專利名稱：冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及中藥冬蟲夏草有效成分含量的測
定方法，特別涉及一種利用固相萃取結(jié)合HPLC測定冬蟲夏草中多球殼菌
素含量的方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草(Cor辦ce戸w'朋w^)是一種名貴中藥，在真菌分類學(xué)中， 冬蟲夏草隸屬于子囊菌綱(Ascomycetes)，肉座菌目(Hypocreales),麥角 菌科(Clavicipitaceae)，蟲草屬(Cordyceps sp.)。蟲草的種類在世界范圍 內(nèi)數(shù)以百計(jì)，我國作為藥用的蟲草主要有冬蟲夏草、蛹蟲草(Cb^vc印s m///to^)和蟬花(Cora^ce戸等，尤以冬蟲夏草最為著名。冬蟲 夏草具有益精髓、補(bǔ)虛損、保肺、益腎等功效，主要用于虛勞咳嗽、咯血 盜汗、陽痿遺精、腰膝酸軟等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明冬蟲夏草具有治療慢 性支氣管炎、治療慢性腎炎、鎮(zhèn)靜催眠、雄激素樣等作用，還具有抗癌活 性以及免疫調(diào)節(jié)等作用。
,多球殼菌素是存在于冬蟲夏草中的一種有效成分。藥理研究表明，多 球殼菌素具備多種藥理作用，如多球殼菌素具有顯著的雙向免疫調(diào)節(jié)作用，特別是具有獨(dú)特的免疫抑制作用，能阻斷白介素-2受體以下的信號(hào)傳
導(dǎo)途徑，抑制絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性，從而特異性抑制T細(xì)胞的增殖；
多球殼菌素對同種細(xì)胞障礙性T細(xì)胞的誘導(dǎo)均有很強(qiáng)的抑制活性，在這些 方面比環(huán)孢菌素A強(qiáng)10 100倍；在同種混合淋巴球混合反應(yīng)方面，多 球殼菌素也比臨床廣泛應(yīng)用的環(huán)孢菌素A顯示更強(qiáng)的活性。
除了從蟬花發(fā)酵濾液及菌絲體中分離得到多球殼菌素外，F(xiàn)ujita等從 無孢菌(^Mece//a他n'〃z'a)、多球菌(AfyWococcw附a/6o附y(tǒng)ces)及木霉多孢 菌(7Wc^(iermapo/;^on^)等微生物中分離得到多球殼菌素。我們在冬 蟲夏草及其無性型中國被毛孢(s/wera/s)菌絲體中發(fā)現(xiàn)含有多球 殼菌素?；诙嗲驓ぞ氐乃幚韮r(jià)值及冬蟲夏草廣泛的臨床應(yīng)用，建立簡 便易行的冬蟲夏草中多球殼菌素的HPLC測定方法對于合理評價(jià)冬蟲夏 草的價(jià)值，有效利用冬蟲夏草資源，控制人工冬蟲夏草藥材質(zhì)量，以及開 發(fā)多球殼菌素均具有重要意義。
目前國內(nèi)外尚未見定量分析多球殼菌素方法的文獻(xiàn)報(bào)道，也未見分析 冬蟲夏草或中國被毛孢菌絲體中多球殼菌素含量的報(bào)道。多球殼菌素經(jīng)紫 外吸收光譜測定，為末端吸收，隨著波長變長噪音變小，但靈敏度下降， 響應(yīng)值變低，因而檢測波長需選擇在紫外末端；冬蟲夏草中多球殼菌素含 量較低，化學(xué)成分復(fù)雜，含有大量糖、肽、氨基酸等物質(zhì)，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重； 冬蟲夏草的溶劑提取物色澤深、粘度大。這些因素均顯著影響冬蟲夏草中 多球殼菌素含量的測定，冬蟲夏草溶劑提取物需經(jīng)分離純化方可用于 HPLC分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種簡便、靈敏、重現(xiàn)性好的固相萃取結(jié)合高效液相色 譜定量測定冬蟲夏草中多球殼菌素的方法。采用的技術(shù)方案如下 一種冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法，包括以下步驟
(1) 對照品溶液的制備
精密稱取多球殼菌素對照品，加甲醇制成0.001 1.0 mg/mL的多球 殼菌素對照品溶液備用；
