專利名稱：吲哚類半菁染料的合成與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類吲哚類半菁染料的合成與應(yīng)用，屬于精細(xì)化工領(lǐng)域中一類功能染料的合成及其作為熒光染料的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子在許多細(xì)胞過程中都扮演一個重要的角色，如細(xì)胞的成長、鈣的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)吞作用、細(xì)胞粘連等。研究細(xì)胞內(nèi)PH的動力學(xué)對理解許多細(xì)胞內(nèi)生理機能的調(diào)節(jié)機制是至關(guān)重要的。檢測細(xì)胞內(nèi)pH的方法很多，如微電極、核磁共振等，而熒光顯微鏡比這些方法更靈敏、更方便，因此近幾年熒光PH探針被廣泛用于監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)pH 的變化。一般來說，細(xì)胞內(nèi)存在兩個較寬的PH范圍一個是大約6. 8 - 7. 4，如細(xì)胞質(zhì)；另一個是大約4. 5 - 6. 0，即所謂的酸性細(xì)胞器，如溶酶體。以各種熒光團為母體的pH探針已經(jīng)被報道，有些已被用于組織或活細(xì)胞成像，有些也已經(jīng)商品化。但是具有雙發(fā)射的PH探針已見報道的很少。特別是酸性PH探針，幾乎都是基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)機理，因此沒有波長的變化。雖然商品化探針DND160是具有雙發(fā)射的酸性pH探針(Dirni Z, Chen CS, Zhang CChem. Biol. 1999，6 (7) : 411-418)，但其缺點明顯探針的吸收和發(fā)射波長都很短，容易對細(xì)胞造成損傷，而且還會產(chǎn)生生物質(zhì)自熒光的干擾。因此合成較長波長的雙發(fā)射、低PKa的探針，將會有更好的應(yīng)用前景。苯乙烯類吲哚菁染料具有良好的光穩(wěn)定性，合適的水溶性，很好的細(xì)胞膜通透性以及在細(xì)胞內(nèi)具有較強的熒光，而且這類染料的合成非常簡單，收率也很高，但是通常對PH不敏感。羥基是一個重要的PH探針官能團，許多含有羥基的pH探針已經(jīng)被報道(Tang B，Liu X，Xu KH, Huang H，Yang Gff, An LG. Chem. Comm. 2007，3726-3728)。而應(yīng)用于細(xì)胞酸泡成像的PH探針需要具有較低的pKa，在染料分子中引入吸電基團可以降低分子的pKa。近幾年，具有固體熒光的有機化合物已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，因為它們不僅可以用來進(jìn)行基礎(chǔ)研究，而且還可能應(yīng)用于光電領(lǐng)域，如有機發(fā)光二極管，光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)。理解它們的發(fā)光行為和固態(tài)的性能是非常重要的，因為在實際應(yīng)用中，這些材料一般是以薄膜的形式應(yīng)用的。然而，具有固態(tài)發(fā)射的有機化合物很少。這主要是因為在晶體形態(tài)或者無定形的固相(例如薄膜)，熒光團之間堆積得非常緊密，即使具有最亮發(fā)射的熒光團，也會導(dǎo)致嚴(yán)重的淬滅。另外，固態(tài)的激發(fā)光和發(fā)射光具有很強的消光系數(shù)，這對固體熒光是非常有害的(Ozdemir T, Atilgan S，Kutuk I，Yildirim, LTj Tulek A, Bayindir M, Akkaya EU. Org. Lett. 2009，11 (10) : 2105-2107)，特別當(dāng)熒光團的斯托克斯位移很小的時候。因此，高效的固態(tài)熒光分子的開發(fā)是一個具有挑戰(zhàn)的課題。最近幾年，有很多文獻(xiàn)(OoyamaY，Mamura T, Yoshida K. E. J. Org. Chem. 2007，5010 - 5019; Shimizu M, TakedaY，Higashi M. Angew. Chem. Int. Ed. 2009，48 (20): 3653-3656; Shimizu M，TakedaY，Higashi M，Hiyama T. Angew. Chem. Int. Ed. 2009，48 (20) : 1-5)報道固體發(fā)射的熒光團結(jié)構(gòu)，闡述其發(fā)光機理，它們都是帶有較大側(cè)鏈的共軛體系，這樣可以抑制分子間的聚集；而且多數(shù)分子是供-受體形式，有較強的分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)，可以增大熒光團的斯托克斯位移，減少熒光自淬滅。