專利名稱：用于試樣結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法和熒光顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及試樣結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像方法。此外，本發(fā)明還涉及一種與此相反的方法。此外，本發(fā)明還涉及用于實施該方法的熒光顯微鏡。
背景技術(shù)：
WO2004/090617公開了一種方法。在此，在用轉(zhuǎn)換信號將物質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)時均只有試樣的特定空間區(qū)域針對性地發(fā)出。該區(qū)域是具有零點的干涉模式的強度最小值，而轉(zhuǎn)換信號的強度已經(jīng)在零點的所有環(huán)境中的大小使其超過將物質(zhì)完全轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的飽和極限值。以此方式，從各自保留在第一狀態(tài)下的一部分物質(zhì)發(fā)出的光學測量信號可以設(shè)置針對性地用轉(zhuǎn)換信號發(fā)出的試樣區(qū)域。因此，在用物質(zhì)標記的感興趣的試樣結(jié)構(gòu)成像時，空間分辨率不再取決于在所用傳感器陣列上試樣成像的空間分辨率極限。更精確而言，空間分辨率是由轉(zhuǎn)換信號零點的延伸確定的，在此之內(nèi)物質(zhì)還處于第一狀態(tài)，因為從零點周圍環(huán)境沒有測量信號，相應(yīng)地也不必設(shè)置待從零點分離的空間位置。因此，在感興趣的試樣結(jié)構(gòu)空間成像時，可能的是，不會超出分辨率極限(即通過雙倍數(shù)量的口徑分散的通過光波長給定的衍射條件的Abbe'sche極限)，其基本上限制了成像的光學方法的空間分辨率并且直接取決于最長波長的相關(guān)光學信號。
在試樣內(nèi)部的轉(zhuǎn)換信號的零點位置的確定可以由測量信號的強度分布是通過具有比成像的空間分辨率極限更高精度的傳感器陣列而進行的，只要確定測量信號僅來自于該零點的區(qū)域。在確定位置時可達到的精度除了取決于零點的大小外，原則上僅取決于傳感器陣列的像素密度，機或CMOS照相機，以及取決于所得的
信噪比和成像的點成像函數(shù)的寬度。具體而言，在確定位置時可達到的
精度甚至遠遠在通過成像比例分散的傳感器陣列的像素的距離之下；在 良好的信噪比時甚至遠低于1納米，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
眾所周知，該現(xiàn)象即使在確定發(fā)熒光的單個分子在試樣中的位置時 也加以利用。但是在此的前提條件是，發(fā)熒光的單個分子與它們各自最 近鄰的分子的距離大于在傳感器陣列上試樣成像的空間分辨率極限，因 為另一方面從傳感器陣列接收到的光學測量信號與發(fā)熒光的單個分子互 相結(jié)合。在此發(fā)生時，單個分子的位置無法沒有困難地加以確定。
在由WO2004/0卯617 A2公開的方法和所有的其他方法中，用發(fā)出 測量信號的物質(zhì)，尤其是發(fā)熒光的物質(zhì)，標記感興趣的試樣結(jié)構(gòu)，物質(zhì) 分子在試樣中的密度的大小，使得單個分子與它們最近鄰的分子的距離 僅對應(yīng)于傳感器陣列上試樣成像的空間分辨率極限的一小部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法以及實施方法的裝置，利用該方法 在感興趣的試樣結(jié)構(gòu)成像時無法超越衍射極限，而不必為此將具有空間 上精細結(jié)構(gòu)化的強度分布的轉(zhuǎn)換信號施加在試樣上。
本發(fā)明的目的是通過根據(jù)本發(fā)明的方法以及根據(jù)本發(fā)明的裝置實現(xiàn)的。
在根據(jù)本發(fā)明的第一新方法中，記錄從第二狀態(tài)中的物質(zhì)的各部分 發(fā)出的光學測量信號，在將一部分物質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信 號的強度，使得各自轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的分子的主要百分比部分與其最近 鄰的第二狀態(tài)中的分子的距離大于在傳感器陣列上試樣成像的空間分辨 率極限。對于屬于該主要百分比部分的物質(zhì)的每個分子，其在試樣中的 位置是以基本已知的極高的位置分辨率從由其發(fā)出的光學測量信號通過 傳感器陣列的強度分布而確定的，該位置分辨率明顯低于在傳感器陣列 上試樣成像的空間分辨率極限。但這也允許用物質(zhì)標記的感興趣的試樣結(jié)構(gòu)以極高的位置分辨率成像。只須不斷將物質(zhì)的其他分子轉(zhuǎn)換至第二 狀態(tài)，在此該分子屬于第二狀態(tài)中的物質(zhì)的主要百分比部分的分子，其 與第二狀態(tài)中的與其最近鄰的分子的距離大于在傳感器上的試樣成像的 空間分辨率極限。但這不成問題，因為適合于這些條件的分子的選擇是 基于躍遷概率，因而服從統(tǒng)計學規(guī)律。因為通過每次變換循環(huán)以統(tǒng)計學 方式看，物質(zhì)的其他分子更早轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)，所以對于用物質(zhì)標記的 總是具有更高密度的試樣結(jié)構(gòu)詢問單個物質(zhì)分子的位置。