專利名稱：利用熒光顯微鏡的競(jìng)爭(zhēng)性粒子免疫測(cè)定法的制作方法
利用熒光顯微鏡的竟?fàn)幮粤Ｗ用庖邷y(cè)定法 相關(guān)申請(qǐng)資料本申請(qǐng)要求于2005年5月11日提交的美國(guó)專利'臨時(shí)申請(qǐng)第 60/679,717號(hào)的權(quán)益，該申請(qǐng)內(nèi)容以其整體在此引作參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及測(cè)量樣品中的被分析物的方法，更具體地講，涉 及用竟?fàn)幮粤Ｗ用庖邷y(cè)定測(cè)量—皮分析物的方法。發(fā)明背景基于某些可觀測(cè)的品質(zhì)進(jìn)行禽蛋判別，這在家禽業(yè)是眾所周知和 長(zhǎng)期使用的實(shí)行方法。"照蛋"是一種這類技術(shù)的常用名詞，是來(lái)源 于用蠟燭光檢查蛋這一習(xí)慣的術(shù)語(yǔ)。正如熟悉蛋的人所知，盡管蛋殼 在最好的照明條件下似乎不透明，但實(shí)際上其有些半透明，當(dāng)將其置 于直射光前時(shí)，可看到蛋的內(nèi)容物。在孵化室管理中，可能理想的是基于諸如性別、疾病、遺傳性狀 等等不同特性來(lái)分開(kāi)禽類。舉例而言，可能理想的是用特定疫苗接種 雄性禽類，而用不同疫苗接種雌性禽類。在孵化時(shí)由于其它原因分開(kāi) 禽類性別也可能^[艮重要。例如，因?yàn)樾坌曰痣u和雌性火雞的生長(zhǎng)率和 營(yíng)養(yǎng)需求不同，習(xí)慣上按性別來(lái)分離火雞。在產(chǎn)蛋雞或食用蛋工業(yè)， 理想的是只保留雌性。在肉用仔雞工業(yè)，理想的是基于性別將雞分開(kāi) 以增進(jìn)飼養(yǎng)效率、改進(jìn)加工的 一致性和降低生產(chǎn)成本。不幸的是，鳥(niǎo)類性別鑒定的常規(guī)方法可能花費(fèi)大、勞動(dòng)強(qiáng)度大、 費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，通常需要訓(xùn)練有素的專門(mén)技術(shù)人員。鳥(niǎo)類性別鑒定的常規(guī)方 法包括羽毛鑒定性別法、肛門(mén)鑒定性別法和DNA或血液鑒定性別法。 每小時(shí)約可經(jīng)羽毛鑒定三千只(3,000)雞的性別，每只雞花費(fèi)約0.7-2.5美分。每小時(shí)約可經(jīng)肛門(mén)鑒定一千五百只(1,500)雞的性別，每只雞花 費(fèi)約3.6-4.8美分。通過(guò)分析采自禽的小量血液樣品，可實(shí)施DNA或 血液鑒定性別法。理想的是在孵化前鑒別禽類性別以及禽類的其它特性。孵化前性 別鑒定可顯著降低家禽業(yè)各個(gè)環(huán)節(jié)的成本。盡管常規(guī)照蛋技術(shù)能比較 有效地區(qū)分活蛋和死蛋，但這些常規(guī)照蛋技術(shù)不能可靠地測(cè)定未孵化 的禽類的性別和其它特性。發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供檢測(cè)樣品中被分析物存在情況的方法，其包括 使樣品、結(jié)合有竟?fàn)巹┓肿拥亩喾N微粒、和特異性結(jié)合被分析物的熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白混合在一起；讓該混合物在容器中放置一段足以讓微粒沉降的時(shí)間；和經(jīng)由熒光顯微鏡方法，通過(guò)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)視野中熒光標(biāo)記的沉降微粒的數(shù)量并將熒光標(biāo)記的微粒數(shù)量與預(yù)定值比較，來(lái)測(cè)定樣品中被分析物的存在情況，其中數(shù)量低于預(yù)定值說(shuō)明樣品中存在高于閥值水平的被分析物。本發(fā)明也提供測(cè)定蛋中禽胚胎性別的方法，其包括使來(lái)自禽蛋的尿嚢液樣品與結(jié)合有竟?fàn)巹┓肿拥亩喾N微粒和特異性結(jié)合雌激素類固醇化合物的熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白混合在一起； 讓該混合物在容器中放置一段足以讓微粒沉降的時(shí)間；和 經(jīng)由熒光顯微鏡方法，通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記的沉降微粒，來(lái)測(cè)定樣品中雌激素類固醇化合物的存在情況，其中樣品中存在高于閥值量的雌激素類固醇化合物說(shuō)明禽胚胎為雌性。