥用資源的開發(fā)研究中發(fā)現(xiàn)，野葛藤中也含有大量與葛根相同的異黃酮成分，有可以替代葛根入藥的可能性。但野葛藤藥材因品種、產(chǎn)地的不同，其有效成分的含量存在一定的差異，因此用于臨床的質(zhì)量穩(wěn)定性也難以保證。目前，還沒有建立一種能較好的控制其質(zhì)量的方法。中藥指紋圖譜是指采用一定的分析手段得到的某種中藥材或中藥制劑中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜圖或光譜圖。以指紋圖譜作為中藥(天然藥物)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法，已成為目前國際共識，美國食品藥品管理局(FDA)允許草藥保健品申報(bào)資料中提供色譜指紋圖譜；世界衛(wèi)生組織(WHO)在1996年草藥評價(jià)指導(dǎo)原則中也規(guī)定，如果草藥的活性成分不明確，可以提供色譜指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致；歐共體在草藥質(zhì)量指南中亦稱，單靠測定某種有效成分考查質(zhì)量的穩(wěn)定性是不夠的，因?yàn)椴菟幖捌渲苿┦且哉w為活性物質(zhì)。因此，建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，是現(xiàn)階段控制中藥內(nèi)在質(zhì)量的有效手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，為確保野葛藤提取物的質(zhì)量，控制和評價(jià)其質(zhì)量穩(wěn)定性提供依據(jù)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的所述的野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)供試品溶液的制備稱取野葛藤藥材，每50g加入65%~75%(V/V)的乙醇300~350mL，回流提取3次，每次l2h，合并提取液，回收乙醇，濃縮至比重1.12后離心，取上清液上大孔樹脂柱，依次用2倍柱體積的純化水、5倍柱體積的70。/。(V/V)乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，噴霧干燥，干燥成細(xì)粉；取上述細(xì)粉約5mg，精密稱定，置25ml容量瓶中，加95。/。(V/V)的乙醇10ml溶解，加重蒸水定容至刻度，用微孔濾膜濾過，所得續(xù)濾液即為供試品溶液；(2)高效液相色譜分析色譜條件色譜柱DiamonsilTMd8色譜柱，250mmX4.6mm，5pm;檢測波長250nm，流動相流速1.0ml/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為lOpl;流動相A為乙腈，流動相B0.5。/。(V/V)的乙酸水溶液，采用梯度洗脫，洗脫程序如下其中下述比例為體積比Omin時(shí)，流動相A:流動相B45:85;40min時(shí)，流動相A:流動相B-40:60;60min時(shí)，流動相A:流動相B-50:50;(3)精確吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，按上述條件操作，得到野葛藤提取物的HPLC指紋圖譜。該指紋圖譜所具有的共有特征峰為(4)、(7)、(12)、(16)四個(gè)峰，其保留時(shí)間分別為7.9min、12.8min、19.7min、31.2min，經(jīng)分析確定這四個(gè)峰依次為葛根素、大豆苷、染料木苷和大豆苷元的特征峰。進(jìn)一步的，本發(fā)明方法中得到的指紋圖譜的共有特征峰還包括(l)、(2)、(3)、(5)、(6)、(8)、(9)、(10)、(11)、(13)、(14)、(15)、(17)十三個(gè)峰，其保留時(shí)間分別為5.2min、6.1min、6.9min、8.9min、10.7min、14.1min、14.9min、16.7min、18.1min、20.9min、524.3min、27.7min、32.5min。按照本發(fā)明所述的方法，在供試品溶液的制備時(shí)，優(yōu)選每50g野葛藤樣品加入70%的乙醇300mL，進(jìn)行回流提取，每次提取1.5h。所述的大孔樹脂柱優(yōu)選為HPD100或HPD600型。為保證野葛藤藥材的質(zhì)量穩(wěn)定性，確定野葛藤藥材的定期采集時(shí)間為每年l-4和9-12月。本發(fā)明選取不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間的藥材20多批，按本發(fā)明的方法進(jìn)行高效液相分析，通過對不同批次圖譜的比較，確定了其共有的特征峰。本發(fā)明的有益效果是通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，明確了野葛藤藥材的采集時(shí)間、提取方法，并對野葛藤醇提物的純化工藝和HPLC色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇，最終通過高效液相色譜法確定了野葛藤提取物指紋圖譜的總體特征；該方法精確，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，操作簡便，容易掌握，所得指紋圖譜中各共有特征峰分離良好，易于辨認(rèn)，能較嚴(yán)格地評價(jià)和控制野葛藤提取物的內(nèi)在質(zhì)量。