這些位置之和 是用新方法獲得的感興趣結(jié)構(gòu)的成像，其具有遠超過通常分辨率極限的 位置分辨率。在此，甚至單個分子可重復屬于滿足在此提出的標準的選 擇。然后，在總是只有較小比例的總計存在于試樣所考慮的范圍內(nèi)的分 子轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)并滿足距離標準時，其精確位置可多重確定的分子的 比例對于在通常重復將一部分物質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)時只有一次屬于可精 確地確定位置的主要百分比部分的分子而言是可忽略的。即使該比例更 大，由此可能損害效率，特別是速度，但是不損害新方法的功能?；?此，通過選擇用于以最高位置分辨率定位的分子，由于躍遷概率，實施 其定位的分子的總量在足夠大的數(shù)量時，即足夠大的抽驗數(shù)量時，根據(jù) 統(tǒng)計學規(guī)律是存在于試樣中的物質(zhì)分子的總量的代表，因而是用其標記 的感興趣的試樣結(jié)構(gòu)的代表。
為了可以由來自第二狀態(tài)中的物質(zhì)分子的測量信號通過傳感器陣列 的強度分布確定的分子在試樣中的位置的位置分辨率高于在傳感器陣列 上試樣成像的空間分辨率極限，應(yīng)當理解傳感器陣列的像素的柵距必須 至少小于空間分辨率極限與成像的成像系數(shù)之積。柵距優(yōu)選最大僅為空 間分辨率極限與成像的成像系數(shù)之積的一半，從而使來自一個分子的測 量信號分配到傳感器陣列的至少四個像素上。傳感器陣列的像素的更小 的柵距是與在確定分子在試樣中的位置時位置分辨率沒有相應(yīng)地提高相 關(guān)聯(lián)的。反而產(chǎn)生信噪比明顯變差的危險。柵距是空間分辨率極限與成
像的成像系數(shù)之積的60至10%，所以通常是最有利的。
8各自在--個時間點轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的分子的主要百分比至少為 10%,其滿足在第二狀態(tài)中的分子的距離大于在傳感器陣列上試樣成像 的空間分辨率極限的標準。尤其是當?shù)诙顟B(tài)中的相互距離較小的分子 的與此互補的百分比比較大時，重要的是，將由此發(fā)出的測量信號或其 通過傳感器陣列的強度分布與由足夠距離外的分子發(fā)出的測量信號分 離。這可以如下方式進行，檢驗測量信號的總強度、測量信號通過傳感 器陣列的強度分布的形狀和/或面積是否對應(yīng)于單個或多個分子。僅對于 相應(yīng)于單個分子的情況，由強度分布確定這些分子的位置。應(yīng)當理解有 意義的是，對于盡可能大的百分比的所記錄的局部強度分布，可以確定 物質(zhì)的單個分子的位置及因此感興趣的試樣結(jié)構(gòu)的位置。因此，優(yōu)選地 盡可能大的百分比的均轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的分子與第二狀態(tài)中的相鄰分子 之間具有所需的距離。該百分比以該順序以增加的量而占先。然而，意 義不大的是，試驗對于所有轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的分子而言，避免其不具有 同樣處于第二狀態(tài)且距離小于在傳感器上的試樣成像的空間分辨率極限 的相鄰分子，因為在此各自可處于第二狀態(tài)的分子的平均距離非常大， 所以在轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的過程之后可以確定的分子位置的數(shù)量再次減 少。利用轉(zhuǎn)換信號的強度，感興趣的試樣結(jié)構(gòu)最終可以最迅速地成像， 即通過最少次重復的轉(zhuǎn)換過程，最終取決于在測量信號通過傳感器陣列 的強度分布之間加以區(qū)分的復雜程度的大小，其歸于僅一個第二狀態(tài)的 分子或者第二狀態(tài)的兩個或更多個相鄰的分子。
雖然由于其更簡單的可操作性而優(yōu)選為光學轉(zhuǎn)換信號，因為該新方
法即使沒有試樣范圍中的轉(zhuǎn)換信號的空間結(jié)構(gòu)化也是可以的，所以轉(zhuǎn)換
信號實際上也可以是非光學信號。利用光學轉(zhuǎn)換信號例如可以容易地用 轉(zhuǎn)換信號的不同強度進攻試樣的不同區(qū)域，從而考慮用以標記感興趣的
試樣結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在這些不同區(qū)域內(nèi)以明顯不同的濃度存在。然而，在該 新方法中通過尺寸大于傳感器陣列上試樣成像的空間分辨率極限的區(qū)域 的轉(zhuǎn)換信號的強度總是具有恒定的值?？梢跃唧w地確定該恒定的值與物質(zhì)在試樣的該區(qū)域中的平均局部濃度成反比。為了確定該濃度，首先物 質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的比例大于之后在單個分子定位時的情況，為此也調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)換信號的強度大于用傳感器陣列定位單個分子時的情況。因此，得 出的測量信號通過傳感器陣列的強度分布對應(yīng)于通過試樣的第二物質(zhì)的 濃度分布，其中該濃度分布的位置分辨率通過在傳感器陣列上試樣成像 的空間分辨率極限而加以確定。