本發(fā)明另 一方面提供檢測(cè)樣品中被分析物存在情況的方法，其包括使液態(tài)樣品、結(jié)合有竟?fàn)巹┓肿拥亩喾N能漂浮的孩i粒、和特異性 結(jié)合被分析物的熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白混合在一起；讓該液態(tài)混合物在容器中》丈置一段足以讓能漂浮的微粒漂浮到靠近液態(tài)混合物表面的時(shí)間；和經(jīng)由熒光顯微鏡方法，通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記的微粒數(shù)量并將熒光標(biāo) 記的微粒數(shù)量與預(yù)定值比較，來(lái)測(cè)定樣品中被分析物存在情況，其中 數(shù)量低于預(yù)定值說(shuō)明液態(tài)樣品中存在高于閥值量的被分析物。附圖簡(jiǎn)述

圖1為闡明按本發(fā)明實(shí)施方案測(cè)定樣品中被分析物存在情況的方 法的流程圖。圖2為可用于實(shí)施本發(fā)明實(shí)施方案的例示性樣品盤(pán)的俯視圖。圖3為闡明孔底部高度的可變性的例示性樣品盤(pán)的側(cè)視圖。圖4為闡明按本發(fā)明實(shí)施方案測(cè)定禽蛋尿嚢液樣品中雌激素類固醇化合物存在情況的方法的流程圖。圖5為闡明按本發(fā)明實(shí)施方案用能漂浮微粒測(cè)定液態(tài)樣品中被分析物存在情況的方法的流程圖。發(fā)明詳述現(xiàn)在將在下文中參考附圖更全面地闡述本發(fā)明，其中展示優(yōu)選的 本發(fā)明實(shí)施方案。然而，本發(fā)明可以不同形式來(lái)具體化，不應(yīng)該解釋 為局限于本文提出的實(shí)施方案；相反，提供這些實(shí)施方案是為了向本領(lǐng)域技術(shù)人員完全徹底和全面地傳達(dá)本發(fā)明范圍。全文中相同的編號(hào) 指相同的要素。在各圖中，為了清楚起見(jiàn)可能夸大了某些線條、層次、 成分、要素或特征的厚度。除非另外所指，否則虛線說(shuō)明任選的特征 或操作。本文所用術(shù)語(yǔ)僅為了闡述具體實(shí)施方案的目的，并非意欲限制本 發(fā)明。除非上下文明確指出另有所指，否則本文所用的單數(shù)形式"a"、 "an"、"所述"意欲也包括復(fù)數(shù)。應(yīng)該進(jìn)一步理解，當(dāng)術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括"等等用于本說(shuō)明書(shū)中時(shí)，其指定所述特征、整數(shù)、步驟、操 作、要素和/或成分存在，但并非排除一種或多種其它特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、成分和/或其組群(group)的存在或加入。本文所用術(shù)語(yǔ)"和/或"包括一種或多種所列相關(guān)項(xiàng)目的任意組合和所有組合。本文所用措辭例如"在X和Y之間"和"在約X和Y之間，，應(yīng)該解釋 為包括X和Y。本文所用措辭例如"在約X和Y之間"意即"在約 X和約Y之間，，。本文所用措辭例如"約X-Y，，意即"約X-約Y，，。除非另外定義，否則本文所用的所有術(shù)語(yǔ)(包括科技術(shù)語(yǔ))具有與 本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解相同的含義。應(yīng)該進(jìn)一步理 解，除非本文特別定義，否則術(shù)語(yǔ)(例如在常用字典中定義的那些術(shù)語(yǔ)) 應(yīng)解釋為具有與其在說(shuō)明書(shū)上下文和相關(guān)領(lǐng)域中 一致的含義，而不應(yīng) 該解釋為理想化的和過(guò)于正式的含義。為了簡(jiǎn)潔和/或清楚起見(jiàn)，可能 不詳細(xì)闡述眾所周知的功能或構(gòu)建。應(yīng)該理解，當(dāng)提到一種要素位于另一種要素"上"、"附著，，于 另一種要素、與另一種要素"連接"、"偶聯(lián)"、"接觸"等等時(shí)， 其可能直接位于該另一要素之上、附著于另一要素、直接與另一要素 連接、偶聯(lián)或接觸，或也可存間插要素。