(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取多球殼菌素對照品溶液適量，分別精密吸取1、 10、 20、 40、 50|iiL 注入高效液相色譜儀；采用色譜柱C18色譜柱，流動(dòng)相乙腈與水體積 比20 80: 80 20，流速0.6 1.2 mL/min，柱溫20 65 。C，檢測波長 190 215nm;測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)
(3) 供試品溶液的制備
提取取冬蟲夏草樣品，經(jīng)粉碎，通過20 200目的分樣篩，然后精 密稱取0.1 5g置入容器中，加10 250mL溶劑提取，隨后移出上清液， 同法提取1 3次，得總提取液；其中所述冬蟲夏草樣品的提取溶劑為甲 醇、乙醇、水的一種或它們的混合溶劑；所述提取方法采用超聲提取法、 加熱回流提取法、浸泡提取法的一種；
過固相萃取柱定量移取總提取液在常壓或減壓下?lián)]干后用濃度小于50%的甲醇溶液或水1 10 mL溶解，離心，取上清液作上樣液；將上樣 液加到十八垸基固相萃取柱上，待上樣液通過十八烷基固相萃取柱后，第 一次用濃度小于50%的甲醇溶液或水沖洗，沖洗液棄之；隨后第二次用 60% 100%的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；其中所述十八烷基固相萃取柱 上樣前先用甲醇活化和蒸餾水平衡；
供試品定容收集含有多球殼菌素的洗脫液在常壓或減壓下?lián)]干，向
揮干后的殘留物加入甲醇溶解，甲醇溶解液離心，取上清液即得供試品溶
液；或甲醇溶解液用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液得供試品溶液； (4)采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定
取供試品溶液，進(jìn)樣量為1 60pL，在步驟(2)的條件下進(jìn)行HPLC 測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法確定多球殼菌素的含量。
本發(fā)明所述冬蟲夏草是指野生冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草及冬蟲夏 草無性型中國被毛孢發(fā)酵菌絲體。
其中步驟(2)所述各種條件的優(yōu)化參數(shù)是乙腈與水體積比是65: 35，流速是1.0mL/min，柱溫是30°C，檢測波長是203 nm。
其中步驟(3)所述冬蟲夏草樣品的提取溶劑最好是甲醇。
其中步驟(3)移出上清液可采用過濾法、離心法。
步驟(3)所述冬蟲夏草樣品的提取方法最好采用超聲提取法，超聲提 取時(shí)間每次為20 120min，每個(gè)樣品提取1 3次。
其中步驟(3)中上柱處理后第二次洗脫按每1 g藥材取4 mL 80%甲醇進(jìn)行洗脫。
在進(jìn)行固相萃取時(shí)，對流出曲線進(jìn)行了考察。對上樣液，每0.5mL流 出液收集一份，將每份溶液各進(jìn)樣10 piL，記錄高效液相色譜圖，結(jié)果顯 示流出液中不含多球殼菌素，而流出液中含大量其它物質(zhì)；對于一支含500 mg樹脂的常規(guī)反向固相萃取柱，取3 g冬蟲夏草或其無性型中國被毛孢 菌絲體樣品的上樣液，通過高效液相色譜跟蹤，直至上樣結(jié)束流出液中也 不含多球殼菌素。上樣后，用濃度小于50%的甲醇溶液或水沖洗固相萃取 柱，每0.5mL沖洗液收集一份，將每份溶液各進(jìn)樣10pL，記錄色譜圖， 結(jié)果顯示多球殼菌素不被洗脫下來，而大量的其他極性雜質(zhì)被洗脫下來； 隨后用60% 100%的甲醇溶液洗脫，每0.5 mL收集一份，將每份溶液各 進(jìn)樣10 uL，記錄高效液相色譜圖，結(jié)果顯示多球殼菌素可被洗脫下來； 對于1 g藥材的上樣液，80%甲醇溶液3 mL可基本洗脫完固相萃取柱吸 附的多球殼菌素，3.5ml流出液中多球殼菌素的濃度趨零，為了確保含量 測定的準(zhǔn)確性，對于1 g藥材，故取4 mL 80%甲醇溶液作為洗脫液。對 于冬蟲夏草或中國被毛孢菌絲體的不同藥材量、藥材中多球殼菌素含量差 異較大者及不同甲醇濃度洗脫，通過上述方法可優(yōu)化流出操作過程。
采用質(zhì)譜法進(jìn)行定性分析