為了非常迅速地確定，由試樣對應(yīng)于傳感器陣列的多個像素的區(qū)域 發(fā)出的測量信號歸于物質(zhì)的一個或多個分子，因而是否值得記錄測量信 號的強度分布以由此進行單個分子的定位，該區(qū)域可平行于光傳感器上 的傳感器陣列而成像，用其可觀察到由該區(qū)域發(fā)射單個光子的時間順序。 若在該區(qū)域中只有單個分子處于第二狀態(tài)，則由此發(fā)射出的測量信號光 子具有時間上的最小距離，因為該分子在其一個激發(fā)循環(huán)中只能發(fā)射一 個光子。相應(yīng)地，更短地彼此緊接著的光子表明它們是由在該區(qū)域中處 于第二狀態(tài)的多個分子發(fā)射出的。在此情況下，中斷記錄測量信號的強 度分布的過程，并重新試驗在該區(qū)域中將物質(zhì)的僅單個分子轉(zhuǎn)換至第二 狀態(tài)。用于觀察由該區(qū)域發(fā)射單個光子的時間順序的光傳感器可以具有 單個傳感器單元，條件是其在記錄第一個光子之后的時滯足夠短。否則 光傳感器應(yīng)由兩個傳感器單元構(gòu)成，利用它們在重合傳感器的意義上針 對性地探測幾乎同時由該區(qū)域發(fā)射出的光子。這是關(guān)于該物質(zhì)的多個同 時在該區(qū)域中處于第二狀態(tài)的分子的暗示。
如本發(fā)明的說明書所述，尤其是涉及該新方法的這些實施方案，其 中該物質(zhì)選自以下亞組在第二狀態(tài)中利用光學激發(fā)信號可激發(fā)而自發(fā) 地發(fā)射熒光的物質(zhì)，該熒光利用傳感器陣列被記錄為光學測量信號。
此外，該物質(zhì)還可選自以下亞組利用光學反向信號可由第二狀態(tài) 轉(zhuǎn)換返回至第一狀態(tài)的物質(zhì)。在此情況下，在利用轉(zhuǎn)換信號將物質(zhì)的其 他部分轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)之前，可以針對性地利用反向信號將預先轉(zhuǎn)換至 第二狀態(tài)的一部分物質(zhì)轉(zhuǎn)換返回至第一狀態(tài)。因而無須等待一個時間段，
10在該時間段中物質(zhì)分子例如由于熱激發(fā)或者還在此處首先應(yīng)激發(fā)以自發(fā) 地發(fā)射熒光的光學評估信號的影響下由第二狀態(tài)轉(zhuǎn)換返回至第一狀態(tài)。 然而，若第二狀態(tài)的物質(zhì)分子的半衰期具有有利的數(shù)量級，則該新方法 還可以非常有效地實施，條件是該物質(zhì)無法利用光學反向信號由第二狀 態(tài)轉(zhuǎn)換返回至第一狀態(tài)。
用于該新方法中的物質(zhì)的一個特別有利的組是由一個(能量)供體
和一個(能量)受體構(gòu)成的通?？s寫為FRET對的所謂的Fdrster諧振能 量傳輸對。首先是該FRET對特別適合用于該新方法中，其中受體是對 光反應(yīng)變色的，并利用轉(zhuǎn)換信號加以轉(zhuǎn)換，以改變供體的熒光特性。在 此，受體本身可以是發(fā)熒光的，但是這在該新方法中通常無法利用。
在由蛋白質(zhì)限定的感興趣的試樣結(jié)構(gòu)的情況下，有利的是用以標記 感興趣的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在基因技術(shù)上嵌入該分子中或者懸掛在其上。在此， 直接實施嵌入或懸掛，即標記物質(zhì)本身可以在融合蛋白的意義上直接用 于試樣中的蛋白質(zhì)中或者懸掛在其上。但是標記物質(zhì)的僅一個連接位也 可用于蛋白質(zhì)中或者懸掛在其上，然后通過該連接位可以用物質(zhì)進行標 記。 一個用于標記蛋白質(zhì)的熒光蛋白質(zhì)的原則上已知的連接位本身例如 由蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的4個半胱氨酸序列組成，即由一個所謂的四 半胱氨酸基序組成。特別有利的是，通過表達試樣中的至少一個細胞中 的如此改性的蛋白質(zhì)以代替原來的蛋白質(zhì)而在試樣中于基因技術(shù)上將物 質(zhì)或物質(zhì)的連接位嵌入蛋白質(zhì)中或者懸掛在蛋白質(zhì)上，從而使感興趣的 結(jié)構(gòu)直接由此顯示為標記物質(zhì)或者這些改性蛋白質(zhì)的連接位。
在標記物質(zhì)的單個分子在試樣中的位置定位時，極高的位置分辨率 使得能夠觀察到試樣中非常小的結(jié)構(gòu)的空間排列。該結(jié)構(gòu)可由單個蛋白 分子組成，然后該蛋白分子于多個不同的點用物質(zhì)標記。這些點完全典 型地相鄰接的距離小于蛋白質(zhì)的各種可想象的光學成像時的空間分辨率 極限。在該新方法中，在一個時間點各自在蛋白分子用物質(zhì)標記的僅一 個點詢問物質(zhì)的測量信號。在每次重復詢問時，再次僅在一個標記點用
ii轉(zhuǎn)換信號將該物質(zhì)轉(zhuǎn)換至提取測量信號的第二狀態(tài)。這甚至可以是之前 的同一點。但是因為該過程通過躍遷概率加以控制，所以在足夠多次重 復詢問時穩(wěn)固地開始對該物質(zhì)在蛋白分子的所有標記點進行詢問，并相 應(yīng)地以最高的位置分辨率確定蛋白分子的所有標記點的位置。在此，位 置分辨率的大小使得能夠觀察到蛋白分子的蛋白折疊及其他構(gòu)象變化。
在該新方法中，所有用物質(zhì)標記的結(jié)構(gòu)的成像要求相對更多次重復 將相對更小比例的物質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)，在該狀態(tài)下它們發(fā)射出的測量 信號用傳感器陣列記錄。若這些重復進行得非常迅速，則感興趣的試樣 結(jié)構(gòu)成像總共所需的時間總是仍然相對較短。然而，它們可以在此情況 下以如下方式加以縮短，用至少兩種不同的物質(zhì)平行地實施該新方法， 這些物質(zhì)在它們各自的第二狀態(tài)下發(fā)出可區(qū)分的光學測量信號。以如下 方式限制該新方法的速度，第二狀態(tài)的物質(zhì)的具有足夠距離的分子的密 度以及由此在該新方法的一個循環(huán)中其位置可被確定的分子的數(shù)量自然 地被限制。只要區(qū)分用于標記感興趣的結(jié)構(gòu)的兩種不同物質(zhì)的光學測量 信號，使它們可以分離，則通過使用此類不同物質(zhì)，在該新方法的一個 循環(huán)中其位置被確定的分子的數(shù)量可以與不同物質(zhì)的量成比例地提高。
