專利名稱：一類不對稱菁類熒光染料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及適合用于核酸染色的染料，更具體地說涉及不對稱 菁類熒光染料。
背景技術：
熒光檢測技術在DNA雜交測試、基因重組測試、免疫檢測、血 細胞分析和紳瘤細胞早期診斷等方面的廣泛應用極大地促進了熒光 染料的發(fā)展。最早應用于生物分析的熒光染料為吖啶、菲啶類染料， 如吖啶橙、溴乙錠等，它們通過嵌入或靜電吸引與DNA小分子結合， 結合后熒光大大增強。但未結合染料的自身熒光會造成高的熒光背 景，從而干擾檢測。同時溴乙4定等有很大的毒性和致癌性，因此它 們已逐漸被其它熒光染料代替。
目前，使用比較多的有羅丹明、熒光素類、BODIPY類和菁類 熒光染料。菁類熒光染料首先由Williams發(fā)現(xiàn)，至今已有150年的 歷史，如今作為生物熒光檢測探針、CD和VCD記錄材料、感光材 料光敏劑、光電轉換材料等已被廣泛的應用，其中作為生物分子的 熒光探針用于檢測核酸、蛋白質(zhì)等尤其成為關注的焦點。
菁染料曱川鏈兩端的含氮芳香母核有很多種類，包括噻唑、噻 吩、2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等。按其相同與否可分為對稱和不 對稱兩類。其中，不對稱菁染^f主要應用于物理結合熒光標示，與 核酸的結合方式包括靜電吸引、堿基對嵌入及溝槽結合。具體的結 合方式取決于染料的結構及染料與核酸濃度的比例。不對稱菁染料 中最典型的一類為TOTO及其類似物和衍生物類。TOTO (p塞唑橙二 聚體)、YOYO (惡唑黃二聚體)是由Glazer研究組開發(fā)的一類對核酸具有高度親和力的多正電荷不對稱菁類熒光染料，通過改變多亞曱 基鏈兩端的染料分子可以得到不同的異二聚體類似物和衍生物。這 類染料在溶液中無熒光，與核酸結合后焚光增強，因此降低了檢測
過程中的熒光背景干擾。Jason等用溶液粘度測定法和原子力顯微鏡 解釋了 TOTO和YOYO與DNA的雙嵌入作用[丄A. Bordelon, K.J. Feierabend, S.A. Siddiqui, L丄.Wright. J. Phys. Chem. B， 2002, 106, 4838-3843]。 Ftirstenberg等利用超快速熒光轉換和時間相關單光子計 數(shù)法進 一 步闡述了熒光增強的動力學機理[A. Ftirstenberg, M.D. Julliard, T.G. Deligeorgiec, N.I, Gadjev. J. AM. CHEM. SOC.， 2006, 128, 7661-7669]。但是此類染料的光i普在可見光區(qū)(490-530 nm),而生物
樣品在這個區(qū)域有很強的吸收和熒光發(fā)射，這會造成熒光檢測效率 大大降低。盡管通過增加共軛鏈數(shù)可以使染料的吸收和發(fā)射波長產(chǎn) 生紅移達到近紅外區(qū)(WO-IOOO nm)，如TOTAB、 TOTIN、 TO-PRO-3、 PO-PRO-2和BO-PRO-2等[K.M. Sovenyhazy,丄A. Bordelon, J.T. Petty. Nucleic Acids Res, 2003, 31, 2561],但這類染料一般分子較大，結構 復雜，合成步驟多，因而使其商品化受到了限制。
此外，隨著曱川鏈的增長，菁染料的光穩(wěn)定性逐漸下降，因此 需要進一步提高長波長菁染料的光穩(wěn)定性。
美國專利6004816描述了一種用于分類和計數(shù)白細胞的試劑， 其中包含的熒光染料特異性結合RNA而增加其熒光強度。但是這種 焚光染料的光穩(wěn)定性仍然不足，容易造成實驗誤差。
美國專利公開2003/0145394公開了 一種氦-氖激光器可激發(fā)的熒 光染料，其用于檢測和計數(shù)網(wǎng)織紅細胞。這種熒光染料需要昂貴的 氦-氖激光器，實際應用的設備成本較高。
因此，需要開發(fā)新的熒光染料，該熒光染料優(yōu)選具有以下性質(zhì) 在不存在核酸時不發(fā)熒光，而在存在核酸時具有良好的熒光量子產(chǎn) 率；具有一定水平的水溶性，同時具有一定的穿過細胞膜的能力； 光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有較大差異。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，本發(fā)明結合現(xiàn)有的各類菁染料的優(yōu)點，在其基礎