與此相反，當(dāng)提及一種要素 例如"直接位于另一種要素之上"、"直接附著于另一種要素，，、與 另一種要素"直接連接""直接偶聯(lián)"或"直接接觸"時(shí)，沒(méi)有間插 要素存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)該了解，提及一種結(jié)構(gòu)或特征被置于 另一種特征"鄰近"時(shí)，則可能有重疊或位于該接近特征之下的部分。相對(duì)空間術(shù)語(yǔ)例如"在……之下"、"在……下面，，、"低于，，、 "在……之上"、"上面的"等等，可用于本文靈活描述，以闡述如 各圖中所闡明的一種要素或特征與另外的要素或特征的相互關(guān)系。應(yīng) 該理解，除了各圖中描述的方位外，相對(duì)空間術(shù)語(yǔ)意欲包括設(shè)備在使 用或操作中的不同方位。例如，若將圖中的設(shè)備倒置，則被闡述為在 其它要素或特征"之下"或"下面"的要素，將會(huì)定位為在其它要素 或特征"之上"。因此，例示性術(shù)語(yǔ)"在……之下，，可包括"在……之上"和"在……之下"兩種情況。設(shè)備可按其它方式定位(旋轉(zhuǎn)90 度或以另外的方位)，本文所用的相對(duì)空間描述語(yǔ)應(yīng)相應(yīng)解釋。同樣地， 除非另外明確指出，否則術(shù)語(yǔ)"向上"、"向下"、"垂直"、"水 平，，等等在本文中僅用于解釋。應(yīng)該理解，盡管術(shù)語(yǔ)"第一，，、"第二"等等在本文中可用于闡 述各種要素、成分、區(qū)域、層次和/或部分，但這些要素、成分、區(qū)域、 層次和/或部分不應(yīng)該受這些術(shù)語(yǔ)限制。這些術(shù)語(yǔ)僅僅用于將一種要 素、成分、區(qū)域、層次或部分與另一種區(qū)別開(kāi)。因此，以下討論的"笫 —"要素、成分、區(qū)域、層次或部分也可稱為"第二，，要素、成分、 區(qū)域、層次或部分而并不偏離本發(fā)明的教導(dǎo)。除非另外明確指出，否 則操作(或步驟)次序不限于后附權(quán)利要求或附圖中所呈現(xiàn)的次序。本發(fā)明實(shí)施方案提供快速廉價(jià)的檢測(cè)被分析物的方法。本發(fā)明的 實(shí)施方案適合涉及最小樣品處理和操作的高通量自動(dòng)操作?，F(xiàn)參看圖1，其闡明了按本發(fā)明某些實(shí)施方案檢測(cè)樣品中被分析物存在情況的方法。獲得樣品^H"料(框io)，然后使其與結(jié)合有竟?fàn)巹┓肿拥奈⒘：吞禺愋越Y(jié)合被分析物的熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白混合在一起(框20)。樣品實(shí)際上可自任何來(lái)源得到，包括有機(jī)材料和無(wú)機(jī)材料，在特 定實(shí)施方案中，可為生物樣品(例如來(lái)自受驗(yàn)者或禽蛋)。例示性生物 樣品包括生物流體和組織，其包括但不限于尿、糞、血液、血漿、血 清、淋巴、腦脊髓液、乳汁、尿嚢液、卵黃、羊水、胚下液、組織、 組織勻漿和它們的混合物。就禽蛋而言，例示性樣品材料可得自尿嚢 液、血液、羊水、組織、組織勻漿等等或任一前述材料的提取物。在其它實(shí)施方案中，樣品可為土壤樣品、水樣、廢水樣品等等， 或任一前述樣品的提取物。本發(fā)明的實(shí)施方案并不限于胚胎發(fā)育期間特定天數(shù)(例如第11天) 的禽蛋。按照本發(fā)明的特定實(shí)施方案，樣品來(lái)自蛋內(nèi)(/w ovo)孵化(即 胚胎發(fā)育)的后半段、笫四分之三段、第四分之四段的蛋。例如，對(duì)于雞蛋而言，孵化的后半段為孵化的約第10天到第20天，蛋內(nèi)孵化的 第四分之三段為孵化的約第IO天到第14天，蛋內(nèi)孵化的第四分之四 段為孵化的約第15天到第20天。在具體實(shí)施方案中，樣品來(lái)自蛋內(nèi) 孵化約第十八天或第十九天的雞蛋。在其它實(shí)施方案中，樣品采自孵 化約第十四天到第二十七天、孵化約第十四天到第二十天、孵化約第 二十一天到第二十七天、孵化約第二十五天或第二十六天的火雞蛋。另外，本發(fā)明實(shí)施方案的方法可用于任何種類的禽蛋，包括但不 限于雞蛋、火雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鵪鶉蛋、野雞(pheasant)蛋、鶴(crane) 蛋、長(zhǎng)尾小鸚鵡(parakeet)蛋、鸚鵝蛋等等?？梢圆煌襟E使樣品、微粒和結(jié)合蛋白混合。例如，可首先使樣 品和結(jié)合蛋白混合在一起，然后將微粒加入到樣品-結(jié)合蛋白混合物。 