專利名稱：：確定含有粒子的樣本的特征性質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種確定含有至少一個(gè)物種的粒子的樣本的特征性質(zhì)的方法，該粒子在固定的連續(xù)的時(shí)間間隔內(nèi)在觀察容量中發(fā)射、散射和/或折射光子。另外，本發(fā)明還延伸到對不同的時(shí)間間隔確定含有粒子的樣本的特征性質(zhì)。
背景技術(shù)：
：上述方法是才艮才居熒光漲落i脊方法(FluorescenceFluctuationSpectroscopy,FFS)[參見LMandel:Fluctuationsofphotonbeamsandtheircoirelations，/Voc..72，pages1037-1048，(1958)],它被建立為在廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域、特別是在生物物理學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。4皮研發(fā)以應(yīng)用在高壓過程篩選(High-throughputScreening)和在線分析方面的理論和實(shí)現(xiàn)是從WO98/16814和PeetKask，KaupoPalo,DirkUllmann，andKarstenGall:Fluorescence-intensitydistributionanalysisanditsapplicationinbiomoleculardetectiontechnology,尸nTVff,/.5W.96，pages13765-13761，(1999)而獲知的熒光強(qiáng)度分布分析(FIDA)。在單個(gè)分子實(shí)驗(yàn)中，情況如下從小觀察容量V中的分子發(fā)射的光子擊中光子檢測器。離散的時(shí)間點(diǎn)ti(i-0，l，2…)將觀察時(shí)間分成等距離的時(shí)間間隔Atj=[tN1，ti)(i二1，2，3，…N)。在時(shí)間間隔Atj中計(jì)數(shù)的光子的數(shù)目呈數(shù)列(EU，n2，n3，...}。一次完整的測量給出有限數(shù)目的計(jì)數(shù)率ih,n2，...，nN。在其中有n個(gè)光子被計(jì)數(shù)的時(shí)間間隔(^k)的數(shù)目給出了光子計(jì)數(shù)分布(弁k(n))。。將序列弁k(n)中的每個(gè)元素除以間隔的總數(shù)S給出了一實(shí)數(shù)它至少在"大量"測量的時(shí)間間隔的極限的情況下可被解釋為在時(shí)間間隔At內(nèi)測量到n光子的概率。相應(yīng)的物理概率分布由定義。為簡單起見，我們假設(shè)所有的光子都是由感興趣的分子產(chǎn)生而忽略例如由檢測器硬件或散射光產(chǎn)生的背景噪聲。合并的背景噪聲是直接的，它對p(n)的影響以后將被討論。在FFS中確定樣品的特征性質(zhì)的方法包括兩個(gè)基本步驟1)將在觀察時(shí)間r=f>ti的連續(xù)時(shí)間間隔Atj-[t"，ti)(i=1,2，3，...N)內(nèi)登記的光子事件的數(shù)目ni(計(jì)數(shù)率)進(jìn)行登記和計(jì)數(shù)，2)確定在預(yù)定時(shí)間間隔At內(nèi)的光子事件數(shù)目n的分布函數(shù)p(n)，和3)以這種方式確定感興趣的一個(gè)或數(shù)個(gè)性質(zhì)，在該方法中給定的理論模型以最優(yōu)符合(下文成為"擬合")說明測量結(jié)果p(n)。可以從p(n)提取的典型的性質(zhì)包括1.在純?nèi)芤褐械姆肿拥臐舛?.在混合物中的分子的濃度3.分子間結(jié)合過程的動力學(xué)4.分子間離解過程的動力學(xué)速率5.分子內(nèi)保形變化的動力學(xué)速率6.分子的擴(kuò)散率7.分子亮度8.光學(xué)裝配(設(shè)置，setup)的空間亮度函數(shù)9.分子特有的單態(tài)活期10.檢測器的后脈沖(after-pulse)率在FIDA中，理論的光子計(jì)數(shù)分布p(n)通過生成函數(shù)^計(jì)算。G(g)表示為對依賴于所謂空間亮度函數(shù)Bf)的函數(shù)的空間積分的指數(shù)?？臻g亮度函數(shù)是光學(xué)設(shè)備的激發(fā)光強(qiáng)度和熒光傳輸系數(shù)的積，作為在樣本中的粒子的坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化(歸一化，normalized)函數(shù)。應(yīng)用B(。的簡單模型來特征化光學(xué)設(shè)備，由單個(gè)物種的實(shí)驗(yàn)確定B(。的調(diào)整參數(shù)。未知的樣本參數(shù)、濃度c和特定亮度值q由非線性擬合法或由規(guī)則化逆變換來確定。FIDA的缺點(diǎn)是1.生成函數(shù)的方法使理論模型很不直觀，并且將方法延伸到更復(fù)雜的應(yīng)用中是困難的。2.模型在未知參數(shù)c和q方面是高度非線性的，確定這些參數(shù)是復(fù)雜的。3.每個(gè)分子的亮度被表示為對所有物種都是共同的空間亮度函數(shù)和對每一個(gè)物種具有一個(gè)特征值的特定亮度的積。因?yàn)閷Σ煌锓N三重態(tài)種群差別極大，所以在所有的測量中，在某種程度上違反了這個(gè)假設(shè)。4.假i殳分子的坐標(biāo)在計(jì)數(shù)時(shí)間間隔(區(qū)間寬度，binwidth)期間不變。即使是對在幾微秒的范圍內(nèi)的非常短的時(shí)間間隔，這也只是粗略的近似。而且，p(n)對分子的擴(kuò)散運(yùn)動的依賴(相依性，dependence)帶有不能從模型提取的有用信息。通過在FIDA中引入半經(jīng)驗(yàn)校正因子，建立了所謂的熒光強(qiáng)度多分布分析(FIMDA)來同時(shí)確定擴(kuò)散時(shí)間和分子亮度[參見KaopoPalo,tjloMets，StefanJSger，PeetKask,andKarstenGall:Fluorescenceintensitymultipledistributionanalysis:Concurrentdeterminationofdiffusiontimesandmolecularbrightness,5/<7/;/rj^/c"http://79，pages2858-2866,(2000)。與FIDA相比，通過主方程直接計(jì)算光子計(jì)數(shù)分布顯示出顯著改進(jìn)的擬合質(zhì)量。然而，這種數(shù)值仿真是非常慢的，并且不適合于高生產(chǎn)率應(yīng)用[參見KaopoPalo，tloMets，VelioLoorits，andPeetKask:Calculationofphotoncountnumberdistributionsviamasterequatons，必/0/7/^5ic"http://90，pages2179-2191,(2006)。替代FIDA及其后繼者的方法是基于光子計(jì)數(shù)區(qū)間PCH算法[參見YanCheng,D.MttllerJoachi，PeterT.C.So,andEnricoGratton:Thephotoncountinghistograminfluorescencefluctuationspectroscopic,必/o/i/f戸.cfl//.77，pages553-557，(1999)，YanCheng:y4冊/"/s1flwflfa/p//cff,/ows"/7woresce"ce//w"w^Vws/;ec的sco/^.博士論文，UniversityofIllinoisatUrbana-Champain，Urbana，Illinois,(1999)，可在http:〃www.lfd.uiuc.edu/staff/gratton得到，ThomasD.Perroud，BoHuang,andRichardN.Zare:Effectonbintimeonthephotoncountinghistogramforone-photonexcitation,C&附尸一C^附6，pages905，912，(2005)，Y.Cheng,M.Tekmen，L.Hillesheim，J.Skinner,B.Wu，andJ.Mtiller:Dual-colorphotoncountinghistogram,/88,pages2177-2192，(2005)]。這些方法僅在技術(shù)細(xì)節(jié)上有別于FIDA,并且為空間激光亮度分布假設(shè)不同的形狀。PCH方法對商業(yè)應(yīng)用起次要作用。在PCH方法中檢測容量必須相當(dāng)任意地選擇。像起作用的分子的平均數(shù)目和單個(gè)分子的光子概率分布這樣的性質(zhì)變成抽象性質(zhì)，而沒有任何物理意義。本發(fā)明的目的在于提供改進(jìn)的理論平臺來先驗(yàn)預(yù)測光子計(jì)數(shù)區(qū)間。本發(fā)明的另一目的在于給FFS提供更深刻的物理洞察力和使PCH方法直觀地延伸到復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)任務(wù)中。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的上述目的由具有權(quán)利要求1的特征的方法解決。