專利名稱：：用于檢測可溶性pd-1蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學及生物學檢測領域，具體涉及一種用于檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，以及應用該試劑盒檢測可溶性蛋白的方法。
背景技術：
：PD-1是一個5055kD的免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，主要表達在激活的T、B細胞和骨髓內(nèi)發(fā)育的特定階段(參見IshidaY等人，TheEMBOJournal,11:3887-3895(1992);AgataY等人，Int.Immunol,8:765-772(1996))，最初的研究表明，PD-1胞漿區(qū)的兩個酪氨酸殘基與下游的信號分子作用，可發(fā)揮免疫負性調(diào)控功能(參見LatchmanY等人，NatImmunol,2(3):261-268(2001);RavetchJV等人，Science,290(5489》84-89(2000)。PD-1還能促進T細胞的增殖，此作用依賴于CD28共刺激信號(參見RioML等人，EurJImmunol,35:3545-3560(2005))。另有動物實驗顯示，在PD-1基因敲除小鼠的動物模型中，PD-1的缺乏可導致一系列免疫性疾病的發(fā)生。PD-1缺陷小鼠可導致自主免疫的擴大性心肌病(參見HiroyukiN等人，Science,291:319-321(2001))。研究也表明阻斷PD-1信號可加速IFN-Y依賴的移植物抗宿主反應(參見BlazarBR等人，JImmunol,171:1272-1277(2003))。PD-1/PD-L信號途徑與實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)有關(參見SalamaAD等人，JExpMed，198:71-78(2003))。AIDS等臨床疾病的研究表明，PD-1的表達與體內(nèi)T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用有關，HIV感染可選擇性下調(diào)被感染細胞的PD-1的表達，防止細胞的早期凋亡(參見VenkatachaHNJ等人，Virology.;376:140-153(2008))。PD-1基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，不同的PD-1mRNA的剪輯將造成PD-1分子胞內(nèi)段、跨膜段以及胞外段的缺失，實驗證實PD-lAex3(第3號外顯子缺失)將形成可溶性PD-1(solublePD-l,sPD-l)，并且在細胞增殖試驗中用westernblot的方法證實，T細胞受CD3CD28刺激后，培養(yǎng)上清中sPD-l表達水平不增髙(參見NislsenC等人，CellImmunol,235:109-116(2005));BingW等在RA患者外周血和關節(jié)腔中證實了sPD-l的存在，并用RT-PCR的方法驗證了此可溶性PD-1的mRNA是第3號外顯子缺失(Aex3)的產(chǎn)物(參見WanB，NieH,ZhangJW等人，JImmunol,177:8844-8850(2006"。馮作化等人應用PD-1/PD-L這條通路的特點，以編碼PD-1胞外段的cDNA構建真核表達載體，表達了可溶性PD-l,并證明sPD-l能以高親和力結合PD-Ls,阻斷PD-Ls/PD-1的相互作用，從而增強T細胞殺腫瘤效應(參見邱惠，張慧，馮作化，耿輝，張桂梅，中華肝臟雜志，14(7):505-509(2006);賀蘭湘，張桂梅，賀宇飛，張慧，項錦毅，朱漢鋼，馮作化，中華微生物學和免疫學雜志，26(5):463-467(2006"因此，血清中sPD-l的表達水平的檢測對多種自身免疫性疾病及血液病等疾病的發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測具有重大意義，然而現(xiàn)今國內(nèi)還沒有sPD-l酶聯(lián)免疫試劑盒。發(fā)明人明志君的博士論文《鼠抗人PD-l單克隆抗體的研制及其生物學功能研究》公開了制備兩株識別位點不同的鼠抗人PD-l分子單克隆抗體的技術方案，自主研發(fā)了兩株鼠抗人PD-l雜交瘤及其分泌的單克隆抗體，命名為1F2和5F10。目前仍沒有關于利用這兩種單克隆抗體檢測sPD-l的酶聯(lián)免疫試劑盒被報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是利用單克隆抗體1F2和5F10制備檢測sPD-l蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，并提供檢測方法，從而實現(xiàn)對sPD-l蛋白進行準確而又靈敏的檢測。