然而，本發(fā)明的實(shí)施方案并不限于將這些成分混合在一起的任何特定 次序?？蓪⒒旌衔飪?chǔ)存一段時(shí)間(框30)，盡管這一步并非在所有實(shí)施方 案中都是必不可少。按照某些實(shí)施方案，可將混合物儲(chǔ)存約l分鐘-約45分鐘。按照其它實(shí)施方案，可將混合物儲(chǔ)存比60分鐘更長(zhǎng)的時(shí) 間(例如約2-6小時(shí)或約3-4小時(shí))。然后將混合物在容器中放置一段足以讓微粒沉降到混合物底部的 時(shí)間(框40)。本文所用術(shù)語(yǔ)"沉降"意即微?；旧铣练e在容器底部。 微粒沉降所需時(shí)間隨微粒和樣品而變，這一點(diǎn)可為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 理解。舉例而言，為了使微粒沉降，具有高粘度的混合物可能比具有低粘度的混合物需要更長(zhǎng)的時(shí)間。置于容器中的混合物的量實(shí)質(zhì)上可為任意量。例示性的量可為約1 pl至25、 50、 100或250inl。容器實(shí)質(zhì)上可為能保留混合物的任何類型的裝置。例示性容器包 括但不限于顯微鏡玻片、樣品孔等等。在具體實(shí)施方案中，容器為多 孔板的孔，例如4孑L板、12孔板、24孔板、96孔板、384孔板或1536孔板的孔。該方法可用于一次檢測(cè)一個(gè)容器中被分析物的存在情況， 或作為選擇，檢測(cè)多個(gè)容器(例如在多孔板中)中被分奸物的存在情況。 因?yàn)槿缦滤越?jīng)由熒光顯微鏡方法來(lái)觀察混合物，所以容器的一 個(gè)或多個(gè)部分通常為光學(xué)透明的。例如，若容器為孔，則孔底部分通 常為光學(xué)透明的，以便可通過(guò)孔底觀察到混合物，和/或?qū)旌衔锍上瘛?在通過(guò)孔頂觀察/成像情況下，孔頂應(yīng)該為光學(xué)透明的。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)之一為其可用常規(guī)熒光顯微鏡方法來(lái)施行，藉此避 免了需要與其它技術(shù)有關(guān)的更昂貴的設(shè)備，例如共焦顯微鏡。因此，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明方法不使用共焦顯微鏡。本發(fā)明方法的另 一優(yōu)勢(shì)為除了通過(guò)如上所述使微粒沉降來(lái)達(dá)到分 離之外，不需要將未結(jié)合的標(biāo)記結(jié)合蛋白與微粒分離。一旦微粒沉降，經(jīng)由熒光顯微鏡方法，通過(guò)檢測(cè)與沉降微粒結(jié)合的熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白，可測(cè)定樣品中被分析物存在情況(框50)。按照本發(fā)明的實(shí)施方案， 一皮分析物的測(cè)定在本質(zhì)上與其說(shuō)定量， 不如說(shuō)是定性。例如，在具體實(shí)施方案中，定性測(cè)定樣品中的雌激素 類固醇化合物可用于測(cè)定禽胚胎是雄性還是雌性，而不必為了定量樣 品中的雌激素類固醇化合物使用昂貴的顯微鏡技術(shù)。另外，按照本發(fā)明，不必定量未結(jié)合的熒光(即本底)和/或定量已 結(jié)合的熒光和/或測(cè)定這兩個(gè)值之間的比率或差值。因此，在具體實(shí)施 方案中，本發(fā)明方法并不定量未結(jié)合的熒光(即本底)，和/或并不定量 已結(jié)合的熒光，和/或不測(cè)定這兩個(gè)值的比率或差值。本文所用術(shù)語(yǔ)例如"定量"、":定量的"等具有本領(lǐng)域通常理解 的含義，例如涉及測(cè)定指定物質(zhì)的量(例如重量和/或濃度)。在具體實(shí)施方案中，通過(guò)與截止值比較來(lái)測(cè)定被分析物的存在情于截止值則說(shuō)明存在高于閥值的被分析物。例如，在通過(guò)檢測(cè)胚胎液 (例如血液或尿嚢液)中的雌激素類固醇化合物來(lái)測(cè)定蛋中禽胚胎性別 的本發(fā)明方法中，高于截止值的熒光說(shuō)明為雄性胚胎(即胚胎液中雌激素類固醇化合物水平低)，低于截止值的熒光說(shuō)明為雌性胚胎(即胚胎 液中雌激素類固醇化合物水平相對(duì)較高)。本發(fā)明方法可用于進(jìn)行其它 的定性測(cè)定，例如樣品中是否存在高于閥值量的污染物、病原體或管 制物質(zhì)。