有效容量Veff不容易由光學(xué)裝配描述，還取決于要考慮的粒子物種的性質(zhì)。當(dāng)且僅當(dāng)粒子對計(jì)數(shù)率起作用時(shí)，粒子才被定義為在某一特定時(shí)間間隔期間在容量"內(nèi)"。對位于任何空間位置的粒子，對計(jì)數(shù)率起作用的概率不為零。因此，有效容量Veff不能由物理空間邊界確定。不管怎樣，"進(jìn)入"和"離開"這個(gè)容量的過程是一個(gè)隨機(jī)過程，類似于進(jìn)出一個(gè)小的物理容量的擴(kuò)散過程?？梢宰⒁獾?，像受激發(fā)射損耗(STED)[參見LarsKastrup,HansBlom，ChristianEggeling，andStefanW.Hell:Fluorescencefluctuationspectroscopyinsubdiffractionfocalvolume,i^".及ev.le汰94,(2005)的技術(shù)能夠大大減少有效容量。根據(jù)定義，有效容量內(nèi)的"單個(gè)粒子，，不能產(chǎn)生任何零計(jì)數(shù)率。因此，術(shù)語有效容量內(nèi)的"單個(gè)粒子，，與在任何空間容量有"單個(gè)粒子，，在概念上有很大的不同。通過只考慮非零計(jì)數(shù)率，在物理上可以在理想實(shí)驗(yàn)(Gedankenexperiment)中測量概率分布P^n)。在時(shí)間間隔Ati期間所有的光子事件只源自一個(gè)單個(gè)的粒子。源自幾個(gè)粒子的信號的疊加必須,皮忽纟見掉。根據(jù)本發(fā)明，對給定的實(shí)驗(yàn)裝配，用兩個(gè)量有效容量Veff和單個(gè)粒子分布Pi(n)來將例如分子物種的粒子物種特征化。如上文所討論的，這兩個(gè)量有明確的物理意義?？梢岳闷洫?dú)特的性質(zhì)P"n-0"0來將單個(gè)粒子分布Pi(n)與FIDA方法和PCH方法中的同名的單個(gè)粒子分布區(qū)分開來?？梢岳肰eff和P"n)的知識來快速和穩(wěn)健地確定包括一個(gè)或幾個(gè)物種(混合物)的分子的樣本中的分子濃度。該方法對限制諸如FIDA、FIMDA或PCH算法等所有現(xiàn)有方法的例如后脈沖、分子擴(kuò)散或單態(tài)激發(fā)等干擾效果是穩(wěn)健抗干擾的。根據(jù)本發(fā)明的方法不僅限于如FIDA或PCH算法的短區(qū)間寬度。它適用于任分子何環(huán)境，例如流、微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、囊、乳膠或凝膠(到現(xiàn)在為止尚未實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證)。根據(jù)本發(fā)明的方法比所有的現(xiàn)有方法更簡單。從技術(shù)上講，它可以與例如非線性擬合、生成函數(shù)或矩方法(矩量方法，methodofmoment)的標(biāo)準(zhǔn)擬合方法結(jié)合。根據(jù)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，這是一個(gè)適于在線診斷的非?？焖俚姆椒āＴ贔IDA中，一種分子用由實(shí)數(shù)值所給的特定分子亮度特征化。根據(jù)本發(fā)明，一種分子由Veff和P"n)完全特征化。就它們包含如擴(kuò)散率或單態(tài)激發(fā)概率的與實(shí)驗(yàn)裝配有關(guān)的所有信息的意義上說，性質(zhì)Veff和P"n)是豐富的。原則上，對例如分子的粒子特征化的所有的信息都可以從Veff和P"n)提取。但是，要獲得此信息，必須應(yīng)用具體的理論模型。就它們對單個(gè)粒子的性質(zhì)特征化、在任何實(shí)驗(yàn)中沒有因幾個(gè)粒子同時(shí)作用而存在平均過程的意義上說，性質(zhì)Vw和P"n)是單純的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，基于馬爾可夫過程理論的單個(gè)粒子分布函數(shù)P"n)由給出，其中^(11=0):=0，其中ft(O表示粒子的亮度函數(shù)，其由在位置尸的單個(gè)粒子的光子事件的平均值和泊松分布Poi(n，ji)=exp(卞)n7n！定義。因?yàn)榭臻g上不同的激光強(qiáng)度和光學(xué)裝配的光子收集性質(zhì)，所以，給定區(qū)間寬度Ati的光子計(jì)數(shù)率ni強(qiáng)烈依賴于所有分子相對于激光焦點(diǎn)的位置。在激光焦點(diǎn)附近的分子對光子計(jì)數(shù)率產(chǎn)生大的作用，而遠(yuǎn)離激光焦點(diǎn)的分子產(chǎn)生小或零的作用。單個(gè)分子的作用可以通過將其固定在表面(如玻璃表面)上或矩陣(如凝膠)中的指定的位置F來測量。該裝配所記錄的光子計(jì)數(shù)Hi的序列給出了概率分布p(n)。這樣測量的光子計(jì)數(shù)的平均值〈"〉-"^n)被稱為在位置F的分子亮度H。分子亮度KO的測量可對任何位置f進(jìn)行，H(。的函數(shù)形式可以通過對分子的各個(gè)位置重復(fù)這一過程，例如通過對等距空間網(wǎng)格上的所有位置測量n并在網(wǎng)格點(diǎn)之間插值，進(jìn)行測量。由于分子亮度函數(shù)n(。的測量費(fèi)時(shí)昂貴，所以通常是用基于分子熒光光譜理論的模型和空間激光光照強(qiáng)度的給定模型近似。在此背景下，分子的亮度nO取決于例如區(qū)間寬度At、空間分布和在激發(fā)波長(X)的光強(qiáng)度、光學(xué)裝配的收集效率函數(shù)、檢測器(q)的量子效率、橫截面((T)和給定類型的分子的熒光量子產(chǎn)率(q)f)的參數(shù)。諸如三重態(tài)激發(fā)和檢測器的后脈沖的參數(shù)也被證明發(fā)揮了重要作用。對任何從頭開始預(yù)測實(shí)驗(yàn)光子計(jì)數(shù)分布，對分子亮度nf)的了解是必然的。在FIDA和PCH中，應(yīng)用了n(0的理論模型。在這些模型中的自由參數(shù)通過在單個(gè)物種上試驗(yàn)來確定。如果假定分子亮度函數(shù)W。是由直接測量或理論模型的近似而已知的，那么，曼德爾(Mandd)的經(jīng)典公式描述了從單個(gè)分子測量n個(gè)光子的概率P"n)[參見L.Mandel:Fluctuationsofphotonbeamsandtheircorrelations,/Vw.尸一.72，pages1037-1048,(1958)式中泊松分布Poi(n，n)=exp(-ji)nn/n!對分子的所有可能的位置求平均。p(。-IZV表示找到空間點(diǎn)F處粒子的恒定概率。不幸的是，上述方程y在無限大積分容量V的極限下產(chǎn)生了簡單解P"n):^。n，這反映一個(gè)物理事實(shí)，即在無限大容量中的單個(gè)分子對應(yīng)于零濃度，根本不能產(chǎn)生任何光子計(jì)數(shù)事件。一種普遍的做法是通過引入大而有限的容量來規(guī)避這一缺點(diǎn)，參見例如在YanCheng,JoachimD.Mtiller,PeterT.C.So,andEnricoGratton:Thephotoncountinghistograminfluorescencefluctuationspectroscopic,77，pages553-557,(1999)中的討論。根據(jù)本發(fā)明，通過將有效容量Veff中的"單個(gè)分子，，的定義應(yīng)用到曼德爾公式，PCH算法的上述問題是可以避免的，那么曼德爾公式變?yōu)槠渲蠵i(n-O):=0。該公式建立了在P"n)、Vw和ji(F)之間的關(guān)系，這可用于確定這些特征性質(zhì)中的一個(gè)或其它。此外，基于馬爾可夫過程理論的泊松近似導(dǎo)致用于<111>和Veff的下面的公式?？紤]到在真實(shí)的物理情況下的非零濃度c，對每一個(gè)計(jì)數(shù)率起作用的分子的平均數(shù)目<111>由〈w〉=]I卜尸o/("-0,/i(。)],給出，其中cdV表示在容量元dV中的分子數(shù)目，因子[1-Poi(n-0，15表示dV中的每個(gè)分子產(chǎn)生至少一個(gè)光子計(jì)數(shù)事件的概率。通過關(guān)系式Veff:=<m>/c，得到j(luò)[l一尸oi(n-0，;/(F))rf廠，上述公式分別建立了在<111>、H(。和C之間以及在Veff和fl(O之間的理論關(guān)系，這可用于確定這些特征性質(zhì)中的一個(gè)或其它。在大多數(shù)FFS的應(yīng)用中，同一物種的粒子(分子)發(fā)熒光或熒光標(biāo)記的，并且使用激光束來激發(fā)粒子。亮度函數(shù)H(O的最大值由分布函數(shù)的一次矩(一階矩)來確定一v，0)-v,2(/;)-v,(力#鵬—o作為非線性擬合過程的替代過程的該矩方法的重要性將在下面進(jìn)一步考慮。如果考慮到噪聲作用〈H、。ise，亮度函數(shù)Jl(F)的最大值就通過具有參數(shù)aj和不同的亮度函數(shù)hf)(j=1，2，...，K)的不同的亮度函數(shù)的疊加y來建模?？商鎿Q地，亮度函數(shù)(j=1,2，…，K)可以通過具有參數(shù)aj和不同的亮度函數(shù)j=1,2,..，，K)的不同的亮度函數(shù)的疊加'來建模。