選用質(zhì)譜儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABIQ-TRAP，質(zhì)譜條件電噴 霧離子源，負(fù)離子掃描，去簇電壓9V,碰撞能量35eV，離子源溫度350 °C，離子源電壓5kV。收集冬蟲夏草供試品溶液與多球殼菌素對照品溶液在高效液相色譜圖中出
峰時(shí)間一致的餾分約200 nL，取2 pL注入質(zhì)譜儀進(jìn)行掃描，掃描范圍 m/z : 100 800，獲得樣品的總離子流圖(見圖3);從圖3可見，在ESI 負(fù)離子全掃描方式下，主要生成[M-H]_的準(zhǔn)分子離子峰，得其m/z (M-H〉為400.3，與多球殼菌素的理論值及Sasaki等報(bào)道的多球殼菌素質(zhì)譜 結(jié)果一致，因而可確定冬蟲夏草供試品溶液(圖2)與多球殼菌素對照品 (圖l)在高效液相色譜圖出峰時(shí)間一致的色譜峰化學(xué)成分是多球殼菌素。 采用質(zhì)譜儀軟件系統(tǒng)提供的萃取離子功能，選擇m/z 400，得其二級(jí) 質(zhì)譜圖(見圖4)，從圖4可觀察到m/z400.3準(zhǔn)分子離子峰，及m/z 86.2、 104.1、 294.8和333.9等碎片峰。根據(jù)碎片峰m/z推測了準(zhǔn)分子離子m/z 400.3的合理裂解方式(見圖4)。因而可進(jìn)一步確定冬蟲夏草供試品與 多球殼菌素對照品在高效液相色譜圖中出峰時(shí)間一致的色譜峰的化學(xué)成分 是多球殼菌素。
本發(fā)明液相色譜儀進(jìn)樣分析前對提取的樣品進(jìn)行處理，通過反相固相 萃取柱除去強(qiáng)極性的糖、肽、氨基酸等雜質(zhì)，從而減少對測定結(jié)果的干擾。 該法的有益效果是測定效果穩(wěn)定，重現(xiàn)性、精密度良好，測量結(jié)果準(zhǔn)確。


圖1多球殼菌素對照品的HPLC色譜圖 圖2供試品的HPLC色譜圖 圖3供試品餾分的總離子流圖 圖4多球殼菌素的二級(jí)質(zhì)譜圖具體實(shí)施例
下面將通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對 本發(fā)明作限定，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)特征所作的等同替換， 或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
(1) 實(shí)驗(yàn)儀器
色譜儀:Agilent 1100型高效液相色譜儀(G1379A脫氣機(jī)、G1311A四 元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測器， Chemstations工作站)；AE240電子分析天平(瑞士梅特勒一托利多集團(tuán))； 超聲儀器KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
(2) 試藥
多球殼菌素對照品純度大于98.0%，購于Sigma公司；甲醇和乙腈色 譜純，購于Dikma公司；水為重蒸餾水，其他試劑為分析純。
中國被毛孢菌絲體的預(yù)處理通過液體發(fā)酵法制備冬蟲夏草菌發(fā)酵液， 過濾，并用水淋洗2 3次獲得濕菌絲體，置于50 °C烘箱烘干至恒重， 置干燥器備用。
(3) 色譜條件 色譜柱C18色譜柱；
流動(dòng)相乙腈-水(20 80: 80 20)，優(yōu)選乙腈-水(65: 35); 、流速0.6 1.2 mL/min，優(yōu)選1.0mL/min; 柱溫20 65°C，優(yōu)選30 °C;檢測器選用普通紫外檢測器或二級(jí)管陣列檢測器； 檢測波長190 215nm，優(yōu)選203 205 nm，進(jìn)一步優(yōu)選203 nm; 進(jìn)樣體積1 50mL，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)進(jìn)樣量10pL。 (4)系統(tǒng)適用性
多球殼菌素色譜峰的理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2000，多球殼菌素色譜峰與 其他化學(xué)成分色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。 實(shí)施例1 野生冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法
