專利名稱：：結(jié)腸癌相關(guān)基因tom34的制作方法結(jié)腸癌相關(guān)基因roM34本申請(qǐng)要求2005年7月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列No.60/703,265的權(quán)益，在此將上述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容引用并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及4企測(cè)和診斷結(jié)腸癌的方法以及治療和預(yù)防結(jié)腸癌的方法。發(fā)明背景結(jié)腸直腸癌是全世界癌癥死亡的最常見(jiàn)原因之一。盡管各種結(jié)腸直腸癌的診斷和治療取得了各種進(jìn)步，但許多晚期結(jié)腸直腸癌患者的死亡率很高。為了改善他們的預(yù)后，有必要研制用于早期癌檢測(cè)的敏感而特異的診斷用生物標(biāo)志以及更為有效且有害性更小的治療性藥物。為了達(dá)到這個(gè)目的，有必要更清楚地了解結(jié)腸直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制。最近的分子研究披露了結(jié)腸直腸癌發(fā)生涉及遺傳改變的積累，包括在腫瘤抑制基因和/或癌基因包括APC、p53、beta-聯(lián)蛋白和K-ras的遺傳改變(NishishoI，etal.Science253:665-669,1991;BakerSJ，etal.，Science244:217-221，1989;MorinPJ,etal"Science275:1787-1790,1997;ForresterK,etal.，Nature327:298-303,1987)。除了這些類型的改變之外，表觀遺傳事件，例如改變的曱基化作用(JonesPA&LairdPW，NatGenet21:163-167，1999)和印記的丟失(CuiH,etal.,NatMed4:1276-1280,1998)和/或由于遺傳變化或其它未知的才幾制所致的失調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄控制，與結(jié)腸直腸腫瘤的發(fā)生相關(guān)。在涉及癌發(fā)生的基因中，我們預(yù)想對(duì)癌細(xì)胞的增殖和/或存活必需的基因產(chǎn)物的抑制將導(dǎo)致它們的生長(zhǎng)抑制或細(xì)胞死亡。因此，產(chǎn)生致癌活性并特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)的分子，是用于研制新抗癌藥的有希望的靶標(biāo)。人TOM34是從人EST和cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的，并且被預(yù)測(cè)為線粒體蛋白輸入機(jī)構(gòu)的組分，因?yàn)樵摫活A(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)在一個(gè)62位殘基基序的區(qū)域中與已知的線粒體受體的酵母Tom70家族具有序列同源性(NuttallSD,etal.，DNACellBiol16:1067-1074,1997)。然而，最近的研究披露，在細(xì)胞和組織分級(jí)后，TOM34主要被包括在細(xì)胞質(zhì)級(jí)分中，部分被包括在線粒體和膜級(jí)分中(ChewawiwatN,etal.，JBiochem(Tokyo)125:721-727,1999)。另一項(xiàng)研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色顯示了它在HeLa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的亞細(xì)胞定位(Chun-SongYandHenryY.,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110,2002;AbhijitM,etal.，ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:97-104,2002)。酵母雙雜交篩選系統(tǒng)已經(jīng)顯示TOM34在體外與含纈酪肽蛋白(valosin-containingprotein,VCP)、一種AAA(與多種細(xì)胞活性相關(guān)的ATP酶)家族成員(Chun-SongY,etal"ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110,2002)、或90-kDa熱休克蛋白(YoungJC,etal"JBiolChem273:18007-18010，1998)相互作用。然而，TOM34的生物學(xué)作用尚不清楚。已經(jīng)證明，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)識(shí)別提呈到MHCI類分子上的來(lái)源于腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的表位肽，并裂解腫瘤細(xì)胞。自MAGE家族作為TAA的第一個(gè)例子被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，應(yīng)用免疫方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它的TAA(BoonT.，IntJCancer.1993;54(2):177-80.，BoonT&vanderBruggenP,JExpMed.1996;183(3):725-9.，vanderBmggenP,et.al.,Science.1991;254(5038):1643-7.,BrichardV,et.al.,JExpMed.1993;178(2):489-95"KawakamiY,et,al.,JExpMed,1994;180(l):347-52),目前其中一些在臨床研究過(guò)程中已被當(dāng)作免疫治療的耙標(biāo)。到目前為止發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE(vanderBruggenP,et.al.,Science.1991;254(5038):1643-7)、gplOO(KawakamiY,et.al.，JExpMed.1994;180(l):347-52)、SART(ShichijoS,et.al.，JExpMed.1998;187(3):277-88)、NY-ESO-1(ChenYT,etal"ProcNatlAcadSciUSA.1997;94(5):1914-8)。同時(shí)已證明，腫瘤細(xì)胞以一定程度的特異性過(guò)高表達(dá)的基因產(chǎn)物為被識(shí)別為細(xì)胞免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。這些包括p53(UmanoY，et.al.,BrJCancer.2001;84(8):1052-7)、HER2/歸(TanakaH，et.al"BrJCancer.2001;84(l):94-9)、CEA(NukayaI，et.al"IntJCancer.1999;80(l):92-7)以及其它產(chǎn)物。盡管這些是在基礎(chǔ)和臨床研究中已經(jīng)取得顯著進(jìn)展的例子(RosenbergSA，et.al.,NatMed.1998;4(3):321-7.，MukherjiB,et.al.，ProcNatlAcadSciUSA.1995;92(17):8078-82"HuX，et.al"CancerRes.1996;56(11):2479-83)，一般用于腺癌包括結(jié)腸癌治療的候選TAA數(shù)量非常有限。如果有僅僅在癌細(xì)胞中但不在正常細(xì)胞中大量表達(dá)的TAA,它們將是有希望的候選免疫治療靶標(biāo)。發(fā)明概述為了驗(yàn)證在結(jié)腸直腸癌發(fā)生中的分子作用并為結(jié)腸直腸癌(CRC)患者尋找新的治療靶標(biāo)，我們應(yīng)用由23040個(gè)基因構(gòu)成的cDNA微陣列進(jìn)行了表達(dá)模式分析(LinYM，etal.,Oncogene21:4120-4128，2002)。在結(jié)腸直腸腫瘤中顯示上調(diào)表達(dá)的基因中，我們著眼于TOM34(34kDa的線粒體外膜移位酶)，因?yàn)樗谋磉_(dá)水平在受檢的20個(gè)CRC樣品中在其中16個(gè)中頻繁提高。多組織Northern印跡分析顯示該基因大量表達(dá)于睪丸和卵巢中，弱表達(dá)于前列腺、脾臟和結(jié)腸中，但在受檢的其它11個(gè)正常成人組織中均不表達(dá)。TOM34的免疫組織化學(xué)染色顯示，在CRC組織中與它們相應(yīng)的非癌粘膜有顯著的蓄積。在本發(fā)明中，證實(shí)了人TOM34在CRC中頻繁上調(diào)，它在睪丸和卵巢中表達(dá)，但在被;險(xiǎn)的其它15種正常成人組織中不表達(dá)。既然通過(guò)siRNA抑制該TOM34明顯降低了結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，該基因產(chǎn)物可能是一種潛在的人腫瘤的治療靶標(biāo)，也是一種有用的診斷標(biāo)志。而且，考慮TOM34可能作為一種能誘發(fā)顯著的抗結(jié)腸癌細(xì)胞免疫反應(yīng)的TAA(肺瘤相關(guān)抗原)。為了^r證這個(gè)^(叚設(shè)，我們用來(lái)源于TOM34的肽刺激了從健康志愿者收集的PBMC，并成功獲得了肽特異性CTL克隆，這些克隆也可以識(shí)別和殺傷表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞。具體地，以rOMM特異性小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116和RKO細(xì)胞有效地抑制了它的表達(dá)，并顯著地抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)。而且，對(duì)于具有來(lái)源于TOM34的序列的肽，我們考察了它們作為抗原表位肽的潛力，并探索了一種可以誘導(dǎo)顯著的抗結(jié)腸癌細(xì)胞免疫應(yīng)答，用于癌癥免疫治療的新表位肽。用具有TOM34部分序列的肽刺激了健康供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。選擇了那些被推測(cè)與HLA-A*2402結(jié)合的肽。我們成功地鑒定了一種其序列來(lái)源于TOM34的特異性抗原肽，其可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)細(xì)胞系，所述CTL細(xì)胞系針對(duì)以HLA-A24限制性的方式提呈該抗原的細(xì)胞顯示特異性細(xì)胞毒性。從這些CTL細(xì)胞系中建立了CTL克隆。進(jìn)一步的CTL克隆分析顯示它們不但對(duì)負(fù)載肽的靶細(xì)胞，而且對(duì)內(nèi)源性表達(dá)TOM34的細(xì)胞具有強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。而且，非放射性靶抑制測(cè)定(coldtargetinhibitionassay)表明這些CTL克隆特異性識(shí)別了MHCI類分子復(fù)合物中的所述抗原肽。這些結(jié)果強(qiáng)烈地提示該肽為一種HLA-A24限制性的表位肽，其可誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)TOM34的結(jié)腸癌細(xì)胞的強(qiáng)力而特異的免疫應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)提示TOM34與癌細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，并可能促進(jìn)新的抗癌藥和/或CRC診斷的開(kāi)發(fā)。本發(fā)明是基于TOM34的基因表達(dá)圖式的發(fā)現(xiàn)。TOM34的核苷酸序列和氨基酸序列分別列出在SEQIDNO:60和61中。這些序列也可從Genbank登錄AB085681獲得。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種通過(guò)確定來(lái)源于患者的生物樣品，例如組織樣品中的TOM34表達(dá)水平，來(lái)診斷或確定受試者對(duì)結(jié)腸癌的傾向性(predisposition)的方法。正常細(xì)胞是獲自結(jié)腸組織?；虮磉_(dá)水平與正常對(duì)照基因表達(dá)水平相比的變化，例如增加，表明該受試者患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生結(jié)腸癌。應(yīng)用于本發(fā)明背景下的術(shù)語(yǔ)對(duì)結(jié)腸癌的"傾向性"涵蓋受試者易感于結(jié)腸癌，具有結(jié)腸癌趨勢(shì)、發(fā)病性、傾向或敏感性的狀態(tài)。而且，該術(shù)語(yǔ)也涵蓋受試者有獲得結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明的背景下，詞組"對(duì)照水平"指的是在對(duì)照樣品中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。對(duì)照水平可以是來(lái)源于單一參照群體的單一表達(dá)圖式，或是來(lái)源于多個(gè)表達(dá)圖式的單一表達(dá)圖式。例如，對(duì)照水平可以是來(lái)自于在先測(cè)試細(xì)胞的表達(dá)圖式的數(shù)據(jù)庫(kù)。"正常對(duì)照水平，，指的是在正常健康個(gè)體或已知未患有結(jié)腸癌個(gè)體的群體中所檢測(cè)的基因表達(dá)水平。正常個(gè)體是沒(méi)有結(jié)腸癌臨床癥狀的個(gè)體。與正常對(duì)照水平相比，在測(cè)試樣品中纟企測(cè)到TOM34表達(dá)水平的增加表明受試者(從其獲得樣品者)患有CRC或者有發(fā)生CRC的風(fēng)險(xiǎn)。才艮據(jù)本發(fā)明，若基因表達(dá)與對(duì)照水平相比增加了10%、25%、50%,則認(rèn)為基因表達(dá)水平是"改變的，，?；蛘?，若基因表達(dá)與對(duì)照水平相比增加了至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多倍，則基因表達(dá)水平被認(rèn)定為"增加的，，。通過(guò);f企測(cè)雜交，例如TOM34探針對(duì)來(lái)源于患者的組織樣品的基因轉(zhuǎn)錄物的雜交而確定表達(dá)。在本發(fā)明的背景下，來(lái)源于患者的組織樣品是來(lái)自測(cè)試受試者的任何組織，例如已知患有或懷疑有結(jié)腸癌的患者。例如，該組織可能含有上皮細(xì)胞。更特別地，該組織可能是來(lái)自結(jié)腸直腸癌的上皮細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)將表達(dá)TOM34的測(cè)試細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，并確定TOM34的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性，來(lái)鑒定抑制TOM34表達(dá)或活性的物質(zhì)的方法。該測(cè)試細(xì)胞可以是上皮細(xì)胞，例如獲自結(jié)腸直腸癌的上皮細(xì)胞。與基因或基因產(chǎn)物的對(duì)照水平或活性相比，TOM34表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性下降，表明該測(cè)試化合物為TOM34抑制劑并可用于減輕結(jié)腸癌癥狀。本發(fā)明也提供了包含與TOM34核酸或多肽結(jié)合的檢測(cè)試劑的試劑盒。本發(fā)明的治療方法包括治療或預(yù)防受試者中結(jié)腸癌的方法，包括給受試者施用TOM34拮抗劑或抑制劑例如反義組合物或抗體組合物的步驟。該拮抗劑或抑制劑可作用于核酸或蛋白質(zhì)水平從而降低或抑制TOM34表達(dá)或活性。在本發(fā)明的背景下，反義組合物降低特異性靶基因的表達(dá)。例如，反義組合物可含有與TOM34序列互補(bǔ)的核苷酸。或者，本方法可包括給受試者施用小干擾RNA(siRNA)組合物的步驟。在本發(fā)明的背景下，siRNA組合物降低TOM34的表達(dá)。在另外一種方法中，受試者中結(jié)腸癌的治療或預(yù)防可以通過(guò)給受試者施用核酶組合物而實(shí)施。在本發(fā)明的背景下，核酸特異性核酶組合物降〗氐TOM34的表達(dá)。實(shí)際上，siRNA對(duì)TOM34的抑制效應(yīng)得到了證實(shí)。例如，在樣品切片中已經(jīng)清楚地顯示出TOM34的siRNA抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖。因此，在本發(fā)明中，TOM34是優(yōu)選的結(jié)腸癌治療l巴標(biāo)。本發(fā)明也包括疫苗和接種方法。例如，治療或預(yù)防受試者中的結(jié)腸癌的方法可包含對(duì)受試者施用含有TOM34核酸編碼的多肽或該多肽的免疫活性片段的疫苗。在本發(fā)明的背景下，免疫活性片段是長(zhǎng)度短于全長(zhǎng)天然存在的蛋白，但誘導(dǎo)與全長(zhǎng)蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類似的免疫應(yīng)答的多肽。例如，免疫活性片段應(yīng)該是長(zhǎng)度至少為8個(gè)殘基，并且能夠刺激免疫細(xì)胞例如T細(xì)胞或B細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子(例如IL-2)的生成(elaboration)或抗體的產(chǎn)生而測(cè)量免疫細(xì)胞刺激。除非另有定義，本發(fā)明中所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。盡管與本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施和檢驗(yàn)，下文中對(duì)合適的方法和材料進(jìn)行了描述。本申請(qǐng)引證本文中提及的所有的出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考數(shù)據(jù)的全部?jī)?nèi)容。本文中的任何內(nèi)容均不應(yīng)被解釋一旦出現(xiàn)矛盾，將以包括定義在內(nèi)的本說(shuō)明書為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，并不意圖起限制作用。本文描述的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在檢測(cè)到明顯的結(jié)腸癌臨床癥狀之前鑒定疾病。根據(jù)以下詳細(xì)的說(shuō)明和權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是自明的。附圖簡(jiǎn)述圖1描述rOM54基因在各種組織中的表達(dá)水平。(A)結(jié)腸癌組織和它們相應(yīng)的非癌粘膜中的rOM34的半定量RT-PCR分析。T，腫瘤組織；N,正常組織。的表達(dá)作為內(nèi)部對(duì)照。(B)TOM34的多組織northern印跡分析。r07lf34的轉(zhuǎn)錄物的大小大約為2.0-kb。圖2描述TOM3V基因編碼的蛋白質(zhì)在各種組織中的表達(dá)水平。(A)結(jié)腸癌組織和它們相應(yīng)的非癌粘膜中TOM34的Western印跡分析。T,腫瘤組織；N,正常組織。(B)TOM34在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)。beta-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。圖3描述在結(jié)腸癌組織中的TOM34的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。(A和B)癌性和非癌性細(xì)胞中的代表性染色圖像。放大倍數(shù)X40,(C和D)正常粘膜和癌性組織的圖像(C正常，D;肺瘤)。放大倍數(shù)X200。圖4描述TOM34siRNA對(duì)TOM34基因表達(dá)或CRC細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。(A)siRNA對(duì)HCT116細(xì)胞中表達(dá)的影響。通過(guò)western印跡分析分析了TOM34的表達(dá)。(3-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。制備了EGFP特異性siRNA(s正GFP)為陰性對(duì)照。(B)TOMM-siRNA對(duì)HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。通過(guò)一式三份的MTT測(cè)定法測(cè)量了響應(yīng)于EGFP-siRNA或TOM34-siRNA的HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)能力。誤差條形，SD;星號(hào)表示通過(guò)ScheffF檢驗(yàn)(ScheffsFtest)確定的顯著性差異(PO.OOOl)。圖5描述10聚體肽TOM34-299誘導(dǎo)的CTL系的細(xì)胞毒性效應(yīng)。10聚體肽TOM34-299激發(fā)產(chǎn)生的CTL系顯示出肽特異性細(xì)胞毒性。CTL系顯示了對(duì)負(fù)載有TOM34-299的靶細(xì)胞(TISI)的高細(xì)胞毒活性，而它們對(duì)沒(méi)有負(fù)載肽的同樣的靶細(xì)胞(TISI)未顯示顯著的細(xì)胞毒活性。這證明CTL系具有肽特異性細(xì)胞毒性。圖6描述TOM34-299激發(fā)的CTL系肽特異性強(qiáng)細(xì)胞毒性。CTL系在低達(dá)1.2的E/T比(E/Tratio)顯示出可;f全測(cè)的抗原特異性強(qiáng)細(xì)胞毒性。圖7描述CTL克隆的強(qiáng)細(xì)胞毒性。可以建立具有極強(qiáng)的TOM34-299特異性細(xì)胞毒性的CTL克隆。從抗TOM34-299的CTL系建立的CTL克隆顯示了不同的殺傷活性，其中一些具有極強(qiáng)的活性。圖8描述TOM34-299激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆的HLA特異性。被TOM34-299激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆識(shí)別并以HLA限制性的方式裂解內(nèi)源性表達(dá)TOM34的肺瘤細(xì)胞。使用由TOM34-299激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆作為效應(yīng)細(xì)胞，測(cè)試了針對(duì)內(nèi)源性表達(dá)TOM34的DLD-1和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性。用內(nèi)源性表達(dá)TOM34但不表達(dá)HLA-A24的SNU-C2A細(xì)胞作為靶標(biāo)。CTL克隆對(duì)既表達(dá)TOM34也表達(dá)HLA-A24的DLD-1和HT29細(xì)胞均顯示了高的細(xì)胞毒活性。另一方面，它們對(duì)表達(dá)TOM34但不表達(dá)HLA-A24的SNU-C2A細(xì)胞沒(méi)有顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。.圖9描述TOM34-299激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆的HLA特異性。