每一個(gè)亮度函數(shù)(j-l，2，…，K)由給定數(shù)目的M個(gè)特征參數(shù)Hjk(k=l，2,...，M)來確定。用于亮度函數(shù)的一種常見的模型是空間高斯分布exp(-2r2/a2)'其中Jl隨是激光焦點(diǎn)中心中的分子的亮度，a表示激光束的腰參數(shù)。幾個(gè)小組展示了以這種粗逼近來說明相當(dāng)復(fù)雜的三維空間亮度函數(shù)的局限性，參見BoHuang,ZhomasD.Per削d,andRichardN.Zare，Photoncountinghistogram:One-photonexcitation,ChemPhysChem5，pages1323-1331，(2004)及其中的文獻(xiàn)。適合做幾處說明來證實(shí)作為說明性的例子的這一選擇。首先，本發(fā)明我們的方法可以適用于任何空間亮度函數(shù)。其次，高斯函數(shù)近似通常易于處理，已經(jīng)證明，高斯函數(shù)的縮并收斂到任何可積的空間函數(shù)[參見BrunoKlahnandWernerA.Bingel:TheconvergenceoftheRaleigh-RitzMethodinQuantumChemistry,77reor".^4""44，pages9-43，(1977)。這是它們已被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代量子化學(xué)研究幾十年的原因之一。分別將高斯分布插入有效容量的定義和單個(gè)分子函數(shù)，坐標(biāo)r—n的轉(zhuǎn)換和在旋轉(zhuǎn)對稱上的積分得到和其中，和可以應(yīng)用數(shù)值Romberg積分來計(jì)算函數(shù)F和Q。說明的是，Q只對n^l是有限的，對n-0發(fā)散。對高斯型nf)，有效容量Veff變得與FCS中的相應(yīng)的檢測容量相同，對F(〃咖)-^，^"2"3,即，對Pmax的一些值，P!(ll)可以以對于Hm^數(shù)值穩(wěn)定和快速的方式計(jì)算并具有確定的物理意義。一個(gè)更精確的亮度函數(shù)H(F)的建模通過具有參數(shù)^和fij2(j-l，2，."，K)的高斯分布的疊加來執(zhí)行特征參數(shù)fijk(j=l，2，...，K;k=l，2，...，M)由標(biāo)準(zhǔn)去巻積方法來確定。特征參數(shù)nJk(j=l,2，...，K;k=l，2，…，M)也可以由迭代理查森-露西(Richardson-Lucy)去巻積算法來確定。上述的單個(gè)分子函數(shù)P"Il)和Veff的理論運(yùn)算是基于經(jīng)典曼德爾公式的。但是，這個(gè)公式具有一定的局限性。光子計(jì)數(shù)率的分布可能偏離泊木〉分布Poi(n，n())，因?yàn)樵跁r(shí)間間隔AT期間光子的產(chǎn)率(productionrate)可能會改變。一些影響可能會導(dǎo)致這種光子的產(chǎn)率的改變。在時(shí)間點(diǎn)t處于位置F的單個(gè)分子可能運(yùn)動，該分子可能會在時(shí)間間隔At期間訪問其它地點(diǎn)。由于空間激光強(qiáng)度改變，所以擴(kuò)散過程例如可能會導(dǎo)致重大的非固定的光子產(chǎn)率和曼德爾公式的無效。在這些情況下，曼德爾公式中的泊松分布必須替換為更廣泛的分布p(n，F(xiàn))，對n>0，/U")=l/^Jp(",F)W以及P"n-0》=0。有效容量由給出。p(n，0是在時(shí)間點(diǎn)t。處于位置f的單個(gè)分子在時(shí)間間隔te[t。，t。+At)期間計(jì)數(shù)的光子事件數(shù)目的分布。分布p(n，？)的計(jì)算一般來說是一個(gè)理論性的任務(wù)?？紤]到分子的擴(kuò)散運(yùn)動，分布p(n，F(xiàn))可以正式寫成=limJ化f[叱c(^-^"，A〃w)的形式，式中G表示擴(kuò)散的Greens函數(shù)。G(;c，r):-1/[術(shù)P2在緩慢擴(kuò)散D—0的極限情況下，通過lim/K",F)=尸o'("，MO)得到了經(jīng)典的曼德爾公式。這個(gè)例子示出了上面介紹的單個(gè)粒子分布函數(shù)Pi(n)的概念可以很容易地延伸到復(fù)雜的測量狀況。但應(yīng)當(dāng)指出，在理論考慮不可及的情況下，P"n)和Veff可由實(shí)驗(yàn)來確定。從單個(gè)粒子概率分布P"n)出發(fā)，如下得到了P"n)和測量的分布函數(shù)pO)之間的聯(lián)系。在真實(shí)的物理情況下，平均數(shù)目<m>=cVeff的粒子同時(shí)對信號起作用。使用馬爾可夫過程理論，給定濃度c的概率分布p(n，c)通過將所有m個(gè)粒子的作用相加而得到m0式中Pm(n)是指單個(gè)粒子概率分布PKn)的第m巻積以及P。(n)-5n。?？商鎿Q地，p(n，c)可通過遞推公式計(jì)算/7("，c)=^"l>7U^("-''，c)其中p("=0，c)=exp#)忽略背景噪聲，粒子的濃度完全由獲得計(jì)數(shù)率為0的概率確定c=-lnCp("-0，c))/~如果考慮背景噪聲，粒子的濃度c由得到計(jì)數(shù)率為0的概率和噪聲作用來確定c=[-lnCp("-0，c))_〈"〉」粒子的平均數(shù)目<111>由得到計(jì)數(shù)率為0的概率來確定附〉-一l"(p("-0,c)).考慮到噪聲作用，粒子的平均數(shù)目<111>由〈—--1"(/7("=0，C》-得到。單個(gè)粒子概率分布函數(shù)P"n)可以通過遞推公式1來計(jì)算。19分布函數(shù)p(n，c)可能必須與泊松分布Poi(n，〈n、。iM)巻積以考慮額外的背景信號(例如硬件的隨機(jī)噪聲)&(",c,〈"〉J=(P(c)尸o'(〈"〉根據(jù)上述理論考慮，對給定的實(shí)驗(yàn)裝配，使用濃度c、亮度函數(shù)H()、有效容量Veff和單個(gè)粒子分布PKn)將含有熒光粒子(如分子)的樣本特征化。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)實(shí)驗(yàn)裝配中的噪聲作用<n>n。ise不能忽略，也必須考慮到噪聲作用〈n、。ise。遵循在FIDA和PCH算法中說明的規(guī)范，可以通過例如Marquard-Levenberg算法或適于本任務(wù)的任4可其它數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)擬合方法的非線性多參數(shù)擬合過程來確定這些參數(shù)。因此，亮度函數(shù)p(O必須由具有多個(gè)可調(diào)參數(shù)的分析函數(shù)來近似。的分析形式可被選為高斯函數(shù)(如上面的例子中)，幾個(gè)高斯函數(shù)的縮并或任何其它適當(dāng)形狀的函數(shù)。所有的可調(diào)參數(shù)的n()以及濃度c和噪聲作用〈n、。ise必須通過將理論模型與實(shí)測量的分布p(n)進(jìn)行非線性擬合來確定。如上文所述，有效容量Veff和單個(gè)粒子分布P"n)直接來自于對n。的積分。非線性擬合過程的可替換的過程是矩方法，它采用預(yù)先計(jì)算的對可調(diào)參數(shù)p(F)、濃度c和噪聲作用〈n、。ise的任何一組值所預(yù)期的矩的列表。由于這種列表可以對合適范圍內(nèi)的參數(shù)預(yù)先計(jì)算并儲存，所以這是用于在線應(yīng)用的可能的最快的過程。分布p(n)的矩由伸o定義。以ai，i-l，2，".，k表示要確定的k個(gè)參數(shù)。在參數(shù)aj的值的適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，可以計(jì)算出期望的矩Vi，i=l，2，...，l。對所有可能的組的參數(shù)值ai,i=l，2，...，k預(yù)計(jì)算第一階1矩v產(chǎn)生了一個(gè)映射(a,,a2，…，at*)—(v，，v2，…，v,)離散參數(shù)值的網(wǎng)格減少了計(jì)算力度，并且不在這個(gè)網(wǎng)格上的參數(shù)值的期望的矩必須例如用樣條外推來推斷。將矩1的數(shù)目選得盡可能低，但足夠高以保證上述映射是雙射函數(shù)。該映射可以倒過來(v,,v2，…,v,)~>(a,，a2，.",。*)這為任何一組測量的矩pi，i=l，2，...，l給出了需要的參數(shù)，單個(gè)粒子的概率分布函數(shù)的矩通過遞推公式計(jì)算?？梢允褂脹]有熒光粒子的樣本的介質(zhì)液體直接測量實(shí)驗(yàn)裝配的噪聲作用〈n、。ise。樣本的介質(zhì)液體可由具有相同或相似的(光)性質(zhì)的液體取代。事先確定〈n、。ise，該參數(shù)可以在非線性擬合過程和矩方法中保持固定。這樣，在這些過程中需要的參數(shù)的數(shù)目減少了一個(gè)。上述考慮關(guān)注單個(gè)物種的粒子樣本。本發(fā)明還明確適用于含N個(gè)不同物種的粒子(粒子物種的混合物)的樣本。在粒子物種混合物的情況下，每個(gè)物種的濃度的確定都是在多步過程中完成。首先，必須為混合物中存在的每一個(gè)物種s和給定的實(shí)驗(yàn)裝配測量有效容量和單個(gè)粒子分布W)W。這通過上述過程中的一個(gè)來完成。