如前所述，根據(jù)本發(fā)明的第二方法是第一方法的變體。具體而言， 在第二方法中用傳感器陣列記錄光學測量信號，該光學測量信號并不是 由轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的物質(zhì)分子發(fā)出的，而是由仍處于第一狀態(tài)的物質(zhì)分 子發(fā)出的。相應(yīng)地，在此本發(fā)明方法的實施方案在于，在將一部分物質(zhì) 轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信號強度的大小，使得各自處于第一狀態(tài) 的分子的主要百分比部分與其最近鄰的第一狀態(tài)的分子的距離大于在傳 感器陣列上試樣成像的空間分辨率極限。在考慮該區(qū)別時，根據(jù)本發(fā)明 的第一新方法的所有前述實施方案至優(yōu)選的實施方案也適合于第二新方 法。該區(qū)別在此基本上僅能看出，隨著標記物質(zhì)在試樣中濃度的增長， 所需的轉(zhuǎn)換信號強度并不是下降而是上升，因為在各自所考慮的區(qū)域內(nèi) 的更大數(shù)量的物質(zhì)分子的情況下，更多的分子必須被轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)，從而僅保留該新方法可容許的低密度的第一狀態(tài)的分子。最后所述的密 度與試樣中分子的濃度無關(guān)。
用于實施該新方法的兩種實施方案的熒光顯微鏡與已知熒光顯微鏡 不同，利用它們達到的空間分辨率大于衍射極限，不存在用于精細結(jié)構(gòu) 化來自轉(zhuǎn)換信號源的轉(zhuǎn)換信號的措施，而是根據(jù)該新方法由轉(zhuǎn)換信號源 的操縱設(shè)備調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信號的強度。
可以額外存在至少一個光傳感器，在其上使對應(yīng)于傳感器陣列的多 個像素的試樣區(qū)域成像，以觀察由該區(qū)域發(fā)射單個光子的時間順序。如 與該新方法有關(guān)的描述，利用該光傳感器可以非常迅速地，尤其是在讀 取傳感器陣列之前確定是否在各個區(qū)域中記錄僅一個或多個物質(zhì)分子的 測量信號強度以例如中斷記錄而有利于一次新的試驗，條件是并不確定 僅來自單個分子的強度。其意義大于，讀取傳感器陣列通常是在結(jié)束該 新方法的一次循環(huán)時的限制速度的因素。必須讀取該傳感器陣列，然后 可以利用轉(zhuǎn)換信號重新選擇物質(zhì)分子，然后它們處于顯示測量信號的狀 態(tài)，因而測量信號可來自于該新選擇的分子。適合于實施該新方法以及
新型熒光顯微鏡的傳感器陣列包括常用結(jié)構(gòu)類型的CCD傳感器陣列及 優(yōu)選的CMOS傳感器陣列，在其選擇中除了可以迅速讀取以外還應(yīng)注意， 暗場噪聲及讀取噪聲損失小，因此在實施該新方法時得到良好的信噪比。
此外，用于實施該新方法的新型熒光顯微鏡可以具有用于用反向信 號進攻試樣的一個分離的反向信號源。但是，如在該新方法中所述，用 以標記感興趣的試樣結(jié)構(gòu)的物質(zhì)也可以自發(fā)地即以熱激發(fā)的方式，由其 第二狀態(tài)轉(zhuǎn)換返回至第一狀態(tài)，或者該轉(zhuǎn)換過程也可通過激發(fā)信號引發(fā)， 利用該激發(fā)信號首先激發(fā)該物質(zhì)以發(fā)射測量信號。
在本發(fā)明的有利的實施方案中，在說明書引言部分中所述的特征和 多個特征的組合的優(yōu)點僅是示例性的，并且可以改變或累積地發(fā)揮作用， 而這些優(yōu)點并非必須由根據(jù)本發(fā)明的實施方案實現(xiàn)。由附圖，尤其是所 示幾何形狀及多個組件相互之間的相對尺寸以及它們的相對順序和有效連接，可以得出其他特征。本發(fā)明的不同實施方案的特征的組合同樣可 以偏離本發(fā)明所選擇的反向關(guān)系，并由此被激發(fā)。這還涉及在不同附圖 中所示的或者在其說明中所述的特征。這些特征還可與不同的其他特征 相結(jié)合。


下面依據(jù)附圖中所示的優(yōu)選的實施方案進一步闡述和說明本發(fā)明。 圖1所示為在用于實施在第一實施方案中使感興趣的試樣結(jié)構(gòu)以空
間高分辨率成像的新方法的第一實施方案中的熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)；
圖2所示為用于標記感興趣的試樣結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的發(fā)熒光的分子的致
密的均勻分布以及所得的通過傳感器陣列的對應(yīng)區(qū)域的熒光強度分布，
在該傳感器陣列上該試樣在根據(jù)圖1的熒光顯微鏡的情況下成像；
圖3所示為在試樣的一個區(qū)域內(nèi)的單個分子及兩個緊鄰分子的情況
下在傳感器陣列上的測量信號的強度分布；
圖4所示為通過根據(jù)圖3的對應(yīng)于一個分子的傳感器陣列上的強度
分布的截面圖5所示為通過根據(jù)圖3的對應(yīng)于兩個緊鄰分子的傳感器陣列上的 測量信號強度分布的截面圖6所示為相對于圖1補充了約一個反向信號源的第二實施方案中 的熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)；