TOM34-299激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆以HLA-A24限制性的方式特異性地識(shí)別TOM34。如"材料與方法"描述的那樣進(jìn)行非放射性靶抑制測(cè)定。制備了被Na^Cr04標(biāo)記的HT29細(xì)胞作為放射性耙，而用具有或沒(méi)有TOM34-299肽負(fù)載的無(wú)"Cr標(biāo)記TISI細(xì)胞作為非放射性靶。E/T比固定于20。僅當(dāng)負(fù)載肽時(shí)，添加TISI細(xì)胞才抑制CTL克隆對(duì)HT29細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖10描述TOM34-299激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆的細(xì)胞毒活性的特異性。TOM34-299激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆的細(xì)胞毒活性，被識(shí)別T細(xì)胞表面抗原I類HLA或CD8的抗體特異性地阻斷。在識(shí)別T細(xì)胞表面抗原的抗體存在下，確定了CTL克隆對(duì)HT29細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。加入識(shí)別I類HLA或CD8的抗體明顯地阻斷了CTL活性，且加入II類HLA或CD4的抗體輕微地影響了該活性，而它根本不被同種型匹商己只于照抗體(isotype國(guó)matchedcontrolantibody)的力口入戶斤才中制。發(fā)明詳述除非有其它特別說(shuō)明，文中所用的詞語(yǔ)"一個(gè)(種)"("a","an")和"所述"("the")意味著至少一個(gè)(種)。除非上下文另有要求，該說(shuō)明書的通篇和之后的權(quán)利要求中，詞語(yǔ)"包括"、"包含"、"含有"("comprise")及其變型例如"comprises"和"comprising"，當(dāng)理解為意口木著包含所述的整體(integer)或步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其它整體或步驟或者整體或步驟的組。本發(fā)明是部分基于下述發(fā)現(xiàn)，即在來(lái)自CRC患者結(jié)腸組織的細(xì)胞中TOM34的表達(dá)提高。應(yīng)用綜合cDNA孩i陣列系統(tǒng)(comprehensivecDNAmicroarraysystem)鑒定了才是高的基因表達(dá)。先前應(yīng)用含有23,040個(gè)基因的cDNA微陣列構(gòu)建了20位患者的綜合基因表達(dá)模式。TOM34在CRC患者中高水平表達(dá)。本文鑒定的TOM34作為CRC標(biāo)記用于診斷目的，或者作為基因靶標(biāo)，對(duì)其表達(dá)進(jìn)行改變以治療或減輕CRC癥狀。通過(guò)測(cè)量TOM34在細(xì)胞樣品中的表達(dá)而診斷CRC。類似地，通過(guò)測(cè)量響應(yīng)于各種物質(zhì)的TOM34的表達(dá)，可以鑒定治療CRC的物質(zhì)。本發(fā)明涉及確定(例如測(cè)量)TOM34的表達(dá)。利用GeneBankTM數(shù)據(jù)庫(kù)條目提供的TOM34序列信息，應(yīng)用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)檢測(cè)和測(cè)量了TOM34。例如，使用相應(yīng)于TOM34的序列數(shù)據(jù)庫(kù)條目?jī)?nèi)的序列來(lái)構(gòu)建探針，用于在例如Northern印跡雜交分析中檢測(cè)TOM34RNA序列。另舉一例，該序列可用于構(gòu)建引物，用于在例如基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法(例如基于逆轉(zhuǎn)錄的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))中特異性地?cái)U(kuò)增TOM34。然后將測(cè)試細(xì)胞群體如來(lái)源于患者的組織樣品中的TOM34表達(dá)水平與參照群中的TOM34表達(dá)水平進(jìn)行比較。參照細(xì)胞群體包括一種或多種被比較參數(shù)已知的細(xì)胞，即CRC細(xì)胞或非CRC細(xì)胞。與參照細(xì)胞群體比較，測(cè)試細(xì)胞群體中的基因表達(dá)圖式是否指示CRC或其傾向性，取決于參照細(xì)胞群體的組成。例如，如果參照細(xì)胞群體由非CRC細(xì)胞組成，在測(cè)試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體中基因表達(dá)模式相似則表明測(cè)試細(xì)胞群體為非CRC。相反地，如果參照細(xì)胞群體由CRC細(xì)胞組成，在測(cè)試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體之間的基因表達(dá)模式相似則表明測(cè)試細(xì)胞群體包括CRC細(xì)胞。如果測(cè)試細(xì)胞群體中的TOM34的表達(dá)水平不同于參照細(xì)胞群體，相比于參照細(xì)胞群體中相應(yīng)的TOM34變化了1.0倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、10.0倍或更多的倍數(shù)，則認(rèn)為其表達(dá)水平發(fā)生了改變?？梢詫y(cè)試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體之間差異的基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照核酸，例如持家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。例如，對(duì)照核酸是已知不依賴于細(xì)胞癌性或非癌性狀態(tài)而差異的核酸。可以使用對(duì)照核酸的表達(dá)水平來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體中的信號(hào)水平。對(duì)照基因的例子包括，但不限于，例如肌動(dòng)蛋白、甘油醛3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。將測(cè)試細(xì)胞群體與多個(gè)參照細(xì)胞群體比較。所述已知參數(shù)在多個(gè)參照細(xì)胞群體的每一個(gè)中可以不同。因此，可以將測(cè)試細(xì)胞群體與已知含有例如CRC細(xì)胞的第二參照細(xì)胞群體相比較，以及與已知含有例如非CRC細(xì)胞(正常細(xì)胞)的第二參照細(xì)胞群體相比較。測(cè)試細(xì)胞群體可以包含在來(lái)自已知含有或懷疑含有CRC細(xì)胞的受試者的組織類型或細(xì)胞樣品中。測(cè)試細(xì)胞群體從身體組織或體液，例如生物流體(例如，血液，痰，唾液)中獲得。例如，測(cè)試細(xì)胞是從組織純化的。優(yōu)選地，測(cè)試細(xì)胞群體包括上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自已知是或懷疑是CRC的組織。參照細(xì)胞群體中的細(xì)胞來(lái)源于與測(cè)試細(xì)胞相似的組織類型?？蛇x地，參照細(xì)胞群體是細(xì)胞系，例如CRC細(xì)胞系(陽(yáng)性對(duì)照)或正常非CRC細(xì)胞系(陰性對(duì)照)?；蛘?，對(duì)照細(xì)胞群體來(lái)源于分子信息數(shù)據(jù)庫(kù)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于被測(cè)定參數(shù)或條件已知的細(xì)胞。受試者優(yōu)選哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以是例如人、非人靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。本文公開(kāi)的TOM34的表達(dá)使用本領(lǐng)域已知的方法在蛋白或者核酸水平上加以確定。例如，可以使用特異性識(shí)別該序列的探針進(jìn)行Northern雜交分析來(lái)確定基因表達(dá)?；蛘?，使用基于逆轉(zhuǎn)錄的PCR測(cè)定法來(lái)測(cè)量基因表達(dá)，例如，使用對(duì)于TOM34特異性的引物。也在蛋白水平上確定表達(dá)，即通過(guò)測(cè)量本文所述基因產(chǎn)物所編碼多肽的水平或其生物學(xué)活性。此類方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，例如，使用基于針對(duì)7UM^編碼蛋白的抗體的免疫測(cè)定。該基因編碼的蛋白質(zhì)的生物活性也是已知的。診斷CRC:在本發(fā)明的背景下，通過(guò)測(cè)量來(lái)自測(cè)試細(xì)胞群體(即來(lái)源于患者的生物樣品)的TOM34表達(dá)水平而診斷CRC。優(yōu)選地，測(cè)試細(xì)胞群體含有上皮細(xì)胞，例如，獲自結(jié)腸組織的細(xì)胞。也可從血或其它體液如尿測(cè)量基因表達(dá)。其它生物樣品可用于測(cè)量蛋白質(zhì)水平。例如，可通過(guò)免疫測(cè)定或其它常規(guī)的生物測(cè)定來(lái)測(cè)量來(lái)源于待診斷受試者的血液或血清中的蛋白質(zhì)水平。確定測(cè)試細(xì)胞或生物樣品中TOM34的表達(dá)，并與纟皮測(cè)TOM34的相關(guān)正常對(duì)照表達(dá)水平進(jìn)行比較。正常對(duì)照水平是典型地在已知未患CRC群體中發(fā)現(xiàn)的TOM34表達(dá)模式。來(lái)源于患者的組織中TOM34表達(dá)水平的變化(例如增加)表明該受試者患有CRC或具有發(fā)生CRC的風(fēng)險(xiǎn)。例如，與于正常對(duì)照水平相比，測(cè)試群體中TOM34的表達(dá)的增加表明該受試者患有CRC或具有發(fā)生CRC的風(fēng)險(xiǎn)。與于正常對(duì)照水平相比，測(cè)試群體中TOM34的變化表明該受試者患有CRC或具有發(fā)生CRC的風(fēng)險(xiǎn)?？赏ㄟ^(guò)定量TOM34的相應(yīng)mRNA或TOM34的編碼蛋白質(zhì)來(lái)估計(jì)生物樣品中TOM34的表達(dá)水平。mRNA的定量方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可通過(guò)Northern印跡法或RT-PCR估計(jì)TOM34mRNA的水平。由于TOM34的核苷酸序列是已知的，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均可設(shè)計(jì)探針或引物的核苷酸序列以定量TOM34。例如，包含SEQIDNO:43和44所示核苷酸序列的TOM34特異性引物組是優(yōu)選的引物。也可以基于TOM34蛋白的量或活性分析TOM34的表達(dá)水平。以下顯示了一種確定TOM34蛋白量的方法。例如，免疫測(cè)定方法對(duì)確定生物材料中的蛋白質(zhì)是有用的。只要TOM34基因在結(jié)腸癌患者的樣品中表達(dá)，任何生物材料均可用作確定該蛋白質(zhì)或其活性的生物樣品。例如，結(jié)腸組織可認(rèn)為是這樣的生物樣品。然而，也可以分析體液例如血液和尿。另一方面，適于確定TOM34基因編碼蛋白質(zhì)活性的方法，也可以根據(jù)待分析的蛋白質(zhì)的活性加以選擇。估計(jì)生物樣品中的TOM34基因的表達(dá)水平并與正常樣品(例如來(lái)源于非患病受試者的樣品)中的表達(dá)水平進(jìn)行比較。當(dāng)這樣的比較顯示該基因的表達(dá)水平高于正常樣品的表達(dá)水平時(shí)，判斷該受試者為結(jié)腸癌受累?？梢酝瑫r(shí)確定來(lái)自正常受試者和待診斷受試者的生物樣品中TOM34基因的表達(dá)水平。或者，可以通過(guò)統(tǒng)計(jì)方法確定表達(dá)水平的正常范圍，該方法基于對(duì)預(yù)先從對(duì)照組采集的樣品中的基因表達(dá)水平的分析結(jié)果。將通過(guò)比較受試者樣品獲得的結(jié)果與正常范圍相比；若該結(jié)果未落入該正常范圍，則判斷該受試者受累于結(jié)腸癌或具有發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明中還提供了用于診斷結(jié)腸癌的診斷試劑。本發(fā)明的診斷試劑包含與TOM34基因的多核香酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選地，與TOM34基因的多核苷酸雜交的寡核苷酸或與TOM34基因編碼的多肽結(jié)合的抗體可用作這樣的化合物。而且，適體，例如RNA、DNA或肽適體也可以用作這樣的化合物。優(yōu)選地，該診斷劑包含可檢測(cè)標(biāo)記，例如本領(lǐng)域公知的萸光、發(fā)光或生物發(fā)光標(biāo)記。本文診斷結(jié)腸癌的方法可以用于評(píng)定受試者中結(jié)腸癌治療的效力。根據(jù)本方法，從正在經(jīng)歷結(jié)腸癌治療的受試者獲取生物樣品例如測(cè)試細(xì)胞群體。該評(píng)定方法可根據(jù)診斷結(jié)腸癌的常規(guī)方法進(jìn)行。如果需要，在治療前、治療中或治療后不同時(shí)間點(diǎn)從受試者獲取生物樣品。然后，確定該生物樣品中TOM34基因的表達(dá)水平，并與對(duì)照水平進(jìn)行比較，其中對(duì)照水平來(lái)源于，例如，包括結(jié)腸癌狀態(tài)(即癌性細(xì)胞或非癌性細(xì)胞)已知的細(xì)胞的參照細(xì)胞群體。對(duì)照水平在未曾經(jīng)受該治療的生物樣品中確定。如果對(duì)照水平是來(lái)源于不含癌性細(xì)胞的生物樣品，則來(lái)源于受試者的生物樣品中的表達(dá)水平與對(duì)照水平之間的相似性表明治療是有效的。來(lái)源于受試者的生物樣品中的TOM34基因的表達(dá)水平與對(duì)照水平之間的差異則表明不太令人滿意的臨床結(jié)果或預(yù)后。抑制TOM34表達(dá)的作用物質(zhì)的鑒定通過(guò)將表達(dá)TOM34的測(cè)試細(xì)胞群體與測(cè)試物質(zhì)接觸并確定TOM34的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性，可以鑒定抑制TOM34表達(dá)或其基因產(chǎn)物活性的物質(zhì)。相比于該測(cè)試物質(zhì)不存在時(shí)的表達(dá)或活性水平，該物質(zhì)存在時(shí)制劑并有用于抑制CRC。該測(cè)試細(xì)胞群體可以是任何表達(dá)TOM34的細(xì)胞。例如，該測(cè)試細(xì)胞群體可含有上皮細(xì)胞如來(lái)源于結(jié)腸組織的細(xì)胞。而且，測(cè)試細(xì)胞可以是來(lái)源于癌(carcinoma)細(xì)胞或結(jié)腸直腸癌的永生化細(xì)胞系。或者，測(cè)試細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)染了TOM34的細(xì)胞，或者轉(zhuǎn)染了可操作地連接于報(bào)道基因的來(lái)自TOM34的調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子序列)的細(xì)胞。受試者中CRC治療的效力評(píng)估本文鑒定的差異表達(dá)TOM34還使得監(jiān)測(cè)CRC的治療過(guò)程成為可能。在該方法中，從接受CRC治療的受試者提供測(cè)試細(xì)胞群體。如果希望的話，在治療前、治療中和治療后的不同時(shí)間點(diǎn)從受試者獲得測(cè)試細(xì)胞群體。然后確定細(xì)胞群體中TOM34的表達(dá)并與包括已知TOM34狀態(tài)的細(xì)胞的參照細(xì)胞群體相比較。在本發(fā)明的背景下，所述參照細(xì)胞應(yīng)尚未暴露于感興趣的治療。如果參照細(xì)胞群體不含CRC細(xì)胞，則測(cè)試細(xì)胞群體中和參照細(xì)胞群體中TOM34表達(dá)相似表明該目標(biāo)治療是有效的。然而，測(cè)試群體中與正常對(duì)照參照細(xì)胞群體中TOM34表達(dá)差異則表明不太令人滿意的臨床結(jié)果或預(yù)后。類似地，如果參照細(xì)胞群體含有CRC細(xì)胞，則測(cè)試細(xì)胞群體中和參照細(xì)胞群體中TOM34表達(dá)差異表明該目標(biāo)治療是有效的，而在測(cè)試群體與癌癥對(duì)照參照細(xì)胞群體中TOM34表達(dá)相似則表明不太令人滿意的臨床結(jié)果或預(yù)后。另外，可以將治療后從受試者獲得的生物學(xué)樣品中確定的TOM34表達(dá)水平(即治療后水平)與治療前從受試者獲得的生物學(xué)樣品中確定的TOM3表達(dá)水平(即治療前水平)相比較。治療后樣品中TOM34表達(dá)水平的減少表明感興趣的治療是有效的，而治療后樣品中表達(dá)水平的增加或維持則指示較為不利的臨床結(jié)果或預(yù)后。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"有效的，，表明該治療導(dǎo)致病理性上調(diào)基因表達(dá)下降，或?qū)е率茉囌咧蠧RC的大小、患病率(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力的減少。當(dāng)目標(biāo)治療是預(yù)防性地應(yīng)用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"有效的"意思是該治療延緩或預(yù)防CRC的形成，或延緩、預(yù)防或減輕臨床CRC的癥狀。結(jié)腸腫瘤的評(píng)定可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)臨床規(guī)程進(jìn)行。此外，可結(jié)合任何有關(guān)已知的CRC診斷或治療方法確定有效性。CRC可通過(guò)例如鑒定異常癥狀，例如體重減輕、腹痛、背痛、食欲減退、惡心、嘔吐、全身不適、虛弱和黃痘，來(lái)加以-〖t斷。特定個(gè)體CRC治療的合適治療劑的選擇個(gè)體遺傳構(gòu)成(geneticmakeup)的差異可導(dǎo)致他們代謝各種藥物的相對(duì)能力的差異。在受試者中被代謝并作為抗CRC劑起作用的物質(zhì)，可通過(guò)誘導(dǎo)受試者細(xì)胞中的基因表達(dá)圖式從癌性狀態(tài)特征性基因表達(dá)圖式變成非癌性狀態(tài)特征性基因表達(dá)圖式的方式來(lái)顯示自身。因此，本文公開(kāi)的TOM34使得人們有可能在來(lái)自選定受試者的測(cè)試細(xì)胞群體中測(cè)試假定的治療性或預(yù)防性CRC抑制劑，以確定物質(zhì)在受試者中是否是合適的CRC抑制劑。為了鑒定適合于特定受試者的CRC抑制劑，將來(lái)自受試者的測(cè)試細(xì)胞群體暴露于治療劑處理，并確定TOM34的表達(dá)。在本發(fā)明的方法的背景下，測(cè)試細(xì)胞群體含有表達(dá)TOM34的CRC細(xì)胞。優(yōu)選地，測(cè)試細(xì)胞為上皮細(xì)胞。例如，可以在候選物質(zhì)存在下孵育測(cè)試細(xì)胞群體，可測(cè)量測(cè)試細(xì)胞群體的基因表達(dá)圖式，并與一個(gè)或多個(gè)參照模式，例如CRC參照表達(dá)模式或非CRC參照表達(dá)模式比較。相對(duì)于含有CRC的參照細(xì)胞群體，測(cè)試細(xì)胞群體中TOM34的表達(dá)下降表明該物質(zhì)具有治療潛力。在本發(fā)明的背景下，測(cè)試物質(zhì)可為任何化合物或組合物。示例性的測(cè)試物質(zhì)包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑。用于鑒定治療物質(zhì)的篩選測(cè)定應(yīng)用rOM34基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)或該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，可以篩選改變?cè)摶虻谋磉_(dá)或改變?cè)摶蚓幋a多肽的生物活性的化合物。這樣的化合物可以用作治療或預(yù)防CRC的藥物。因此，本發(fā)明提供了使用該n〕M34多肽篩選治療或預(yù)防CRC的化合物的方法。該篩選方法的一個(gè)實(shí)施方案中包含下列步驟a)使測(cè)試化合物與TOM34多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測(cè)該多肽和測(cè)試化合物之間的結(jié)合活性；和c)選擇與該多肽結(jié)合的測(cè)試化合物.用于篩選的rOK^多肽可以是重組多肽或源于自然的蛋白質(zhì)或其部分肽。要與測(cè)試化合物接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶性蛋白、結(jié)合于載體的形式或與其它多肽融合的融合蛋白。就使用roMW多肽篩選蛋白質(zhì)，例如與roM4多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法而言，可使用許多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法?？赏ㄟ^(guò)例如免疫沉淀方法，特別是如下方式進(jìn)行這樣的篩選。將編碼roM^多肽的基因插入外源基因表達(dá)載體，例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8，在宿主(例如動(dòng)物)細(xì)胞等中表達(dá)該基因。用于表達(dá)的啟動(dòng)子可以是任何可常用的啟動(dòng)子，包括，例如，SV40早期啟動(dòng)子(RigbyinWilliamson(ed.),GeneticEngineering,vol,3.AcademicPress,London,83-141(1981))、EF-a啟動(dòng)子(KimDW,etal.,Gene91:217-23(1990))、CAG啟動(dòng)子(Niwaetal.,Gene108:193-9(1991))、RSVLTR啟動(dòng)子(Cullen,MethodsinEnzymology152:684-704(1987))、SRa啟動(dòng)子(Takebeetal.,MolCellBiol8:466-72(1988))、CMV立即早期啟動(dòng)子(SeedandAruffo,ProcNatlAcadSciUSA84:3365-9(1987》、SV40晚期啟動(dòng)子(GheysenandFiers，JMolApplGenet1:385-94(1982))、腺病毒晚期啟動(dòng)子(Kaufmanetal.,MolCellBiol9:946-58(1989))和HSVTK啟動(dòng)子等等。可根據(jù)任何方法將基因?qū)胨拗骷?xì)胞以表達(dá)外源基因，例如，電穿孔法(Chuetal.,NucleicAcidsRes15:1311-26(1987》、磷酸釣法(ChenandOkayama，MolCellBiol7:2745-52(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopataetal.,NucleicAcidsRes12:5707-17(1984);SussmanandMilman,MolCellBiol4:1641-3(1984》和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectin)法(Derijard,BCell76:1025-37(1994);Lambetal.,NatureGenetics5:22-30(1993):Rabindranetal.，Science259:230-4(1993))等等。通過(guò)導(dǎo)入其特異性已明確的單克隆抗體的抗原表位至多肽的N或C末端，可將r<9MW基因編碼的多肽表達(dá)為含有單克隆抗體識(shí)別位點(diǎn)(抗原表位)的融合蛋白?？