上改進，提供了一類不對稱菁類熒光染料，其具有下列結構通式I:
其中
n為1 、 2或3;
X為C(CH3)2、 O、 S或Se;
R,和R2各自獨立選自H、 C^烷基、-(:1.6烷基-0115或卣素； Rs為H、 Cw烷基、OR5、 -&.6烷基-0115、 COOR5、 N02、 CN 或卣素；
&為Cw烷基、-CVJ^l-OR"芐基或鹵素，所述芐基由選自 以下的取代基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、 芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧 基；
Rs為H或C,.,8烷基； Y為負離子。
優(yōu)選n為l或2，更優(yōu)選n為l。
優(yōu)選X為C (CH3)2、 O或S;更優(yōu)選X為C (CH。2或S;最優(yōu) 選X為S。
優(yōu)選1^和R2各自獨立選自H、 C,.)8烷基或卣素；更優(yōu)選R,和 R2各自獨立選自H或Cws烷基；再更優(yōu)選R,和R2各自獨立選自H 或Cl12烷基；再更優(yōu)選&和R2各自獨立選自H或CV6烷基；最優(yōu) 選R,和R2均為H。優(yōu)選R3為H、 Cw8烷基、OR5、 COORs或面素；更優(yōu)選R3為H、 <^.12烷基、OR5、 COORs或鹵素；最優(yōu)選R3為H、 C^烷基、OR5、 COORs或囟素。
優(yōu)選R4為Cl18烷基、千基或卣素，所迷千基由選自以下的取代 基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧 基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更優(yōu)選114 為C^8烷基或者芐基，所述芐基由鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基 或氨基任選取代；更優(yōu)選R4為Cw2烷基或者千基，所述千基由面素、 羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取代；更優(yōu)選R4為Cl12烷基或 者千基，所述千基由卣素、羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取 代；最優(yōu)選R4為Cw烷基或千基，所述千基由面素、羥基、巰基、 氰基、硝基或氨基任選取代。
優(yōu)選115為H或Cw烷基，更優(yōu)選Rs為H或C^烷基。 優(yōu)選Y-為鹵素離子、C104-、 PF6—、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或對 甲苯磺酸負離子。
在一個實施方案中，本發(fā)明還提供上述式I化合物的綴合物。 在另一個方面，本發(fā)明還4是供合成上述式I化合物或其綴合物 的方法。
在另一個方面，本發(fā)明還4是供包含上述式I化合物或其綴合物 的組合物，所述組合物用于生物樣品的染色。
在另一個方面，本發(fā)明還4是供使用上述式I化合物或其綴合物 或包含式I化合物的組合物以染色生物樣品的方法。
本發(fā)明的這些特征和優(yōu)點以及其他特征和優(yōu)點在參考以下附圖 和本發(fā)明的具體實施方式
之后將變得顯而易見。


圖1是化合物A、 B和已知化合物M在乙醇中的光穩(wěn)定性對比。 橫坐標為時間(小時)，縱坐標為吸光度值保留百分數(shù)。所用光源為500W碘鴒燈；所用儀器為紫外可見分光光度計，型號Lambda35。 圖2是化合物A、 B和已知化合物M在DMSO中的光穩(wěn)定性對 比。橫坐標為時間(小時)，縱坐標為吸光度值保留百分數(shù)。所用光 源為500W碘鴒燈；所用儀器為紫外可見分光光度計，型號Lambda 35。