圖7所示為熒光顯微鏡的另一個實施方案，在此相對于圖1補充了 一個光傳感器；
圖8所示為在根據(jù)圖7的光傳感器的觀察區(qū)域內(nèi)的單個分子； 圖9所示為來自根據(jù)圖8的分子的由根據(jù)圖7的光傳感器接收的測 量信號的光子的時間順序；
圖IO所示為根據(jù)圖7的光傳感器的觀察區(qū)域內(nèi)的兩個分子； 圖11所示為根據(jù)圖10的兩個分子的測量信號的光子的順序；圖12所示為根據(jù)圖1的熒光顯微鏡的實施方案中不同光學信號的時 間順序；
圖13所示為根據(jù)圖6的熒光顯微鏡的實施方案中不同光學信號的時 間順序；
圖14所示為在該新方法中可用作標記感興趣的試樣結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的 由供體和受體組成的FRET對的結(jié)構(gòu)和功能；及
圖15所示為利用多個根據(jù)圖14的FRET對標記單個蛋白分子。
具體實施例方式
圖1中所示的熒光顯微鏡1用于使試樣2中感興趣的結(jié)構(gòu)以空間高 分辨率成像。試樣2中感興趣的結(jié)構(gòu)在此沒有突出顯示，而是用其分子 具有兩種狀態(tài)的物質(zhì)標記，第一狀態(tài)不發(fā)熒光，第二狀態(tài)通過來自激發(fā) 信號源4的光學激發(fā)信號3激發(fā)而自發(fā)地發(fā)射熒光，該信號被記錄為來 自傳感器6的測量信號5。所述物質(zhì)的分子可用來自轉(zhuǎn)換信號源8的光 學轉(zhuǎn)換信號7在第一和第二狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。在此沒有分別再次給出的轉(zhuǎn) 換信號源8的操縱設(shè)備如此設(shè)計，使其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信號7的強度，從而用 以標記試樣2感興趣的結(jié)構(gòu)的第二狀態(tài)的物質(zhì)的分子的量各自僅使第二 狀態(tài)的發(fā)熒光的分子的距離大于在傳感器陣列6上以圖1中僅粗略顯示 的成像光學系統(tǒng)9成像試樣2時的空間分辨率極限。這使得試樣2中處 于第二狀態(tài)的物質(zhì)分子的位置由于其附屬的測量信號5的強度分布而能 夠通過傳感器陣列6以遠超過成像的空間分辨率極限的精度加以確定， 其除了物質(zhì)分子的尺寸以外基本上取決于傳感器陣列6的像素密度、成 像比例和信噪比。在此，定位甚至可以不超過傳感器陣列6的像素距離。 在圖1中再次僅粗略顯示的半透鏡10用于疊加激發(fā)信號3和轉(zhuǎn)換信號7 的光路，或者用于分離由試樣發(fā)出的測量信號5。在此在各種情況下額 外使用狹帶濾色片，從而從傳感器陣列6僅記錄感興趣的測量信號5， 而不是激發(fā)信號3或轉(zhuǎn)換信號7由試樣反射的部分。試樣2前方的雙箭 頭11表明試樣2既被光學信號3， 7進攻，也發(fā)射光學測量信號5。
15圖2所示為試樣2中標記物質(zhì)的分子12的均勻的統(tǒng)計學分布。所示
分子12均處于其發(fā)熒光的第二狀態(tài)。分子12的距離小于在傳感器陣列 6上以成像光學系統(tǒng)9成像試樣2時的空間分辨率極限。具體而言，在 此分子12的距離甚至遠小于分辨率極限。由此獲得通過傳感器陣列6的 測量信號5的強度分布，其在不考慮統(tǒng)計學波動和噪聲時是恒定的，這 在圖2中用傳感器陣列6的所示區(qū)域的均勻陰影表示。因此無法由用傳 感器陣列6記錄的測量信號5確定單個分子12的位置。試樣2中分子 12分布的結(jié)構(gòu)化在圖2中不存在，其可以在發(fā)熒光的狀態(tài)的分子12的 距離僅如此小直至在傳感器陣列6上以成像光學系統(tǒng)9成像試樣2的空 間分辨率極限時加以解決。在該新方法中，總是僅有小部分的分子12轉(zhuǎn) 換至其可發(fā)熒光的狀態(tài)，主要存在的分子的密度是與此無關(guān)的。
圖3所示為傳感器陣列6上試樣2區(qū)域的成像，其中總計3個分子 12處于發(fā)熒光的第二狀態(tài)。在此，兩個分子12成對地相互緊鄰，而第 三個分子12與該對的距離13更大，甚至大于在傳感器陣列6上以成像 光學系統(tǒng)9成像試樣2時的空間分辨率極限。與此相反，該對的兩個分 子12的距離小于該分辨率極限。由分子12發(fā)出的熒光被傳感器陣列6 記錄為測量信號5的兩個離散的強度分布14和15。在此，強度分布14 對應(yīng)于單個分子12，而強度分布15對應(yīng)于分子12的對。
圖4和5中再次給出通過強度分布14和15的截面。強度分布在其 形狀上沒有明顯區(qū)別。兩種強度分布基本上都是Airy-Scheibe。但是強度 分布15的積分大小是強度分布14的兩倍，并具有更大的半值寬度。由 強度分布14可以非常精確地得出分子12在試樣2中的位置，其分辨率 甚至尤其是大于在傳感器陣列6上以成像光學系統(tǒng)9成像試樣2的空間 分辨率極限。在此，由傳感器陣列6上的強度分布14的橫向位置可以得 出在試樣2的x-y平面上的位置，而強度分布14的形狀可以得出關(guān)于試 樣2中于Z方向上的位置的結(jié)論。強度分布15則不同。這甚至還可以歸 于試樣中的一個位置。但是這僅是該對的兩個分子12的中間位置。由強度分布15無法得知兩個分子12相對于中間位置的位置。因此，在用于