墒褂檬惺鄣目乖砦?抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))?？衫闷涠嗫寺∥稽c(diǎn)表達(dá)具有例如半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和綠色熒光蛋白(GFP)等等的融合蛋白的載體是可商購(gòu)的。還報(bào)道了這樣制備的融合蛋白僅僅導(dǎo)入由數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)個(gè)氨基酸構(gòu)成的小表位以不改變多肽的特性。表位，例如多組氨酸(His-tag)、流感病毒聚集體(aggregate)HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-tag)、人單純皰滲病毒糖蛋白(HSV-tag)、E-tag(—種單克隆噬菌體上的抗原表位)等等以及識(shí)別它們的單克隆抗體，可用作表位-抗體系統(tǒng)以篩選結(jié)合于rOM34多肽的蛋白質(zhì)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。在免疫沉淀中，通過(guò)將這些抗體加入至用合適的去污劑制備的細(xì)胞裂解產(chǎn)物而形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物由rOM^多肽、包括與該多肽結(jié)合能力的多肽、以及抗體。除了使用針對(duì)以上表位的抗體以外，也可以使用抗roM^多肽抗體進(jìn)行免疫沉淀，這些抗體可如以上描述制備。當(dāng)該抗體為小鼠IgG抗體時(shí)，可用例如蛋白Asepharose或蛋白Gsepharose沉淀免疫復(fù)合物。如果7DM^基因編碼的多肽被制備為帶有表位例如GST的融合蛋白，則可使用特異性結(jié)合這些表位的物質(zhì)例如谷胱甘肽-sepharose4B,以與使用抗TOM34多肽抗體相同的方式形成免疫復(fù)合物。免疫沉淀可遵照或根據(jù)例如文獻(xiàn)(HarlowandLane，Antibodies,511-52,ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))中的方法進(jìn)行。SDS-PAGE通常用于免疫沉淀的蛋白質(zhì)的分析，使用具有適合濃度的凝膠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。由于結(jié)合與rOM34多肽的蛋白質(zhì)難于通過(guò)常規(guī)染色方法例如考馬斯染色(Coomassiestaining)和銀染色檢測(cè)，可通過(guò)如下步驟提高該蛋白質(zhì)的檢測(cè)敏感性在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或"S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，并檢測(cè)該蛋白質(zhì)。當(dāng)一種蛋白質(zhì)的分子量已經(jīng)明確時(shí)，可直接從SDS聚丙烯酰胺凝膠純化出該靶蛋白并確定它的序列。作為使用rOM34多肽來(lái)篩選結(jié)合該多肽的蛋白質(zhì)的方法，可使用例如West-Western印跡分析(Skolniketal.,Cell65:83-90(1991))。具體地，結(jié)合rOM54多肽的蛋白質(zhì)可按如下步驟獲得使用噬菌體載體(例如ZAP)從期望表達(dá)結(jié)合7UM34多肽的蛋白質(zhì)的細(xì)胞、組織、器官(例如，組織如睪丸或卵巢)或培養(yǎng)的細(xì)胞(例如CW2、DLD1、HCT116、HCT15、RKO、LS174T)制備cDNA文庫(kù)，在LB瓊脂糖上表達(dá)該蛋白質(zhì)，將該蛋白質(zhì)固定于濾膜(filter)上，使純化、標(biāo)記的r(9MW多肽與上述濾膜反應(yīng)，并根據(jù)標(biāo)記檢測(cè)表達(dá)結(jié)合于TOM34多肽的蛋白的噬斑。本發(fā)明的多肽可利用生物素和抗生物素蛋白之間的結(jié)合，或者利用與rOM34多肽特異性結(jié)合的抗體或與7Y)M34多肽融合的肽或多肽(例如GST)而進(jìn)行標(biāo)記。也可采取使用放射性同位素或焚光等的方法?；蛘?，本發(fā)明的篩選方法的另一實(shí)施方案中采用了利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)("MATCHMAKERTwo-Hybridsystem","MATCHMAKERMammalianTwo-HybridAssayKit","MATCHMAKERone-Hybridsystem"(Clontech);"HybriZAPTwo-HybridVectorSystem"(Stratagene);參考文獻(xiàn)"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)，，，"FieldsandStemglanz,TrendsGenet10:286-92(1994)")。在雙雜交系統(tǒng)中，本發(fā)明的多肽與SRF結(jié)合區(qū)域或GAL4結(jié)合區(qū)域融合并表達(dá)于酵母細(xì)胞中。從期望表達(dá)結(jié)合本發(fā)明多肽的蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)，使得這樣的文庫(kù)被表達(dá)時(shí)融合于VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域。然后將該cDNA文庫(kù)導(dǎo)入以上酵母細(xì)胞，從檢測(cè)到的陽(yáng)性克隆分離來(lái)源于該文庫(kù)的cDNA(當(dāng)結(jié)合本發(fā)明多肽的蛋白質(zhì)表達(dá)于酵母細(xì)胞中時(shí)，二者的結(jié)合激活報(bào)道基因，使得陽(yáng)性克隆可檢測(cè))。cDNA編碼的蛋白質(zhì)可通過(guò)導(dǎo)入以上分離的cDNA至大腸桿菌中并表達(dá)而加以制備。除了HIS3基因之外，例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因和螢光素酶基因可用作報(bào)道基因。也可用親合色i普法篩選與r(9M34基因編碼多肽結(jié)合的化合物。例如，可將本發(fā)明的多肽固定于親和柱載體上，將含有可結(jié)合本發(fā)明多肽之蛋白質(zhì)的測(cè)試化合物加至該柱子上。本文中的測(cè)試化合物可以是，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等等。加載該測(cè)試化合物后，洗滌該柱子，然后可制備與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。當(dāng)測(cè)試化合物是蛋白質(zhì)時(shí)，分析所獲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，基于所述序列合成寡聚DNA，并使用該寡聚DNA作為探針篩選cDNA文庫(kù)以獲得編碼該蛋白質(zhì)的DNA。使用表面等離子共振現(xiàn)象的生物傳感器可以用作檢測(cè)或定量本發(fā)明中的結(jié)合化合物的手段。當(dāng)使用這樣的生物傳感器(例如BIAcore，Pharmacia)時(shí)，僅僅使用微小量的多肽且不用標(biāo)記，即可通過(guò)表面等離子共振信號(hào)實(shí)時(shí)觀察本發(fā)明多肽與測(cè)試化合物之間的相互作用。因此，使用生物傳感器例如BIAcore有可能評(píng)估本發(fā)明多肽與測(cè)試化合物之間的結(jié)合。當(dāng)使固定化的rOM54多肽暴露于合成化合物或天然物質(zhì)庫(kù)(naturalsubstancebanks)或隨機(jī)p藍(lán)菌體肽展示文庫(kù)(randomphagepeptidedisplaylibrary)時(shí)，篩選結(jié)合分子的方法，以及使用基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量來(lái)分離與TOM34蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)乃至化合物(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)的篩選方法(Wrightonetal.，Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan，Nature384:17-9(1996)),是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?；蛘?，本發(fā)明提供一種使用rOM34基因編碼的多肽來(lái)篩選用于治療或預(yù)防CRC的化合物的方法，包含如下步驟a)使測(cè)試化合物與TOM34的多核普酸編碼的多肽接觸；b)檢測(cè)步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇這樣的測(cè)試化合物，與不存在測(cè)試化合物時(shí)檢測(cè)的所述多肽的生物活性相比，其抑制TOM34的多核香酸編碼之多肽的活性。由于rOMW蛋白具有促進(jìn)CRC細(xì)胞之細(xì)胞增殖的活性，使用該活性作為指標(biāo)可篩選抑制該蛋白這種活性的化合物。任何多肽只要它們包含蛋白的生物活性就可用于篩選。這樣的生物活性包括人roM^蛋白的細(xì)胞增殖活性。例如，可使用roM34蛋白，也可使用功能上等價(jià)于這些蛋白質(zhì)的多肽。這樣的多肽可由細(xì)胞內(nèi)源性或外源性地表達(dá)。通過(guò)如此篩選分離的化合物，是roM3^基因編碼多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑的候選物。術(shù)語(yǔ)"激動(dòng)劑"指的是通過(guò)與多肽結(jié)合而活化其功能的分子。同樣地，術(shù)語(yǔ)"拮抗劑"指的是通過(guò)與多肽結(jié)合而抑制其功能的分子。而且，通過(guò)如此篩選分離的化合物，是抑制多肽與分子(包括DNA和蛋白質(zhì))體內(nèi)相互作用的化合物的候選物。當(dāng)本方法中待檢測(cè)的生物活性為細(xì)胞增殖時(shí)，其可以，例如，通過(guò)制備表達(dá)roM3^多肽的細(xì)胞，在測(cè)試化合物存在下培養(yǎng)該細(xì)胞，并確定細(xì)胞增殖的速度，測(cè)量細(xì)胞周期等等加以斥企測(cè)，以及如實(shí)施例所描述的那樣通過(guò)測(cè)量集落形成活性來(lái)加以檢測(cè)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選用于治療或預(yù)防CRC的化合物的方法。如以上詳細(xì)討論的，通過(guò)控制roM^的表達(dá)水平，可以控制CRC的發(fā)作和進(jìn)展。因此，使用以rOM34的表達(dá)水平作為指標(biāo)的篩選，能夠鑒定可用于治療或預(yù)防CRC的化合物。在本發(fā)明的背景下，這樣的篩選可包含例如下列步驟a)使候選化合物與表達(dá)TOM34的細(xì)胞接觸；和b)選擇這樣的候選化合物相比于不存在候選化合物時(shí)的對(duì)照水平，其降低TOM34的表達(dá)水平。表達(dá)7Y9M^的細(xì)胞包括例如從CRC建立的細(xì)胞系；這樣的細(xì)胞可用于上文本發(fā)明的篩選(例如CW2、DLD1、HCT116、RKO、LS174T)。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法估計(jì)表達(dá)水平。在篩選方法中，可選擇降低TOM34表達(dá)水平的化合物作為用于治療或預(yù)防CRC的候選物質(zhì)?；蛘?，本發(fā)明的篩選方法可包含如下步驟a)使候選化合物與已經(jīng)導(dǎo)入載體的細(xì)胞接觸，該載體包含TOM34的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域控制下表達(dá)的報(bào)道基因；b)測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性；和c)選擇降低所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性的候選化合物。適合的報(bào)道基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的。篩選所需的報(bào)道構(gòu)建體(reporterconstruct)可使用標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域加以制備。若本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)得知標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，則可使用先有的序列信息制備報(bào)道構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域尚未鑒定時(shí)，可基于標(biāo)志基因的核苷酸序列信息，從染色體文庫(kù)分離含有該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的核苷酸節(jié)段(nucleotidesegment)?？梢杂糜诮Y(jié)合蛋白質(zhì)的支持物的例子包括不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；以及合成樹(shù)脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅(silicon);優(yōu)選使用可市售的由以上材料制成的珠子(beads)和板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當(dāng)使用珠子時(shí)，它們可填充于柱子中?？筛鶕?jù)常規(guī)方法例如化學(xué)鍵合和物理吸附將蛋白質(zhì)結(jié)合于支持物?；蛘?，可借助特異性識(shí)別該蛋白質(zhì)的抗體將蛋白質(zhì)結(jié)合于支持物。而且，也可藉由抗生物素蛋白和生物素將蛋白質(zhì)結(jié)合于支持物。只要緩沖液不抑制蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，蛋白質(zhì)之間的結(jié)合在緩沖液中，例如但不限于磷酸鹽緩沖液和三羥曱基氨基曱烷(Tris)緩沖液中進(jìn)行。在本發(fā)明中，使用表面等離子共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測(cè)或定量結(jié)合蛋白質(zhì)的手段。當(dāng)使用這樣的生物傳感器時(shí)(例如BIAcore,Pharmacia)，僅僅使用微小量的多肽且不用標(biāo)記，蛋白質(zhì)之間的相互作用可作為表面等離子共振信號(hào)而得以實(shí)時(shí)觀察?；蛘?，可以標(biāo)記多肽，并且可利用結(jié)合蛋白質(zhì)的標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)或測(cè)量該結(jié)合蛋白質(zhì)。特別地，在預(yù)標(biāo)記了這些蛋白質(zhì)中的一個(gè)以后，在測(cè)試化合物存在下使被標(biāo)記的蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)接觸，然后，經(jīng)過(guò)洗滌，根據(jù)標(biāo)記物檢測(cè)或測(cè)量結(jié)合蛋白質(zhì)。標(biāo)記物質(zhì)，例如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶類(例如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明)和生物素/抗生物素蛋白，可用于在本方法中的蛋白質(zhì)標(biāo)記。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)標(biāo)記有放射性同位素時(shí)，可通過(guò)液體閃爍進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)量?；蛘?，以酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)加入酶的底物，用吸收光度計(jì)檢測(cè)底物的酶促變化例如顏色的發(fā)生，來(lái)檢測(cè)或測(cè)量。進(jìn)一步地，在使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物的情形下，可以使用熒光光度計(jì)檢測(cè)或測(cè)量結(jié)合蛋白質(zhì)。在本篩選中使用抗體的情形下，優(yōu)選用上面提及的標(biāo)記物質(zhì)之一標(biāo)記該抗體，并基于該標(biāo)記物質(zhì)才企測(cè)或測(cè)量該抗體?；蛘?，可使用抗TOM34多肽或肌動(dòng)蛋白的抗體作為第一抗體，該第一抗體用標(biāo)記有標(biāo)記物質(zhì)的第二抗體加以4企測(cè)。而且，可使用蛋白G或蛋白A柱子檢測(cè)或測(cè)量在本發(fā)明篩選中結(jié)合于蛋白質(zhì)的抗體?；蛘撸诒景l(fā)明篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)("MATCHMAKERTwo-Hybridsystem"，"MATCHMAKERMammalianTwo-HybridAssayKit","MATCHMAKERone-Hybridsystem"(Clontech);"HybriZAPTwo-HybridVectorSystem"(Stratagene);參考文獻(xiàn)"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)","FieldsandSternglanz,TrendsGenet10:286-92(1994)")。在雙雜交系統(tǒng)中，本發(fā)明的rOM34多肽融合至SRF結(jié)合區(qū)域或GAL4結(jié)合區(qū)域，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。作為報(bào)道基因，除了HIS3基因之外，可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因和螢光素酶基因。任何測(cè)試化合物，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵樣i生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、中，也可使用本領(lǐng)域熟知的很多組合文庫(kù)方法中的任何途徑來(lái)獲得測(cè)試化合物，包括(l)生物文庫(kù)，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(kù)(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要解巻積(deconvolution)的合成文庫(kù)法，(4)"一珠一化合物"("one-beadone-compound")文庫(kù)法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫(kù)法。使用親和色譜選擇的生物文庫(kù)法限于肽文庫(kù)，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(kù)(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12:145-67)。合成分子文庫(kù)方法的例子可在本領(lǐng)域中找到(DeWittetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-13;Erbetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-6;Zuckermannetal.(1994)J.Med.Chem.37:2678-85;Choetal.(1993)Science261:1303-5;Carelletal,(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carelletal.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Gallopetal.(1994)J.Med.Chem.37:1233-51)?；衔镂膸?kù)可提供于溶液中(參見(jiàn)Houghten(1992)Bio/Techniques13:412陽(yáng)21)或珠子上(Lam(1991)Nature354:82-4)、芯片上(Fodor(1993)Nature364:555-6)、細(xì)菌上(USPat.No.5,223,409)、孢子上(USPat.No,5,571,698;5,403,484，and5,223,409),質(zhì)粒上(Culletal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865畫9)或噬菌體上(ScottandSmith(1990)Science249:386-90;Devlin(1990)Science249:404-6;Cwirlaetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-82;Fdici(1991)J.Mol.Biol.222:301-10;美國(guó)專利申請(qǐng)2002103360)。通過(guò)本發(fā)明的篩選方法分離的化合物是抑制TOM34多肽活性、為治療或預(yù)防例如屬于細(xì)胞增殖性疾病的疾病如CRC的藥物的候選物。通過(guò)本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物包括通過(guò)本發(fā)明的本篩選方法獲得的化合物的部分結(jié)構(gòu)通過(guò)添加、缺失和/或取代而轉(zhuǎn)換的化合物。用于治療或預(yù)防CRC的藥物組合物當(dāng)本發(fā)明的方法分離的化合物作為藥物施用于人和其它哺乳動(dòng)物例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒狒和猩猩時(shí)，該分離的化合物可直接施用或可使用已知的藥物制劑方法按方制造成劑型。例如，根據(jù)需要，該藥物可以作為糖包衣片、膠嚢、酏劑和微膠嚢劑而口服，或以無(wú)菌溶液注射劑或含水懸浮劑或任何其它藥學(xué)可接受的液體的形式非口服施用。例如，該化合物可與藥學(xué)可接受的載體或介質(zhì)特別是滅菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑、溶媒、防腐劑、粘合劑等混合成適于公知藥物實(shí)施(drugimplementation)所需的單位劑型。這些制劑中活性成份構(gòu)成可得的標(biāo)稱范圍內(nèi)的合適劑量?？梢該交斓狡瑒┖湍z嚢劑中的添加劑的例子包括但不限于粘合劑如明膠、玉米淀粉、西黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑如結(jié)晶纖維素；膨脹劑如玉米淀粉、明膠和海藻酸；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精；和增味劑如薄荷、a&"of/^x油和櫻桃。當(dāng)單位劑型是膠嚢劑時(shí)，上述成分中還可以進(jìn)一步包括液體載體如油類液體?？梢愿鶕?jù)常規(guī)藥物實(shí)施方法使用注射用蒸餾水等溶^某配制注射用無(wú)菌組合物。生理鹽水、葡萄糖和其它含有輔料的等滲液可以用作注射用水溶液，所述的輔料包括D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化鈉。