根據(jù)確定的性質(zhì)^和W)(")，期望的總分布p(n;d，C2，…，Cn)可以由單個(gè)物種的作用p(s)(n;cs)，s=1，2，...,N的巻積來表示p("(";c》0p(2)(";c2)"',)(";cw)尸o/("《"〉加Jnoisc《要確定的參數(shù)是濃度cs，s=1，2，…，N和噪聲作用<11>。要求的參數(shù)能夠通過使用將測量數(shù)據(jù)與理論模型的非線性擬合來確定。與上面說明的非線性擬合過程相同，可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值技術(shù)。在某些情況下，生成函數(shù)法可能加快p(n;d，C2，…，CN)的計(jì)算。與非線性擬合可替換地，如上所述，可用矩方法確定參數(shù)。這一過程利用p(n;d，C2，.,.，CN)的矩能夠表示為p，n;Cs)的積這樣一個(gè)事實(shí)而在技術(shù)上被簡化了，其中s-l，2，…，N。沒有任何模型或分子亮度函數(shù)方面的知識而進(jìn)行Vd和P"n)的測量是可能的。這些性質(zhì)可能通過分析測量分布p(n，c)直接確定。由于測量分布是有噪聲的數(shù)據(jù)，所以誤差傳播效應(yīng)能夠使用于提取P"n)的數(shù)值方法不穩(wěn)定。出于這個(gè)原因，Pi(n)的整體表示是有利的。一個(gè)強(qiáng)大的方法是所謂的離散Galerkin逼近，其形式為其中ak是廣義矩，Y(n，p，k)是具有可調(diào)參數(shù)p和k的加權(quán)函數(shù)，lk(n，p，X)是相應(yīng)的多項(xiàng)式。參數(shù)p和X由P"n)的一次矩確定。這種誤差控制的Galerkin預(yù)測是數(shù)值數(shù)學(xué)中研究透徹的方法，通常適用于高分子化學(xué)[參見P.DeuflhardandJ.Ackermann:AdaptiveDiscreteGalerkinMethodsforMacromolecularProcesses,inH.P.DikshitandCharlesA.Michelli,editors:AdvancesinComputationalMathematics,WorldScientificPublishingCo.，Inc.,(1993);J.AckermannandM.Wulkow:MACRON一AProgramPackageforMacromolecularReactionKinectics，Konrad-Zuse-Zentrum，PreprintSC-90-14,(1990),M.WulkowandJ.Ackermann:NumericalSimulationofMacromolecularKinetics-RecentDevelopments,TXZ-iMCM^rA^Vigi*"/*<V，M"c/vg""/,(1990);M.WulkowandJ.Ackermann:TheTreatmeantofMacromolecularProcesseswithChain-Length-DependentReactionCoefficients-AnExamplefromSootFormation,Konrad-Zuse-ZentrumBerlin,Preprint-91-18，(1991);U.BuddeandM.Wulkow:Computationofmolecularweightdistributionsforfreeradicalpolymerizationsystems,Chem.Ing.Sci.46，pages497-508，(1991)，M.Wulkow:NumericalTreatmentofCountableSystemsofOrdinaryDifferentialEquations,ThesisandTechnicalReport-90-8，Konrad-Zuse-ZentrumBerlin,(1990);M.Wulkow:AdaptiveTreatmentofPolyreactionsinWeightedSequenceSpaces,IMPACTComput.Sci.Engrg.4，pages152-193，(1992)。該逼過程)或與上面說明的矩方法相類似的矩方法從p(n，c)得到。在這方面一個(gè)有用的性質(zhì)是生成n個(gè)光子的平均分子亮度，定義為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>，>n以有效光子產(chǎn)率的形式將空間亮度Jl(。特征化，通過與概率分布P^n)關(guān)聯(lián)。通常情況下，對低計(jì)數(shù)率n，分子亮度線性增加，<n>n-n，在激發(fā)光焦點(diǎn)的中心的分子處于最大亮度時(shí)變?yōu)槌?shù)。這個(gè)性質(zhì)使得單個(gè)分子信號明顯區(qū)別于給出恒定分布，、=常數(shù)的隨機(jī)噪聲信號。在下面的三個(gè)實(shí)施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的上述和其它目的、方面和優(yōu)勢將得到更好的理解，其中在實(shí)施例中分析了聚苯乙烯微球面懸浮系列、染料若丹明(dyeRhodamine)6G稀釋系列以及聚苯乙烯微球面和若丹明6G染料的混合物。使用現(xiàn)有技術(shù)的熒光光鐠單元來收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所述熒光光鐠設(shè)備包括在50微瓦的強(qiáng)度下發(fā)射532nm激發(fā)光的光源、內(nèi)置高靈敏度的光電倍增管及數(shù)字相關(guān)器。所使用的焚光光鐠單元具有30納秒的反應(yīng)時(shí)間。用在接連的兩次光子登記之間的計(jì)數(shù)時(shí)鐘脈沖實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)采集。根據(jù)這些收集到的數(shù)據(jù)，可以為不同的區(qū)間寬度At計(jì)算出數(shù)個(gè)光強(qiáng)度軌跡。樣例1:微球面懸浮系列作為第一實(shí)施例，對一個(gè)熒光聚苯乙烯微球面懸浮系列進(jìn)行了分析。圖1示出了為含有摩爾濃度CM-1.9E-10Mol/L的聚苯乙烯樣t球面(滴)的樣本記錄達(dá)3.2秒的典型光照強(qiáng)度跡線。圖2示出了自相關(guān)曲線(對100個(gè)圖1所示的3.2秒跡線平均)。圖3示出了區(qū)間寬度At=0.1毫秒的相應(yīng)的光子計(jì)數(shù)分布p(n，c)。圖4示出了各個(gè)樣本的由熒光相關(guān)光鐠(FCS)取得的分子的數(shù)目(虛線)以及由根據(jù)本發(fā)明的方法取得的分子的數(shù)目(實(shí)線)。作為參考，還示出了理論的下降斜度(未連的方塊)。圖1示出了為含有已知摩爾濃度CM-1.9E-10摩爾/L的0.014微米的滴的樣本記錄的典型光照強(qiáng)度跡線。區(qū)間時(shí)間已調(diào)整為l毫秒。強(qiáng)度峰值表示通過聚焦FCS容量的分子的轉(zhuǎn)變。圖2示出了相應(yīng)的自相關(guān)曲線(對100個(gè)3.2秒環(huán)平均)。擬合導(dǎo)致了擴(kuò)散時(shí)間t=1.74毫秒和在聚焦FCS容量中有n=0.1529個(gè)滴。對數(shù)個(gè)FCS測量求平均的擴(kuò)散時(shí)間為t=1.9U0.33毫秒。該擴(kuò)散時(shí)間確定了滴通過聚焦FCS容量所需的時(shí)間。根據(jù)制造商的信息，采用的熒光光鐠設(shè)備具有VFCS-1飛升(fL)的FCS容量。圖3示出了區(qū)間寬度At=0.1毫秒的相應(yīng)的光子計(jì)數(shù)分布p(n，c)。概率p(n=0，c)=0.79976意味著圖1中約80%的所有光子計(jì)數(shù)為零。使用純凈水的測量給出了背景噪聲級〈n、。is^0.0230642。根據(jù)本發(fā)明，有效容量Veff中的分子的平均數(shù)目〈m〉由上式給出cVeff-〈m〉。-infp("/J-0,c"_<n>n0iSe=0,20038。并因此，根據(jù)本發(fā)明的有效容量Veff結(jié)果是在(CM-1.9E-10Mol/L，NA=6.022E23)Veff=<m>/(CMNa)-1.75fL量級的幅度上，因此，稍大于聚焦FCS的容量。可以注意到，通過減少(增加)區(qū)間寬度At或激發(fā)光強(qiáng)度，該值Veff可能下降(增大)，數(shù)據(jù)未示。通常，Veff取決于儀器參數(shù)以及分子參數(shù)。圖4示出了各個(gè)樣本的由標(biāo)準(zhǔn)FCS分析所得的分子的數(shù)目(虛線)。對每一樣本執(zhí)行兩次測量；每一次測量分別以點(diǎn)(測量I)和星(測量II)所示。該系列的測量以預(yù)定的CM=2.44E-8Mol/L的初始溶液從步驟l開始。這一初始溶液用"混分法，，在12步驟中稀釋。50nL的樣本以50pL水稀釋;所得的100nL—半被拿去測量，另一半作為樣本的下一個(gè)"混分，，步驟的樣本。理想的是，微球面滴的濃度在每一個(gè)稀釋步驟下降兩倍。在步驟13達(dá)到了微球面的最低濃度，導(dǎo)致CM=3E-12Mol/L。在圖4的對數(shù)標(biāo)度中，由標(biāo)準(zhǔn)FCS所得的滴的數(shù)目應(yīng)該如未連接的方塊那樣線性下降。