使試樣2的用物質(zhì)標記的結(jié)構(gòu)以空間高分辨率成像的該新方法中，均只 有如此小比例的分子12被根據(jù)圖1的轉(zhuǎn)換信號7轉(zhuǎn)換至發(fā)熒光的第二狀 態(tài)，以使得盡可能多的分子12單獨存在，即與緊鄰的分子12的距離使 得在傳感器陣列6上成像時得到離散的強度分布14，由此可以各自精確 地確定分子12的位置。
圖6所示為熒光顯微鏡1的實施方案，相對于根據(jù)圖1的實施方案 補充了約一個用于用反向信號17進攻試樣2的反向信號源16。為了疊 加光學反向信號17的光路，還存在另一個半透鏡10。利用反向信號17 將試樣2中的物質(zhì)分子針對性地由其第二狀態(tài)轉(zhuǎn)換返回至第一狀態(tài)，從 而為了單個分子在試樣2中的下一回定位而利用轉(zhuǎn)換信號7重新選擇分 子。該新方法需要用于獲得該位置的分子的數(shù)量，使試樣2用其標記的 結(jié)構(gòu)代表性地成像，頻繁重復用轉(zhuǎn)換信號7選擇單個分子，其中作為基 礎(chǔ)的躍遷概率導致總是變換的選擇，即使多重選擇單個分子。反向信號 17并不是絕對必需的，條件是分子自動地即通過熱激發(fā)在合理的時間內(nèi) 轉(zhuǎn)換返回至其第一狀態(tài)，或者也通過激發(fā)信號3的作用。否則反向信號 17是絕對必需的。
圖7中所示的熒光顯微鏡1不具有根據(jù)圖6補充的反向信號源16; 但其還可設(shè)置在該實施方案中。然而圖7用于說明光傳感器18的額外布 置。設(shè)置光傳感器18以記錄來自試樣對應(yīng)于傳感器陣列6的多個像素的 區(qū)域的測量信號5的單個光子的時間順序。在此，光子順序的監(jiān)測應(yīng)當 用于非常迅速地確定在各個區(qū)域內(nèi)是否僅單個分子處于發(fā)熒光的狀態(tài)， 或者是否有多個分子由該區(qū)域發(fā)射熒光。若涉及多個分子，則這在該區(qū) 域的尺寸小的情況下表明，由其發(fā)出的測量光線在傳感器陣列6上的強 度分布無法分離，即無法用于定位單個分子。相應(yīng)地，可以停止用傳感 器陣列6記錄測量信號5，有利于用轉(zhuǎn)換信號7重新選擇分子。至少可 以省略讀取傳感器陣列6的對應(yīng)區(qū)域。例如在此情況下有意義的是，試
17樣2或傳感器陣列6的不同區(qū)域的光傳感器18被設(shè)計為另一個具有更少 像素數(shù)的陣列的形式。具體而言，光傳感器18在圖7中被表示為重合傳 感器排列(Koinzidenzdetektoranordnung)，其中兩個傳感器單元19借助 于作為分光器(Stmhlteiler)的半透鏡10平行地轉(zhuǎn)換。重合傳感器排列 檢測測量光線15在時間上非常接近的光子在兩個傳感器單元19上相遇 的情況，即光子的重合。在單個發(fā)熒光的分子的情況下在試樣2的由光 傳感器18所監(jiān)測的區(qū)域中不會發(fā)生該重合，因為單個發(fā)熒光的分子由于 其激發(fā)而總是僅可發(fā)射一個光子，并且由于其下一次激發(fā)才會發(fā)射下一 個光子，其中在單次激發(fā)之間存在最短時間。
這些關(guān)系再一次依照圖8至11加以說明。圖8所示為根據(jù)圖9發(fā)射 測量信號5的具有最小時間間隔21的光子20的單個分子。但是若用根 據(jù)圖7的光傳感器18記錄測量信號5的光子20的時間順序，如它們在 圖11中所示，在兩個光子20之間存在遠小于根據(jù)圖9的間隔21的時間 間隔22，則這表明至少兩個發(fā)熒光的分子12在發(fā)出測量信號5的區(qū)域 內(nèi)。該情況如圖IO所示。
圖12是根據(jù)圖1的熒光顯微鏡的實施方案中的轉(zhuǎn)換信號7、激發(fā)信 號3和測量信號5的時間順序的曲線圖。在此應(yīng)強調(diào)，信號形狀在此僅 是示意性的，并非一定真實地重復給出。應(yīng)當基本上顯示時間順序，其 中首先用轉(zhuǎn)換信號7確定地將物質(zhì)分子轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)，然后用激發(fā)信 號3激發(fā)以發(fā)熒光。該熒光導致測量信號5，該測量信號在激發(fā)信號3 減弱之后逐漸消失。圖12所示為用熒光顯微鏡1實施的方法的僅一次循 環(huán)。 一旦通過熱激發(fā)或者通過激發(fā)信號3將物質(zhì)分子由第二狀態(tài)轉(zhuǎn)換返 回至其第一狀態(tài)，則以同樣的信號順序開始下一次循環(huán)。
根據(jù)圖13的信號順序?qū)?yīng)于根據(jù)圖6的熒光顯微鏡1的實施方案， 其中該方法的下一次循環(huán)可以與下一個轉(zhuǎn)換信號7立即相接，因為在各 次循環(huán)結(jié)束時實施反向信號17，使物質(zhì)分子在各種情況下轉(zhuǎn)換返回至其 第一狀態(tài)。圖14所示為由一個供體23和一個受體24組成的FRET對，其形成 分子12的亞單元(Untereinheiten)。供體23和受體24可以是融合成為 分子12的蛋白質(zhì)。具體而言，受體可以是已知為Dronpa的蛋白質(zhì)，而 供體可以是ECFP型蛋白質(zhì)。在該新方法中根據(jù)圖14的FRET對的功能 如下。受體24是對光反應(yīng)變色的，并由于轉(zhuǎn)換信號7而改變其吸收光譜。 在受體24的吸收光譜的情況下的移動導致供體23的熒光特性的改變。 具體而言，供體23變?yōu)榘l(fā)熒光的，因為通過激發(fā)信號3激發(fā)供體通過改 變受體24的吸收光譜無法由供體向受體傳遞能量，現(xiàn)在通過發(fā)射熒光即 測量信號5而可以逐漸增大地實施供體的退激發(fā)。