圖3是化合物A和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光譜和發(fā) 射光語。橫坐標為波長(nm),縱坐標為吸光度和熒光強度的歸一化 數(shù)值。所用儀器為紫外可見分光光度計，型號Lambda 35;熒光分 光光度計，型號LS55。
—圖4是化合物B和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光譜和發(fā) 射光語。橫坐標為波長(nm)，縱坐標為吸光度和熒光強度的歸一化 數(shù)值。所用儀器為紫外可見分光光度計，型號Lambda 35;熒光分 光光度計，型號LS55。
圖5是化合物A在含不同濃度pET-32a (+)質(zhì)粒DNA的水溶液 中的焚光發(fā)射光i普。橫坐標為波長(nm)，縱坐標為熒光強度?；?物A的濃度為3.3 nM。箭頭表示DNA的濃度(ng/mL)變化從小到大 依次為0、 6.67、 13.33、 20、 26.67。所用儀器為熒光分光光度計， 型號LS55。
具體實施例方式
除另有說明外，本文中使用的術語具有以下含義。 本文中使用的術語"烷基"包括直鏈烷基和支鏈烷基。如提及 單個烷基如"丙基"，則只特指直鏈烷基，如提及單個支鏈烷基如
"異丙基"，則只特指支鏈烷基。例如，"&.6烷基"包括C"烷基、
Cw烷基、曱基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)則也適
用于本說明書中使用的其它基團。
本文中使用的術語"卣素"包括氟、氯、渙和碘。
本文中使用的術語"千基，，是指-CIVPh基團。當用"任選取代"修飾卡基時，指該千基可以未取代的形式存在，或者可被合適的取 代基在任何合適的位置取代。合適的取代基包括但不限于卣素、輕 基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、 氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基等，只要最終形成的化合物具有本 發(fā)明期望的性質(zhì)。優(yōu)選千基由卣素、羥基、巰基、氰基、硝基或氨 基任選取代。
本文中使用Y表示負離子，其可為任何合適的負離子，包括但 不限于無機負離子或有機負離子，例如卣素離子、CIO" PF6-、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或對曱苯磺酸根負離子。
本發(fā)明的化合物及其綴合物
在一個方面，本發(fā)明提供了具有下列結構通式I的不對稱菁類 熒光染料
其中
n為1、 2或3;
X為C (CH3)2、 O、 S或Se;
R,和R2各自獨立選自H、 C!-,8烷基、-。1.6烷基-0115或卣素； 113為H、 &.18烷基、OR5、 -(^.6烷基-0115、 COOR5、 N02、 CN 或卣素；
R4為CV,8烷基、-&_6烷基-0115、芐基或鹵素，所述芐基由選自 以下的取代基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、 芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
Rs為H或Cw8烷基； Y-為負離子。
優(yōu)選n為1或2,更優(yōu)選n為1 。
優(yōu)選X為C (CH3)2、 O或S;更優(yōu)選X為C (CH3)2或S;最優(yōu) 選X為S。
優(yōu)選R!和R2各自獨立選自H、 (^.18烷基或卣素；更優(yōu)選R,和 R2各自獨立選自H或烷基；更優(yōu)選R,和R2各自獨立選自H或
烷基；更優(yōu)選R,和R2各自獨立選自H或Cw烷基；最優(yōu)選& 和Rs均為H。
優(yōu)選R3為H、 &.18烷基、OR5、 COORs或卣素；更優(yōu)選R3為H、 C^2烷基、OR5、 COORs或卣素；最優(yōu)選R3為H、 (^.6烷基、OR5、 COORs或卣素。