從這一理論行為的小的偏離可能源于在系列"混分，，步驟期間處理小容量中的不確定性。然而，4艮明顯，用標(biāo)準(zhǔn)FCS進(jìn)行的對同一樣本的兩次測量的結(jié)果相差在10%和50%之間。這種差別指示出確定數(shù)目的滴的相當(dāng)大的統(tǒng)計(jì)誤差以及類似的由FCS得到的濃度的不確定性。但是，更激烈的是在低濃度的FCS的表現(xiàn)。對低于CM=3.8E-10M的濃度，F(xiàn)CS方法無法確定正確的濃度，并給出錯(cuò)誤的高值。FCS為在稀釋步驟13中的樣本給出了幅度高于兩個(gè)數(shù)量級的過高的值。上述的FCS的這種表現(xiàn)眾所周知，呈現(xiàn)了FCS方法特別是對低濃度的嚴(yán)重的限制。在下面將看到，相對于現(xiàn)有技術(shù)的FCS方法，本發(fā)明的方法產(chǎn)生了更精確地確定熒光粒子的數(shù)目。如上所示，根據(jù)本發(fā)明，熒光粒子的濃度即在Veff中粒子的數(shù)目〈m〉可由p(n-0,c)確定?？梢宰⒁獾剑琾(n-O，c)能夠在低濃度狀態(tài)下以高的統(tǒng)計(jì)精度測量。分子的相應(yīng)數(shù)目示于圖4(實(shí)線)。本發(fā)明的方法已應(yīng)用于與FCS方法使用的相同的采集數(shù)據(jù)記錄中。因此，沒有進(jìn)行額外的測量來取得本發(fā)明的方法的這些結(jié)果。與FCS得出的值相比，<m>的統(tǒng)計(jì)變化要低得多(在對大約CM=5E-10Mol/L的濃度的1。/。和對最低的濃度CM=3E-12M的10%之間)。更重要的是，測量的濃度遵循正確的理論線性下降斜度，在低至CM=3E-12M的濃度時(shí)也未見檢測極限。樣例2:染料若丹明6G稀釋系列對染料若丹明6G的稀釋系列(與樣例l相同的條件)，得到了類似的結(jié)果。在這里，F(xiàn)CS的檢測極限由裝置(apparus)的靈敏度確定，是在CM=3E-9MoI/L的量級。本發(fā)明證明使?jié)舛鹊臏y量精度甚至比FCS的檢測極限低2%，數(shù)據(jù)未示。對若丹明6G，對熒光光鐠單元的給定裝置參數(shù)，有效容量的值減少到Veff-0.2fL。為了提高熒光粒子產(chǎn)生的光子計(jì)數(shù)信號的統(tǒng)計(jì)意義，選擇相當(dāng)大區(qū)間寬度可能是有益的。與標(biāo)準(zhǔn)分析方法及其后繼方法相比，本發(fā)明能夠以極佳的簡單性和精度檢測非常低的濃度。樣例3:滴(bead)和若丹明6G的混合物對于含有滴和染料若丹明6G(Rh6G)的混合物的樣本的測量給出了有效容量中的粒子的平均數(shù)目<111>=2.2(實(shí)驗(yàn)條件如上)。該值與FCS2.35相似。但是，兩參數(shù)FCS無法單獨(dú)確定每個(gè)物種的濃度。根據(jù)本發(fā)明，滴和Rh6G的濃度可通過各種方法確定。一個(gè)辦法是利用矩方法。對于滴和Rh6G，分別從在上面的樣例1中說明的測量中計(jì)算出單個(gè)分子分布的一次矩Vi(p,eads))=1.55和Vl(p/脇))=1.06。因此，應(yīng)用在測量的分布V！(pt。t)的一次矩和單個(gè)分子分布Vl(Pj的矩之間的關(guān)系可以注意到，值W(p/bea叫)和^(p/Rh6^)將每一物種特征化，與其實(shí)際濃度無關(guān)。對混合物獲得的單個(gè)分子信號的一次矩給出^(Pleads+Rh6G))=1.30,既不與滴的矩?cái)M合也不與染料的矩?cái)M合。為計(jì)算W(P,eads+Rh6G)),應(yīng)用關(guān)系式(<m>(^*〉+<m>(効");)*i/JiV6^+助");)滴對混合物中的信號的作用部分可由關(guān)系式vW+麵))=;c*WC+(1-"*容易得到。我們得出<m>beads=x*<m>=0.95<m>Rh6G=(l-x)*<m>=1.25產(chǎn)生的濃度(以mol/L為單位)是cM(beads)=<m>bead3/(Veff(beads)*NA)1E_9Mol/LCM(Rh6G)=<m>to6G/(Vef￡(Rh6G>*NA)*1E-8Mol/L為這個(gè)樣本的稀釋系列測量的濃度再為兩個(gè)物種生成正確的濃度下降，數(shù)據(jù)未示。確定比率X的替代方法是分別比較滴、Rh6G和混合物的單個(gè)分子分布^(n=l)的第一非零分量。應(yīng)用關(guān)系式以從測量的Pt。t(n-l)得到單個(gè)分子分布P！(1)。利用x-[柳一+薩)-柳(薩)/[柳—)-柳(歸)〗確定比率x，得到值x-0.36±0.15。上述兩種方法都能將混合物與純?nèi)芤簠^(qū)分開來并確定混合物中的每個(gè)物種的濃度幅值的量級。上述方法和樣例適用于確定含有粒子的樣本的特征性質(zhì)的固定的區(qū)間時(shí)間At。這些性質(zhì)依賴于分子物種的光學(xué)物理屬性，其可從為給定區(qū)間時(shí)間記錄的光照強(qiáng)度跡線中提取。因此，區(qū)間寬度的選擇對由上述方法所得的結(jié)果有影響。本發(fā)明延伸到作為At的函數(shù)確定合適或最優(yōu)區(qū)間寬度和確定含有一個(gè)物種粒子或幾個(gè)不同物種的混合物的樣本的特征性質(zhì)Eh.,.，Ei^的另一方法。能夠利用方法對區(qū)間寬度At的依賴來通過例如其擴(kuò)散時(shí)間的動態(tài)特性對分子物種進(jìn)行特征化。一種測量擴(kuò)散時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)方法是熒光相關(guān)光語(FCS)，它利用了光跡線的時(shí)間行為，但忽略了物種的不同的光學(xué)物理屬性。因此，當(dāng)不同亮度的分子物種存在于樣本中時(shí)，F(xiàn)CS方法的應(yīng)用變得困難[參見E.VanCraenenbroeck，G.Matthys，J.Beirlant，andY.Engelborghs:"Astatisticalanalysisoffluorescencecorrelationdata":JournalofFluorescence,9，pages325-331,1999。在以下文獻(xiàn)中說明了區(qū)間時(shí)間對PCH方法的參數(shù)的影響，[ThomasD.Perroud，BoHuang,RicardN.Zare,"Effectofbintimeonthephotoncountinghistogramforone-photonexcitation",ChemPhysChem:6，pages卯5-912,(2005)和對FIDA的參數(shù)的影響[參見KaopoPalo，tloMets，StefanJ3ger，PeetKask，andKarstenGall:"Fluorescenceintensitymultipledistributionanalysis:Concurrentdeterminationofdiffusiontimesandmolecularbrightness",BiophysicalJ.79，pages2858-2866,(2000)。這些方法分別被稱為時(shí)間依賴性光子計(jì)數(shù)多區(qū)間(PCMH)和熒光強(qiáng)度多分布分析(FIMDA)。PCMH和FIMDA已經(jīng)被用來同時(shí)測量分子物種的擴(kuò)散時(shí)間和分子亮度。已經(jīng)示范了由混合物確定濃度和確定蛋白質(zhì)-配體的相互作用的結(jié)合常數(shù)的FIMDA的應(yīng)用。FIMDA的應(yīng)用以及PCMH的應(yīng)用有幾個(gè)缺點(diǎn)。1.為每一個(gè)區(qū)間寬度確定分子亮度需要一個(gè)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)和數(shù)值上不穩(wěn)定的非線性擬合過程。2.這兩種方法都依賴于復(fù)雜的公式來說明模型參數(shù)對區(qū)間寬度的依賴。3.此外，這些公式是基于未保存的特設(shè)假設(shè)(adhocassumption)。根據(jù)本發(fā)明的另一方法涉及對一系列不同的時(shí)間寬度At確定含有根據(jù)本發(fā)明的上述第一種方法說明的粒子的樣本的特征性質(zhì)。對固定區(qū)間寬度確定的特征性質(zhì)在這里理解為作為區(qū)間寬度At的函數(shù)。因此，本發(fā)明的另一方法包括如下步驟1)將在觀察時(shí)間r-f△、的連續(xù)預(yù)定時(shí)間間隔Ati-[tw，tj)(i=,=11,...，N)內(nèi)登記的光子事件的數(shù)目ni(計(jì)數(shù)率)進(jìn)行登記和計(jì)數(shù)，其中At產(chǎn)At=常數(shù)，2)確定在預(yù)定時(shí)間間隔At內(nèi)的光子事件數(shù)目n的分布函數(shù)p(n)，和3)執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明上述第一方法的其它步驟；還包括進(jìn)一步的步驟4)使用不同的時(shí)間間隔Atk(k=lv..，K)重復(fù)步驟l)至3)K次，并且通過每一系列的這些步驟確定相同的特征性質(zhì)Eb...，Eu5)確定特征性質(zhì)Eh...，EL對Atk的依賴，和6)從根據(jù)步驟5)的測量的依賴來確定合適的或最優(yōu)At或粒子的其它特性?？