為達到上述目的，本發(fā)明具體技術方案是，一種用于檢測sPD-l蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括PD-l融合蛋白標準品，PD-l單克隆抗體1F2包被板，生物素標記的PD-l單克隆抗體5F10,辣根過氧化酶以及輔助試劑。上述PD-l單克隆抗體1F2和5F10的制備方法在發(fā)明人明志君的博士論文《鼠抗人PD-l單克隆抗體的研制及其生物學功能研究》已經(jīng)公開，該論文已經(jīng)收錄在萬方數(shù)據(jù)庫中，并且申請人蘇州大學保證自申請日起的20年內(nèi)提供這兩種單克隆抗體PD-1單克隆抗體1F2和5F10。所述PD-1融合蛋白標準品的制備過程包括以下步驟PCR法克隆人PD-1基因的胞外段序列，RT-PCR從人脾臟細胞中擴增出人IgGlFc恒定區(qū)基因，兩者拼接后插入逆轉錄病毒載體pEGZ-Term中，重組載體與兩個輔助病毒載體脂質(zhì)體法共轉染293T包裝細胞，用含病毒顆粒的培養(yǎng)上清感染L929細胞，Zeocin篩選獲得能穩(wěn)定分泌表達PD-lIg蛋白的基因轉染細胞，經(jīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集的上清用dotblot檢測、ELISA定量后，濃縮并上ProteinG柱純化，進一步westernblot鑒定。所述單克隆抗體1F2包被板用PD-1單克隆抗體1F2包被酶標板而得，酶標板可選用12X8孔的可拆條板，其制作步驟如下(1)制備單克隆抗體1F2:克隆鼠抗人PD-1基因，制備穩(wěn)定分泌抗人PD-1抗體的雜交瘤細胞株1F2,置于含胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；收集生長良好的雜交瘤細胞1F2，注入經(jīng)姥鮫垸(Pristane)致敏2周的Balb/c小鼠腹腔，710天后收集腹水，ProteinG免疫親和層析純化單抗；其詳細制備方法參見明志君的博士論文《鼠抗人PD-1單克隆抗體的研制及其生物學功能研究》；(2)包被將上述單克隆抗體1F2用包被液稀釋成2jig/ml，加入ELISA酶標板的各孔中，每孔lOOpl,于4'C下過夜；第二天，用封閉液封閉，200p1/孔，于4'C過夜；第三天，用清洗液洗滌；即獲得單克隆抗體1F2包被酶標板。所述包被液由1體積份的Tirs-HCL與9體積份的水組成；所述封閉液為質(zhì)量分數(shù)為1%的BSA的PBS溶液；所述清洗液為含有溶液總質(zhì)量1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)，其配置方法為現(xiàn)有技術。本發(fā)明所述試劑盒中的生物素標記的PD-1單克隆抗體5F10為生物素N—羥基丁二酰亞胺酯標記的PD-1單克隆抗體5F10,其制備步驟如下(l)制備單克隆抗體5F10:克隆鼠抗人PD-1基因制備穩(wěn)定分泌抗人PD-1抗體的雜交瘤細胞株5F10,置于含15%胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；收集生長良好的雜交瘤細胞5F10，注入經(jīng)姥鮫烷(Pristane)致敏2周的BALB/c小鼠腹腔，710天后收集腹水，經(jīng)ProteinG免疫親和層析純化單抗5F10;(2)準備lmg單抗5F10,加入碳酸緩沖液(pH99.5)至lml，自來水沖洗透析袋，然后用CoatingBuffer沖洗透析袋；4'C下，在0.01mol/LpH=9.5的碳酸緩沖液中透析過濾；加入濃度為lmg/ml的BNHS-DMSO溶液40jd，用搖床，避光、室溫震蕩4h;用PBS透析7次，每天換兩次液；用PD-1/L929基因轉染細胞，用流式細胞法檢測PD-1在PD-1/L929上的表達率，以鑒定標記效果，本生物素標記的5F10單抗檢測PD-1在PD-1/L929上的表達率達到99%。所述辣根過氧化酶由1體積份的Avidin-HRP與16667體積份的BSA組成。所述輔助試劑包括清洗液，顯色液和終止液，它們的組成為清洗液含有質(zhì)量分數(shù)1%的吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4);顯色液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的水溶液，其中四甲基聯(lián)苯胺與水的體積比為1:2;終止液2M硫酸。