上述許多研究在X-射線單晶衍射的基礎(chǔ)上，闡述了固體熒光性質(zhì)和分子堆積結(jié)構(gòu)的關(guān)系。研究表明分子間的強作用和鄰近的熒光團之間連續(xù)的分子內(nèi)氫鍵是導(dǎo)致固態(tài)熒光淬滅的主要因素。因此，設(shè)計新型的強固態(tài)發(fā)射的熒光團首先要減少引起熒光淬滅的分子間作用。當(dāng)前消除分子間聚集的方法主要是引入大體積取代基或者引入具有位阻的取代基構(gòu)建非平面結(jié)構(gòu)，以此來解決聚集淬滅熒光的問題。苯乙烯類染料具有較強的ICT效應(yīng)，通過引入較大的取代基也可以使其具有較強的固態(tài)熒光，這類染料的光穩(wěn)定性好，易于合成與純化，適于光電領(lǐng)域的研究。熒光染料作為功能性色素在科學(xué)技術(shù)的各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在生命科學(xué)、臨床醫(yī)療診斷、免疫分析檢測等方面的研究在全世界備受矚目。目前，菲啶類(EB、PI)、吖啶類(AO)、咪唑類(Hoechst、DAPI)和花菁家族類(Cy、T0T0、SYT0)等商品化熒光染料 在基因組學(xué)技術(shù)、核酸定量檢測、血細(xì)胞分析等領(lǐng)域中都起到了重要的作用。然而，這些染料都各自存在著應(yīng)用的局限性。其一主要表現(xiàn)在大多熒光染料受限于固定細(xì)胞樣品。例如TOPRO、TOTO家族染料、溴乙錠(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通過增大細(xì)胞膜的通透性或類似使膜崩解的方法才能對生物樣品進(jìn)行有效的熒光標(biāo)記。然而，這種固定方法往往對細(xì)胞和生物組織真實形態(tài)的觀察有負(fù)面影響[Kozubek S，Lukasova E, Amrichova J,Kozubek M, Liskova A, Slotova J. Anal Biochem 2000; 282:29 - 38] 同時，溴乙淀等吖啶，菲啶類染料有很大的毒性和致癌性。其二，有相當(dāng)一部分熒光染料的激發(fā)光處在紫外光區(qū)，如能夠?qū)Ｒ蛔R別脫氧核糖核酸(DNA)的熒光染料4’，6- 二氨基-2-苯基吲哚啉化合物(DAPI)、Hoechst33258，Hoechst34580等，與DNA結(jié)合后，在紫外光激發(fā)放下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。由于紫外光對細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白等組分會造成嚴(yán)重的損傷，因此這類熒光在熒光顯微技術(shù)中的使用受到光激發(fā)時間的限制[Davis SK, Bardeen CJ. Photochem Photobiol2003; 77:675 - 679]。因此，研究開發(fā)出具有良好熒光光譜性能，毒性小，活細(xì)胞通透性的新型熒光染料仍然是推動熒光分析技術(shù)和生命科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵和核心。在眾多種類的熒光染料中，菁類熒光染料以其波長范圍寬，摩爾消光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率適中等優(yōu)點，作為生物分子熒光探針、CD和VCD記錄材料、感光材料光敏劑、光電轉(zhuǎn)換材料等已被廣泛的應(yīng)用。不對稱菁類化合物中最典型的為TOTO及其類似物(YOYO)和衍生物類(TOPRPO)。TOTO (噻唑橙二聚體)、Y0Y0 (惡唑黃二聚體)是由Glazer研究組開發(fā)的一類對核酸具有高度親和力的多正電荷不對稱菁類熒光染料，通過改變多亞甲基鏈的長度和兩端的芳香母核(噻唑、惡唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的結(jié)構(gòu)可以得到不同的異二聚體類似物和衍生物。這類染料在溶液中幾乎無熒光，降低了檢測過程中的熒光背景干擾，與核酸結(jié)合后熒光增強。此類染料中的有些品種已經(jīng)商品化，如SYT0X Blue, T0T0,P0P0,BOBO, YO-PRO等。但這些商品化的染料大部分分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，屬活細(xì)胞非通透性，只能應(yīng)用于活體外核酸的識別與檢測。近幾年，一些苯乙烯類半菁染料已經(jīng)逐漸被用于DNA的測試，其中包括吡啶類、苯并噻唑類、喹啉類以及吲哚類等。