優(yōu)選R4為烷基、千基或囟素，所述卡基由選自以下的取代 基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧 基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更優(yōu)選114 為Cw8烷基或者芐基，所述芐基由面素、羥基、巰基、氰基、硝基 或氨基任選取代；更優(yōu)選IV為Cw2烷基或者千基，所述卡基由囟素、 羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取代；更優(yōu)選R4為CV12烷基或 者千基，所述千基由卣素、羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取 代；最優(yōu)選114為C^烷基或千基，所述千基由卣素、羥基、巰基、 氰基、硝基或氨基任選取代。
優(yōu)選R5為H或Cl12烷基，更優(yōu)選R5為H或C,.6烷基。
優(yōu)選Y-為囟素離子、C1CV、 PF6'、 CF3S(V、 BF4-、乙酸根或對 曱苯磺酸根負離子。
本發(fā)明化合物可作為本文中所述的鹽形式直接用于生物樣品的 染色?；蛘撸谝粋€實施方案中，本發(fā)明化合物可作為式I化合物的 衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于綴合物。
典型地，綴合物在熒光激活細胞分選儀(FACS)中使用。本文中 使用的"綴合物"是指本發(fā)明熒光染料通過共價鍵與其它分子連接 而形成的化合物?？膳c本發(fā)明熒光染料綴合的分子可為與細胞或細 胞成分特異性結合的分子，包括但不限于抗體、抗原、受體、配體、 酶、底物、輔酶等。通常，測試樣品與熒光綴合物溫育一段時間， 使得該熒光綴合物與測試樣品中的某些細胞或細胞成分特異性結
色步驟可依次進行多次，或用多種綴合物同時進行多種染色。染色 完成后，樣品在熒光激活細胞分選儀中進行分析，其中激發(fā)光源激 發(fā)綴合物中的本發(fā)明熒光染料，而測定裝置測定由激發(fā)的熒光染料 產(chǎn)生的發(fā)射光。
或者，在另一個實施方案中，該熒光綴合物還可用于固相免疫 測試，例如夾心型免疫測試。固相免疫測試的技術是本領域7>知的， 可由標準教科書獲得。本發(fā)明的熒光綴合物可用作固相免疫測試中 的各種合適成分。
化合物的合成
在另一個方面，本發(fā)明還4是供合成上述式I化合物的方法。 該不對稱菁類熒光染料的合成一般通過以下流程進行首先由 未取代或取代的2-曱基苯并噻唑、2-曱基苯并嚼唑或2,3,3-三曱基-3H-吲哚啉等原料開始，使其與取代或未取代的千基面化物反應，兩者 的摩爾比為1: 1-2,在曱苯中回流12-36小時，可制得季銨鹽中間體 II:II
其中X、 Rn 113和Y-如式I化合物中所述定義； 然后，將制得的季銨鹽中間體II與連接分子縮合，可得到式III 化合物
其中X、 n、 Rp 113和Y-如式I化合物中所述定義，連接分子可 為N，N，-二苯基曱脒或其高級同系物；
通過與制備式II化合物類似的方法得到取代或未取代的4-曱基 喹啉季銨鹽中間體，最后將其與式III化合物在吡啶或醋酐的作用下 回流，即可得到本發(fā)明的不對稱菁類熒光染料。所得熒光染料可通 過本領域公知的分離和純化技術回收，以達到需要的純度d
本發(fā)明中使用的各種原料均可市售獲得，或者可通過本領域技 術人員公知的方法或現(xiàn)有技術中公開的方法由本領域公知的原料簡 單地制備得到。
應認識到，本發(fā)明化合物中的各種環(huán)取代基有 一 些可在上述步 驟進行之前或剛完成后，通過標準的芳族取代反應來引入或通過常 規(guī)的官能團修飾來產(chǎn)生，這包括在本發(fā)明的方法步驟方面。這種反 應和修飾包括例如取代基通過芳族取代反應的引入、取代基的還原、 取代基的烷基化和取代基的氧化。用于這些過程的試劑和反應條件 是化學領域公知的。芳族取代反應的具體實例包括用濃硝酸引入硝 基，用例如酰囟和路易斯酸(如三氯化鋁)在Friedel Crafts條件下引 入?；?，用烷基卣和路易斯酸(如三氯化鋁)在Friedel Crafts條件下 引入烷基，和引入鹵素基團。修飾的具體實例包括通過例如用鎳催化劑進行催化氫化或者用鐵在鹽酸存在下進行加熱處理，將硝基還
原成氨基；將烷硫基氧化成烷基亞磺?；蛲榛酋；?。
包含式I化合物的本發(fā)明熒光綴合物可通過任何本領域已知的常 規(guī)方法合成。