(1) 對照品溶液的制備
精密稱取多球殼菌素對照品，加甲醇制成0.15 mg/mL的多球殼菌素 對照品溶液；
(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取多球殼菌素對照品溶液適量，分別精密吸取1、 10、 20、 40、 50
注入高效液相色譜儀，采用色譜柱Inertsil ODS-3色譜柱(GL Sciences Inc., 4.6mmx250mm， 5 pm);流動(dòng)相乙腈與水體積比為65: 35;流 速1.0mL/min;柱溫30°C，檢測波長203證；測定峰面積，以進(jìn)樣量為 橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為 Y = 74.47X.4.38, r = 0.9992，線性范圍為0.15 7.54
(3) 供試品溶液的制備
精密稱定過60目篩的野生冬蟲夏草粉末lg，置50mL具塞錐形瓶 中，加入甲醇10mL，超聲提取40min，過濾，同法提取3次，合并濾液；濾液在60 °C真空下?lián)]干，殘?jiān)?0%甲醇溶液3 mL溶解，離心10 min (4,000 r/min);將上清液加到經(jīng)過10 mL甲醇活化、5 mL蒸餾水平 衡處理好的Bondelut固相萃取柱(C18， 500 mg， 3 mL，美國瓦里安公司) 上，待其通過后，第一次用40%的甲醇溶液3 mL沖洗，沖洗液棄之， 隨后第二次用80%的甲醇溶液4 mL洗脫，收集洗脫液；在常壓下水浴 加熱至80 °C揮干洗脫液，殘?jiān)芗尤爰状糽mL，溶解，離心10min (4,000 r/min)，取上清液即得供試品溶液； (4)采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定 取供試品溶液進(jìn)樣量10 pL在步驟(2)的條件下進(jìn)行HPLC測定， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法確定多球殼菌素的含量，測得野生冬蟲夏草多 球殼菌素含量為0.065 mg/g。
實(shí)施例2 中國被毛孢菌絲體中多球殼菌素含量的測定方法
供試品溶液制備時(shí)各種技術(shù)參數(shù)做了以下調(diào)整，其余步驟與實(shí)施例l 相同。供試品溶液的制備如下
中國被毛孢菌絲體粉末(過60目篩)約lg，精密稱定，置100mL 具塞錐形瓶中，加入乙醇25mL，超聲提取60min，過濾，提取2次， 合并濾液；濾液在60 °C真空下?lián)]干，殘?jiān)?0%甲醇溶液4mL溶解， 離心10 min (4,000 r/min);將上清液加到經(jīng)過10 mL甲醇活化、5mL蒸 餾水平衡處理好的Bond elut固相萃取柱(C18， 500 mg， 3 mL，美國瓦里 安公司)上，待其通過后，第一次用30%的甲醇溶液4mL沖洗，沖洗液棄之，隨后第二次用90%的甲醇溶液4mL洗脫，收集洗脫液；在70 °C水浴揮干洗脫液，殘?jiān)芗尤爰状糽mL，溶解，離心10min (4,000 r/min)，取上清液即得供試品溶液；
分別精確量取對照品和供試品10 nL進(jìn)行HPLC測定，測得中國被 毛孢菌絲體中多球殼菌素含量為0.586 mg/g。
實(shí)施例3為了進(jìn)一步證實(shí)該測定方法的可靠性，做以下試驗(yàn)進(jìn)行考察
(1) 精密度試驗(yàn)
精密吸取實(shí)施例2制備的同一份供試品溶液10^L，連續(xù)進(jìn)樣5次， 測得峰面積積分值的RSD值為1.38% (n = 5)，結(jié)果表明精密度良好。
(2) 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取中國被毛孢菌絲體粉末5份，每份lg，精密稱定，按實(shí)施例2供 試品溶液的制備方法處理后，分別進(jìn)樣10 pL,用外標(biāo)法計(jì)算多球殼菌素 的含量，RSD為1.12%,結(jié)果表明該法重現(xiàn)性良好。