圖1為按本發(fā)明方法獲得的野葛藤提取物的HPLC指紋圖譜。圖2為按實(shí)施例1方法獲得的混合對照品和野葛藤提取物的指紋圖譜。其中，1~17為野葛藤提取物的HPLC指紋圖譜中的共有特征峰。AF為不同批次的野葛藤提取物的HPLC指紋圖譜。G為混合對照品的圖譜，峰l:葛根素；峰2:大豆苷；峰3:染料木苷；峰4:大豆苷元。具體實(shí)施方式實(shí)施例11儀器Waters高效液相色譜儀Empower色譜工作站，Waters600泵，Waters2996檢測器；AE-241型分析天平上海梅特勒-托利多儀器有限公司。試劑95%乙醇(分析純)天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠20050314;甲醇(色譜純)天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心20060427;冰醋酸(優(yōu)級醇)天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心20051015。對照品葛根素(中國藥品生物制品檢定所，編號110752-200209);大豆苷(中國藥品生物制品檢定所，編號111738-200501)，染料木苷(中國藥品生物制品檢定所，編號111709-200501)，大豆苷元(中國藥品生物制品檢定所，編號1502-200101)，染料木素(中國藥品生物制品檢定所，編號111704-200501)。2試藥野葛藤藥材共6批，編號16號。l號山東新泰，采集時(shí)間2004.02;2號河南西峽，采集時(shí)間2004.11;3號濟(jì)南柳埠，采集時(shí)間2006.11;4號濟(jì)南西營釆集時(shí)間2006.11;5號山東煙臺，采集時(shí)間2006.11;6號濟(jì)南彩石，采集時(shí)間2006.11。將上述采集到的藥材切成薄片曬干。取野葛藤切片，每50g加入70X(V/V)的乙醇加熱回流提取，提取3次，每次1.5h，合并提取液，回收乙醇濃縮至適量，離心，取上清液加于已處理好的HPD100型大孔吸附樹脂柱上，然后依次用2BV的純化水和5BV的70X(V/V)的乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，回收乙醇后，噴霧干燥，進(jìn)口溫度12(TC，出口溫度65。C，即得野葛藤醇提物粉末。3方法與結(jié)果3.1供試溶液制備3丄1對照品溶液制備精密稱取對照品葛根素1.20mg，大豆苷1.30mg，染料木苷0.57mg，大豆苷元0.97mg，染料木素0.5mg，置同一容量瓶中，加95%乙醇溶解至10ml，搖勻，用微孔濾膜(孔徑微0.45pm)濾過，濾液作為對照品混合溶液。3丄2供試品溶液的制備:取1-6號野葛藤提取物粉末各約5mg，分別精密稱定，置25ml容量瓶中，加95%(V/V)乙醇溶解至刻度，用微孔濾膜(孔徑微0.45pm)濾過，濾液作為供試品溶液。3.2HPLC色譜條件色譜柱DiamonsilTMC18色譜柱(250mmX4.6mm，5pm);檢測波長250nm;流動相流速l.Oml/min;柱溫為室溫；進(jìn)樣量為lOpl;流動相為乙腈-0.5%乙酸水溶液按不同體積進(jìn)行混合的二元梯度洗脫，梯度洗脫程序見表l。精確吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，按上述條件操作，得到對照品和各批次野葛藤提取物的HPLC指紋圖譜，見圖l、圖2。與對照品的指紋圖譜比較可見，在此色譜條件下，供試品中已知成分的各色譜峰能得以較好地分離；對比6批次的圖譜，其共有峰的相對保留時(shí)間符合程度較好，經(jīng)專用統(tǒng)計(jì)軟件分析統(tǒng)計(jì)表明RSD<5%、p>0.05，不僅提示葛藤提取物作為藥用新資源具有十分好的前景，也從另一角度提示臨床應(yīng)用藥材應(yīng)在固定產(chǎn)地的前提下才能確保療效的一致性。表1野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的流動相組成時(shí)間(min)A%(乙腈)B%(0.5%乙酸)01585404060605050表2各批次野葛藤提取物HPLC指紋圖譜中共有峰的保留時(shí)間一覽表保留時(shí)間(min)均值RSD%批號1246峰15.1475,1405.165.1025.2115.2735.1751.30426細(xì)6.0765.7876,0346.2006.2686.0752.73036,9296.9106.6276.8727.0867.1426.9282.62147，7.8847.6927.8428.0828.1277.9232.0248,8648.8488.6568.8189.0379.0908.8861.771610,62610.60910.41610.58410.89410.94010.6781.874號712.70412.70012.54012.68012.97012.97912.7621.373814