組合物
在再另一個方面，本發(fā)明還提供包含上述式I化合物或其綴合 物的組合物，所述組合物用于生物樣品的染色。
本發(fā)明的組合物除包含式I化合物或其綴合物外，還可包含生
物樣品染色所需要的其它組分，例如溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)
劑、表面活性劑等。本發(fā)明的組合物可作為水溶液形式存在，或者 可作為臨用前用水配制為溶液的其它合適形式存在。
使用
在再另一個方面，本發(fā)明還提供使用上述式I化合物或包含式I 化合物的組合物以染色生物樣品的方法，該方法包括使上述式I化合 物或其綴合物或包含式I化合物的組合物與生物樣品接觸的步驟。本 文中使用的術語"接觸"可包括在溶液或固相中接觸。
特點
由以上描述以及本領域技術人員^^知的常識，可了解本發(fā)明焚
光染料的各種優(yōu)點，包括但不限于以下
(1) 本發(fā)明的熒光染料化合物分子中引入了空間位阻大的千 基，提高了染料的光穩(wěn)定性，減小了因甲川鏈增長而導致的染料光 穩(wěn)定性下降的問題；
(2) 本發(fā)明的熒光染料化合物在一端引入了喹啉環(huán)，與曱川鏈 相同的對稱苯并噻唑和吲哚啉類菁染料相比，最大吸收波長可增加 約80nm,發(fā)射波長范圍寬，可達650 nm-900 nm的近紅外區(qū)，可避 免生物自身的熒光背景干擾，同時其染料摩爾消光系數(shù)大，靈敏度高，可應用于核酸標記、免疫4企測、血細胞分析等各生物分析領域；
(3) 本發(fā)明的熒光染料化合物沒有過長的甲川鏈，因此結構簡 單，原料易得，毒副性小，成本低廉，易產(chǎn)業(yè)化；
(4) 本發(fā)明的熒光染料化合物可應用廉價、體積小、性能穩(wěn)定 的紅色半導體激光器作為光源，大大降低配套的儀器成本。
為了說明本發(fā)明的化合物對染料性能的優(yōu)化改進，在實施例6, 7中以已知化合物M作為參照。M結構如下
M可通過以下合成路徑來合成，也可參見Journal of the American Chemical Socitey (1945) 67, 18889-93。<formula>complex formula see original document page 17</formula>
實施例1
中間體l-芐基-2-曱基苯并噻唑季銨鹽的合成
將20 mmol 2-曱基苯并瘞唑和22 mmol溴化卡加入到50 ml含20 ml曱苯的圓底燒瓶中，氬氣保護。反應加熱回流持續(xù)反應24小時后 停止?；旌衔锢鋮s后過濾沉淀并用乙醚洗滌濾餅。干燥后得到淡粉 色的固體粉末，粗收率58%。
實施例2
化合物A的制備
在60 ml醋酸中，將lOmmol l-卡基-2-曱基苯并噻唑季銨鹽與30 mmol N,N，-二苯基曱脒于90。C油浴上加熱攪拌1.5小時。將反應得 到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次，除去醋酸。然后加入一定 量的乙醚析出橙色固體粉末，過濾，干燥。將此粗產(chǎn)品通過硅膠柱 分離，用洗脫液二氯曱烷:曱醇=100:3，收集黃色組分，收率42%。
向其中加入l-卡基-4-曱基喹啉季銨鹽4mmo1及吡咬10ml, 90。C油 浴上加熱攪拌1.5小時。將反應液倒入乙醚中，析出暗紫色小顆粒， 過濾，干燥。染料通過硅膠柱分離，用洗脫液二氯甲烷:甲醇- 100:5， 收集藍色組分，得到標題化合物，收率70%。
tH-NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 5.49 (s， 2H)， 5.71 (s, 2H), 6.44 (d, 1H), 6.98 (d， 1H), 7.18-7.80 (m, 18H), 8.23 (t, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C33H27BrN2S m/z: 483.2 [M-Br〗+。
實施例3