它們可以與合適的增溶劑結(jié)合使用，增溶劑有例如醇(如乙醇)、多元醇如丙二醇和聚乙二醇；及非離子表面活性劑如Polysorbate80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油可以用作油狀液體，可以與苯曱酸苯曱醇酯或苯曱醇結(jié)合使用作為增溶劑，并且可以與下列物質(zhì)一起配制緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖劑和乙酸鈉緩沖劑；止痛劑，如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，如苯曱醇和苯酚；和/或抗氧化劑。制成的注射劑可以充入合適的安瓿中。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法對(duì)患者施用本發(fā)明的藥物組合物，例如作為動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)皮注射，或作為鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌肉內(nèi)或口服施用。施用方法和劑量根據(jù)患者的體重和年齡和施用方法而變化，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可常規(guī)地選擇合適的施用方法。此外，若所述的化合物是可被DNA編碼的，則可將該DNA插入基因治療用載體，然后將該載體施用于患者進(jìn)行治療。施用劑量和方法根據(jù)患者的體重、年齡和癥狀而變化，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠合適地選擇它們。例如，盡管與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的取決于癥狀，當(dāng)口服地施用于正常成人(體重60kg)時(shí)，通常的劑量為每天約0.1至約100mg，優(yōu)選每天約1.0至約50mg，更優(yōu)選每天約1.0至約20mg。當(dāng)通過(guò)非消化道途徑以注射劑形式施用化合物于正常成人(體重60kg)時(shí)，盡管根據(jù)患者、靶器官、癥狀和施用方法而有一些不同，但方便的是靜脈內(nèi)注射每天約0.01至約30mg，優(yōu)選每天約0.1至約20mg,更優(yōu)選每天約0.1至約10mg的劑量。在其它動(dòng)物的情形下，可通過(guò)換算為60kg體重常規(guī)地求出適合的劑量。患有CRC的受試者的預(yù)后評(píng)定本發(fā)明還提供評(píng)估患有CRC的受試者之預(yù)后的方法，包括將測(cè)試細(xì)胞群體中TOM34的表達(dá)與參照細(xì)胞群體中TOM34的表達(dá)相比較的步驟，其中參照細(xì)胞群體來(lái)源于處于一系列疾病階段的患者。通過(guò)比較TOM34在測(cè)試細(xì)胞群體中和參照細(xì)胞群體中的基因表達(dá)，或者通過(guò)經(jīng)時(shí)地比較來(lái)自受試者的測(cè)試細(xì)胞群體中的基因表達(dá)圖式，可以評(píng)價(jià)受試者的預(yù)后。例如，TOM34表達(dá)相比于正常對(duì)照樣品的增加指示較為不利的預(yù)后。相反，TOM34表達(dá)與正常對(duì)照樣品的相似性，指示受試者較為有利的預(yù)后。試劑盒本發(fā)明還包括CRC檢測(cè)試劑，例如，特異性結(jié)合或鑒定TOM34核酸的核酸，例如與TOM34核酸的一部分互補(bǔ)的寡核香酸序列，或者與TOM34核酸編碼的蛋白結(jié)合的抗體，或者適體。可以以試劑盒的形式將檢測(cè)試劑包裝在一起。例如，檢測(cè)試劑可以包裝在不同的容器中，例如核酸或抗體(或者結(jié)合于固體基質(zhì)，或者與用于將它們結(jié)合于基質(zhì)的試劑分別包裝)、對(duì)照試劑(陽(yáng)性/陰性)、和/或可檢測(cè)標(biāo)簽。該試劑盒中還可以包括關(guān)于實(shí)施測(cè)定的說(shuō)明書(例如書面(written)、磁帶(tape)、VCR、CD-ROM等)。試劑盒的測(cè)定樣式可以是Northern雜交或夾心ELISA,二者都是本領(lǐng)域已知的。例如，CRC檢測(cè)試劑可以固定在固體基質(zhì)，例如多孔片條(porousstrip)上，形成至少一個(gè)CRC檢測(cè)位點(diǎn)。多孔片條的測(cè)量或檢測(cè)區(qū)域可包括多個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)均含有核酸。測(cè)試片條(teststrip)也可以含有用于陰性和/或陽(yáng)性對(duì)照的位點(diǎn)。或者，對(duì)照位點(diǎn)可以位于不同于所述測(cè)試片條的片條上。任選地，不同的檢測(cè)位點(diǎn)可含有不同量的固定核酸，即第一4企測(cè)位點(diǎn)中的量較高，隨后的位點(diǎn)中的量較低。添加測(cè)試樣品時(shí)，顯示可檢測(cè)信號(hào)的位點(diǎn)的數(shù)目提供樣品中存在的CRC的定量指標(biāo)。檢測(cè)位點(diǎn)可以構(gòu)成為任何可合適檢測(cè)的形狀，典型地是跨越測(cè)試片條寬度的條形或點(diǎn)形。抑制CRC的方法本發(fā)明進(jìn)一步提供一種通過(guò)減少TOM34的表達(dá)(或者其基因產(chǎn)物的活性)來(lái)治療或緩解受試者中CRC癥狀的方法?？梢詫?duì)患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生(或易感)CRC的受試者預(yù)防性或治療性地施用合適的治療化合物。這樣的受試者可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床方法來(lái)鑒定，或者通過(guò)4全測(cè)TOM34的異常表達(dá)水平或者其基因產(chǎn)物的異?；钚詠?lái)鑒定。在本發(fā)明的背景下，合適的治療劑包括，例如，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖的抑制劑?；蛘?，本發(fā)明的治療方法可包括減少TOM34基因產(chǎn)物的表達(dá)、功能，或其二者的步驟，其中TOM34的表達(dá)在結(jié)腸癌細(xì)胞中異常增加("上調(diào)"或"過(guò)高表達(dá)"的基因)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何方法來(lái)抑制表達(dá)。例如，可以對(duì)受試者施用抑制或拮抗過(guò)高表達(dá)基因之表達(dá)的核酸，例如破壞過(guò)高表達(dá)基因之表達(dá)的反義寡核苷酸或小干擾RNA。當(dāng)然，本文中描述的治療或緩解方法，經(jīng)過(guò)必要的修改后，可適用于本文所述之減少TOM34表達(dá)(或其基因產(chǎn)物之活性)的化合物在制備用于治療或緩解受試者中結(jié)腸癌的藥物組合物中的用途。這樣的化合物可以是，例如，反義、siRNA、抗體、適體或核酶組合物。反義核酸及siRNA:如上所述，可以使用相應(yīng)于TOM34核苷酸序列的反義核酸來(lái)降低該基因的表達(dá)水平。相應(yīng)于CRC中上調(diào)的TOM34的反義核酸對(duì)CRC治療是有用的。具體地說(shuō)，本發(fā)明的反義核酸可以如下起作用結(jié)合TOM34的核苷酸序列，或其相應(yīng)的mRNA,從而抑制所述基因的轉(zhuǎn)錄或翻i,，促進(jìn)mRNA降解，和/或抑制TOM34所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，由此抑制這些蛋白的功能。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"反義核酸"涵蓋與靶序列完全互補(bǔ)的核苷酸，和具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸錯(cuò)配的核苷酸，只要這些反義核酸能夠特異性地與靶序列雜交。例如，本發(fā)明的反義核酸包括在至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的范圍內(nèi)具有至少70%或更高、優(yōu)選80%或更高、更優(yōu)選90%或更高、甚至更優(yōu)選95%或更高的同源性的多核苦酸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的算法確定同源性。本發(fā)明的反義核酸通過(guò)下述方式作用于產(chǎn)生TOM34編碼蛋白的細(xì)胞結(jié)合編碼所述蛋白的DNA或mRNA,抑制它們的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA降解，抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而導(dǎo)致蛋白功能的抑制。混，制成外用制劑，例如搽劑或罨劑。并且，根據(jù)需要，通過(guò)添加賦形劑、等滲劑(isotonicagents)、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、鎮(zhèn)痛劑等，可以將本發(fā)明的反義核酸配制成片劑、粉末、顆粒、膠嚢、脂質(zhì)體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。這些劑型可通過(guò)下文的7>知方法制備。本發(fā)明的反義核酸可以通過(guò)直接施于患處上，或者通過(guò)注射入血管以使其到達(dá)患處，來(lái)施用于患者。也可以使用反義封固介質(zhì)(antisense-mountingmedium)以提高持久性和膜通透性。例子包括但不限于脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectine)或它們的衍生物。本發(fā)明的反義核酸衍生物的劑量，可以根據(jù)患者的狀況適當(dāng)調(diào)整，并以所需的量使用。例如，可以施用0.1至100mg/kg，優(yōu)選O.l至50mg/kg的劑量范圍。本發(fā)明的反義核酸抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)，因而可以用于抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性。此外，含有本發(fā)明的反義核酸的表達(dá)抑制劑也是有用的，因?yàn)樗鼈兛梢砸种票景l(fā)明的蛋白質(zhì)的生物活性。在靶細(xì)胞中siRNA與對(duì)應(yīng)于TOM34的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)生減少。寡核苷酸的長(zhǎng)度為至少IO個(gè)核苷酸，可以與天然存在的轉(zhuǎn)錄物等長(zhǎng)。優(yōu)選寡核苷酸的長(zhǎng)度為少于75、50、25個(gè)核苷酸。最優(yōu)選寡核苷酸的長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸包括經(jīng)修飾的寡核苷酸。例如，可以使用硫羰酸化(thioated)寡核苷酸以賦予針對(duì)寡核苷酸核酸酶的抗性。而且，可以使用針對(duì)TOM34的siRNA以降低TOM34的表達(dá)水平。本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)"siRNA"指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子?？梢圆捎脤iRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，這其中包括以DNA為RNA轉(zhuǎn)錄之才莫板的技術(shù)。在本發(fā)明的背景下，siRNA含有有義核酸序列和針對(duì)上調(diào)標(biāo)志物基因例如TOM34的反義核Si序列。構(gòu)建siRNA以使單一轉(zhuǎn)錄物具有來(lái)自靶基因的互補(bǔ)的反義序列和有義序列，例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。TOM34的siRNA與耙mRNA雜交，通過(guò)與通常為單鏈的mRNA轉(zhuǎn)錄本相結(jié)合，從而干擾翻譯，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)的表達(dá)，藉此減少或抑制TOM34編碼之多肽的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的siRNA分子可通過(guò)其在嚴(yán)緊條件下與TOM34的mRNA特異性雜交的能力來(lái)定義。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"雜交"或"特異性雜交"用于表示兩個(gè)核酸分子在"嚴(yán)緊雜交條件下"雜交的能力。短語(yǔ)"嚴(yán)緊雜交條件"是指這樣的條件，在該條件下，典型地在檢測(cè)的雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境下會(huì)不同。越長(zhǎng)的序列在越高的溫度發(fā)生特異性雜交。在下列文獻(xiàn)中可找到核酸雜交的詳細(xì)才旨導(dǎo)Tijssen，rec/zw々M&y/"5z'oc/zew^^vAfo/ecw/arWo/ogy—外Z)W6fe加'oww"/zWwc/e/c尸raZ&y,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一4殳i也，嚴(yán):緊條件選擇比限定的離子強(qiáng)度pH下特定序列的熱解鏈溫度(TJ低大約5-10°C。Tm是這樣的溫度(在限定的離子強(qiáng)度，pH和核濃度)，在該溫度平衡狀態(tài)時(shí)時(shí)，50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)緊條件還可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如曱酰胺實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交而言，陽(yáng)性信號(hào)至少是背景的2倍，優(yōu)選地是背景雜交的10倍。嚴(yán)緊雜交條件的實(shí)例可如下50%曱酰胺、5xSSC和l。/cSDS,42。C溫育，或者5xSSC、1%SDS，65。C溫育，在50°C0.2xSSC、和0.1。/。SDS中清洗。在本發(fā)明的背景下，siRNA的長(zhǎng)度優(yōu)選小于500、200、100、50、或者25個(gè)核苦酸。更優(yōu)選地，siRNA的長(zhǎng)度為19-25個(gè)核芬酸。示例性的用于產(chǎn)生TOM34siRNA的核S吏序列包含SEQIDNO:48或52的核芬酸的序列作為靶序列。在RNA或其衍生物中，核苷酸序列中的堿基"t"應(yīng)當(dāng)替換為"u"。因此，例如，本發(fā)明提供包含核香酸序列5'-gaaaguguucucuacucca-3，(SEQIDNO:48)或5'隱ggauggaaacugcagagac-3，(SEQIDNO:52)的雙鏈RNA分子。為了提高siRNA的抑制活性，在靶序列反義鏈的3，端可以添加核苷酸"u"。所添加的"u"的數(shù)目為至少2個(gè)，一般2-10個(gè)，優(yōu)選地2-5個(gè)。添加的"u"在siRNA反義鏈的3'端形成單鏈。可以將TOM34的siRNA以能與mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式直接導(dǎo)入細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，典型地如上文對(duì)反義分子的描述對(duì)本發(fā)明的siRNA分子進(jìn)行修飾。其他修飾也是可能的，例如膽固醇偶聯(lián)的siRNA顯示藥理學(xué)性質(zhì)改善(Songetal.NatureMed.9:347-51(2003))?；蛘?，可以在載體中攜帶編碼siRNA的DNA。載體可以例如這樣制備將TOM34靶序列克隆到表達(dá)載體中，其中所述表達(dá)載體具有可操作連接的調(diào)控序列，所述調(diào)控序列以這樣的方式位于所述靶序列的側(cè)翼，使得兩條鏈均有可能得以表達(dá)(通過(guò)DNA分子的轉(zhuǎn)錄)(Lee,N.S.,etal"(2002)NatureBiotechnology20:500-5.)。與TOM34mRNA反義的RNA分子由第一啟動(dòng)子(例如位于所克隆DNA3'側(cè)的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄，而作為TOM34mRNA之有義鏈的RNA分子則由第二啟動(dòng)子(例如位于所克隆DNA5，側(cè)的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄。所述有義鏈和反義鏈在體內(nèi)雜交，從而產(chǎn)生用于沉默所述TOM34的siRNA構(gòu)建體?；蛘?，可以利用兩個(gè)構(gòu)建體生成siRNA構(gòu)建體的有義鏈和反義鏈?？寺〉腡OM34可編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)例如發(fā)夾的構(gòu)建體，其中單一轉(zhuǎn)錄物具有來(lái)自靶基因的互補(bǔ)反義序列和有義序列。為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可在有義序列和反義序列之間放置由任意核苷酸序列組成的環(huán)序列(loopsequence)。因此，本發(fā)明還提供具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA，其中[A]為對(duì)應(yīng)于與TOM34的mRNA或cDNA特異性雜交之序列的核糖核苷酸序列，[B]為由3-23個(gè)核苷酸組成的核糖核苷酸序列，和[A，]是由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苷酸序列。[A]區(qū)與[A，]區(qū)雜交，然后形成由[B]區(qū)組成的環(huán)(loop)。所述環(huán)序列的長(zhǎng)度可以為3-23個(gè)核苷酸。所述環(huán)序列例如可以選自下列序列(http://ambionxom/tecMb/tb/tb_50dhtml)。此外，由23個(gè)核香酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque,J,M.,etal.,(2002)Nature418:435-8.)。CCC,CCACC或CCACACC:Jacque,J.M,etal.,(2002)Nature,Vol.418:435-8。UUCG:Lee，N.S.，etal.，(2002)NatureBiotechnology20:500-5.;Fruscoloni,P.，etal.，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44。UUCAAGAGA:Dykxhoorn,D.M.，etal.,(2003)NatureReviewsCellBiology4:457-67。因此，環(huán)序列可以選自下組CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA。優(yōu)選的環(huán)序列是UUCAAGAGA(DNA中為"ttcaagaga")。在本發(fā)明的背景下適于使用的示例性發(fā)夾siRNA包括對(duì)TOM34-siRNA-D(siD，針對(duì)靶序列SEQIDNO:48)5'-gaaaguguucucuacucca-[B]畫uggaguagagaacacuuuc-3'(SEQIDNO:49)and對(duì)TOM34-siRNA-E(s正，針對(duì)靶序列SEQIDNO:52)5'-ggauggaaacugcagagac-[B]-gucucugcaguuuccaucc-3'(SEQIDNO:53)適當(dāng)?shù)膕iRNA的核苷酸序列可使用可從Ambion網(wǎng)站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder,html)得到的siRNA設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序來(lái)設(shè)計(jì)。所述計(jì)算機(jī)程序基于如下規(guī)程選擇核苷酸序列用于siRNA合成。選擇siRNA靶位點(diǎn)1.從目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開(kāi)始向下游掃描尋找AA二核苷酸序列。記錄每個(gè)AA的出現(xiàn)及其3'側(cè)鄰近的19個(gè)核苷酸作為siRNA靶位點(diǎn)。根據(jù)Tuschl等在(1999)GenesDev13(24):3191-7，不推薦針對(duì)5'和3'非翻譯區(qū)(UTRs)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個(gè)堿基之內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)樯鲜鰠^(qū)域可能富含調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)。UTR結(jié)合蛋白和/或翻"％起始復(fù)合物可干擾與siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將所述潛在靶位點(diǎn)與人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，從考慮范圍中排除與其它編碼序列具有顯著的序列同一性的任何靶序列?？刹捎肂LAST2.0進(jìn)行序列同一性搜索，它可以在NCBI服務(wù)器ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/找到。3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，優(yōu)選可沿著待評(píng)價(jià)的基因的長(zhǎng)度選擇數(shù)個(gè)靶序列。側(cè)翼鄰接于TOM34基因序列的調(diào)節(jié)序列可以相同，也可以不同，使得它們的表達(dá)可以獨(dú)立地、或者以時(shí)間性或空間性方式得到調(diào)控。通過(guò)將TOM34模板分別克隆到載體中來(lái)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA,其中所述載體含有例如來(lái)自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單位或人HIRNA啟動(dòng)子。為了將載體導(dǎo)入細(xì)胞，可以使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑(transfection-enhancingagent)。FuGENE(Rochediagnostices)，Lipofectamine2000(Invitrogen),Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)可以用作轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，因而可以用于抑制本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性。并且，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的表達(dá)抑制劑是有用的，因?yàn)樗鼈兛梢砸种票景l(fā)明多肽的生物學(xué)活性。因此，包含本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物對(duì)于治療CRC是有用的?？