梢岳米鳛閰^(qū)間時(shí)間At的函數(shù)的特征性質(zhì)的知識來執(zhí)行以下操作1.為上述的根據(jù)本發(fā)明的第一種方法的區(qū)間時(shí)間選擇一個(gè)合適的或最優(yōu)的值，2.特征化分子物種，3.通過將給定的分析函數(shù)與測量的依賴擬合來獲得另一特征性質(zhì)，4.識別混合物中分子物種并計(jì)算其濃度。時(shí)間間隔(區(qū)間寬度)At14(k=l，...，K)能夠在10"秒和幾秒之間選擇。特征性質(zhì)的一個(gè)例子是單個(gè)分子的有效亮度，對于小的區(qū)間寬度，有效亮度是高的，對于大的區(qū)間寬度，有效亮度下降(參見樣例4)。亮度的下降源于可見分子遠(yuǎn)離激光焦點(diǎn)的擴(kuò)散。因此，最高亮度和亮度的斜率特征化了分子物種。離散區(qū)間寬度可以選擇為在對數(shù)標(biāo)度上等距離，例如Atk-0.8秒，k-0，…，72。最高亮度Jlm^對區(qū)間寬度的依賴生成了實(shí)驗(yàn)的衰減函數(shù)，它是特定物種的分子的亮度和大小的特征。通過測量的依賴來計(jì)算這種函數(shù)可以高速(在幾秒鐘之內(nèi))執(zhí)行。從原理上講，能夠?qū)蝹€(gè)物種的粒子的所有性質(zhì)確定這種對區(qū)間寬度At的依賴，其已經(jīng)如上對根據(jù)本發(fā)明的第一種方法進(jìn)行了說明。度At的測量依賴擬合。特征性質(zhì)可以是要測量的樣本中的分子的特定物種。進(jìn)一步的特征性質(zhì)可以是樣本中的幾個(gè)物種的分子的混合物中的部分濃度。k測量的依賴可以與已經(jīng)測量的依賴或理論函數(shù)比較，以確定樣本中的分子的特定物種或分子的部分濃度。根據(jù)已測量的依賴的疊加或理論函數(shù)通過非線性擬合將特征性質(zhì)對區(qū)間寬度At的測量依賴引入，以確定樣本中的粒子的特定物種或特定物種的粒子的部分濃度。在一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的方法的特定應(yīng)用中，測量了分布函數(shù)p(nk，Atk)(k=l，...，K)，并且通過適當(dāng)?shù)臄M合過程，從p(n、At"來確定最大亮度函數(shù)H皿x(Atk)作為特征性質(zhì)。上述方法還可進(jìn)一步包括，通過適當(dāng)?shù)臄M合函數(shù)，從Hmax(At)來確定時(shí)間極限At—0的nmax(At)、擴(kuò)散運(yùn)動、擴(kuò)散時(shí)間td和/或裝置的結(jié)構(gòu)參數(shù)SP。作為進(jìn)一步的步驟，從flmax(At)來確定衰減時(shí)間Tp和/或樣本中特定物種的粒子的比例。在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一樣例中，可以測量有數(shù)個(gè)物種的粒子的樣本，其中確定pmax(Atk),通過公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>由先前測量的或以其它方式確定的pmax，s(At)來確定樣本中物種s的摩爾比例Xs?？商鎿Q地，通過將參數(shù)OSXSl)(s-l，...，S)與邊界條件^Xs=l進(jìn)行非線性擬合來確定樣本中物種的摩爾比例Xs。在下面的另外的樣例4和5中，例示了特征對區(qū)間寬度At值的依賴。示例4:特征性質(zhì)的一個(gè)說明性的例子是由公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>計(jì)算的亮度值gmax，其中Vl(p)和v2(p)是測量的概率分布的一次矩和二次矩。在高亮度的情況下，即對vAp^xn、。ise，噪聲作用〈n、。ise可以忽略。由上式計(jì)算的亮度值p隨是高斯分布ji():=ftmaxexp(-2r2/a2)的亮度函數(shù)fi(F)的最大值，但也是其它分布類型的特征亮度值。在ConSense檢測系統(tǒng)(FIuITBiosystems，圣奧古斯丁(SanktAugustin)，德國，http:〃www.fluit-biosystems.de)中觀'量了含有摩爾濃度C-56E-10M的染料ATT0532(ATTOTEC，希根，德國)的樣本。記錄了3分鐘的熒光強(qiáng)度的光跡，并用虛擬實(shí)驗(yàn)室軟件(FIuITBiosystems)分析。對從1秒到幾微秒(1(T6秒)的范圍內(nèi)的各種區(qū)間時(shí)間，構(gòu)建了概率分布p(n，c)。特別是，我們選擇離散區(qū)間時(shí)間Atn=At00.8n秒，n=0，1，2，3，.."72，At0=ls。對于每個(gè)區(qū)間時(shí)間和相應(yīng)的概率分布p(n，c)，通過p(n，c)的一次和二次矩計(jì)算亮度值nmax，見上面的公式。所得的Jlmax值取決于應(yīng)用的區(qū)間時(shí)間，在圖5繪出了對應(yīng)于At的fimax。因此，特征性質(zhì)Jlmax被理解為是At的函數(shù)，在下面以flmax(At)表示。最大亮度Hmax可以解釋為激光焦點(diǎn)的中心的單個(gè)分子的亮度。通過擴(kuò)散，位于中心的單個(gè)分子移離中心，并且其亮度(以每秒計(jì)數(shù)為單位，CPS)下降。因此，對長的區(qū)間時(shí)間At，測量的有效最大亮度Pmax(At)下降。對短的區(qū)間時(shí)間，有效最大亮度變大。物種的(有效)亮度值取決于區(qū)間寬度At。在圖5中繪制的曲線可與具有參數(shù)P咖x(At-O)、^和SP的分析函數(shù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>擬合。參數(shù)fimax(At=0)、IV和SP分別指在極限短的區(qū)間時(shí)間時(shí)的最大亮度、衰減時(shí)間和光學(xué)裝配的結(jié)構(gòu)參數(shù)。擬合給出亮度值fi咖x(At=0)=15.1kcps，衰減時(shí)間^=0.731ms，和結(jié)構(gòu)參數(shù)2。亮度值pmax(At=O)和衰減時(shí)間^是在給定光學(xué)裝配中的分子物種的特征性質(zhì)。亮度值ji皿(At-O)取決于分子的光學(xué)物理性質(zhì)和最大局部激光光強(qiáng)度。衰減時(shí)間^與分子的擴(kuò)散常數(shù)，即其水動力學(xué)半徑和共焦檢測容量成正比。為了說明光學(xué)裝配的影響，對含有摩爾濃度3.0.1(T"M的染料ATTO的樣本測量了兩次。首先，使用直徑為100nm的針孔來降低背景噪聲，用ConSense檢測系統(tǒng)記錄3分鐘樣本的熒光光強(qiáng)度的光跡。在第二個(gè)裝配中代之以測量30秒帶有75nm直徑的針孔的相同的樣本。如上所述分析熒光光強(qiáng)度的兩個(gè)光跡；在圖6中示出了獲得的兩個(gè)裝配的亮度函數(shù)。針孔直徑的直徑從100fiin減少到75pm也導(dǎo)致衰減時(shí)間1>從0.567毫秒下降到0.343毫秒。較小的針孔直徑產(chǎn)生檢測容量的較小的尺寸，并因此減小了衰減時(shí)間。樣例5:為了辨別樣本中的不同分子物種，可以利用特征性質(zhì)對區(qū)間時(shí)間的依賴。在第一步，必須對探針中的所有可能的分子物種測量特征性質(zhì)及其對區(qū)間時(shí)間的依賴。在圖7和表1中描繪了一個(gè)典型的情況。已經(jīng)為熒光染料測量了亮度函數(shù)H，x(At);如樣例4中所示，已經(jīng)用非線性擬合確定了參數(shù)Jl,x(At-0)和T"已經(jīng)使用此染料標(biāo)記了一種抗體。由于抗體要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于染料，所以對標(biāo)記抗體測量的該衰減(fadeout)時(shí)間Tf255fis遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于為純?nèi)玖蠝y量的衰減時(shí)間Tp=33jis。標(biāo)記的抗體以衰減時(shí)間和其較高的亮度值來區(qū)別于染料。最有可能是每個(gè)抗體分子由兩個(gè)染料分子標(biāo)記；這由抗體的高亮度值Jlmax(At-O)標(biāo)示。另一方面，抗體能結(jié)合到(bind)蛋白質(zhì)上。為了特征化復(fù)雜抗體+蛋白質(zhì)，超過樣本來提供蛋白質(zhì)?？梢宰⒁獾剑鞍踪|(zhì)分子沒有標(biāo)記，并且在沒有加到熒光抗體上時(shí)是黑的。較長的衰減時(shí)間s=663jis對應(yīng)于復(fù)合體的增加的直徑。蛋白質(zhì)的結(jié)合減少了抗體分子的亮度值，這表明蛋白質(zhì)取代了兩個(gè)染料分子中的一個(gè)。蛋白質(zhì)可以結(jié)合到聚合物上。超過溶液地添加聚合物產(chǎn)生只包含復(fù)雜抗體+蛋白質(zhì)+聚合物(和黑的分子)的樣本。由長的衰減時(shí)間Tp=1611jis標(biāo)示出，這個(gè)復(fù)合物是相當(dāng)大的。減少的亮度值可以被解釋為有相當(dāng)大群體的分子處于電子三重態(tài)。