本發(fā)明試劑盒的測試方法，包括以下步驟-(1)抗原-抗體反應在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中，分別加入標準品PD-1融合蛋白的梯度稀釋液或者待測血清樣品的梯度稀釋液，37'C保溫1.5h;然后用清洗液洗板3次；所述標準品PD-lIg蛋白的梯度稀釋液是最高濃度為50ng/ml,按0.4倍稀釋為7個濃度的梯度稀釋液50ng/ml，20ng/ml，8ng/ml，3.2ng/ml，1.28ng/ml，0.512ng/ml，0.2048ng/ml;所述待測樣品的梯度稀釋液同樣按0.4倍稀釋為7個濃度；(2)再加入濃度為2fig/ml生物素標記的PD-1單抗5F10，100pl/孑L，37'C保溫lh;用清洗液洗板4次后，每孔加Avdin-HRPlOOjil，0'C保溫20min;然后用清洗液洗板6次；(3)每孔加入顯色劑TMB100p1,37'C保溫15min;最后每孔加50^il終止液終止反應；(4)以空白對照孔的吸光值為零，用酶標儀于450nm測得OD值；(5)結果計算A.制作標準工作曲線以標準品sPD-l的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制sPD-l的標準工作曲線。計算標準曲線回歸系數(shù)R，當W大于0.98本次測定有效；B.根據(jù)待測樣品的OD值從標準曲線計算出待測血清樣品的sPD-l的含量。由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點1.由于PD-1單克隆抗體1F2和5F10的應用，這兩種抗體的結合位點不同，而且具有特異性，因此利用這兩種抗體可以實現(xiàn)檢測可溶性PD-1蛋白的目的；2.在制作標準工作曲線的過程中，一般的方法采用對倍稀釋，本發(fā)明加入的標準品梯度稀釋液采用了0.4倍稀釋，獲得的工作曲線線性優(yōu)良，回歸系數(shù)達到了0.9997;3.本發(fā)明提供應用在檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有穩(wěn)定性，檢測準確，靈敏的優(yōu)點。圖l實施例一中制作試劑盒與獲得標準工作曲線的流程圖；圖2實施例二中應用試劑盒檢測sPD-l蛋白的流程圖；圖3實施例一和二中獲得的標準工作曲線圖；圖4實施例二中各組測試對象血清中sPD-l含量分布圖。具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述，除非特別指出，實施例中涉及的百分數(shù)皆為質(zhì)量百分數(shù)實施例一，制作檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯(lián)檢測試劑盒為方便說明，首先列出實施例中使用的主要試劑和儀器生物素N—羥基丁二酰亞胺酯((BNHS)Sigma公司)包被液體積比Tirs-HCL:H20=1:9清洗液PB配制(pH=7.4)的含質(zhì)量分數(shù)1%吐溫20的溶液封閉液質(zhì)量分數(shù)1%BSA(Sigma公司)的PBS溶液辣根過氧化酶體積比Avidin-HRP(Sigma公司)BSA=1:16667顯色液體積比四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Sigma公司)H20=1:2終止液2M硫酸酶標測定版(12X8孔，Nunc公司)；酶標測定儀(Bio-Rad公司)一種檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯(lián)檢測試劑盒，包括PD-lIg融合蛋白標準品1瓶，50ng/ml;PD-1單抗1F2包被的ELISA酶標板(96孔)1塊；生物素N—羥基丁二酰亞胺酯標記的PD-1單克隆抗體5F10，2ng/ml;辣根過氧化酶，Avidin-HRP(Sigma公司)BSA=1:16667;顯色液(TMB)1瓶；清洗液l瓶PB配制(pH=7.4)的含1%吐溫20的溶液；終止液1瓶2mol/L的硫酸；制備上述檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯(lián)檢測試劑盒的具體操作步驟如下，流程可參見圖1:1.制備PD-lIg融合蛋白標準品的制備過程包括以下步驟PCR法克隆人PD-1基因的胞外段序列，RT-PCR從人脾臟細胞中擴增出人IgGlFc恒定區(qū)基因，兩者拼接后插入逆轉錄病毒載體pEGZ-Term中，重組載體與兩個輔助病毒載體脂質(zhì)體法共轉染293T包裝細胞，用含病毒顆粒的培養(yǎng)上清感染L929細胞，Zeocin篩選獲得能穩(wěn)定分泌表達PD-lIg蛋白的基因轉染細胞，經(jīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集的上清用dotblot檢測、ELISA定量后，濃縮并上ProteinG柱純化，進一步westernblot鑒定，獲得標準品PD-lIg融合蛋白。