(3) 穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密吸取按實(shí)施例2制備的同一份供試品溶液10^L，分別于0、 2、 4、 8、 12、 24 h進(jìn)樣，測得峰面積積分值的RSD為0.86%，結(jié)果表明供 試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
(4) 回收率試驗(yàn)
精密稱取己知含量中國被毛孢菌絲體粉末6份，每份0.5g，分別精 密加入適量多球殼菌素對照品，按實(shí)施例2方法制備供試品溶液，測定并 計(jì)算多球殼菌素的平均回收率為98.95%, RSD為1.92%。(5)系統(tǒng)適用性
多球殼菌素色譜峰的理論塔板數(shù)為5500，多球殼菌素色譜峰與其他化 學(xué)成分色譜峰的分離度為3.5。用Agilent高效液相色譜儀的 Chemstations工作站光譜軟件對供試品的多球殼菌素色譜峰進(jìn)行光譜圖分 析和純度檢査，表明該峰是單一峰。
通過以上五個(gè)方面對冬蟲夏草中多球殼菌素含量測定方法學(xué)進(jìn)行考 察，包括考察精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率實(shí)驗(yàn)、系統(tǒng)適用性，表明 本方法測定效果穩(wěn)定，重現(xiàn)性、精密度良好，測量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。 實(shí)施例4人工培育冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法
供試品溶液制備時(shí)各種技術(shù)參數(shù)做了以下調(diào)整，其余步驟與實(shí)施例l 相司。特別值得提到的是本實(shí)施例中供試品溶液的制備采用加熱回流提取， 洗脫液用甲醇溶解后所得的液體用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液得供試品溶液; 供試品溶液制備的具體各種技術(shù)參數(shù)如下 (1)供試品溶液的制備
取人工培育冬蟲夏草粉末(過100目篩)約lg，精密稱定，置50mL 圓底燒瓶中，加入甲醇20mL，加熱60 70 °C回流提取2 h，過濾，同 法提取2次，合并濾液；濾液在60 °C減壓下?lián)]干，殘?jiān)?5%甲醇溶 液4mL溶解，離心15min (4,000 r/min);將上清液加到已處理好(上 樣前固相萃取柱用10 mL甲醇活化，5mL蒸餾水平衡)的Cleanert固相 萃取柱(C18， 500mg， 3mL，艾杰爾科技有限公司)上，待其通過后，先用25%的甲醇溶液4 mL沖洗，沖洗液棄之，最后用80%甲醇溶液4 mL洗脫，收集洗脫液；在60 °C減壓下?lián)]干洗脫液，殘?jiān)芗尤爰状? mL，溶解，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液得供試品溶液。
色譜分析條件同實(shí)施例l,分別精確量取對照品和供試品10 pL進(jìn)行 HPLC測定，測得人工培育冬蟲夏草中多球殼菌素含量為0.105 mg/g。
權(quán)利要求
1、一種冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法，包括以下步驟(1)對照品溶液的制備精密稱取多球殼菌素對照品，加甲醇制成0.001～1.0mg/mL的多球殼菌素對照品溶液備用；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取多球殼菌素對照品溶液適量，分別精密吸取1、10、20、40、50μL注入高效液相色譜儀；采用色譜柱C18色譜柱，流動(dòng)相∶乙腈與水體積比20～80∶80～20，流速0.6～1.2mL/min，柱溫20～65℃，檢測波長190～215nm；測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)供試品溶液的制備提取取冬蟲夏草樣品，經(jīng)粉碎，通過20～200目的分樣篩，然后精密稱取0.1～5g置入容器中，加10～250mL溶劑提取，隨后移出上清液，同法提取1～3次，得總提取液；其中所述冬蟲夏草樣品的提取溶劑為甲醇、乙醇、水的一種或它們的混合溶劑；所述提取方法采用超聲提取法、加熱回流提取法