贵w或者，可以通過(guò)施用與基因產(chǎn)物結(jié)合或以其它方式抑制基因產(chǎn)物功能的化合物，來(lái)抑制在CRC中過(guò)高表達(dá)的TOM34的基因產(chǎn)物的功能。例如，所述化合物是與TOM34的基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明涉及抗體特別是針對(duì)TOM34編碼蛋白的抗體、或所述抗體的片段的用途。如本說(shuō)明書中使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"指具有特定結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子，其僅與用于合成該抗體的抗原(即上調(diào)標(biāo)志的基因產(chǎn)物)或與其緊密相關(guān)的抗原相互作用(即結(jié)合)。另外，抗體可以是抗體片段或修飾抗體，只要它結(jié)合TOM34編碼的蛋白。例如，抗體片段可以是Fab,F(ab，)2,Fv,或單鏈Fv(scFv)，在scFv中來(lái)自重鏈和輕鏈的Fv片^殳通過(guò)合適的接頭連接(HustonJ.S.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-83(1988))。更具體地說(shuō)，可以用酶，包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來(lái)生成抗體片段?；蛘?，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達(dá)載體，然后在合適的組主細(xì)胞中表達(dá)(參見(jiàn)例如，CoM.S.etal.J.Immunol.152:2968-76(1994);BetterM.andHorwitzA.H.MethodsEnzymol.178:476-96(1989);PluckthunA.andSkerraA.MethodsEnzymol.178:497-515(1989);LamoyiE.MethodsEnzymol.121:652-63(1986);RousseauxJ.etal.MethodsEnzymol.121:663-9(1986);BirdR,E.andWalkerB.W.TrendsBiotechnol.9:132-7(1991))?？贵w可以通過(guò)與各種分子如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)進(jìn)行修飾。本發(fā)明提供這樣的修飾抗體?？赏ㄟ^(guò)將抗體進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)獲得修飾抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的。或者，抗體可包括嵌合抗體，其具有來(lái)自非人抗體的可變區(qū)及來(lái)自人抗體的恒定區(qū)，或者人源化抗體，其包括來(lái)自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、和來(lái)自人抗體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)。所述抗體可利用已知技術(shù)制備。人源化可通過(guò)用嚙齒類的CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列的方式進(jìn)行(見(jiàn)例如Verhoeyenetal.,Science239:1534-1536(1988))。因而，這樣的人源化抗體是嵌合抗體，其中實(shí)質(zhì)上少于整個(gè)人源可變域的區(qū)域已被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列取代。這樣的抗體可利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備。例如，體外方法包括使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(kù)(例如，Hoogenboom&Winter,(1992)J.Mol.Biol.227:381-8)。類似地，可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如內(nèi)源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，來(lái)制備人源抗體。該方法描述于例如美國(guó)專利Nos.6,150,584;5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5，633，425;5,661,016。指向癌細(xì)胞中發(fā)生的特異性分子變化的癌癥療法的有效性，已經(jīng)通過(guò)下述抗癌藥的臨床開(kāi)發(fā)和管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)得以證實(shí)用于治療晚期乳腺癌的曲妥單抗(trastuzumab)(Herceptin)，用于治療慢性髓性白血病的曱磺酸伊馬替尼(imatinibmethylate)(Gleevec),用于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B細(xì)胞淋巴瘤和外膜細(xì)胞(mantlecell)淋巴瘤的rituximab(抗CD20單克隆抗體)(CiardielloF.etal.，ClinCancerRes.2001Oct;7(10):2958-70.SlamonDJ.etal"NEnglJMed.2001Mar15;344(ll):783-92.;RehwaldU.etal"Blood.2003Jan15;101(2):420-424.;FangG.etal.,(2000).Blood，96,2246-2253)。這些藥物臨床上是有效的，并且比傳統(tǒng)抗癌劑具有更好的耐受性，因?yàn)樗鼈儍H僅耙向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因此，這些藥物不僅改善了癌癥患者的存活率和生活質(zhì)量，而且證明了分子靶向癌癥療法的理念。另外，當(dāng)靶向藥物與標(biāo)準(zhǔn)化療組合使用時(shí)，可以增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化療的效力(GianniL.(2002).Oncology,63Suppl1,47-56.;KlejmanA.etal.，(2002).Oncogene,21，5868-5876.)。因此，未來(lái)的癌癥治療將很可能涉及將常規(guī)藥物與針對(duì)腫瘤細(xì)胞不同特性如血管生成(angiogenesis)和浸潤(rùn)性(invasiveness)的輩巴特異性作用物質(zhì)相結(jié)合。這些調(diào)節(jié)方法可以離體(exvivo)、體外(例如通過(guò)在作用物質(zhì)的存在下培養(yǎng)細(xì)胞)或體內(nèi)(例如通過(guò)給受試者施用作用物質(zhì))進(jìn)行。所述方法包括施用蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的組合、或者核酸分子或核酸分子的組合作為抵抗(counteract)差異表達(dá)基因的異常表達(dá)或其基因產(chǎn)物的異?；钚缘寞煼??？梢杂棉卓?即降低或抑制)一種或多種過(guò)高表達(dá)基因之活性的治療劑來(lái)治療以基因和基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或生物活性(相對(duì)于未患有疾病或病癥的受試者)增加為特征的疾病和病癥?？梢灾委熜曰蝾A(yù)防性地施用拮抗活性的治療劑。因此，可以用于本發(fā)明背景下的治療劑包括例如(i)過(guò)高表達(dá)基因的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；(ii)抗過(guò)高表達(dá)基因或基因產(chǎn)物的抗體；(iii)編碼過(guò)高表達(dá)基因的核酸；(iv)反義核酸或"功能障礙性(dysfunctional)"核酸(即，由于過(guò)高表達(dá)基因的核酸內(nèi)的異源插入所致)；(v)小干擾RNA(siRNA);或(vi)調(diào)節(jié)劑(即，改變過(guò)高表達(dá)或過(guò)低表達(dá)多肽與其結(jié)合配對(duì)物(bindingpartner)之間的相互作用的抑制劑、激動(dòng)劑和拮抗劑)。將功能障礙性反義分子用于通過(guò)同源重組來(lái)"敲除"多肽的內(nèi)源性功能(參見(jiàn)例如Capecchi,(1989)Science244:128892)。通過(guò)獲取患者組織樣品(例如從活;險(xiǎn)組織)，并在體外測(cè)定其RNA或肽水平、表達(dá)的肽(或表達(dá)改變的基因的mRNA)的結(jié)構(gòu)和/或活性，來(lái)定量肽和/或RNA，可以容易地檢測(cè)出水平的上升或下降。本領(lǐng)域公知的方法包括但不限于免疫測(cè)定(例如在Western印跡分析、免疫沉淀后隨十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細(xì)胞化學(xué)等)和/或4企測(cè)mRNA表達(dá)的雜交測(cè)定(例如Northern測(cè)定、點(diǎn)印跡、原位雜交等)。預(yù)防性施用在出現(xiàn)疾病的明顯臨床癥狀之前進(jìn)行，以阻止疾病或病癥的出現(xiàn)或者延遲其進(jìn)程。調(diào)節(jié)差異表達(dá)基因的基因產(chǎn)物的一種或多種活性。蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)劑的例子包括但不限于核酸、蛋白質(zhì)、這些蛋白質(zhì)的天然存在的關(guān)連配體(naturallyoccurringcognateligands)、肽、肽才莫扣乂4勿及其它'J、分子。針對(duì)CRC的接種在本發(fā)明中，TOM34來(lái)源的肽被證明是HLA-24限制性的TAA表位，HLA-24是日本人和白種人群中普遍的HLA等位基因。利用候選的TOM34來(lái)源HLA-A24結(jié)合肽對(duì)HLA-A24的結(jié)合親和力的信息鑒定了它們。用這些負(fù)載這些肽的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞后，使用TOM34-299(KLRQEVKQNL(SEQIDNo.7))成功地建立了CTL。這些CTL表現(xiàn)針對(duì)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的強(qiáng)細(xì)胞毒活性。此外，來(lái)源于這些細(xì)胞的CTL克隆和系也針對(duì)內(nèi)源過(guò)高表達(dá)TOM34的HLA-A24陽(yáng)性結(jié)腸直腸癌細(xì)胞顯示了特異性細(xì)胞毒性。這些CTL克隆和CTL系的細(xì)胞毒活性針對(duì)缺少HLA-A24或靶TAA表達(dá)的細(xì)胞系則沒(méi)有得到顯示。這些CTL克隆和CTL系的特異性細(xì)胞毒活性被非放射性靶(coldtarget)顯著地抑制。這些結(jié)果證明，TOM34可用作CRC的TAA，且TOM34是HLA-A24限制性TAA的表位肽。由于TOM34抗原在大多數(shù)CRC中過(guò)高表達(dá)且與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)，它們是用于抗CRC免疫療法的良好靶標(biāo)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供治療或預(yù)防CRC的方法，所述方法包括施用包括SEQIDNO:7所示氨基酸序列的、少于約40個(gè)氨基酸，往往少于約20個(gè)氨基酸，通常少于約15個(gè)氨基酸的免疫原性肽的步驟。或者，所述免疫原性肽可包括SEQIDNO:7所示序列的衍生物，其中1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或者數(shù)個(gè)氨基酸被修飾、取代或添加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原性肽是九肽或十肽?；蛘?，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)針對(duì)CRC的抗腫瘤免疫的方法，所述方法包含施用包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列之本發(fā)明免疫原性肽或其如上所述的衍生物的步驟。在本發(fā)明中，肽或其衍生物可通過(guò)體內(nèi)或離體施用于受試者。另外，本發(fā)明還提供包含SEQIDNO:7所示序列的十肽TOM34的同源性分析顯示，它們與來(lái)源于任何已知人基因產(chǎn)物的肽均沒(méi)有顯著的同源性。這樣就降低了針對(duì)這些分子的免疫療法帶來(lái)未知或不希望的免疫反應(yīng)的可能性。關(guān)于HLA抗原，使用在日本人中高度表達(dá)的A-24型有利于獲得有效結(jié)果，使用A-2402等亞型更為優(yōu)選。典型地，在臨床上，事先考察需要治療的患者的HLA抗原型，這樣就能夠合適地選擇針對(duì)該抗原具有高水平結(jié)合親和力，或者具有通過(guò)抗原呈遞誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)能力的肽，另夕卜，為了獲得顯示高結(jié)合親和力和CTL誘導(dǎo)能力的肽，可以在天然存在的TOM34部分肽的氨基酸序列的基礎(chǔ)上取代或添加1、2、3、4或數(shù)個(gè)氨基酸。本文中，術(shù)語(yǔ)"數(shù)個(gè)"意思是5個(gè)或更少，或優(yōu)選3個(gè)或更少。此外，除了天然被展示的肽之外，由于通過(guò)結(jié)合HLA抗原而一M示的肽的序列規(guī)則性是已^口的(Kubo，etal.，J.Immunol"152，3913，1994;Rammensee,etal.，Immunogenetics.41:178-228,1995;Kondo,etal"J.Immunol.155:4307-12，1995)，可以基于這種規(guī)則性對(duì)本發(fā)明的免疫原性肽進(jìn)行修飾。例如，對(duì)于顯示高HLA-24結(jié)合親和力的肽，將它們從N末端起的第二個(gè)氨基酸取代為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，而且C末端取代為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸的肽也可有利地使用。但是，若肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同，則可能會(huì)誘發(fā)副作用，例如針對(duì)特定物質(zhì)的自身免疫障礙或變應(yīng)性癥狀；因此，優(yōu)選的是利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索，以避免出現(xiàn)序列與另一蛋白質(zhì)的氨基酸序列一致的情況。另外，如果根據(jù)同源性搜索得知即使1或2個(gè)氨基酸不同的肽亦不存在，則為了增加針對(duì)HLA抗原的結(jié)合親和性和/或增加CTL誘導(dǎo)能力而對(duì)上述氨基酸序列所作的修飾沒(méi)有造成此類問(wèn)題的危險(xiǎn)。雖然上述對(duì)HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽有望成為高度有效的癌癥疫苗，對(duì)于以高結(jié)合親和力的存在作為指標(biāo)選出的候選肽，必須考察它們是否真實(shí)存在CTL誘導(dǎo)能力。CTL誘導(dǎo)能力的驗(yàn)證如下進(jìn)行誘導(dǎo)帶有人MHC抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)，或更具體地說(shuō)，來(lái)自人外周血單核白細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞，用肽刺激后，與CD8陽(yáng)性細(xì)胞混合，然后測(cè)定針對(duì)革巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可以使用制備為表達(dá)人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如BenMohamedL.，etal.,Hum.Immunol.2000Aug.;61(8):764-79中描述的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標(biāo)記耙細(xì)胞，并根據(jù)耙細(xì)胞釋放的放射性計(jì)算細(xì)胞毒活性。或者，可以通過(guò)測(cè)定在攜帶有固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞的存在下CTL產(chǎn)生并釋放的IFN-y,并利用抗IFN-y單克隆抗體使培養(yǎng)基上的抑制區(qū)域可見(jiàn)，來(lái)進(jìn)行考察。如上所述考察肽CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有針對(duì)HLA抗原的高結(jié)合親和力的肽不一定具有高的誘導(dǎo)能力。另外，包含KLRQEVKQNL(SEQIDNo.7)所示氨基酸序列的十肽顯示了特別高的CTL誘導(dǎo)能力。如上文提到的，本發(fā)明提供具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力，并且包含其中取代或添加了1、2、3、4或數(shù)個(gè)氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列的肽。包含SEQIDNO:7中所示9個(gè)或10個(gè)氨基酸且其中取代或添加了1、2、3、4或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選不與其它蛋白質(zhì)的氨基酸序列一致。尤其是，從N末端起第二個(gè)氨基酸取代為苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、曱硫氨酸(M)或色氨酸(W)的氨基酸取代，以及C末端氨基酸取代為苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、色氨酸(W)或曱硫氨酸(M)的氨基酸取代，以及N末端和/或C末端添加1到2個(gè)氨基酸的氨基酸添加是優(yōu)選的例子。具體地，本發(fā)明提供一種十肽，其包含氨基酸序列KLRQEVKQNL(SEQIDNO:7),或K-[L,F,Y，M或W]-RQEVKQN-[L,F,L,I,W或M]。本發(fā)明的肽可以利用7>知的技術(shù)制備。例如，可以利用重組DNA^支術(shù)或化學(xué)合成來(lái)合成地制備所述肽。本發(fā)明的肽可以個(gè)別地合成，或者作為包含兩個(gè)或多個(gè)肽的較長(zhǎng)多肽合成。所述肽優(yōu)選是分離的，即，基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白或其片段。肽可包含修飾諸如糖基化、側(cè)鏈氧化或磷酸化，只要這些修飾不破壞本文所述的這些肽的生物活性。其它修飾包括納入D-氨基酸或其它能夠使用的氨基酸才莫擬物，例如，以增加這些肽的血清半壽期。本發(fā)明的肽可以制備為包含2種或更多種本發(fā)明肽的組合，用作可以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL的癌癥疫苗。所述肽可以作為合劑(cocktail)，或者使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)相互偶聯(lián)。例如，所述肽可以作為單一多肽序列表達(dá)。組合中的肽可以是相同或不同的。通過(guò)施用本發(fā)明的肽，這些肽被以高密度呈遞于抗原呈遞細(xì)胞的HLA抗原，然后誘導(dǎo)出與被展示肽和HLA抗原所成的復(fù)合物特異性反應(yīng)的CTL。或者，通過(guò)除去受試者中的樹(shù)突狀細(xì)胞，獲得了將本發(fā)明的肽固定化在其細(xì)胞表面上的抗原呈遞細(xì)胞，用本發(fā)明的肽刺激它們，將這些細(xì)胞再次施用給受試者以誘導(dǎo)受試者中的CTL，結(jié)果，可以增加針對(duì)耙細(xì)胞的攻擊性。更具體地，本發(fā)明提供治療腫瘤或預(yù)防肺瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等等的藥物，其包括1種或更多種本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽可用于治療CRC。本發(fā)明的肽可以作為通過(guò)常規(guī)制劑方法配制的藥物組合物直接施用。在此情況下，除了本發(fā)明的肽以外，可以包括通常用于藥物的載體、賦形劑等等，視情況而定沒(méi)有具體限制。本發(fā)明的免疫原性組合物可用于治療和預(yù)防CRC。包含本發(fā)明的肽作為活性成分，用于治療和/或預(yù)防CRC的免疫原性組合物，可以包含佐劑以使細(xì)胞免疫得以有效地建立，或者它們可以與其它活性成分例如抗腫瘤劑一起施用，而且它們可通過(guò)配制為顆粒劑施用?？梢允褂玫淖魟┌ㄎ墨I(xiàn)中描述的那些(Johnson，Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289，1994)。示例性的佐劑包括，磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬。另外，可以方便地使用脂質(zhì)體制劑、其中藥物結(jié)合于數(shù)iim直徑小珠的顆粒制劑、和其中脂質(zhì)結(jié)合于肽的制劑。施用方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，全身施用或局部施用于靶腫瘤附近是可能的。本發(fā)明肽的劑量可以根據(jù)待治療的疾病、患者年齡、體重、施用方法等合適地調(diào)整，通常是0.001mg至)j1000mg,4尤選0.01mgf)100mg，更^t選0.1mg至))10mg,^f尤選數(shù)天到數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合適地選擇合適的劑量?；蛘撸景l(fā)明提供名為外來(lái)體(exosome)的細(xì)胞內(nèi)小泡，它們將本發(fā)明的肽和HLA抗原之間形成的復(fù)合物呈現(xiàn)在它們的表面上。外來(lái)體可以例如使用日本專利特表平11-510507號(hào)公報(bào)和特表2000-512160號(hào)公報(bào)中詳細(xì)記載的方法來(lái)制備，并且優(yōu)選使用從作為治療和/或預(yù)防目標(biāo)的受試者獲取的抗原呈遞細(xì)胞來(lái)制備。本發(fā)明的外來(lái)體可以與本發(fā)明的肽類似地作為癌癥疫苗接種。所用的HLA抗原類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的類型一致。例如，對(duì)于日本人，HLA-A24,尤其是HLA-A2402往往是合適的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包括刺激(prime)T淋巴細(xì)胞的組分。脂質(zhì)已經(jīng)被鑒定為能夠體外針對(duì)病毒抗原刺激CTL的作用物質(zhì)。例如，可以將棕櫚酸殘基附接于賴氨酸殘基的s-和a-氨基上，然后與本發(fā)明的免疫原性肽連接。然后，脂質(zhì)化的肽可以通過(guò)直接在膠束或顆粒中施用，摻入脂質(zhì)體施用，或者在佐劑中乳化來(lái)施用。