2.制作PD-1單克隆抗體1F2和5F10:2.1細胞株的培養(yǎng)采用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，基因轉染細胞株定期用抗性篩選藥物Zeocin(50(^g/ml)培養(yǎng)，以保持目的基因產(chǎn)物的穩(wěn)定表達，通常以50pg/ml的Zeocin加以維持培養(yǎng)。PD-1/L929細胞和空逆轉錄病毒轉L929細胞株均為貼壁性生長，傳代時用0.25%的胰酶消化，間隔3~4d傳代培養(yǎng)。SP2/0用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，間隔2~3d換液傳代。2.2動物的免疫收集生長良好的PD-1/L929細胞，用無菌PBS洗滌離心(1200rpmx5min)兩遍后，加入絲裂霉素溶液(50^ig/lxl(T個細胞)，混勻，置于37'C反應45min,PBS洗滌、離心(1200rpmx5min)三遍后，再用0.3~0.4ml的NS重新懸浮，采用腹腔注射("107個細胞/只)68周齡Balb/c小鼠。于初次免疫后的第21天和第35天分別進行再次免疫，細胞數(shù)量約為8><106細胞/只(第21天)和5><106細胞/只(第35天)，細胞的預處理及注射的部位同第一次。于融合前45d，再次腹腔注射3xl(^'細胞/只，進行加強免疫。2.3骨髓瘤細胞的準備融合前10~14d，復蘇小鼠骨髓瘤細胞SP2/0，用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，待細胞生長旺盛、形態(tài)良好(圓渾，透亮，大小均一)，且細胞活力大于95%(苔盼藍染色)方可用以融合。融合前2436h用新鮮含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為3xl05/ml。2.4滋養(yǎng)細胞及免疫小鼠脾臟細胞的制備Balb/c小鼠l只，于融合前l(fā)d摘除眼球放血，斷頸處死，置于75%酒精中10min，固定于無菌超凈臺的解剖板上，沿胸骨打開小鼠胸腔并取出胸腺，同法打開小鼠胸腔并取出脾臟，將兩者置于120目的鋼絲網(wǎng)中，將篩網(wǎng)移入盛有20ml基礎培養(yǎng)基的平皿中，研磨胸腺和脾臟，使其成為單個細胞懸于培養(yǎng)基中，離心(1000rpmx5min)，重懸浮細胞并計數(shù)；用完全培養(yǎng)基或HAT培養(yǎng)基調(diào)整滋養(yǎng)細胞濃度為3~4xlOs/ml，將上述細胞點板于96孔培養(yǎng)板中(共10塊96孔培養(yǎng)板)，每孔加入O.lml細胞懸液即(34)xl()"孔，C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。取加強免疫后的Balb/c小鼠，按上述方法處理小鼠，并在左后腹部取出脾臟，經(jīng)研磨獲取單個脾臟細胞。用苔盼藍液作活細胞有核計數(shù)，離心(1000rpmx5min),DMEM洗滌兩遍后，將沉淀細胞懸于10mlDMEM基礎培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中備用。2.5細胞的融合及選擇性培養(yǎng)將DMEM基礎培養(yǎng)基、PEG溶液置于37'C水浴中預溫。收集2><107個生長良好的SP2/0細胞，與lxl()S個脾臟細胞混合于50ml透明塑料離心管中，用無血清RPMI1640洗滌兩遍，1000rpm離心5min后，棄上清，用手指輕彈管底，使兩種免疫沉淀細胞充分混勻成糊狀。將塑料管置于37'C保溫杯中，吸取0.7ml經(jīng)37'C預溫的50%的PEG溶液，將吸管輕輕插入細胞底部，在lmin內(nèi)勻速加完，且邊加邊輕輕攪拌，然后在水浴中靜置90s,再加入40ml37'C預溫的DMEM基礎培養(yǎng)基，室溫靜止5min后離心(1000rpmxlOmin),棄去上清。將沉淀細胞輕輕用100ml含1%HAT、15°/。FCS的DMEM培養(yǎng)懸浮。混勾后滴加在上述含有滋養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，100pl/孔，置于37'C、5V。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-4d后半量換液，1012d后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，2周后轉用含15%FCS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。