.06014.06313.91614.07814.34614.32414.1311.193914.83714.81314.67114.79615.10015.10214.8871.1811016.69516.66416.51516.61916.91316.91816.7210.9731118.03217.9卯17.88717.98818.24018.25018.0650.8181219.66319.59919.52419.60919.86119.87419.6880.7401320.89020.83420,81220.90221.13821.15920.9560.7311424.26124.24424.23124.36524.48924.48424.3460.4888<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2除供試品溶液的制備中，每50g野葛藤藥材加入65。/。(V/V)的乙醇350mL，回流提取3次，每次lh外，其余操作同實(shí)施例l。實(shí)施例3除供試品溶液的制備中，每50g野葛藤藥材加入75。/。(V/V)的乙醇300mL，回流提取3次，每次2h外，其余操作同實(shí)施例l。權(quán)利要求1.一種野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)供試品溶液的制備稱取野葛藤藥材，每50g加入65％～75％(V/V)的乙醇300～350mL，回流提取3次，每次1～2h，合并提取液，回收乙醇，濃縮至比重1.12后離心，取上清液上大孔樹脂柱，依次用2倍柱體積的純化水、5倍柱體積的70％(V/V)乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，噴霧干燥，干燥成細(xì)粉；取上述細(xì)粉約5mg，精密稱定，置25ml容量瓶中，加95％(V/V)的乙醇10ml溶解，加重蒸水定容至刻度，用微孔濾膜濾過，所得續(xù)濾液即為供試品溶液；(2)高效液相色譜分析色譜條件DiamonsilTMC18色譜柱，250mm×4.6mm，5μm；檢測波長250nm，流動相流速1.0ml/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μl；流動相A為乙腈，流動相B0.5％(V/V)的乙酸水溶液，采用梯度洗脫，洗脫程序如下其中下述比例為體積比0min時(shí)，流動相A流動相B＝15∶85；40min時(shí)，流動相A流動相B＝40∶60；60min時(shí)，流動相A流動相B＝50∶50；(3)精確吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，按上述條件操作，得到野葛藤提取物的HPLC指紋圖譜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于得到的野葛藤提取物的HPLC指紋圖譜所具有的共有特征峰為葛根素(4)、大豆苷(7)、染料木苷(12)、大豆苷元(16)四個(gè)峰，其保留時(shí)間分別為7.9min、12.8min、19.7min、31.2min。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于得到的野葛藤提取物的HPLC指紋圖譜中的共有特征峰還包括(l)、(2)、(3)、(5)、(6)、(8)、(9)、(10)、(11)、(13)、(14)、(15)、(17)十三個(gè)峰，其保留時(shí)間分別為5.2min、6.1min、6.9min、8.9min、10.7min、14.1min、14.9min、16.7min、18.1min、20.9min、24.3min、27.7min、32.5min。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于:在步驟(l)中，每50g野葛藤樣品加入70%的乙醇300mL，進(jìn)行回流提取，每次提取1.5h。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述的大孔樹脂柱為HPD100或HPD600型。全文摘要本發(fā)明涉及一種野葛藤提取物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，主要包括以下步驟取野葛藤藥材，用乙醇回流提取得醇提物粉末，用95％的乙醇溶解，定容，濾過，得供試品溶液；然后進(jìn)行高效液相色譜分析，Diamonsil^TMC₁₈色譜柱，檢測波長250nm，流動相為乙腈-0.5％乙酸水溶液；得到野葛藤提取物HPLC指紋圖譜。本發(fā)明的方法精確，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，操作簡便，容易掌握，所得指紋圖譜中各共有特征峰分離良好，易于辨認(rèn)，能較嚴(yán)格地評價(jià)和控制野葛藤提取物的內(nèi)在質(zhì)量。文檔編號G01N30/00GK101518565SQ20091002021公開日2009年9月2日申請日期2009年3月26日優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日發(fā)明者于希昌,劉田云,劉逢芹,李貴海申請人:山東省中醫(yī)藥研究院