作為CTL應(yīng)答的脂質(zhì)刺激的另一個(gè)例子，大腸桿菌脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油半胱氨基絲氨基絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine)(P3CSS),當(dāng)共i"介附才矣于合適的肽時(shí)，可以用于刺激CTL(參見(jiàn)例如Deres,etal.,Nature342:561-4，1989)。酸。參見(jiàn)，例如，Wolffet.al.(1990)Science247:1465-1468;美國(guó)專利5,580,859;5,589,466;5,804,566;5,739,118;5,736,524;5,679,647;和WO98/04720?；贒NA的遞送技術(shù)的例子包括"棵(naked)DNA"，協(xié)助(布比卡因(bupivicaine;聚合物，肽介導(dǎo)的)遞送，陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物，和顆粒介導(dǎo)的("基因槍")或壓力介導(dǎo)的遞送(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利5，922,687)。本發(fā)明的免疫原性肽也可以由病毒或細(xì)菌載體來(lái)表達(dá)。表達(dá)載體的例子包括「減毒病毒宿主，-渚如痘苗病毒(vaccine)或禽痘病毒(fowlpox)。該途徑包括使用痘苗病毒，例如作為載體，來(lái)表達(dá)編碼肽的核苷酸序列。一旦導(dǎo)入宿主中，重組痘苗病毒表達(dá)該免疫原性肽，從而引發(fā)免疫應(yīng)答。在免疫規(guī)程中有用的痘苗病毒載體和方法記載于，例如，美國(guó)專利4,722,848。另一種載體是BCG(卡介苗)。BCG載體記載于Stover,etal.(1991)Nature351:456-460。多種其它可用于治療性施用或免疫的載體，例如腺病毒和腺相關(guān)病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)載體，脫毒的炭疽毒素載體等等，是顯而易見(jiàn)的。參見(jiàn)例如Shata,etal.(2000)Mol.Med.Today6:66-71;Shedlock，etal.(2000)J.Leukoc,Biol.68:793-806;andHipp,etal.(2000)InVivo14:571-85。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的肽誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法?？乖蔬f細(xì)胞可以如下誘導(dǎo)從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞，然后使它們以體外、離體或體內(nèi)方式接觸本發(fā)明的肽(刺激)。當(dāng)將本發(fā)明的肽施用于受試者時(shí)，在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出抗原呈遞細(xì)胞，本發(fā)明的肽固定于這些細(xì)胞?；蛘撸瑢⒈景l(fā)明的肽固定于抗原呈遞細(xì)胞后，可將這些細(xì)胞作為疫苗施用給受試者。例如，離體施用可包括下列步驟a:從受試者收集抗原呈遞細(xì)胞；和b:將步驟a的抗原呈遞細(xì)胞與肽接觸。步驟b獲得的抗原呈遞細(xì)胞可以作為疫苗施用給受試者。本發(fā)明還提供一種誘導(dǎo)具有高水平的細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其中所述方法包括將包含編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的基因體外轉(zhuǎn)移到抗原呈遞細(xì)胞的步驟。導(dǎo)入的基因可以是DNA或RNA的形式。關(guān)于導(dǎo)入方法，沒(méi)有特別限制，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種方法，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofection)、電穿孔和磷酸鈣方法。更具體地，可以如Reeves,etal"CancerRes.，56:5672,1996;Butterfield,etal.，J.Immunol"161:5607，1998;Boczkowski，etal"J.Exp.Med"184:465,1996;日本專利特表2000-509281號(hào)公報(bào)所述的來(lái)進(jìn)行。通過(guò)將基因轉(zhuǎn)入抗原呈遞細(xì)胞，基因在細(xì)胞中經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等等，然后獲得的細(xì)胞被I類或II類MHC加工，并經(jīng)過(guò)呈遞途徑而呈遞出部分肽。此外，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的肽誘導(dǎo)CTL的方法。當(dāng)對(duì)受試者使用本發(fā)明的肽時(shí)，在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)CTL，從而免疫系統(tǒng)針對(duì)腫瘤組織中CRC細(xì)胞的威力增強(qiáng)?；蛘?，它們可以用于離體治療方法，其中使來(lái)源于受試者的抗原呈遞細(xì)胞、CD8陽(yáng)性細(xì)胞或外周血單核白細(xì)胞在體外與本發(fā)明的肽接觸(刺激)，誘導(dǎo)CTL后，將細(xì)胞返回受試者。例如，所述方法可包括下列步驟a:從受試者收集抗原呈遞細(xì)胞；b:使步驟a的抗原呈遞細(xì)胞與肽接觸；c:使步驟b的抗原呈遞細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞混合，并共培養(yǎng)以誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)I包；和d:從步驟c的共培養(yǎng)物收集CD8+T細(xì)胞。步驟d所獲得的具有細(xì)胞毒活性的CD8+T細(xì)胞可以作為疫苗施用給受試者。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及這樣的CD8+T細(xì)胞，它們能夠識(shí)別由MHC分子例如HLA-24呈遞的本文所述的肽。此外，本發(fā)明還涉及呈遞本文所述的肽、包含HLA-24型I類MHC分子的細(xì)胞，例如APC。此外，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的、分離的細(xì)胞毒T細(xì)胞。這些細(xì)胞毒T細(xì)胞是通過(guò)呈遞本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞刺激而誘導(dǎo)的，優(yōu)選來(lái)源于作為治療和/或預(yù)防目標(biāo)的受試者，并且可以單獨(dú)施用，或者與其它藥物，包括本發(fā)明的肽或外來(lái)體聯(lián)合施用，用于抗腫瘤目的。所得的細(xì)胞毒T細(xì)胞特異性作用于呈遞本發(fā)明的肽，或者優(yōu)選地，與誘導(dǎo)所用相同的肽的靶細(xì)胞。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)TOM34的細(xì)胞，或者是轉(zhuǎn)染了TOM34基因的細(xì)胞，而且，由于被本發(fā)明的肽刺激而在細(xì)胞表面上呈現(xiàn)這些肽的細(xì)胞，也可以成為攻擊目標(biāo)。本發(fā)明還提供包括HLA抗原和本發(fā)明肽之間所形成的復(fù)合物的呈遞的抗原呈遞細(xì)胞。通過(guò)使本發(fā)明的肽或者編碼本發(fā)明的肽的核苷酸接觸而獲得的抗原呈遞細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)源于作為治療和/或預(yù)防目標(biāo)的受試者，并且可以作為疫苗單獨(dú)或者與包括本發(fā)明的肽、外來(lái)體或細(xì)胞毒T細(xì)胞在內(nèi)的其它藥物組合施用。在本發(fā)明中，短語(yǔ)"疫苗"(又稱免疫原性組合物)是指這樣的物質(zhì)，當(dāng)它接種到動(dòng)物中時(shí)，具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫或抑制CRC的免疫的功能。根據(jù)本發(fā)明我們提出，包括SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽可能是HLA-A24限制性表位肽，可能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)表達(dá)TOM34的CRC細(xì)胞的特異性強(qiáng)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明還涵蓋一種誘導(dǎo)抗肺瘤免疫的方法，該方法使用包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽。通常，抗腫瘤免疫包括例如下述免疫應(yīng)答隱針對(duì)包含TOM34表達(dá)細(xì)胞的腫瘤的細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞之誘導(dǎo)，-識(shí)別包含TOM34表達(dá)細(xì)胞之腫瘤的抗體之誘導(dǎo)，-抗胂瘤細(xì)胞因子產(chǎn)生之誘導(dǎo)。因此，若某一蛋白質(zhì)在接種于動(dòng)物中時(shí)誘導(dǎo)上述任何免疫應(yīng)答，則判定該蛋白質(zhì)具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的效果。蛋白質(zhì)對(duì)抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)，可以通過(guò)體內(nèi)或體外觀察宿主中免疫系統(tǒng)針對(duì)該蛋白質(zhì)的應(yīng)答來(lái)加以;險(xiǎn)測(cè)。例如，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的檢測(cè)方法是公知的。進(jìn)入活體的外來(lái)物質(zhì)通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用被呈遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞。以抗原特異性方式對(duì)APC呈遞抗原起響應(yīng)的T細(xì)胞由于抗原刺激而分化成細(xì)胞毒T細(xì)胞(或細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞；CTLs)，然后增殖(這稱為T細(xì)胞的活化)。因此，對(duì)于特定肽所致的CTL誘導(dǎo)，可以通過(guò)將所述肽經(jīng)由APC呈遞于T細(xì)胞，然后檢測(cè)CTL的誘導(dǎo)來(lái)加以評(píng)估。另外，APC具有活化CD"T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的作用。由于CD4+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，可以利用這些細(xì)胞的活化效果為指標(biāo)來(lái)評(píng)估所述肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用。使用樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)作為APC以評(píng)價(jià)CTL誘導(dǎo)作用的方法是本領(lǐng)域公知的。DC是一種代表性的APC，在APC中具有最強(qiáng)的CTL誘導(dǎo)作用。在該方法中，首先使測(cè)試多肽接觸DC，然后使該DC與T細(xì)胞接觸。與DC接觸后^r測(cè)到具有針對(duì)感興趣細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的T細(xì)胞，證明測(cè)試多肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的能力。CTL針對(duì)腫瘤的活性可以，例如，利用"Cr標(biāo)記肺瘤細(xì)胞的裂解作為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)?；蛘撸褂?amp;胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)-釋放作為指標(biāo)，評(píng)估腫瘤細(xì)胞損傷程度的方法，也是公知的。除了DC，外周血單核細(xì)胞(PBMC)也可以用作APC。據(jù)報(bào)道，在GM-CSF和IL-4存在的條件下培養(yǎng)PBMC可增強(qiáng)CTL的誘導(dǎo)。類似地，已經(jīng)證明，通過(guò)在鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)和IL-7存在下培養(yǎng)PBMC可誘導(dǎo)CTL。通過(guò)這些方法確認(rèn)為具有CTL誘導(dǎo)活性的測(cè)試多肽，是具有DC活化效應(yīng)及隨后的CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的CTL的多肽可用作抗CRC的疫苗。而且，通過(guò)接觸這些多肽而獲得誘導(dǎo)抗CRC性CTL的能力的APC可用作抗CRC的疫苗。進(jìn)一步，由于APC呈遞所述多肽抗原而獲得細(xì)胞毒性的CTL也可用作抗CRC疫苗。利用APC和CTL所致抗腫瘤免疫的此類CRC治療方法稱為細(xì)胞免疫療法。通常，當(dāng)細(xì)胞免疫療法使用多肽時(shí)，已知通過(guò)組合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽，并使它們與DC接觸，CTL誘導(dǎo)的效率會(huì)增加。因此，當(dāng)用蛋白片段刺激DC時(shí)，使用多種類型的片段的混合物是有利的?；蛘?，多肽對(duì)抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)可以通過(guò)觀察針對(duì)腫瘤的抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)來(lái)確認(rèn)。例如，當(dāng)用多肽免疫的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該多肽的抗體,并且這些抗體抑制胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖或轉(zhuǎn)移時(shí)，所述多肽可確定為具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力。施用本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，而該抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)使治療和預(yù)防CRC成為可能。針對(duì)CRC的治療或預(yù)防可以包括任何下述步驟諸如CRC細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，CRC細(xì)胞的退縮(involution)以及CRC細(xì)胞發(fā)生的抑制。CRC的治療或預(yù)防的效果還包括患CRC個(gè)體的死亡率降低、血液中CRC標(biāo)志減少、CRC伴發(fā)的可檢測(cè)癥狀的緩解等。所述治療性和預(yù)防性效果優(yōu)選是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。例如，在觀察中顯著性水平為5%或更低，在行比較。例如，可將Student'st-檢驗(yàn)，Mann-WhitneyU-檢驗(yàn)或ANOVA用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。上述有免疫活性的蛋白或編碼該蛋白的多核苷酸或載體可與佐劑組合。佐劑是指當(dāng)與具有免疫活性的蛋白共同(或相繼)施用時(shí)增強(qiáng)針對(duì)該蛋白的免疫應(yīng)答的化合物。例示性的佐劑包括但不限于霍亂毒素(choleratoxin)、沙門氏菌毒素(salmonellatoxin)、明鞏(alum)等。此外，本發(fā)明的疫苗可適宜地與藥物可接受的載體組合。這樣的載體的例子有無(wú)菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液等。此外，疫苗可根據(jù)需要包含穩(wěn)定劑，懸浮劑(suspensions),防腐劑，表面活性劑等。疫苗全身或局部地進(jìn)行施用。疫苗施用可以通過(guò)單次給藥進(jìn)行，或者通過(guò)多次給藥來(lái)強(qiáng)化(boost)。當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時(shí)，可以例如通過(guò)離體(exvivo)方法治療或預(yù)防CRC。更具體地，收集接受治療或預(yù)防療法的受試者的PBMC，使細(xì)胞與多肽在離體條件下接觸，誘導(dǎo)APC或CTL，然后可將該細(xì)胞施用于受試者。也可通過(guò)將編碼多肽的載體在離體條件下導(dǎo)入PBMC中來(lái)誘導(dǎo)APC。體外誘導(dǎo)的APC或CTL可以在施用前進(jìn)行克隆。通過(guò)克隆和培養(yǎng)具有高靶細(xì)胞破壞活性的細(xì)胞，可以更有效地實(shí)施細(xì)胞免疫治療。此外，以該方式分離的APC和CTL不僅可以用于針對(duì)提供細(xì)胞的受試者進(jìn)行細(xì)胞免疫治療，還可以用于針對(duì)來(lái)自其它個(gè)體的相似類型的腫瘤進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。用于抑制CRC的藥物組合物在本發(fā)明的背景下，適宜的藥物制劑包括適于口服、直腸、鼻、局部(包括口腔或舌下)、陰道或非消化道(包括肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))施用的制劑，或用于通過(guò)吸入或吹入(insufflation)施用的制劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。制劑可以任選包裝在離散的劑量單位(dosageunit)中。適于口服施用的藥物制劑包括膠嚢劑、扁嚢劑(cachet)或片劑，它們各自含有一定量的活性成分。適合的制劑還包括粉末、顆粒、溶液、懸浮液和乳液。活性成分任選以大丸藥糖劑(boluselectuary)或糊劑(paste)的形式施用。用于口服給藥的片劑和膠嚢劑可含有常規(guī)賦形劑諸如粘合劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑或濕潤(rùn)劑。片劑可通過(guò)壓縮或成型來(lái)制備，任選與一種或多種配方成分壓縮或成型。壓縮片劑可通過(guò)如下方法制備將自由流動(dòng)形式的活性成分，如粉末或顆粒，任選與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑和/或分散劑混合，在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中進(jìn)行壓縮。成型片劑可通過(guò)如下方法制備在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中對(duì)利用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉末化合物的混合物進(jìn)行成型。所述片劑可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行包衣(coated)。口服液體制備物可以是例如水性或油性的懸濁液、溶液、乳液、糖漿或酏劑的形式；或者也可以作為干燥產(chǎn)物提供，在使用前用水或其它適宜溶媒來(lái)構(gòu)成。所述液體制備物可含有常規(guī)添加劑諸如懸浮劑，乳化劑，非水性溶媒(可包括食用油)和/或防腐劑。片劑可任選地配制以提供其中活性成分的緩釋或控釋。片劑的包裝中可以包含每月服用的一片藥物。適于非消化道施用的制劑包括水性和非水性的無(wú)菌注射溶液，其中任選地含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑(bacteriostat)和使得制劑與預(yù)期接受者的血液等張(isotonic)的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無(wú)菌懸浮液，其中含有懸浮劑和/或增稠劑。所述制劑可以提供為單位劑量或多次劑量容器，例如密封的安瓿和小瓶；還可以在冷凍-干燥(凍干的)條件下保存，僅需要在即將使用前添加無(wú)菌液體載體例如鹽水、注射用水?；蛘撸商峁┧鲋苿┯糜谶B續(xù)輸注(continuousinfusion)?？梢?人前述的無(wú)菌4分末、顆粒及片劑的類型制備即配即用的注射溶液和懸浮液。適于直腸給藥的制劑包括含有標(biāo)準(zhǔn)載體如可可脂或聚乙二醇的栓劑(suppository)。適于口內(nèi)局部給藥，例如口腔或舌下給藥的制劑包括錠劑(lozenge)和軟錠劑(pastille),其中錠劑在調(diào)味基質(zhì)，如蔗糖和阿拉伯膠(acacia)或黃蓍膠中包含活性成分，而軟錠劑在基質(zhì)，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中包含活性成分。鼻內(nèi)給藥時(shí)，本發(fā)明的化合物可以用作液體噴霧劑、可分散粉末，或以滴鼻劑(drops)的形式。滴鼻劑可用水性或非水性基質(zhì)配制，該基質(zhì)中也含有一種或多種分散劑、增溶劑和/或懸浮劑。吸入給藥時(shí)，可以由吹入器、霧化器、加壓包裝(pressurizedpack)或其它便利的氣溶膠噴霧遞送裝置方便地遞送化合物。氣溶膠包裝可含有適宜的噴射劑，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過(guò)提供輸送計(jì)量量(meteredamount)的閥門來(lái)確定劑量單位。或者，通過(guò)吸入或吹入給藥時(shí)，化合物可以采取干粉組合物的形式，例如該化合物與適宜粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以提供為單位劑型，例如作為膠嚢、藥筒(cartridge)、凝膠(gelatin)或發(fā)泡包(blisterpack)，借助吸入器或吹入器，可由上述劑型施用所述粉末。其它的制劑包含可釋放治療劑的可植入裝置及粘性貼片(adhesivepatches)。需要時(shí)，可以采用適于活性成分緩釋的上述制劑。藥物組合物中還可以含有其它活性成分，諸如抗微生物劑，免疫抑制劑和/或防腐劑。應(yīng)當(dāng)理解，除了上面具體提到的成分外，本發(fā)明的制劑可包括對(duì)于所討論的制劑類型而言其它本領(lǐng)域常規(guī)的藥劑。例如，適用于口服施用的制劑可包括調(diào)味劑。優(yōu)選的單位劑量制劑含有如下所述有效劑量的活性成分，或有效劑量的適當(dāng)部分的活性成分。對(duì)于前述的各種情況，所述組合物，例如肽和有機(jī)化合物，可以在每天約0.1-約250mg/kg的劑量范圍內(nèi)口服或通過(guò)注射施用。成人的劑量范圍通常為約5mg-約17.5g/天，優(yōu)選為約5mg-約10g/天，更優(yōu)選為約100mg-約3g/天。片劑或其它以分散單元提供的單位劑型可適宜地含有這樣的量，該量在該劑量條件下為有效量，或者在多個(gè)該劑量條件下為有效量；例如，單位劑型含有約5mg-約500mg,通常為約100mg-約500mg的單位。所用劑量將依賴于多種因素，包括受試者的年齡和性別，治療的確切疾患及其嚴(yán)重程度。