2.6分泌PD-1單抗的陽性雜交瘤細胞株的篩選待細胞克隆生長至1/3~1/4培養(yǎng)孔時(培養(yǎng)基顏色呈黃色)，吸取上清，用間接免疫熒光標記法進行篩選。將生長良好的PD-1/L929細胞消化后，用PBS洗滌并調(diào)整其濃度，分于流式管中(5><105細胞/管)，加入雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清(60pl/管)，同時以PE-PD-1mAb為陽性對照。于4'C反應45min,用含5%小牛血清的PBS洗滌兩遍，加入羊抗鼠PE標記抗體；再于4'C反應45min,洗滌后用FCM分析，同時以空逆轉錄病毒轉L929細胞作為陰性對照細胞株進行篩選。2.7陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法對陽性克隆進行亞克隆。吸取PD-1抗體反應陽性孔的雜交瘤細胞，計數(shù)后用HAT選擇性培養(yǎng)基梯度稀釋至細胞為50個/ml和10個/m1/青霉素瓶，加人100^1至含有滋養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，使每孔平均含有5個和1個細胞，37'C、5V。C02培養(yǎng)，觀察細胞生長狀況。待克隆細胞長至孔底的l/5孔時，按已建立的陽性克隆的篩選方法進行復篩。選擇抗體效價髙、呈單個克隆生長且形態(tài)良好的細胞繼續(xù)亞克隆，直至抗體分泌陽性率大于95%;擴大培養(yǎng)并及時液氮凍存。2.8雜交瘤細胞染色體的核型分析取生長良好的細胞，加入秋水仙素，使其終濃度為0.04~0.08pl/ml。培養(yǎng)2h后，收集細胞，離心1000rpm,10min，逐滴加入于37'C預溫的0.075mol/LKC1溶液0.5ml,隨即再補加5~10ml，用吸管輕輕吹打均勻，37'C孵育20min。加入新鮮配制的3份甲醇+1份冰醋酸的固定液1ml(臨用時配制)，離心lOOOrpmXIOmiii,棄上清。再加入8~10ml固定液，用吸管吹打均勻，固定1520min，離心，棄上清。再加入5ml固定液，固定30min。離心棄上清。再加入1.5ml固定液，吹打均勻。取-10'C冰凍的載玻片，滴加12滴細胞懸液，用新鮮Giemsa溶液(1份Giemsa原液加9份0.075mol/L、PH6.8磷酸鹽緩沖液)染色1020min,流水沖洗后晾干。二甲苯透明三次，中性樹脂封片。在顯微鏡下選擇染色體分散良好、不重疊、無失散的標本，油鏡下觀察，記錄并進行顯微攝影。2.9單克隆抗體腹水的制備取810周齡的Balb/c小鼠(15只左右)，腹腔注入pristane(稱作P)0.5ml/只，1周后直接腹腔注入雜交瘤細胞5xl()5細胞/只，輕輕按摩小鼠腹部，使雜交瘤細胞充分混勻，并擴散至整個腹腔。7~12d左右收集腹水，離心，取上清，一80'C備用。2.10單克隆抗體的純化(ProteinG免疫親和層析法)將腹水離心除凝塊，每10ml腹水加入lmllmol/LCaCl2、0.1ml5%Sulfatedextran溶液，室溫攪拌15min,4'C離心(12000rpm，20min)去除纖維蛋白。取上清液按50V。飽和度加入等體積飽和(NH4)2SO4溶液，混勻后置4'C46小時，離心棄上清。取沉淀加0.01mol/L、PH7.4的PBS溶解。透析去除(1\114)2804,按照Pharmacia公司提供的單抗純化方案，樣品經(jīng)FPLC系統(tǒng)上ProteinG親和層析柱，PH2.8甘氨酸洗脫。收集蛋白峰流出液，及時用PH9.0的Tris溶液調(diào)整PH至7.0。經(jīng)PBS透析后用751紫外分光光度計測定抗體蛋白的含量，其濃度的計算公式為抗體蛋白含量(mg/ml)=OD28()xl.55—OD26()x0.76?？贵w過濾除菌后，分裝于-8ox:保存。3.制作PD-1單克隆抗體1F2包被板酶標板可選用國產(chǎn)板或進口板，規(guī)格為96孔板或12X8、6X8孔的可拆條板。本發(fā)明采用一種進口酶標板(Nunc公司產(chǎn)品)。將上述1F2單克隆抗體用包被液稀釋為2網(wǎng)/ml后加入酶標板，每孔lOOjal，包被液由1體積份的Tirs-HCL和9體積份的H20組成，于4'C下過夜；第二天，用Sigma公司生產(chǎn)的封閉液1。/。BSA封閉，200^1/孔，于4'C過夜；第三天，用清洗液洗滌，即獲得單克隆抗體1F2包被酶標板。4.制備生物素N—羥基丁二酰亞胺酯標記的PD-1單克隆抗體5F10:準備lmg單抗5F10,加入pH99.5的碳酸緩沖液至lml,自來水沖洗透析袋，然后用CoatingBuffer沖洗透析袋；在0.01mol/LpH9.5的碳酸緩沖液中透析過濾(4'C);加入濃度為lmg/ml的BNHS-DMSO40fd,用搖床，避光、室溫震蕩4h;用PBS透析7次，每天換兩次液；用PD-1/L929基因轉染細胞，用流式細胞法檢測PD-1在PD-1/L929上的表達率，以鑒定標記效果，本生物素標記的5F10單抗在PD-1/L929上的表達率達到99°/0。