三重態(tài)壽命和群體可通過文獻(xiàn)中說明的對三重態(tài)對亮度的影響進(jìn)行建才莫[JerkerWidengren，tloMets，andRudolfRigler:FluorescenceCorrelationSpectroscopyofTripletStatesinSolution:ATheoreticalandExperimentalStudy,C^附/勿，99，pages13368-13379(1995)并采用非線性擬合方法來得到?？梢赃x擇一個(gè)適當(dāng)?shù)幕蜃顑?yōu)的區(qū)間時(shí)間At來區(qū)分一個(gè)區(qū)間時(shí)間的不同的復(fù)合物。因此，必須選擇這樣的區(qū)間時(shí)間，即在該區(qū)間時(shí)間時(shí)每個(gè)物種的亮度值是相互很好分離的。圖7中以AT^示出了一個(gè)例子，在ATJ斤有組成成分都具有不同的亮度值。參見圖7，不好的選擇是AT2,因?yàn)閺?fù)雜抗體+蛋白質(zhì)+聚合物和染料在此區(qū)間時(shí)間有相同的亮度。在抗體、蛋白質(zhì)和聚合物的混合物中，在表l所列的復(fù)合物可能中的這些復(fù)合物中的每一個(gè)的摩爾濃度。這對于用標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列測量結(jié)合常數(shù)是特別重要的。含有S種不同物種的混合物的樣本的亮度曲線(具有預(yù)定的各自的亮度函數(shù)nmax，s(At)，s=l，2""，S)由/^ax(A0=1>乙(")義,/(^>隨,(AOI,)給出。參數(shù)XsS-l，2，."，S能夠用非線性擬合來確定，并且描述了成分s的相對摩爾份數(shù)，!'=1Cs是組分s的濃度。在本例中，參見表l，組分的數(shù)目為4。必須應(yīng)用圖7所示的四個(gè)亮度函數(shù)來通過非線性擬合算法得到相應(yīng)的摩爾份數(shù)Xss=l，2，3，4。權(quán)利要求1.一種確定含有至少一個(gè)物種的粒子的樣本的特征性質(zhì)的方法，所述粒子在觀察容量中發(fā)射、散射和/或折射光子，其特征在于，該方法包括如下步驟1)將在觀察時(shí)間<mathsid="math0001"num="0001"><math><![CDATA[<mrow><mi>T</mi><mo>=</mo><munderover><mi>&Sigma;</mi><mrow><mi>i</mi><mo>=</mo><mn>1</mn></mrow><mi>N</mi></munderover><mi>&Delta;</mi><msub><mi>t</mi><mi>i</mi></msub></mrow>]]></math>id="icf0001"file="A2007800510310002C1.tif"wi="19"he="11"top="57"left="75"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/></maths>的連續(xù)時(shí)間間隔Δti＝[ti-1，ti)(i＝1，2，3，...)內(nèi)登記的光子事件的數(shù)目ni(計(jì)數(shù)率)進(jìn)行登記和計(jì)數(shù)，2)確定在預(yù)定時(shí)間間隔Δt內(nèi)的光子事件數(shù)目n的分布函數(shù)p(n)，和3)使用在期望的分布函數(shù)p(n)、濃度c、每一光子事件只是源自單個(gè)粒子的理想實(shí)驗(yàn)中在預(yù)定時(shí)間間隔Δt內(nèi)期望的光子事件數(shù)目n的單個(gè)粒子分布函數(shù)P1(n)、以及有效容量Verr＝&lt;m&gt;/c之間的理論關(guān)系來確定P1(n)、Veff、濃度c和/或其它特征性質(zhì)，其中&lt;m&gt;是對每一個(gè)計(jì)數(shù)率起作用的粒子的平均數(shù)，其可通過將這些性質(zhì)與測量的p(n)進(jìn)行擬合來確定。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，基于馬爾可夫過程理論的單個(gè)粒子分布函數(shù)PKn)由下式給出<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，&(11=0)=0，其中jt(F)表示粒子的亮度函數(shù)，其由在位置F的單個(gè)粒子的光子事件的平均值和泊木>分布Poi(n，n)=exp(卞X/n！定義。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，亮度函數(shù)通過對多個(gè)位置？測量fi并在這些位置之間插值H來確定。4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，亮度函數(shù)由基于分子熒光光譜理論的理論模型和空間激光強(qiáng)度的給定模型來確定。5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于，P"n)由亮度函數(shù)H(F)來確定。6.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于，Veff由亮度函數(shù)n(。來確定。7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，亮度函數(shù)由P"H)或Veff來確定。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，P"n)或Veff被直接測量。9.如權(quán)利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于，相同物種的粒子發(fā)熒光或用熒光標(biāo)記，并由激光束激發(fā)。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函數(shù)n(0的最大值由分布函數(shù)的一次矩來確定〃咖一。11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函數(shù)jif)的最大值由分布函數(shù)的一次矩和噪聲作用來確定12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函數(shù)n。通過具有參數(shù)aj和不同的亮度函數(shù)(j=1，2，...，尺)的不同的亮度函數(shù)的疊加來建^^。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，每一個(gè)亮度函數(shù)0}=1，2，...，10由給定數(shù)目的M個(gè)特征參數(shù)Hjk(k=l，2，…，M)來確定。14.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函數(shù)n(。由空間高斯分布〃(。:-A,exp(-2r2/。2),來建模，其中Hmax是激光焦點(diǎn)中心中的粒子的亮度，a表示激光束的腰部參數(shù)。15.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函數(shù)n(F)通過具有參數(shù)nn和nj2(j-l，2,…，K)的高斯分布的疊加來建模。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，特征參數(shù)njk(j=l，2，...，K;k=l，2，...，M)由標(biāo)準(zhǔn)去巻積方法來確定。17.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，特征參數(shù)jijk(j=l，2,.."K;k=l，2，…,M)由迭代Richardson-Lucy去巻積算法來確定。18.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，單個(gè)粒子分布函數(shù)P"n)由<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>給出，其中P(n/)是在時(shí)間點(diǎn)to位于位置F的單個(gè)粒子在時(shí)間間隔te=[t0，t。+At)期間計(jì)數(shù)的光子事件的數(shù)目的分布。19.如權(quán)利要求1至18中任一所述的方法，其特征在于，基于馬爾可夫過程理論，使用在概率分布函數(shù)p(n，c)和單個(gè)粒子分布函數(shù)P"n)之間的理論關(guān)系/K",c)-尤Poi'(附，W)尸J")其中P4n)表示單個(gè)粒子分布函數(shù)PAn)的第m巻積'1，和20.如權(quán)利要求1至19中任一所述的方法，其特征在于，概率分布函數(shù)p(n，c)通過遞推公式來計(jì)算，其中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>21.如;K利要求1至20中任一所迷的方法，其特征在于，粒子的濃度c由得到計(jì)數(shù)率為0的概率來確定c=-lnO("-0，c))/Kejr22.如權(quán)利要求1至20中任一所述的方法，其特征在于，粒子的濃度c由得到計(jì)數(shù)率為0的概率和噪聲作用〈n、。iM來確定c-[-ln(/7("-0,c))-〈"〉J/々23.如權(quán)利要求1至22中任一所述的方法，其特征在于，粒子的平均數(shù)目<1>由得到計(jì)數(shù)率為0的概率來確定〈》i>--ln(p("-O，c))24.