在其它代表性實(shí)施方案中，本發(fā)明用于通過(guò)檢測(cè)抗原(例如表面抗 原)或特異性結(jié)合病原體的抗體來(lái)測(cè)定樣品中病原體的存在情況。舉例 說(shuō)明，該方法可用于檢測(cè)血液、血清或血漿或來(lái)自蛋的胚胎液(例如卵 黃、血液、羊水、尿嚢液)中的抗原或抗體，以便分別測(cè)定個(gè)體受驗(yàn)者、 母親例如產(chǎn)蛋雌禽(即在母源抗體情況下)和/或禽群或動(dòng)物受驗(yàn)者中是 否存在病原體和/或先前接觸病原體。例如，可檢測(cè)禽蛋卵黃中或孵化后的禽受驗(yàn)者的血液、血漿或血清中禽流感抗體(即母源抗體)存在情況，以確定受驗(yàn)者、產(chǎn)蛋雌禽(即 在母源抗體情況下)和/或禽群中是否存在禽流感和/或先前接觸禽流感。作為另一實(shí)例，可檢測(cè)水樣或孵化后禽或蛋內(nèi)禽的血液、血漿或 血清中禽流感表面抗原的存在情況，以確定受驗(yàn)者、產(chǎn)蛋雌禽(即在母 源抗體情況下)和/或禽群中是否存在禽流感和/或先前接觸禽流感?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知任何手段測(cè)定截止值，其任選為預(yù)定值。在具 體實(shí)施方案中，截止值是預(yù)先確定的，意即例如其基于先前對(duì)存在的 已知量被分析物的測(cè)定和/或先前的分析而固定。或者，術(shù)語(yǔ)"預(yù)定" 值也可指，即使在測(cè)定中相同被分析物的具體數(shù)值變化不定，或甚至 可在每次測(cè)定中測(cè)定，得到截止值的方法是預(yù)先確定或固定的。例如， 可由已知陰性和/或陽(yáng)性對(duì)照4羊品來(lái)確定截止值。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，測(cè)定^^皮分析物存在情況的方法包括通過(guò) 熒光顯微鏡法在一個(gè)或多個(gè)顯微鏡視野中計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記的微粒數(shù)或 對(duì)其"打分"。若熒光水平超過(guò)顯微鏡的檢測(cè)設(shè)置，和/或超過(guò)用于評(píng) 估顯微鏡所捕獲圖像的圖像處理系統(tǒng)設(shè)置的檢測(cè)水平，則微粒被計(jì)數(shù) 或記錄為熒光陽(yáng)性。按照本發(fā)明這一實(shí)施方案，不必量化結(jié)合于每種微粒的熒光(即標(biāo)記的結(jié)合蛋白)的量，和/或不必量化未結(jié)合的本底熒 光的量。不論是結(jié)合于微粒的標(biāo)記蛋白的量還是保持未結(jié)合的標(biāo)記蛋 白的量，所有熒光微粒都記錄為熒光陽(yáng)性。熒光微粒數(shù)超過(guò)截止值說(shuō) 明不存在被分析物，或以低濃度存在(即不存在超過(guò)閥值量的)。焚光 微粒數(shù)低于截止值則說(shuō)明樣品中存在超過(guò)閥值量的被分析物。例如， 就通過(guò)測(cè)定雌激素類固醇化合物的存在情況來(lái)確定蛋內(nèi)禽胚胎性別 的方法而言，若熒光微粒數(shù)超過(guò)截止值，則說(shuō)明存在低于閥值量的低 水平雌激素類固醇化合物，胚胎為雄性。若焚光微粒數(shù)低于截止值， 則說(shuō)明存在超過(guò)閥值量的相對(duì)高濃度的雌激素類固醇化合物，胚胎為 雌性。因此，本發(fā)明方法可用于無(wú)需定量已結(jié)合熒光量和/或無(wú)需定量 未結(jié)合熒光量就可提供肯定/否定結(jié)果的測(cè)定(例如，測(cè)定雄性/雌性或 存在/不存在超過(guò)閥值的被分析物)中。可實(shí)施該方法，以使根據(jù)所期需的最終結(jié)果，在落在截止值上或 其附近的熒光微粒數(shù)可被記錄為表明是否存在超過(guò)閥值量的被分析 物。例如，在區(qū)分禽蛋性別情況下，如果將某些雌鳥(niǎo)誤分類為雄鳥(niǎo)更 為有利，則將落在截止值上或與之非?？拷闹涤涗洖樾坌?。按照一種典型的測(cè)定方法，測(cè)定多種樣品的熒光記分分布，截止 值可設(shè)定在分布內(nèi)的任一點(diǎn)，例如通過(guò)用本領(lǐng)域已知統(tǒng)計(jì)學(xué)方法例如"聚類分析"來(lái)設(shè)定。在具體實(shí)施方案中，截止值設(shè)定在其中大約50% 樣品低于截止值而大約50%樣品高于截止值這樣的點(diǎn)。