化合物B的制備<formula>complex formula see original document page 18</formula>在60ml醋酸中，將10mmo1 l-(4-氟)-卡基-2-曱基苯并噻唑季銨 鹽與30 mmol N,N，-二苯基曱脒于90°C油浴上加熱攪拌1.5小時。將 反應得到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次，除去醋酸。然后加 入一定量的乙醚析出橙色固體粉末，過濾，干燥。將此粗產(chǎn)品通過 硅膠柱分離，用洗脫液二氯曱烷:曱醇=100:3,收集黃色組分，收率 47%。向其中加入l-(4-氟)-千基-4-曱基喹啉季銨鹽5mmo1及吡啶 10ml, 90°C油浴上加熱攪拌l.5小時。將反應液倒入乙醚中，析出 暗紫色小顆粒，過濾，干燥。染料通過硅膠柱分離，用洗脫液二氯 曱烷:曱醇=100:5，收集藍色組分，得到標題化合物，收率65%。 'H國NMR 5 (400 MHz, CD3OD,TMS) 5.46 (s, 2H), 5.68 (s, 2H), 6.45 (d，
1H), 6.97 (d, 1H), 7.05-7.76 (m, 16H), 8.18 (t, 1H), 8.30 (d, 1H), 8.37 (d, 1H)。 MS (EI) C33H25BrF2N2S m/z: 519.2 [M-Br] +。實施例4
化合物c的制備
將10mmo1 l-(4-曱氧基)-千基-2-曱基苯并噻唑季銨鹽與14 mmol N, N，-二苯基甲脒在40 ml醋酸中，于90°C油浴上加熱攪拌2小時。 將反應得到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次，除去醋酸。然后 加入一定量的乙醚析出橙色固體粉末，過濾，干燥。將此粗產(chǎn)品通 過硅膠柱分離，用洗脫液二氯甲烷:甲醇=100:3.5,收集黃色組分， 收率35%。向其中加入l-乙基-4-曱基喹啉季銨鹽3 mmol及吡咬8 ml， 90°C油浴上加熱攪拌1小時。將反應液倒入乙醚中，析出暗紫色小 顆粒，過濾，干燥。染料通過硅膠柱分離，用洗脫液二氯曱烷:甲醇= 100:6，收集藍色組分，收率75%。
^-NMR 5 (40Q MHz， CD3OD, TMS) 1.23 (t, 3H), 3.76 (tetra, 2H), 3.69 (s， 3H), 5.69 (s, 2H), 6.44 (d， 1H), 6.98 (d, 1H), 7.18-7.90 (m, 12H)， 8.23 (t, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C29H27IN2OS m/z: 451.2 [M-
I]+。
實施例5
化合物D的制備<formula>complex formula see original document page 20</formula>
將lOmmol l-(4-羧基)-千基-2,3,3-三甲基苯-3H-吲哚啉季銨鹽與 15 mmol N,N，-二苯基曱脒在40ml醋酸中，于90°C油浴上加熱攪拌 1.5小時。將反應得到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次，除去醋 酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固體粉末，過濾，干燥。將此 粗產(chǎn)品通過硅膠柱分離，用洗脫液二氯曱烷:曱醇=100:4,收集黃色 組分，收率37%。向其中加入1,4-二曱基喹啉季銨鹽4 mmol及醋酐 8 ml， 90°C油浴上加熱攪拌2小時。將反應液倒入乙醚中，析出暗 紫色小顆粒，過濾，干燥。染泮+通過硅膠柱分離，用洗脫液二氯甲 烷:曱醇=100:20,收集紫色組分，收率68%。
iH-NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 1.73 (s， 6H), 3.80 (s， 3H), 5.49 (s, 2H) 6.44 (d, 1H), 6.96 (d, 1H) 7.21-7.80 (m, 12H), 8.22 (t, 1H), 8.32 (d,
1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C31H29IN202 m/z: 461.2 [M-I]+。
實施例6 化合物E的制備