圖15所示為可用多個分子12于更多個點標記更大的蛋白質(zhì)25，從 而例如利用該新方法觀察到蛋白質(zhì)25的構(gòu)象變化，如折疊。典型地，在 此以根據(jù)圖14的FRET對的形式顯示的分子12所處的點比在蛋白質(zhì)25 光學成像時可能的空間分辨率極限更緊鄰。然而，在該新方法中總是僅 有一個于蛋白質(zhì)25上的分子12轉(zhuǎn)換至可發(fā)熒光的狀態(tài)，然后其位置由 于由其發(fā)出的測量信號而精確地確定。多次重復該過程，其中位置精確 地確定的各個分子12的選擇遵守統(tǒng)計學規(guī)律，從而在有限數(shù)量的于蛋白 質(zhì)25上的分子12的情況下在少次重復之后詢問所有的蛋白質(zhì)12，即使 僅由躍遷概率確定每一次選擇。附圖標記1熒光顯微鏡
2試樣
3激發(fā)信號
4激發(fā)信號源
測量信號
6傳感器陣列
7轉(zhuǎn)換信號
8轉(zhuǎn)換信號源
9成像光學系統(tǒng)
10半透鏡
11雙箭頭
12分子
13距離
14強度分布
15強度分布
16反向信號源
17反向信號
18光傳感器
19傳感器單元
20光子
21間隔
22間隔
23供體
24受體
25蛋白質(zhì)
權(quán)利要求
1、用于使感興趣的試樣結(jié)構(gòu)以空間高分辨率成像的方法，其包括以下步驟-從以下組中選擇物質(zhì)利用轉(zhuǎn)換信號能夠重復地由具有第一光學特性的第一狀態(tài)轉(zhuǎn)換至具有第二光學特性的第二狀態(tài)并且能夠由該第二狀態(tài)轉(zhuǎn)換返回至該第一狀態(tài)的物質(zhì)；-用該物質(zhì)標記所述感興趣的試樣結(jié)構(gòu)；-用轉(zhuǎn)換信號將變化比例的該物質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)；-在傳感器陣列上使該試樣成像，其中成像的空間分辨率極限大于(即差于)該試樣中所述物質(zhì)的緊鄰分子之間的平均距離；及-利用該傳感器陣列以空間分辨的方式記錄由第二狀態(tài)的所述物質(zhì)的各個部分發(fā)出的光學測量信號；其特征在于，在轉(zhuǎn)換一部分該物質(zhì)至第二狀態(tài)時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信號(7)的強度，從而使至少10％的該物質(zhì)各自轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的分子(12)與其緊鄰的第二狀態(tài)的分子(12)的距離大于該傳感器陣列(6)上該試樣(2)成像的空間分辨率極限。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在轉(zhuǎn)換一部分所述物 質(zhì)至第二狀態(tài)時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信號的強度，從而使至少25%,優(yōu)選至少33%， 更優(yōu)選至少50%，再更優(yōu)選至少66%，特別優(yōu)選至少90%，尤其優(yōu)選 至少95%，最優(yōu)選至少98%的所述物質(zhì)各自轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的分子(12) 與其緊鄰的第二狀態(tài)的分子的距離大于所述傳感器陣列(6)上所述試樣(2)成像的空間分辨率極限。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，將通過尺寸大于 所述傳感器陣列(6)上所述試樣(2)成像的空間分辨率極限的區(qū)域的 轉(zhuǎn)換信號(7)的強度調(diào)節(jié)至恒定的值。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒定的值根據(jù)所 述物質(zhì)在所述試樣(2)中的局部濃度來確定。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在將更大比例的所述 物質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)時預先確定所述物質(zhì)在所述試樣(2 )中的局部濃度， 其中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信號(7)的強度大于利用所述傳感器陣列(6)定位單個 分子(12)時的情況。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5之一所述的方法，其特征在于，對應(yīng)于所述 傳感器陣列(6)的多個像素的所述試樣(2)的區(qū)域在光傳感器(18) 上成像，以觀察由該區(qū)域發(fā)射單個光子(20)的時間順序。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1至6之一所述的方法，.其特征在于，所述物質(zhì)選 自以下亞組在第二狀態(tài)中能夠利用光學激發(fā)信號激發(fā)而自發(fā)地發(fā)射熒 光的物質(zhì)，該熒光利用所述傳感器陣列(6)被記錄為光學測量信號(5)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1至7之一所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)選 自以下亞組能夠利用光學反向信號(17)由第二狀態(tài)轉(zhuǎn)換返回至第一 狀態(tài)的物質(zhì)，以及在利用轉(zhuǎn)換信號(7)將所述物質(zhì)的其他部分轉(zhuǎn)換至第 二狀態(tài)之前，利用該反向信號(17)將預先轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的物質(zhì)的部 分轉(zhuǎn)換返回至第一狀態(tài)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1至8之一所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)選 自具有一個供體(23)和一個受體(24)的F6rster諧振能量傳輸(FRET) 對，其中該受體(24)是對光反應(yīng)變色的，并利用轉(zhuǎn)換信號(7)加以轉(zhuǎn) 換，以改變該供體(23)的熒光特性。