5.配制清洗液PB配制(pH=7.4)的含1°/。吐溫20的溶液；6.配制辣根過氧化酶溶液Avidin-HRP(Sigma公司)BSA=1:16667;7.配制顯色液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Sigma公司)H20=1:2;8.配制終止液2M硫酸。應用本發(fā)明技術制備的可溶性PD-1蛋白的酶聯(lián)檢測試劑盒的質(zhì)量檢測(l)穩(wěn)定性試驗包被好的酶標板置4'C保存0、10、20、30天后，分別分析標準曲線中部分測定點數(shù)值的變異系數(shù)CV<5.17%。具體結果參見表1:表1sPD-lELISA試劑盒的穩(wěn)定性分析(y±s，CV%)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(2)準確性試驗采用加入法，在5份已知sPD-l濃度的血清標本稀釋液中，分別加入sPD-l的標準品5.00ng。測定回收率，平均約為100%。具體結果參見表格2:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(3)精密度實驗隨機用15盒不同批次試劑盒，用同一樣本進行重復測定，計算每次測定結果，求出均值、SD和變異系數(shù)，CV<12%。(4)線性范圍加入標準品(PD-1Ig)，最髙濃度為50ng/ml，按0.4倍稀釋為7個濃度50ng/ml，20ng/ml，8ng/ml，3.2ng/ml，1.28ng/ml，0.512ng/ml，0.2048ng/ml的梯度稀釋液，按照說明書的步驟進行操作測定。以sPD-l的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制曲線，試劑盒的線性范圍為0.2-50ng/ml。(5)檢測靈敏度根據(jù)上述線性范圍測定結果，本試劑盒的檢測靈敏度為0.2ng/ml。實施例二應用可溶性PD-1蛋白的酶聯(lián)檢測試劑盒的使用實例，其流程圖可參見圖2(1)收集正常人，再生障礙性貧血(AA)患者，急性淋巴白血病(ALL)患者，急性髓性白血病(AML)患者，非柯氏淋巴瘤(NHL)患者，肝移植病人，甲亢患者的血清，零下20'C凍存；(2)將標準品PD-1Ig(濃度50ng/ml),用二次蒸餾水按0.4倍稀釋7個梯度濃度，試劑盒中的標準曲線由7個不同濃度的標準品組成，標準曲線各點的濃度分另'J為50ng/ml，20ng/ml，8ng/ml，3.2ng/ml，1.28ng/ml,0.512ng/ml，0.2048ng/ml;同樣將待測樣本血清按0.4倍稀釋7個梯度濃度；(3)抗原-抗體反應在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中，分別加入標準品和待測樣本血清的梯度稀釋液，37'C保溫1.5h,然后用清洗液洗板三次；(4)酶聯(lián)反應每孔加入100pl濃度為2jag/ml的生物素標記的PD-1單抗Bio-5F10，37'C保溫lh;清洗液洗板四次后，每孔加lOOjil的Avdin-HRP,0'C保溫20min;(5)最后用清洗液洗板6次，每孔加入顯色劑TMB100jul，37'C保溫15min;然后加每孔2M的H2S04溶液50^1終止反應；(6)比色以空白對照孔的吸光值為零，用酶標儀于450nm測得OD值；(7)結果計算以sPD-l的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制sPD-l的標準工作曲線，參見圖3，應用軟件曲線專家1.3，求得樣本sPD-l含量。檢測結果見圖4，統(tǒng)計學分析結果見表3:表3各組人外周血上清sPD-l含量的統(tǒng)計學分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>人外周血上清中sPD-l含量的測定結果如圖4和表3所示，正常人(28例)的含量在0.7751.825之間，平均值為1.103，中位數(shù)為1.033;AA患者(29例)含量在1.06214.000之間，平均值為3.542，中位數(shù)為2.002;ALL(10例)患者的含量在1.2425.604之間，平均值為2.736，中位數(shù)為2.187;AML(5例)患者含量在0.9110.127，平均為3.864，中位數(shù)為1.74;NHL(3例)患者含量在2.0563.946之間，平均值為3.145，中位數(shù)為2.325;甲亢和器官移植患者各8例，與正常人比較都沒有顯著差異。