該實(shí)施方案尤 其適于測(cè)定其中有兩相分布的被分析物?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知任何方法 測(cè)定樣品值分布，例如，其可基于集合多次測(cè)定的結(jié)果，或可內(nèi)部測(cè) 定，即基于一次測(cè)定。聚類分析指多種多變量技術(shù)，其目的在于將對(duì)象放在根據(jù)數(shù)據(jù)提 示的組群中，以便一個(gè)聚類內(nèi)的對(duì)象相似，而不同聚類內(nèi)的對(duì)象不相 似。盡管組群的成員可能已被指定，或提供了組群全體成員數(shù)量實(shí)例， 但聚類分析并不設(shè)想預(yù)先已知組群的數(shù)量或全體成員。聚類分析可用 于給變量(通常采用皮爾遜相關(guān))或觀測(cè)量(case)(通常采用平方歐氏距離(距離平方之和))分組。聚類可為重疊、不相交、層次或沖莫糊聚類。 聚類分析可用于分析區(qū)間數(shù)據(jù)、計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)或二元數(shù)據(jù)，若使用不同變 量，則在分析之前可將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。常使用的聚類分析技術(shù)為(l)K-均值聚類 一種迭代法，其中每一步將觀測(cè)量以最接近的中心分為聚 類，重新計(jì)算聚類中心，繼續(xù)進(jìn)行直到中心不再發(fā)生變化，或直到達(dá) 到迭代的最大次數(shù)；(2)層次聚類 一種凝聚法，其中開(kāi)始時(shí)將最靠近 的一對(duì)對(duì)象合并為一類，隨后每一步合并對(duì)象對(duì)、聚類對(duì)或聚類中的 對(duì)象，直到所有數(shù)據(jù)聚類到 一起成為樹(shù)狀圖(樹(shù))。'在具體實(shí)施方案中， 用Ward氏最小方差法(兩個(gè)聚類之間的距離為點(diǎn)與形心偏差平方之 和；目的為將類中平方和減為最小)的層次聚類來(lái)選擇截止值?？赏ㄟ^(guò)眼睛或作為替代用數(shù)字成像軟件來(lái)為熒光微粒打分，其在 本4頁(yè)i或眾戶斤周頭口(侈寸3口 National Instruments Image Builder, NIH Image, Cognex VisionPro)。在具體實(shí)施方案中，用機(jī)器視覺(jué)來(lái)給熒光微粒成 像。機(jī)器視覺(jué)使得可進(jìn)行自動(dòng)視覺(jué)檢查，機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)常規(guī)包括以下 組分圖像處理器(基于主機(jī)或內(nèi)置式)、顯示圖像的視頻監(jiān)測(cè)器、處 理和分析圖像的圖像軟件、用戶界面、照相機(jī)和照明設(shè)備。本發(fā)明領(lǐng) 域的技術(shù)人員可很好地理解機(jī)器視覺(jué)，不必在此作進(jìn)一步闡述。舉例說(shuō)明，當(dāng)使用Cognex VisionPro系統(tǒng)時(shí)，可使用斑點(diǎn)Blob發(fā) 現(xiàn)真法(Blob finding algorithm),該算法搜尋某種大小(以像素?cái)?shù)計(jì))的 像素斑點(diǎn)?；蛘?，可采用模板匹配算法。例如，可進(jìn)入單珠粒模板， 該算法可搜尋匹配模板的區(qū)域的圖像?？墒褂闷渌上穹?，包括^f旦不限于Wavefront Coding技術(shù)(CMD Optics, Inc., Boulder Colorado》根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，通過(guò)熒光顯微鏡方法測(cè)定樣品中被 分析物的存在情況，包括通過(guò)熒光顯微鏡成像獲得混合物的一個(gè)或多 個(gè)圖像。含有混合物的容器部分通常為光學(xué)透明的，以使可成像。例 如，若將樣品置于孔中，則孔底通常為光學(xué)透明的。得到孔中混合物 的孔底焦平面圖像。圖像中的熒光水平可用上述圖像分析軟件以自動(dòng)方式來(lái)測(cè)定。圖像中的微粒熒光高于截止值則說(shuō)明樣品中被分析物的 濃度低于閥值水平。相反，圖像中的微粒熒光低于截止值則說(shuō)明樣品 中被分析物的濃度超過(guò)閥值水平。