<formula>complex formula see original document page 20</formula>
將8 mmol l-千基-2-曱基苯并噻唑季銨鹽與10 mmol丙二醛縮苯
胺鹽酸在20 ml溶劑(醋酸:醋酸酐=1:1)中加熱到120°C,反應1小 時后，冷卻，加入乙酸乙酯析出固體。過濾，乙酸乙酯沖洗3次， 除去未反應的過量的縮合劑。干燥，得棕黃色粉末，粗收率79%。 向其中加入l-(4-硝基)-千基-4-甲基喹淋季銨鹽6 mmol及醋酐10 ml, 120°C油浴上加熱攪拌1.5小時。將反應液倒入乙醚中，析出暗紫色 小顆粒，過濾，干燥。染料通過硅膠柱分離，用洗脫液二氯曱烷:曱 醇=100:10，收集藍色組分，收率43%。
!H國NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 5.49 (s， 2H), 5.72 (s, 2H),6.24 (d, 1H), 6.37 (d, 1H), 6.48 (t, 2H), 8.29 (t, 1H), 7.22-7.85 (m， 17H), 8.38 (d, 1H), 8.45 (d, 1H)。 MS (EI) C35H28BrN302S: m/z: 554.2 [M誦Br] +。
實施例7
化合物A、 B和M在乙醇和DMSO中的光穩(wěn)定性測定
將化合物A、 B和M分別配成1 x 1(T5M的甲醇和DMSO溶液 裝入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亞灘酸鈉溶液盛于一個長方 體玻璃缸中^L截止濾光器，濾去波長小于400 nm的紫外光。另外， 亞硝酸鈉溶液也能起到冷阱的作用，使樣品的溫度保持常溫。測定 樣品的初始吸光度值后，選用500W碘鴒燈作為光源，距離樣品20 cm 處，通電光照，計時。每隔l小時后，測量樣品光照后的吸光度值。 如圖l和2所示，經(jīng)過6小時光照后，已知化合物M在乙醇和DMSO 中分別褪色38%和54%;化合物A分別褪色16%和45%;化合物B 分別褪色21%和48%。所用儀器為紫外可見分光光度計，型號Lambda 35。
數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明化合物相對已知化合物，顯示出明顯較高的 光穩(wěn)定性。
實施例8
化合物A、 B和M在乙醇中的熒光量子產(chǎn)率的測定
配置一定濃度的化合物A、 B和M的乙醇溶液，滿足經(jīng)紫外可見分光光度計測定最大吸收值<0.1。分別選定激發(fā)波長測定熒光強
度。平行測定三次，算出熒光量子產(chǎn)率，取平均值。以羅丹明B作 為標準物(Of = 0.97,乙醇)計算，在乙醇溶液中已知化合物M的熒 光量子產(chǎn)率0F = 0.44 x 10-2; A的熒光量子產(chǎn)率0>F = 0.76 x 10'2; B 的熒光量子產(chǎn)率①F = 0.55 xlO-2。如圖3和4分別為化合物A和M, B和M在乙醇中的吸收和發(fā)射光i普。所用儀器為紫外可見分光光度 計，型號Lambda 35;熒光分光光度計，型號LS 55。
數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明化合物相對已知化合物，顯示出較高的熒光 量子產(chǎn)率。
實施例9
化合物A在含不同濃度DNA的水溶液中熒光強度的測定
配制濃度為1 x 10-4 M的化合物A的DMSO溶液，取lOO^L加 去離子水稀釋至3mL置于比色皿中，測定其熒光強度。然后，取濃 度為10ng/|iiL的pET-32a (+)質(zhì)粒DNA 2 滴加到上述比色皿中， 穩(wěn)定后測定其熒光強度。如此繼續(xù)滴加該DNA并測定熒光強度值， 結果見圖5,隨著DNA濃度的增大，熒光逐漸增強。同時，染料發(fā) 射光譜與加入DNA之前相比出現(xiàn)lOnm左右的紅移。測試溫度為0-5°C;所用儀器為熒光分光光度計，型號LS55。根據(jù)圖5可知，本 發(fā)明熒光染料產(chǎn)生的熒光強度與DNA的濃度呈濃度依賴性，從而可 用于細胞內(nèi)核酸的染色。
權利要求