AA患者血清中sPD-l含量明顯高于正常人(P^.01，表3),其他類型的血液病患者也有少數(shù)髙于正常值，甲亢和器官移植病人的sPD-l含量于正常人比較沒有顯著差異。該方法可供科研、臨床自身免疫性疾病及血液病等疾病的檢測，對臨床相關疾病的診斷、監(jiān)測及預后提供評估。權利要求1.一種用于檢測sPD-1蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于包括PD-1Ig融合蛋白標準品，PD-1單克隆抗體1F2包被板，生物素標記的PD-1單克隆抗體5F10，辣根過氧化酶以及輔助試劑。2.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測sPD-l蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述單克隆抗體1F2包被板用PD-1單克隆抗體1F2包被酶標板而得，酶標板的孔中單克隆抗體1F2的濃度為2pg/ml。3.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測sPD-l蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述生物素標記的PD-1單克隆抗體5F10為生物素N—羥基丁二酰亞胺酯標記的PD-1單克隆抗體5F10。4.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測sPD-l蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述辣根過氧化酶由1體積份的Avidin-HRP與16667體積份的BSA組成。5.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測sPD-l蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述輔助試劑包括清洗液，顯色液和終止液。6.—種測試sPD-l蛋白的方法，包括抗原-抗體反應、酶聯(lián)反應、顯色反應、終止反應步驟，其特征在于釆用權利要求1所述的試劑盒，包括以下具體步驟，(1)抗原-抗體反應在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中，分別加入標準品PD-1Ig融合蛋白的梯度稀釋液或者待測血清樣品的梯度稀釋液，37'C保溫1.5h;然后用清洗液洗板3次；所述標準品PD-lIg的梯度稀釋液是最髙濃度為50ng/ml，用質(zhì)量分數(shù)1%BSA的磷酸鹽緩沖溶液按0.4倍稀釋為7個濃度的梯度稀釋液50ng/ml，20ng/ml，8ng/ml，3.2ng/ml，1.28ng/ml，0.512ng/ml，0.2048ng/ml;所述待測樣品的梯度稀釋液同樣按0.4倍稀釋為7個濃度；(2)再加入濃度為2pg/ml生物素標記的PD-1單抗5F10，100]nl/孔，37'C保溫lh;用清洗液洗板4次后，每孔加Avdin-HRP100^1，0'C保溫20min;然后用清洗液洗板6次；(3)每孔加入顯色劑TMBlOOjil,37'C保溫15min:最后每孔加終止液終止反應；(4)以空白對照孔的吸光值為零，用酶標儀于450nm測得OD值；(5)結果計算A.制作標準工作曲線以標準品sPD-l的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制sPD-l的標準工作曲線。計算標準曲線回歸系數(shù)R，當W大于0.98本次測定有效；B.根據(jù)待測樣品的OD值從標準曲線計算出待測血清樣品的sPD-l的含量。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明試劑盒由PD-1融合蛋白標準品、單克隆抗體包被板、酶標單克隆抗體及輔助試劑組成。該試劑盒應用發(fā)明人自主研發(fā)的兩株鼠抗人PD-1雜交瘤及其分泌的單克隆抗體，命名為1F2和5F10，并根據(jù)兩株單抗的識別位點不同的特點，建立了可溶性PD-1(sPD-1)的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法；利用該試劑盒可以準確而又靈敏地檢測出sPD-1蛋白。該方法可供科研、臨床自身免疫性疾病及血液病等疾病的檢測，對臨床相關疾病的診斷、監(jiān)測及預后提供評估。文檔編號G01N33/577GK101339195SQ200810021580公開日2009年1月7日申請日期2008年8月6日優(yōu)先權日2008年8月6日發(fā)明者吳海競,張學光,明志君,陳永井申請人:蘇州大學