此外，給藥途徑也依賴于病癥及其嚴(yán)重程度而變化。然而無(wú)論怎樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員都能在考慮上述因素的基礎(chǔ)上常規(guī)地計(jì)算出合適的最佳劑量。下面的實(shí)施例描述了本發(fā)明的方面，它們并不意在限制權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍。下面的實(shí)施例例示了在CRC細(xì)胞中差異表達(dá)的基因的鑒定和表4i。實(shí)施例細(xì)胞系和臨床材料人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)。所有這些細(xì)胞均在合適的培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)，即McCoys5A(Invitrogen,Carlsbad,CA)用于HCT116;RPMI1640(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis，MO)用于RKO,培養(yǎng)基i勻添力口了100/o月臺(tái)牛血;青(CanseraInternationalInc.,Ontario,Canada)和1。/o抗生素/抗真菌劑溶液(Sigma-Rich)。將細(xì)胞維持在37。C、5%<^02的加濕氣氛下。癌性組織和相應(yīng)的非癌性粘膜是從12名患者獲得知情同意后于手術(shù)中切除的。人B-類淋巴母細(xì)胞系TISI細(xì)胞(HLA-A24/24)和EHM(HLA-A3/3)由TakaraShuzoCo,Ltd.(Otsu，Japan)惠贈(zèng)。將TISI細(xì)胞用于肽介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測(cè)定。結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系DLD-1(HLA-A24/02)、HT29(HLA-A24/01)和SNU-C2A(HLA-A31/26)購(gòu)自ATCC。慢性髓性白血病細(xì)胞系K562購(gòu)自ATCC。半定量RT-PCR使用TRIZOL試劑(Invitrogen)根據(jù)制造商的規(guī)程從培養(yǎng)細(xì)胞或臨床組織中提取總RNA。用DNA酶I(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)處理提取的RNA，然后利用oligo(dT)12_18引物和SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。我們通過(guò)監(jiān)測(cè)<^4戶￡>//基因作為定量對(duì)照，序列為5，-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3，(SEQIDNO;41)和5，-GGTCCACCACTGACACGTTG-3，(SEQIDNO;42)用于04尸D7/;5，-TGGTATAAACCTAAGGCCCTGAT-3，(SEQIDNO;43)和5，-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3，(SEQIDNO;44)用于TOM34。在所有擴(kuò)增反應(yīng)前先用94"預(yù)先熱變性2min，然后再進(jìn)行18個(gè)(對(duì)于GL4尸D^)或29個(gè)(對(duì)7PM3力如下的擴(kuò)增循環(huán)94°C30秒，6(TC30秒，和72。C30秒；反應(yīng)在GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(PEAppliedBiosystems，F(xiàn)oster,CA)上進(jìn)行。Northern印跡將人多組織印跡(BDBioscience,PaloAlto，CA)與32P標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交。探針是使用引物組5，-GAACGTGAAGGCATTCTACAGA-3，(SEQIDNO;45)和5'-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3，(SEQIDNO;44)進(jìn)4亍RT-PCR，然后用Mega標(biāo)記試劑盒(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UnitedKingdom)用32P-dCTP進(jìn)行隨機(jī)寡核苦酸標(biāo)記而制備的。預(yù)雜交、雜交和清洗根據(jù)供應(yīng)商的建議進(jìn)行。用增感屏將印跡在-80。C放射自顯影10天?？筎OM34多克隆抗體的制備使用下列引物組5，-CATAAGCTTGCATGGCCCCCAAATTCCCA-3，(SEQIDNO;58)和5，-GTTAAGCTTTTAGTGTAGGTTCT-3，，(SEQIDNO;59)擴(kuò)增TOM34的整個(gè)編碼區(qū)域，然后將其克隆到pET28載體(Novagen,Madison,WI)的合適克隆位點(diǎn)中以生成表達(dá)His-標(biāo)簽TOM34蛋白的質(zhì)粒。在大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌抹(Stratagene，LaJolla,CA)中表達(dá)重組蛋白，并使用TALONSuperflowMetalAffinityResin(BDBioscience)根據(jù)制造商的規(guī)程加以純化。將蛋白接種到兔中，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法在親和柱上純化免疫血清。使用含有50mMTris-HCl(pH7.5)、250mMNaCl、0.1%SDS和0,5%NP40，以及蛋白酶抑制劑合劑組III(ProteaseInhibitorCocktailSetIII)(CALBIOCHEM,LaJolla,CA)的0.1%RIPA樣緩沖液(RIPAlikebuffer)從細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，使用該蛋白質(zhì)進(jìn)行Western印跡分析。免疫組織化學(xué)使用親和純化的抗人TOM34多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。通過(guò)將載玻片在0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中108。C高壓蒸汽預(yù)處理10分鐘從脫石蠟并復(fù)水的組織中修復(fù)(retrieve)抗原，然后將石蠟包埋的組織切片用于SAB-PO過(guò)氧化物酶免疫染色系統(tǒng)(Nichirei，Tokyo,Japan)構(gòu)建表達(dá)針對(duì)TOM34的siRNA的psiU6BX根據(jù)先前的記載(W02004/076623)，將雙鏈寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0載體的SfoI位點(diǎn)中來(lái)制備siRNA表達(dá)載體。配對(duì)的寡核苷酸的序列為5,-CACCGAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAGAGATGGAGTAGAGAACACTTTC-3，(SEQIDNO;46)和5'誦AAAAGAAAGTGTTCTCTACTCCATCTCTTGAATGGAGTAGAGAACACTTTC陽(yáng)3，(SEQIDNO;47)用于siD;5，-CACCGGATGGAAACTGCAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3，(SEQIDNO;50)和5,-AAAAGGATGGAAACTGCAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3，(SEQIDNO;51)用于siE。用T4多核香酸激酶磷酸化后，將配對(duì)的寡核苷酸煮沸5min,然后通過(guò)緩慢冷卻退火產(chǎn)生雙鏈寡核苷酸。使用由下述序列組成的寡核苷酸制備對(duì)照質(zhì)粒psiU6BX-EGFP。各核苷酸序列、siRNA靶序列和SEQIDNO均示于表l。5'畫CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，(SEQIDNO;54)和5，-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，(SEQIDNO;55)。為了考察TOM34-siRNA的效果，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒5天后使用抗TOM34抗體進(jìn)行Western印跡分析。表1插入siRNA表達(dá)載體的特異性雙鏈寡核苷酸的序列及各個(gè)siRNA的靶序列<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>集落形成測(cè)定使用FuGENE6試劑(RocheDiagnostics),用表達(dá)TOM34-si認(rèn)A的質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染鋪在10-cm培養(yǎng)亞(4x105個(gè)細(xì)胞/皿)上的HCT116細(xì)胞，并將細(xì)胞維持在含10%胎牛血清和800[ig/ml遺傳霉素的培養(yǎng)基中兩周。將生存下來(lái)的細(xì)胞用100%曱醇固定并用Giemsa溶液染色。在另一個(gè)實(shí)-驗(yàn)中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(DOJINDO，kumamoto，Japan)測(cè)量活細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析使用可商購(gòu)的軟件(Statview;SASInstitute,Caiy，NC),通過(guò)ScheffesF檢驗(yàn)的ANOVA分析統(tǒng)計(jì)顯著性。TOM34由來(lái)的肽通過(guò)結(jié)合子貞測(cè)軟件(http://bimas.dcrLnih.gov/cgi-biri/molbio/ken_paiker—combofoim)(ParkerKC,et.al.,JImmunol.1994;152(l):163-75),對(duì)可結(jié)合HLA-A24分子的、TOM34肽序列由來(lái)的9聚體和10聚體肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(ParkerKC，et.al.,JImmunol.1994;152(l):163-75)。這些肽由Mimotopes,SanDiego，CA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法合成，并通過(guò)反相HPLC純化。肽的純度(>90%)和同一性分別通過(guò)分析型HPLC和質(zhì)譜分析來(lái)確定。將肽以20mg/ml溶解在二甲亞砜(DMSO)中并保存在-80。C。體外CTL誘導(dǎo)導(dǎo)針對(duì)呈遞于HLA上的肽的CTL。如他處所述體外生成DC(NukayaI，etal.,IntJCancer.1999;80(l):92-7;TsaiV，改aL，JImmunol.1997;158(4):1796"802)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，從正常志愿者(HLA-A24)中用Ficoll-Paque(Pharmacia)溶液分離出外周血單核細(xì)胞(PMBCs)，并通過(guò)附著于塑料組織培養(yǎng)瓶(BectonDickinson)力口以分離，以富集它們的單核細(xì)胞級(jí)分。將富集了單核細(xì)胞的群體在含2%的熱滅活自身血清(AS)的AIM畫V(Invitrogen)中、在l，OOOU/ml的GM畫CSF(KirinBreweryCompany提供)和1,000U/mlIL-4(Genzyme)存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，在AIM-V中，20°C，以4小時(shí)時(shí)間，于3嗎/ml(32-微球蛋白存在的條件下，使產(chǎn)生細(xì)胞因子的DC負(fù)載20pg/ml的HLA-A24-結(jié)合肽。然后照射這些負(fù)載了肽的DC(5，500rad),并以l:20的比例與自身CD8+T細(xì)胞混合，其中CD8+T細(xì)胞是用DynabeadsM-450CD8(Dynal)和Detachabead(Dynal)陽(yáng)性選擇獲得的。進(jìn)一步將該混合物分份，將等份在48孔平板(Corning)中溫育；每個(gè)孔在0.5ml含10ng/mlIL-7(Genzyme)的AIM-V/2%AS中含有1.5xl04個(gè)負(fù)載了肽的DC和3xl()5個(gè)CD8+T細(xì)胞。3天后，向這些培養(yǎng)物補(bǔ)充IL-2(CHIRON)到終濃度為20IU/ml。在第7天和第14天，進(jìn)一步用負(fù)載了自身肽的DC來(lái)再刺激T細(xì)胞。每次用上述相同的方法制備DC。在21天的第3輪肽刺激后，測(cè)試了針對(duì)負(fù)載肽的TISI細(xì)胞的細(xì)胞毒性。CTL擴(kuò)大培養(yǎng)程序使用與Riddell，etal.(Walteretal，NEnglJMed333:1038-1044,(1995)，Riddeletal,NatureMed.2:216-223，(1996))所述的方法類似的方法，在培養(yǎng)物中擴(kuò)大培養(yǎng)CTL。在40ng/ml抗CD3單克隆抗體(Pharmingen)的存在下，將總數(shù)5x104個(gè)CTL重懸在25ml含有25x106個(gè)被照射(3，300rad)的PBMC和5x106個(gè)被照射(8,000rad)的EHM細(xì)胞的AIM-V/5%AS中。在培養(yǎng)開(kāi)始后l天，向培養(yǎng)物中加入120IU/ml的IL-2。在第5、8和11天向培養(yǎng)物中添加含30IU/mlIL-2的新鮮AIM-V/5%AS。CTL克隆的建立將擴(kuò)大培養(yǎng)后的CTL培養(yǎng)物稀釋，并將細(xì)胞分配到96孔圓底微量滴定板(NalgeNuncInternational)的孔中，將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)為0.3、1和3個(gè)CTL/孔。然后將CTL與7xl()4個(gè)細(xì)胞/孔的同種異型PBMC、1x1C)4個(gè)細(xì)胞/孔的EHM、30ng/ml的抗CD3抗體及125U/ml的IL-2在總共150pl/孔的含5%AS的AIM-V中培養(yǎng)。10天后向培養(yǎng)基中加入50pl/孔的IL-2,使得IL-2的終濃度成為125U/ml。在第14天測(cè)試CTL的細(xì)胞毒活性，并使用與上述相同的方法擴(kuò)大培養(yǎng)CTL克隆。細(xì)胞毒性測(cè)定在C02培養(yǎng)箱中37。C條件下、用100pCi的Na^Cr04(PerkinElmerLifeSciences)標(biāo)記靶細(xì)胞1小時(shí)。在標(biāo)記前，通過(guò)將細(xì)胞與20嗎/ml的肽在37。C共溫育16小時(shí)來(lái)制備負(fù)載肽的耙細(xì)胞。漂洗標(biāo)記的靶細(xì)胞，并在圓底微量滴定板中以0.2ml的終體積與效應(yīng)細(xì)胞混合。將平板離心(800xg，4分鐘)以增加細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的接觸，并放置在37。C的C02培養(yǎng)箱中。溫育4小時(shí)后，從每個(gè)孔收集0.1ml上清液，使用y計(jì)數(shù)器(gammacounter)確定放射性。在評(píng)價(jià)針對(duì)內(nèi)源表達(dá)TOM34的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性的場(chǎng)合，在30倍過(guò)量的未標(biāo)記K562細(xì)胞存在下測(cè)定細(xì)胞溶解活性，其排除任何由NK類效應(yīng)物所致的非特異性裂解。通過(guò)非放射性靶抑制測(cè)定(coldtargetinhibitionassay)確證抗原特異性，該測(cè)定使用負(fù)載有抗原肽(37。C、20(ig/ml,16小時(shí))的未標(biāo)記TISI細(xì)胞來(lái)竟?fàn)?Cr-標(biāo)記HT29腫瘤細(xì)胞的識(shí)別。特異性細(xì)胞毒性的百分比是通過(guò)下式計(jì)算特異性51Cr釋放的百分比而求出的{(測(cè)試樣品釋放的cpm-自發(fā)釋放的cpm)/(最大釋放的cpm-自發(fā)釋放的cpm)}x100。自發(fā)釋^L通過(guò)在沒(méi)有效應(yīng)細(xì)胞存在下單獨(dú)溫育靶細(xì)胞來(lái)確定，最大釋放通過(guò)將靶與1NHC1共溫育而獲得。所有的測(cè)量均一式二份進(jìn)行，其平均的標(biāo)準(zhǔn)偏差一直低于平均值的10%。結(jié)果CRC中roM^的表達(dá)上升在我們更早的研究中，我們使用由23040種基因構(gòu)成的cDNA微陣列對(duì)11例CRC和9例結(jié)腸腺癌進(jìn)行了全基因組表達(dá)模式分析，從而鑒定了多種在結(jié)腸肺瘤中表達(dá)水平頻繁變化的基因。在表達(dá)水平在11例癌(carcinoma)中頻繁上調(diào)的基因中，我們?cè)诒景l(fā)明中著眼于一種內(nèi)部標(biāo)識(shí)號(hào)為D3124的基因，它對(duì)應(yīng)于rOM34(GeneBanck登錄號(hào)AB085681,SEQIDNO;60,61)(線粒體外膜的34kDa移位酶)。隨后的半定量RT-PCR分析揭示，它在所檢查的20個(gè)CRC臨床樣品里的16個(gè)中表達(dá)增強(qiáng)(圖1A)。另外，在我們的cDNA微陣列數(shù)據(jù)中，r(9M34在所有8例肝細(xì)胞癌、19例肺癌中的5例、9例膀胱癌中的3例、27例急性髓性白血病中的7例、以及49例軟組織肉瘤中的9例中也有顯著上調(diào)。為了考察它在人類正常組織中的表達(dá)，我們使用r(9M54cDNA作為探針進(jìn)行了多組織Northern印跡分析。結(jié)果，分析顯示了一種大小約2.0kb的轉(zhuǎn)錄物，它在睪丸和卵巢中大量表達(dá)，在前列腺、脾和結(jié)腸中弱表達(dá)，而在其它11個(gè)被一企組織中則均不表達(dá)(圖1B)。結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系和CRC組織中TOM34蛋白質(zhì)的積累我們制備了抗TOM34多克隆抗體，并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色考察了TOM34蛋白在8個(gè)CRC細(xì)胞系和12個(gè)CRC組織中的表達(dá)。免疫印跡分析檢測(cè)到了在全部被檢CRC細(xì)胞系中均大量表達(dá)的34kDaTOM34條帶。另一方面，在兩種非癌性細(xì)胞系MH3T3和COS7中，顯示較低的表達(dá)水平(圖2B)。使用16例CRC及相應(yīng)的非癌性粘膜組織進(jìn)行Western印跡分析，證實(shí)了它在16個(gè)腫瘤的15個(gè)中相比于正常粘膜表達(dá)增強(qiáng)(圖2A)。為了考察TOM34的亞細(xì)胞定位，我們用HCT116和RKO細(xì)胞以抗TOM34抗體進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示該蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位。此外，我們使用12個(gè)石蠟包埋的結(jié)腸癌組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。在這12例腫瘤中的11例中，TOM34在癌性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被強(qiáng)染色，而其在非癌性粘膜中幾乎不S皮染色(圖3)。TOM34-siRNA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響為了闡明TOM34在癌細(xì)胞中的作用，我們制備了表達(dá)針對(duì)TOM34的siRNA的質(zhì)粒，并考察了它們對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。我們制備了兩種形式的表達(dá)設(shè)計(jì)為抑制TOM34的siRNA的質(zhì)粒(psiU6BX-TOM34-siD和-s正)，以及一種對(duì)照質(zhì)粒(psiU6BX-s正GFP)。我們用psiU6BX-TOM34-siD、psiU6BX-TOM34-siE或psiU6BX-siEGFP轉(zhuǎn)染了HCT116細(xì)胞。針對(duì)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞之提取物的Western印跡分析顯示，與psiU6BX-s正GFP相比，psiU6BX-TOM34-siD和psiU6BX-TOM34-s正顯著地抑制了被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TOM34的表達(dá)(圖4A)。我們將共表達(dá)新霉素抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞中，并用合適濃度的遺傳霉素培養(yǎng)它們13天。與TOM34的表達(dá)下降相一致，psiU6BX-TOM34-siD和psiU6BX畫TOM34陽(yáng)siE相比于psiU6BX-s氾GFP均明顯地延遲了被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖4B)。這些數(shù)據(jù)表明，TOM34的表達(dá)是與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)的。TOM34由來(lái)的HLA-A24結(jié)合肽的預(yù)測(cè)表2和3按高結(jié)合親和力的順序顯示了預(yù)測(cè)為抗原的肽。選擇了20個(gè)10聚體肽(表2)和20個(gè)9聚體肽(表3)作為抗原，并如下文所述進(jìn)行了考察。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>使用預(yù)測(cè)的肽刺激T細(xì)胞按照"材料與方法"中描述的方式產(chǎn)生了識(shí)別TOM34由來(lái)的肽的細(xì)胞毒T細(xì)胞。將所得具有可檢測(cè)的細(xì)胞毒活性的CTL擴(kuò)大培養(yǎng)，并且建立了CTL系(CTLlines),這些CTL系針對(duì)負(fù)載肽的靶比針對(duì)沒(méi)有用肽短暫刺激(pulse)的靶顯示更高的細(xì)胞毒活性。用10聚體肽TOM34-299(KLRQEVKQNL(SEQIDNO;7))刺激過(guò)的CTL系針對(duì)負(fù)載肽的靶顯示很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，而對(duì)未負(fù)載肽的靶則不顯示任何顯著的細(xì)胞毒活性(圖5)。這些CTL系顯示強(qiáng)力且抗原特異性的細(xì)胞毒性，在低達(dá)1.2的E/T比仍可檢測(cè)到(圖6)。CTL克隆的建立如"材料和方法"中所述，對(duì)CTL系培養(yǎng)物進(jìn)行有限稀釋，然后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立了CTL的克隆。這樣得到的TOM34-299特異性CTL克隆包括具有極高細(xì)胞裂解活性的克隆，克隆全體的活性在1.2的E/T比為20%到70%的裂解，在10的E/T比為40%到>90%的裂解(圖7)。