1.一類熒光染料，所述染料具有如下結構通式I其中n為1、2或3；X為C(CH3)2、O、S或Se；R1和R2各自獨立選自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或鹵素；R3為H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或鹵素；R4為C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、芐基或鹵素，其中芐基由選自以下的取代基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；R5為H或C1-18烷基；Y-為負離子。
2. 權利要求1的化合物，其中&和112獨立選自H、 C1－18烷基 或卣素；優(yōu)選R1和R2均為H。
3. 權利要求1-2中任一項的化合物，其中113為H、 C1－18烷基、 OR5、 COOR5或卣素；優(yōu)選R3為H、 C1－C6烷基、OR5、 COOR5或卣素。
4. 權利要求1-3中任一項的化合物，其中114為<^.18烷基、千基 或囟素，所述千基由選自以下的取代基任選取代面素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；優(yōu)選R4為C"6烷基或卡基，所述千基由 鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取代。
5. 權利要求1-4中任一項的化合物，其中115為H或Cw2烷基， 優(yōu)選R5為H或C^烷基。
6. 權利要求1-5中任一項的化合物，其中X為C (CH3)2、 O或 S;優(yōu)選X為C(CH3)2或S。
7. 權利要求1-6中任一項的化合物，其中n為1或2。
8. 權利要求1-7中任一項的化合物，其中Y-為卣素離子、CKV、 PF6-、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或對曱苯磺酸負離子。
9. 權利要求1-8中任一項的化合物，其中所述化合物為<formula>see original document page 3</formula><formula>see original document page 3</formula>
10. —種綴合物，其特征在于，所述綴合物中包含權利要求1-9 中任一項的化合物。
11. 一種合成權利要求1-9中任一項的化合物的方法，所述方法包括1)使未取代或取代的2-曱基苯并噻唑、2-曱基苯并噁唑或2，3,3-三曱基-3H-吲咮啉與取代或未取代的千基自化物反應，得到季銨鹽中 間體II:II2)將l)中得到的季銨鹽中間體II與N,N，-二苯基曱脒或其高級同系物縮合，可得到式m化合物:3) 通過與制備式II化合物類似的方法，得到取代或未取代的4-曱基喹啉季銨鹽中間體；4) 將3)中得到的4-曱基喹啉季銨鹽中間體與式III化合物回流， 得到式I化合物；其中X、 n、 Rt、 R2、 R3、 R4、 R5和Y-如權利要求1-9中任一項的定義。
12. —種用于生物樣品染色的組合物，其特征在于所述組合物包 含權利要求1-9中任一項的化合物或權利要求10的綴合物。
13. —種染色生物樣品的方法，所述方法包括將權利要求1-9中 任一項的化合物、權利要求10的綴合物或權利要求11的組合物與 生物樣品接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種式I的不對稱菁類熒光染料，其中X、n、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和Y^-如說明書中的定義。本發(fā)明還提供了該熒光染料的綴合物、制備方法、包含這種熒光染料的組合物和使用這種熒光染料或其組合物進行生物染色的方法。
文檔編號G01N1/30GK101343420SQ200710137258
公開日2009年1月14日 申請日期2007年7月12日 優(yōu)先權日2007年7月12日
發(fā)明者彤 吳, 孫世國, 彭孝軍, 兵 徐, 樊江莉, 王炳帥, 邵建輝 申請人:大連理工大學;深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司