作為選擇，在其它實(shí)施方案中，不用成像技術(shù)，通過(guò)熒光顯微鏡 法測(cè)定樣品中被分析物的存在情況，包括用可測(cè)定沉降微粒與顯微鏡 物鏡之間距離和/或改變距離顯微鏡系統(tǒng)焦距的距離(即自動(dòng)聚焦系統(tǒng)) 的任何技術(shù)。這樣的方法包括但不限于基于激光的距離測(cè)定系統(tǒng)(例如來(lái)自RAMCO Innovations USA的位移傳感器CD4系列)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，微粒通常為直徑約為3微米-約15 微米(3n-15|11)的球形珠。根據(jù)特定實(shí)施方案，微粒通常為直徑小于約 6微米(6^)的球形珠。例示性微粒材料包括但不限于聚苯乙烯、蜜胺、 尼龍、聚甲基丙烯酸曱酯(PMMA)、 二氧化硅、金、氧化鐵和其組合。 結(jié)合蛋白可為特異性結(jié)合^^皮分析物的任何蛋白質(zhì)或肽。合適的實(shí) 例包括但不限于抗體、受體、配體、底物、抗原、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞色 素P450、結(jié)合蛋白例如胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白、和本領(lǐng)域所知的 被分析物的任何其它特異性結(jié)合配偶體。合適結(jié)合蛋白的選擇通常視 感興趣的被分析物的性質(zhì)而定，其在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體， 包括抗體片段?？贵w或抗體片段不限于任何特定形式，可為雙特異性 抗體、人源化抗體、嵌合抗體或抗體片段，可進(jìn)一步為Fab片段、單 鏈抗體等等。例示性受體包括蛋白質(zhì)激素受體、生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子受體、 類固醇激素受體(例如雌激素類固醇化合物受體)、抗體受體等等。特異性結(jié)合雌激素類固醇化合物的結(jié)合蛋白包括^f旦不限于抗體、 雌激素類固醇化合物的受體和芳化酶。雌激素類固醇化合物的受體包 括雌激素受體(例如ERa和/或ER卩)。竟?fàn)巹┓肿涌蔀榕c^皮分析物竟?fàn)幗Y(jié)合熒光標(biāo)記結(jié)合蛋白的任何分 子。竟?fàn)帨y(cè)定為本領(lǐng)域所熟知，通?；跇悠分斜环治鑫锖鸵阎肿?竟?fàn)巹┓肿?之間竟?fàn)幗Y(jié)合結(jié)合蛋白。竟?fàn)巹┓肿雍捅环治鑫餆o(wú)需相 同(盡管在特定實(shí)施方案中為相同)，只要竟?fàn)巹┓肿咏Y(jié)合結(jié)合蛋白并 藉此減少被分析物與結(jié)合蛋白的結(jié)合即可，反之亦然。例如，在抗體 和/或受體情況下，被分析物和竟?fàn)巹┓肿涌梢圆煌?，只要二者皆能與 抗體或受體特異性結(jié)合(盡管不必有同樣的親和力或親合力)，并抑制 另外一個(gè)與抗體或受體結(jié)合。使分子固定或結(jié)合到微粒的方法在本領(lǐng) 域眾所周知。因此，根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合到微粒的竟?fàn)巹┓肿雍蜆悠分械谋环治?物竟?fàn)幗Y(jié)合熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白。若不存在任何被分析物，則標(biāo)記的 結(jié)合蛋白將與結(jié)合于微粒的竟?fàn)巹┓肿咏Y(jié)合，并將被檢測(cè)為微粒相關(guān) 熒光。隨著樣品中被分析物的濃度增加，由于其竟?fàn)幗Y(jié)合標(biāo)記的結(jié)合蛋白，熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白與孩i粒的結(jié)合將會(huì)減少。因此，微粒相關(guān)熒光的量通常與樣品中被分析物的量成反比。任一合適的熒光染料皆可用于標(biāo)記結(jié)合蛋白。按照本發(fā)明的實(shí)施方案，熒光染料可包括藻膽蛋白(例如r-藻紅蛋白、b-藻紅蛋白、別藻 藍(lán)蛋白和/或藻膽體)、羅丹明染料或其衍生物、熒光素染料或其衍生 物、Alexa Fluor⑧染料、BODIPY⑧染料、花青染料或其衍生物(例如 Cy-5、 Cy-5.5和Cy7)、德克薩斯紅和前述物質(zhì)的任意組合。