如權(quán)利要求1至22中任一所述的方法，其特征在于，粒子的平均數(shù)目〈m〉由得到計(jì)數(shù)率為0的概率和噪聲作用〈n、。ke來確定25.如權(quán)利要求1至24中任一所述的方法，其特征在于，單個(gè)粒子概率分布函數(shù)P"n)通過遞推公式辨-丄&聰"-W《附〉"S來計(jì)算。26.如權(quán)利要求1至25中任一所述的方法，其特征在于，分布函數(shù)p(n，c)通過與泊々〉分布巻積<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>以考慮額外的背景信號(例如硬件的隨機(jī)噪聲)來確定。27.如權(quán)利要求1至26中任一所述的方法，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1的步驟(3)的特征性質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)非線性多參數(shù)擬合過程來確定。28.如權(quán)利要求1至26中任一所述的方法，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1的步驟(3)的特征性質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)矩方法來確定。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，單個(gè)粒子概率分布函數(shù)的矩通過遞推公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>來計(jì)算。30.如權(quán)利要求24、26和29中任一所述的方法，其特征在于，噪聲作用-n、。^通過使用沒有任何所述物種粒子的樣本的介質(zhì)液體或使用與樣本具有相同或相似性質(zhì)的液體以使〈n、。ke在權(quán)利要求1的步驟(3)中固定來直接測量。31.—種確定含有N個(gè)不同物種的粒子的混合物的樣本的特征性質(zhì)的方法，所述粒子在觀察容量中發(fā)射、散射和/或折射光子，其特征在于，混合物的總體分布函數(shù)？(11;<^，<;2，...，(^)由單個(gè)物種作用p(s)(n;cs)，s=1，2，...，N的巻積來確定/7(";0,，<;2，."，)=由此單個(gè)物種作用p，n;Cs)是根據(jù)權(quán)利要求1至30中之一由預(yù)定有效容量Veff、在混合物中存在的每一物種s的單個(gè)粒子分布函數(shù)P嚴(yán)(n)以及給定的實(shí)驗(yàn)裝配來確定。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，參數(shù)cs，(s=1，2，...，N)和噪聲作用<n>n。ise通過使用預(yù)定參數(shù)與理論模型的非線性擬合來確定。33.如權(quán)利要求31或32所述的方法，其特征在于，p(n;q,C2,".，CN)的計(jì)算通過生成函數(shù)法加快。34.如權(quán)利要求31或32所述的方法，其特征在于，要求的參數(shù)由矩方法確定，由此卩(11;<:1，(!2，...，<^)的矩由？(8)(11;0的矩的乘積來表示，s=1，2，""N。35.—種確定含有至少一個(gè)物種的粒子的樣本的特征性質(zhì)Eb...,EL的方法，所述粒子在預(yù)定的觀察容量中發(fā)射、散射和/或折射光子，其特征在于，該方法包括如下步驟1)將在觀察時(shí)間r-^Ati的連續(xù)預(yù)定時(shí)間間隔AtiH小ti)(i=1，2,3，…)內(nèi)登記的光子事件的數(shù)目Hi(計(jì)數(shù)率)進(jìn)行登記和計(jì)數(shù)，其中M=:At=常數(shù)，2)確定在預(yù)定時(shí)間間隔At內(nèi)的光子事件數(shù)目n的分布函數(shù)p(n)，和3)根據(jù)權(quán)利要求1至34中之一執(zhí)行其它步驟；還包括進(jìn)一步的步驟4)使用不同的時(shí)間間隔Atk(k=l，...，K)重復(fù)步驟l)至3)K次，通過每一系列的這些步驟確定相同的特征性質(zhì)E1v..，El,5)確定特征性質(zhì)E!，…，EL對A一的依賴，6)從根據(jù)步驟5)的測量的依賴來確定最優(yōu)At或粒子的其它特性。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，時(shí)間間隔Atk(k=l，".，K)在l(T6秒和1秒之間。37.如權(quán)利要求35或36所述的方法，其特征在于，時(shí)間間隔Atk(k=l,...，K)選擇為在對數(shù)標(biāo)度上等距離。'38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，Atk=0.8k秒，其中k=0，.."72。39.如權(quán)利要求35至38所述的方法，其特征在于，根據(jù)步驟5)通過標(biāo)準(zhǔn)擬合過程來將給定的分析函數(shù)與測量的依賴進(jìn)行擬合。40.如權(quán)利要求35至39中任一所述的方法，其特征在于，根據(jù)步驟4)和5)的特征性質(zhì)Elv.，，EL中的一個(gè)是樣本中的粒子的特定物種。41.如權(quán)利要求35至40中任一所述的方法，其特征在于，根據(jù)步驟4)和5)的特征性質(zhì)Eb...，Et中的至少一些是樣本中的混合物中的數(shù)個(gè)物種的粒子的部分濃度。42.如權(quán)利要求35至41中任一所述的方法，其特征在于，將根據(jù)步驟5)的測量依賴與已測量的依賴或理論函數(shù)相比較，以識別樣本中的粒子的特定物種或特定物種的粒子的部分濃度。43.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，根據(jù)已測量的依賴的疊加或理論函數(shù)通過非線性擬合將測量依賴引入，以確定樣本中的粒子的特定物種或特定物種的粒子的部分濃度。44.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，測量分布函數(shù)p(nk，Atk)(k=l，...，K)，并且通過適當(dāng)?shù)臄M合過程，從p0ik，At"來確定最大亮度Ji，x(At)作為特征性質(zhì)。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，作為進(jìn)一步的步驟，通過適當(dāng)?shù)臄M合函數(shù)，從Hmax(At)來確定極限At—0時(shí)的pmax(At)、擴(kuò)散運(yùn)動、擴(kuò)散時(shí)間TD和/或裝置的結(jié)構(gòu)參數(shù)SP。46.如權(quán)利要求44或45所述的方法，其特征在于，其中，作為進(jìn)一步的步驟，從jimax(At)來確定衰減時(shí)間iv和/或樣本中粒子的特定物種的比例。47.如權(quán)利要求44所迷的方法，其特征在于，在有數(shù)個(gè)物種的粒子的樣本中，確定flmax(At)，并且通過公式由先前測量的或以其它方式確定的nmax，s(At)來確定樣本中物種s的摩爾比例Xs。48.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，在有數(shù)個(gè)物種s的粒子的樣本中，確定n咖x(At)，并且通過將參數(shù)0SXs5l(s-l，…，S)與邊界條件^Xs=1進(jìn)行非線性擬合來確定樣本中物種的摩爾比例Xs。全文摘要本發(fā)明提供了一種確定含有至少一個(gè)物種的粒子的樣本的特征性質(zhì)的方法，所述粒子是在預(yù)定的觀察容量中發(fā)射、散射和/或折射光子的物種的粒子，該方法包括如下步驟1)將在觀察時(shí)間T＝∑^N_i=1Δt_i的連續(xù)時(shí)間間隔Δt_i＝[t_i-1，t_i)(i＝1，2，3，...)內(nèi)登記的光子事件的數(shù)目n_i(計(jì)數(shù)率)進(jìn)行登記和計(jì)數(shù)，2)確定在預(yù)定時(shí)間間隔Δt內(nèi)的光子事件數(shù)目n的分布函數(shù)p(n)，和3)使用在期望的分布函數(shù)p(n)、濃度c、在每一光子事件只是源自單個(gè)粒子的理想實(shí)驗(yàn)中在預(yù)定時(shí)間間隔Δt內(nèi)期望的光子事件數(shù)目n的單個(gè)粒子分布函數(shù)P₁(n)、以及有效容量V_eff＝<m>/c(其中<m>是對每一個(gè)計(jì)數(shù)率有作用的粒子的平均數(shù))之間的理論關(guān)系來確定P₁(n)、V_eff、濃度c和/或其它特征性質(zhì)，其中<m>是對每一個(gè)計(jì)數(shù)率有作用的粒子的平均數(shù)，其可通過將這些性質(zhì)與測量的p(n)進(jìn)行擬合來確定。文檔編號G01N21/64GK101627298SQ200780051031公開日2010年1月13日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權(quán)日2006年12月28日發(fā)明者H·馬蒂斯,J·阿克曼申請人:Fluit生物系統(tǒng)有限公司