、浸泡提取法的一種；過固相萃取柱定量移取總提取液在常壓或減壓下?lián)]干后用濃度小于50％的甲醇溶液或水1～10mL溶解，離心，取上清液作上樣液；將上樣液加到十八烷基固相萃取柱上，待上樣液通過十八烷基固相萃取柱后，第一次用濃度小于50％的甲醇溶液或水沖洗，沖洗液棄之；隨后第二次用60％～100％的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；其中所述十八烷基固相萃取柱上樣前先用甲醇活化和蒸餾水平衡；供試品定容收集含有多球殼菌素的洗脫液在常壓或減壓下?lián)]干，向揮干后的殘留物加入甲醇溶解，甲醇溶解液離心，取上清液即得供試品溶液；或甲醇溶解液用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液得供試品溶液；(4)采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定取供試品溶液，進(jìn)樣量為1～60μL，在步驟(2)的條件下進(jìn)行HPLC測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法確定多球殼菌素的含量。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法， 其特征在于冬蟲夏草是指野生冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草及冬蟲夏草無 性型發(fā)酵菌絲體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法， 其特征在于冬蟲夏草無性型指的是中國被毛孢。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法， 其中步驟(2)所述乙腈與水體積比是65: 35,流速是1.0mL/min，柱溫 是30°C，檢測波長是203 nm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法， 其中步驟(3)所述冬蟲夏草樣品的提取溶劑為甲醇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法， 其中步驟(3)所述冬蟲夏草樣品的提取方法是采用超聲提取法。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法， 其中所述超聲提取法，超聲提取時(shí)間每次為20 120 min，每個(gè)樣品提取 1 3次。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法， 其中步驟(3)提取后移出上清液采用過濾法或離心法。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法， 其中步驟(3)上柱處理后第二次洗脫按每1 g藥材取4 mL 80%甲醇進(jìn) 行洗脫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冬蟲夏草中多球殼菌素含量的測定方法，包括以下步驟(1)對照品溶液的制備精密稱取多球殼菌素對照品，加甲醇制成0.001～1.0mg/ml的多球殼菌素對照品溶液備用；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；(3)供試品溶液的制備經(jīng)過提取、過固相萃取柱及供試品定容；(4)采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。該方法的有益效果是測定效果穩(wěn)定，重現(xiàn)性、精密度良好，測量結(jié)果準(zhǔn)確。對有效利用冬蟲夏草資源，控制人工冬蟲夏草藥材質(zhì)量，以及開發(fā)多球殼菌素均具有重要意義。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101315352SQ20081006989
公開日2008年12月3日 申請日期2008年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者余佳文, 劉洪波, 徐紅娟, 朱華李, 毛先兵, 陳仕江 申請人:重慶市中藥研究院