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1至9之一所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)或所述物質(zhì)的至少一個連接位在基因技術(shù)上嵌入所述試樣(2)中的蛋白質(zhì)中或者懸掛在其上。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1至10之一所述的方法，其特征在于，所述試樣(2)中的蛋白分子(25)在多個不同的點用所述物質(zhì)標記。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1至11之一所述的方法，其特征在于，該方法是利用至少兩種不同的物質(zhì)平行地實施的，由這些物質(zhì)在其各自的第二狀態(tài)發(fā)出能夠區(qū)分的光學測量信號(5)。
13、 用于使感興趣的試樣結(jié)構(gòu)以空間高分辨率成像的方法，其包括以下步驟-從以下組中選擇物質(zhì)利用轉(zhuǎn)換信號能夠重復地由具有第一光學特性的第一狀態(tài)轉(zhuǎn)換至具有第二光學特性的第二狀態(tài)并且能夠由該第二狀態(tài)轉(zhuǎn)換返回至該第一狀態(tài)的物質(zhì)；-用該物質(zhì)標記所述感興趣的試樣結(jié)構(gòu)；-用轉(zhuǎn)換信號將變化比例的該物質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)；-在傳感器陣列上使該試樣成像，其中成像的空間分辨率極限大于(即差于)該試樣中所述物質(zhì)的緊鄰分子之間的平均距離；及-利用該傳感器陣列記錄由該物質(zhì)各自處于第一狀態(tài)的部分發(fā)出的光其特征在于，在轉(zhuǎn)換一部分該物質(zhì)至第二狀態(tài)時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信號(7)的強度，從而使至少10%的該物質(zhì)各自處于第一狀態(tài)的分子(12)與其緊鄰的第一狀態(tài)的分子(12)的距離大于該傳感器陣列(6)上該試樣(2)成像的空間分辨率極限。
14、 熒光顯微鏡，其具有用于用激發(fā)信號和光學轉(zhuǎn)換信號進攻試樣的激發(fā)信號源及轉(zhuǎn)換信號源，還具有用于記錄來自該試樣的光學測量信號的傳感器陣列以及用于在該傳感器陣列上使該試樣成像的成像光學系統(tǒng)，其中該傳感器陣列的像素的柵距小于在該傳感器陣列上該試樣成像的空間分辨率極限與成像的成像系數(shù)之積，其特征在于，由轉(zhuǎn)換信號源(8)的操縱設(shè)備控制根據(jù)權(quán)利要求1至10之一所述的方法的轉(zhuǎn)換信^(7)的強度。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的熒光顯微鏡，其特征在于，設(shè)置有至少一個光傳感器(18)，在該光傳感器上使對應(yīng)于所述傳感器陣列(6)的多個像素的試樣(2)的區(qū)域成像，以觀察從該區(qū)域發(fā)射單個光子(20)的時間順序。
16、 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的熒光顯微鏡，其特征在于，設(shè)置有用于用反向信號(17)進攻所述試樣的反向信號源(16)。
全文摘要
為了使感興趣的試樣結(jié)構(gòu)以空間高分辨率成像而實施以下步驟選擇利用轉(zhuǎn)換信號能夠重復地由具有第一光學特性的第一狀態(tài)轉(zhuǎn)換至具有第二光學特性的第二狀態(tài)并且能夠由第二狀態(tài)返回第一狀態(tài)的物質(zhì)；用物質(zhì)標記感興趣的試樣結(jié)構(gòu)；用轉(zhuǎn)換信號將變化比例的物質(zhì)轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)；在傳感器陣列上使試樣成像，其中成像的空間分辨率極限大于試樣中物質(zhì)的緊鄰分子之間的平均距離；及利用傳感器陣列記錄由第二狀態(tài)的物質(zhì)的各個部分發(fā)出的光學測量信號；其特征在于，在轉(zhuǎn)換一部分物質(zhì)至第二狀態(tài)時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換信號的強度，從而使至少10％的物質(zhì)各自轉(zhuǎn)換至第二狀態(tài)的分子與其緊鄰的第二狀態(tài)的分子的距離大于傳感器陣列上試樣成像的空間分辨率極限。
文檔編號G01N21/64GK101484794SQ200780025640
公開日2009年7月15日 申請日期2007年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月6日
發(fā)明者S·W·黑爾 申請人:馬克思-普朗克科學促進協(xié)會