雖然前三類半菁染料中出現(xiàn)了由柔性鏈(帶電荷或不帶電荷)連接的雙染料，但是用于生物分子檢測的吲哚類的雙半菁染料非常少，而用于蛋白檢測的吲哚類雙半菁染料未見報道。值得注意的是，上述所有的雙菁染料中具有活細(xì)胞通透性的結(jié)構(gòu)鮮見報道，可能因為報道的雙菁染料多以含有正電荷的碳鏈作為連接基團，增加了染料的水溶性，降低了細(xì)胞膜通透能力，阻礙了這些具有優(yōu)越性能的染料在活細(xì)胞細(xì)胞器可視化方面的應(yīng)用。適當(dāng)?shù)挠H脂性可以使探針穿過細(xì)胞膜而不會在膜表面堆積(J Colston, Rff Horobin, F Rashid-Doubell, J Pediani, KK Johal. Biotechnic &Histochemistry 2003, 78(6): 323-332);同時，不含水溶性基團的吲哚類菁染料具有良好的活細(xì)胞膜通透性。另一方面，長波長的染料不但可以避開生物體自身的吸收和熒光，而且在應(yīng)用時還能降低激光對細(xì)胞的損傷。因此，以吲哚類半菁染料為熒光團，通過不同連接臂的連接，降低其背景熒光，使其在生物分子識別方面具有更好的應(yīng)用前景
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一類結(jié)構(gòu)簡單、光穩(wěn)定性好、易于合成的新的化合物。根據(jù)取代基的不同，此類化合物可以用于不同領(lǐng)域的功能熒光染料。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一類吲哚類半菁染料分子具有結(jié)構(gòu)通式I :
&_ R3_ R3
\代4I1M
R61
IA其中 = H、鹵素、硝基、磺酸基，R2= H5^R1R2組成萘吲哚環(huán)；RjPR4各自獨立選自H、羥基、鹵素、硝基、Ch烷基；R5 為 H、羥基、N((CH2)niR7)2,其中=R7 = H、OH、OAc、C00H、COOCH3、苯基；R6 為(CH2)pR8,其中=R8 = H、OH、C=C、炔基、OAc、C00H、COOCH3> COOC2H5' p-(C6H4)R9,其中R9 = H、CH3> 鹵素、N02、CN、C00H、L-A ；Y—=鹵素離子、ClO4'PFf 或 TsCT;L = -Ch8 燒基 _、p-(CH2)q (C6H4) (CH2)q-;m = I 18, n = I 或 2, p = 0 18, q = 1-6。當(dāng)n=l、R5為羥基時，具有結(jié)構(gòu)式II
RlxScP^OH
II其中R1 = H、鹵素、硝基、磺酸基，R2= H;或R1R2組成萘吲哚環(huán)；R3和R4各自獨立選自H、羥基、鹵素、硝基、Cl_4烷基；R6 為(CH2)pR8,其中R8 = H、OH、C=C、炔基、OAc、C00H、C00CH3、C00C2H5、p-(C6H4)R9，其中R9 = H、CH3、鹵素、N02、CN、C00H ;
Y-=鹵素離子、C104-、PF6-或 Ts0_，其中P= I 18。當(dāng)R2= H、n=l時，組成結(jié)構(gòu)式III
權(quán)利要求
1.一類吲哚類半菁染料，其特征在于所述染料分子具有如下結(jié)構(gòu)通式IV
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一類吲哚類半菁染料，其特征在于所述具有結(jié)構(gòu)通式IV的化合物用作生物熒光探針。
全文摘要
一類吲哚類半菁染料的合成與應(yīng)用，屬于精細(xì)化工領(lǐng)域中一類功能染料的合成及其作為熒光染料的應(yīng)用。這類化合物由吲哚季銨鹽與相應(yīng)的醛縮合而成，具有摩爾消光系數(shù)大，光穩(wěn)定性好，易于合成等優(yōu)點。該類分子根據(jù)其取代基、陰離子的不同，可以具有pH探針性質(zhì)、固態(tài)熒光性質(zhì)和與生物大分子結(jié)合的性能。作為pH探針時，可根據(jù)取代基的不同調(diào)節(jié)探針的pKa，并且可用于雙色活細(xì)胞成像；作為固態(tài)發(fā)射染料時，根據(jù)取代基與陰離子的不同，可以調(diào)節(jié)其固態(tài)發(fā)射波長；作為生物分子探針時，對生物分子有很好的反應(yīng)，且具有活細(xì)胞細(xì)胞膜通透能力，可用于細(xì)胞染色，而且由于其吸收和發(fā)射波長較長，可以避免生物質(zhì)自熒光的干擾，還能降低激發(fā)光對細(xì)胞或生物組織的損傷。
文檔編號G01N21/64GK102964863SQ20121033096
公開日2013年3月13日 申請日期2010年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月10日
發(fā)明者彭孝軍, 王炳帥, 樊江莉, 王靜云, 吳彤 申請人:大連理工大學(xué)