以內(nèi)源表達(dá)TOM34的結(jié)腸癌細(xì)胞系為耙的細(xì)胞毒活性對(duì)于TOM34-299肽激發(fā)產(chǎn)生的CTL克隆，考察了它們識(shí)別并殺死內(nèi)源表達(dá)TOM34的腫瘤細(xì)胞的能力。圖8顯示了TOM34-299肽激發(fā)產(chǎn)生的兩種CTL克隆所得的結(jié)果。這兩種CTL克隆對(duì)于表達(dá)TOM34及HLA-A24的結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1和HT29均顯示強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。另一方面，這兩種CTL克隆對(duì)表達(dá)TOM34而不表達(dá)HLA-A24的SNU-C2A結(jié)腸癌細(xì)胞系均不顯示任何相關(guān)的細(xì)胞毒活性(圖8)。非放射性乾抑制測(cè)定進(jìn)行了非放射性靶抑制測(cè)定來(lái)確證CTL系的特異性。使用"Cr標(biāo)記的HT29細(xì)胞作為放射性靶(hottarget),將不進(jìn)行51Cr標(biāo)記的負(fù)載或不負(fù)載肽的TISI細(xì)胞作為非放射性靶(coldtarget)。當(dāng)以不同比例向測(cè)定中加入負(fù)載肽的非放射性靶細(xì)胞時(shí)，針對(duì)靶HT29細(xì)胞的特異性細(xì)胞裂解被顯著抑制，但加入未負(fù)載肽的非放射性耙細(xì)胞時(shí)，針對(duì)靶HT29細(xì)胞的特異性細(xì)胞裂解則完全不被抑制。該結(jié)果作為效應(yīng)物/放射性靶比為20時(shí)特異性裂解的百分比顯示(圖9)。抗原肽的同源性分析針對(duì)TOM34-299建立的CTL克隆顯示了非常強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。這可能說(shuō)明該肽的序列與來(lái)源于已知可致敏(sensitize)人免疫系統(tǒng)的其它分子的那些肽具有同源性。為了排除這種可能性，以肽序列作為查詢項(xiàng)，使用BLAST算^r(http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/blast/blast.cgi)(AltschulSF,etal.，NucleicAcidsRes,1997;25(17):3389-402.;AltschulSF，etal"JMolBiol.1990;215(3):403-10)進(jìn)行同源性分析，結(jié)果未顯示具有顯著同源性的序列。這說(shuō)明TOM34-299的序列是獨(dú)特的，而且就我們所知，激發(fā)針對(duì)任何無(wú)關(guān)分子的非期望免疫反應(yīng)的可能性極低。結(jié)合T細(xì)胞表面抗原的抗體所致的CTL活性阻斷為了確認(rèn)觀察到的殺傷活性是否由細(xì)胞毒T細(xì)胞所介導(dǎo)，使用中和CTL活性相關(guān)T細(xì)胞表面抗原的功能的抗體考察了抗體對(duì)該殺傷活性的作用。添加識(shí)別I類HLA或CD8的抗體明顯阻斷了CTL活性，而添加針對(duì)II類HLA或CD4的抗體也以較前者為低的程度阻斷了CTL活性，如圖10所示。該結(jié)果證明，針對(duì)HT29結(jié)腸直腸癌細(xì)胞觀察到的T細(xì)胞克隆的細(xì)胞毒活性，是HLA限制性的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞殺傷活性。討論在本發(fā)明中我們證明，TOM34在CRC中頻繁上調(diào)；它在正常睪丸及卵巢中大量表達(dá)，在前列腺、脾和結(jié)腸中微量表達(dá)，但在所檢查的其它正常成人組織中幾乎未檢測(cè)到。有希望的治療手段之一是癌癥免疫療法，其包括T細(xì)胞介導(dǎo)的抗肺瘤免疫接種。通過(guò)識(shí)別由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子呈遞的肽抗原，CD"細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞以展示抗原的細(xì)胞為靶標(biāo)。由于腫瘤組織源于非癌性自身細(xì)胞，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視。為了應(yīng)用癌癥免疫治療，鑒定在癌細(xì)胞中特異表達(dá)的抗原是非常重要的?？乖辉诓G丸中表達(dá)，因?yàn)槿鄙買類MHC分子(JassimA,etal.,EurJImmunol19:1215-1220,1989)。所以，在癌癥和睪丸中特異性表達(dá)的基因應(yīng)是免疫治療的靶標(biāo)。由于TOM34在除睪丸和卵巢之外的正常器官中不大量表達(dá)，并且在大多數(shù)結(jié)腸癌中上調(diào)，因此TOM34可能作為新的癌-睪丸抗原起到CRC治療靶標(biāo)的作用。最初認(rèn)為TOM34作為將蛋白質(zhì)輸入線粒體的移位酶的組分起作用，因?yàn)樵摰鞍着c酵母Tom蛋白顯示序列同源性(NuttallSD，etal.,DNACellBiol16:1067-1074,1997)。盡管曾預(yù)測(cè)TOM34定位于線粒體外膜中，新近一項(xiàng)研究揭示其包含在Hela細(xì)胞的胞漿中(Chun-SongY&HenryW,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110，2002;AbhijitM，etal,,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:97-104，2002)。與該數(shù)據(jù)一致的是，我們使用抗TOM34多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，TOM34在CRC細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位是細(xì)胞質(zhì)。在另一項(xiàng)報(bào)道中，使用酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選將含纈酪肽蛋白(VCP)和hsp90鑒定為TOM34相互作用蛋白。VCP是一種AAA(與多種細(xì)胞活性相關(guān)的ATP酶)家族成員，又稱p97;它與遍在蛋白化的IkB(x和26S蛋白酶體的亞基形成復(fù)合物，提示VCP可能通過(guò)降解IkBoi而參與轉(zhuǎn)錄因子NFicB向細(xì)胞核的移位(DaiRM，etal.,JBiolChem273:3562-3573,1998)。HSP90是一種分子伴侶，許多分子的穩(wěn)定性和功能都需要它的相互作用。因此，TOM34可能通過(guò)與HSP90結(jié)合而穩(wěn)定化。由于HSP90與致癌性分子例如Rafl、AKT和SMYD3結(jié)合，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了若干種HSP90抑制劑來(lái)治療人類癌癥。人們估計(jì)這些抑制劑會(huì)阻礙正常的功能性HSP90，從而造成嚴(yán)重的不良作用，因?yàn)镠SP90在大多數(shù)正常組織中是普遍表達(dá)的。總之，TOM34在CRC中上調(diào)，但在除睪丸和卵巢之外的正常器官中幾乎不表達(dá)。因此，抑制TOM34很可能不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞帶來(lái)不良影響。另夕卜，抑制TOM34導(dǎo)致癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，這提示TOM34在它們的生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。這些數(shù)據(jù)暗示，TOM34是人結(jié)腸直腸癌的免疫療法及抗癌藥開(kāi)發(fā)的有希望的靶標(biāo)。另外，誘導(dǎo)強(qiáng)力和特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定，保證了各種癌癥類型中肽疫苗接種策略的臨床應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展(BoonT&vanderBruggenP,JExpMed.1996;183(3):725-9，vanderBruggenP，etal"Science.1991;254(5038):1643-7.,BrichardV，etal.,JExpMed.1993;178(2):489-95.,KawakamiY,etal.,JExpMed.1994;180(l):347-52.，ShichijoS，etal"JExpMed.1998;187(3):277畫88,ChenYT，etal"ProcNatlAcadSciUSA.1997;94(5):1914-8.，HarrisCC.,JNatlCancerInst.1996;88(20):1442-55"ButterfieldLH，etal.，CancerRes.1999;59(13):3134畫42.,VissersJL,etal.,CancerRes.1999;59(21):5554隱9.,vanderBurgSH,etal.,JImmunol.1996;156(9):3308-14.，TanakaF，etal.,CancerRes.1997;57(20):4465-8.,FujieT,etal.,IntJCancer.1999;80(2):169-72.,KikuchiM,etal.，IntJCancer.1999;81(3):459-66.，OisoM,etal.，IntJCancer.1999;81(3):387-94.)。我們分析了作為HLA-A24限制性TAA表位的、來(lái)源于TOM34的肽，其中HLA-A24是日本人以及白人人群中常見(jiàn)的HLA等位基因之一(DateY，etal"TissueAntigens,1996;47:93-101.,KondoA,etal"JImmunol,1995;155:4307-12，KuboRT,etal.，JImmunol,1994;152:3913-24)。在本發(fā)明中，我們利用來(lái)自TOM34的HLA-A24限制性表位肽的候選物與HLA-A24的預(yù)測(cè)的結(jié)合親和力，對(duì)它們進(jìn)行了選擇。用負(fù)載有這些候選肽的DC體外刺激T細(xì)胞之后，使用TOM34-299肽(KLRQEVKQNL)(SEQIDNO;"成功地建立了針對(duì)負(fù)載肽的TISI細(xì)胞顯示強(qiáng)細(xì)胞毒活性的CTL。另外，來(lái)源于這些CTL的CTL克隆也顯示了針對(duì)內(nèi)源過(guò)高表達(dá)TOM34的HLA-A24陽(yáng)性結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的特異性細(xì)胞毒性。這些CTL克隆的細(xì)胞毒活性對(duì)于缺少HLA-24或耙TAA表達(dá)的細(xì)胞系不顯示，而且被非放射性靶顯著地抑制。這些結(jié)果強(qiáng)烈地提示TOM34是一種新的結(jié)腸癌TAA,而且TOM34-299是這種TAA的HLA-A24限制性特異表位肽。由于這種抗原在大多數(shù)結(jié)腸癌病例中過(guò)高表達(dá)并且與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)，它似乎是一種可用于結(jié)腸癌免疫療法的極好靶標(biāo)。TOM34-299的同源性分析顯示它與來(lái)自任何已知人基因產(chǎn)物的肽均無(wú)顯著的同源性。工業(yè)應(yīng)用性本文描述了通過(guò)激光捕獲解剖和全基因組cDNA^f效陣列的組合獲得的結(jié)腸癌基因表達(dá)分析，該分析鑒定了用于癌癥預(yù)防和治療的靶標(biāo)的特異性基因。根據(jù)這些差異表達(dá)的基因中的一部分的表達(dá)，本發(fā)明提供了用于鑒定和檢測(cè)CRC的分子診斷標(biāo)志物。本文所描述的方法還可用于鑒定其它分子靶標(biāo)，用于CRC的預(yù)防、診斷和治療。本文報(bào)道的數(shù)據(jù)增加了人們對(duì)CRC的全面理解，方便了新診斷策略的開(kāi)發(fā)，并且為鑒定治療劑和預(yù)防物質(zhì)的分子靶標(biāo)提供了線索。這些信息為深化對(duì)于結(jié)腸腫瘤發(fā)生的認(rèn)識(shí)作出了貢獻(xiàn)，并為診斷、治療及最終預(yù)防CRC的新策略的開(kāi)發(fā)提供了指標(biāo)。例如，阻斷TOM34表達(dá)或者阻止起活性的作用物質(zhì)具有作為抗癌劑，尤其是用于治療CRC的抗癌劑的治療效用。這樣的作用物質(zhì)的例子包括針對(duì)rOMW基因的反義寡核苷酸、小干擾RNA和核酶，以及識(shí)別TOM34的抗體?；蛘?，誘導(dǎo)強(qiáng)力和特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定，為各種癌癥類型中肽疫苗接種策略的臨床應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展提供了保證。另外，盡管已經(jīng)詳細(xì)地并且參考本發(fā)明的具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但可理解的是上述說(shuō)明書實(shí)際上是例示性和解釋性的，意欲闡明本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案。通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明并不意欲受到上述說(shuō)明的限定，而由如下權(quán)利要求及其等同物限定。權(quán)利要求1.一種診斷受試者中結(jié)腸癌或發(fā)生結(jié)腸癌的傾向性的方法，包括確定來(lái)源于患者的生物樣品中TOM34的表達(dá)水平，其中與該基因正常對(duì)照水平相比，所述樣品中表達(dá)水平的增加表明該受試者患有結(jié)腸癌或具有發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品表達(dá)水平比所述正常對(duì)照水平高至少10%。3.權(quán)利要求1的方法，其中基因表達(dá)水平通過(guò)選自下組的方法確定a)才企測(cè)TOM34的mRNA,b)檢測(cè)TOM34編碼的蛋白質(zhì)，和c)檢測(cè)TOM34的生物活性。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述來(lái)源于患者的生物樣品包括上皮細(xì)胞。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述來(lái)源于患者的生物樣品包括結(jié)腸癌細(xì)胞。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述來(lái)源于患者的生物樣品包括來(lái)自結(jié)腸癌細(xì)力包的上皮細(xì)月包。7.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使測(cè)試化合物與TOM34的多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測(cè)該多肽和測(cè)試化合物之間的結(jié)合活性；和c)選擇與該多肽結(jié)合的測(cè)試化合物。8.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使候選化合物與表達(dá)TOM34的細(xì)胞接觸；和b)選擇與不存在該候選化合物時(shí)4企測(cè)的TOM34表達(dá)水平相比，降低TOM34表達(dá)水平的候選化合物。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述細(xì)胞包括結(jié)腸癌細(xì)胞。10.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使測(cè)試化合物與TOM34的多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測(cè)步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇這樣的測(cè)試化合物與不存在該測(cè)試化合物時(shí)檢測(cè)的所述多肽的生物活性相比，該化合物抑制TOM34的多核普酸編碼的多肽的活性。11.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使候選化合物與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含TOM34的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域控制下表達(dá)的報(bào)道基因；b)測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性；和c)選擇降低所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性的候選化合物。12.—種試劑盒，其包含與(a)TOM34或與(b)TOM34編碼的多肽結(jié)合的檢測(cè)試劑。13.治療或預(yù)防受試者中的結(jié)腸癌的方法，包括給所述受試者施用反義組合物，所述反義組合物包含與TOM34編碼序列互補(bǔ)的核香酸序列。14.治療或預(yù)防受試者中的結(jié)腸癌的方法，包括給所述受試者施用siRNA組合物，其中siRNA組合物降低TOM34的表達(dá)。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述siRNA包括含有SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示核苷酸序列的有義鏈。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，,其中[A]為與SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示序列對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列，[B]為由3到23個(gè)核苷酸組成的核糖核苷酸環(huán)序列，[A，]為由[A]的互補(bǔ)序列組成的核;瞎核苷酸序列。17.治療或預(yù)防受試者中的結(jié)腸癌的方法，包括給所述受試者施用藥學(xué)有效量的與TOM34蛋白結(jié)合的抗體或其免疫活性片段的步驟。18.—種治療或預(yù)防受試者中的結(jié)腸癌的方法，包括給所述受試者施用疫苗，該疫苗包含(a)由TOM34的核酸編碼的多肽，(b)所述多肽的免疫活性片段，或(c)編碼該多肽或(b)所述的免疫活性片段的多核苷酸。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述免疫活性片段是以下二者或二者之一(i)包含SEQIDNO:7所示氨基S吏序列的十肽；(ii)具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中該肽包含其中取代或添加了1或2或數(shù)個(gè)氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列。20.—種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括使多肽、編碼該多肽的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體與抗原呈遞細(xì)胞接觸的步驟，其中所述多肽是由TOM34編碼的或者是該多肽的免疫活性片段。21.權(quán)利要求20的方法，其中免疫活性片段是以下二者或二者之一(i)包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的十肽；(ii)具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中該肽包含其中取代或添加了1或2或數(shù)個(gè)氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列。22.權(quán)利要求20的方法，其中該方法進(jìn)一步包括給受試者施用抗原呈遞細(xì)胞的步驟。23.—種治療或預(yù)防受試者中的結(jié)腸癌的方法，所述方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項(xiàng)的方法獲得的化合物的步驟。24.—種用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的針對(duì)TOM34的多核苷酸的反義多核苷酸或siRNA。25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述siRNA包括含有SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示核苷酸序列的有義鏈。26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]為與SEQIDNO:48或SEQIDNO:56所示序列對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列，[B]為由3到23個(gè)核苷酸組成的核糖核苷酸環(huán)序列，[A，]為由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苷酸序列。27.—種用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的與TOM34編碼的蛋白結(jié)合的抗體或其片段。28.—種用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項(xiàng)的方法選擇的化合物作為活性成分，以及藥學(xué)可接受的載體。29.包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的十肽。30.—種具有細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽，其中該肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列，其中取代或添加了1或2或數(shù)個(gè)氨基酸。31.權(quán)利要求30的肽，其中從N末端起第二個(gè)氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、曱碌u氨酸或色氨酸。32.權(quán)利要求30的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸。33.—種用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求29或30的肽作為活性成分。全文摘要本文描述了檢測(cè)和診斷結(jié)腸癌的客觀方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷方法涉及確定在結(jié)腸癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間有區(qū)別的TOM34的表達(dá)水平。最后，本發(fā)明提供了篩選結(jié)腸癌中有用的治療劑的方法，治療結(jié)腸癌的方法以及接種受試者抗結(jié)腸癌的方法。文檔編號(hào)G01N33/574GK101278196SQ20068003538公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2006年7月21日優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日發(fā)明者中村佑輔,古川洋一,松島敏志,田原秀晃,角田卓也申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司