熒光標(biāo)記 蛋白質(zhì)或肽的方法，例如通過(guò)使熒光染料分子結(jié)合于結(jié)合蛋白進(jìn)行標(biāo) 記，在本領(lǐng)域眾所周知，其易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)實(shí)施。作為另 一優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明不需定量未結(jié)合的和/或已結(jié)合的熒光和/ 或測(cè)定已結(jié)合的相對(duì)未結(jié)合的熒光標(biāo)記結(jié)合蛋白之間的差別。因此， 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在產(chǎn)生熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白期間不必分離游 離的標(biāo)記物，藉此避免昂貴費(fèi)力的程序，使得可使用不太昂貴的試劑。用本發(fā)明實(shí)施方案的方法可檢測(cè)樣品中的各種被分析物。生物樣 品中例示性的被分析物包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、細(xì)胞因子、肽類生 長(zhǎng)因子、類固醇激素、蛋白質(zhì)激素、病原體(例如通過(guò)檢測(cè)表面抗原和 /或毒素)、抗體等等。類固醇激素包括雌激素類固醇激素，其包括但不限于雌二醇、雌二醇17卩、雌酮、雌三醇和其綴合衍生物(conjugatedderivatives)。具體 的綴合衍生物包括但不限于雌二醇、雌二醇17(3和雌酮的葡糖苷酸和 硫酸酯衍生物，其包括雌二醇-3-葡糖苷酸、雌二醇-17-葡糖普酸和/ 或雌酮-3-葡糖苷酸。病原體包4舌細(xì)菌、原生動(dòng)物、酵母、真菌和病毒 病原體，包括但不限于賈第鞭毛蟲(chóng)屬(G/ara^)、沙門(mén)氏菌屬 (&r/wo"e〃a)、梭菌(C/( ^7'^fir)、艾美球蟲(chóng)屬(五/we/7cr)、大腸桿菌(五. a /,')、 i斤i成疫病病毒(Newcastle disease virus)、馬立克氏病病毒(Marek's disease vims)、4專染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus)、冗b感(例 如禽流感)、腔上嚢炎病毒(Bursal disease virus)等等。來(lái)自非生物來(lái)源(即不來(lái)自受驗(yàn)者)的例示性被分析物包括但不限 于環(huán)境污染物(例如排泄物、病原體、化學(xué)制品、蛋白質(zhì)激素、類固醇 激素包括雌激素類固醇化合物、生長(zhǎng)因子等等)、爆炸物(例如TNT) 和管制物質(zhì)(例如麻醉品，例如鴉片劑、THC和安非他明，或興奮劑 (performance-enhancing substances), 例如類固醇,包4舌力,激素禾口生長(zhǎng) 激素)。請(qǐng)參看圖2，其闡明了含有在其中以各種陣列形成的多個(gè)樣品孔 72的例示性樣品盤(pán)70。構(gòu)建各個(gè)樣品孔72以接受上述樣品混合物。 可按照本發(fā)明的實(shí)施方案使用含各種樣品孔構(gòu)造和陣列的樣品盤(pán)?？?用各種材料通過(guò)各種技術(shù)形成沖羊品盤(pán)。本發(fā)明不限于使用例示性樣品 盤(pán)70。如圖3所示，樣品盤(pán)70中孔72底部高度可變化。例示性孔72 的底部彼此相對(duì)可有不同高度(E1、 E2、 E3)。為了補(bǔ)償這一點(diǎn)，測(cè)定 各孔的中值底部高度，然后于焦平面獲得孔中混合物的至少兩個(gè)圖 像，其中所述焦平面分別具有高于和低于中值高度的高度。然后如上 所述分析微粒熒光的圖像。本發(fā)明這方面對(duì)于其中孔底部高度可更多 變的較為價(jià)廉的樣品盤(pán)(例如熱成型多孔板)尤其有用。按照本發(fā)明的其它實(shí)施方案，測(cè)定各個(gè)孔底部高度中值。于高度 分別高于和低于中值高度的焦平面獲得孔中混合物的的至少兩個(gè)圖 像，獲得孔中混合物的各孔底部焦平面的圖像。然后如上所述分析微 粒熒光的圖像。在代表性實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于測(cè)量禽蛋樣品的目標(biāo)被分析 物(例如病原體、抗體、激素、生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)、肽等等)。本發(fā)明 的實(shí)施方案尤其適用于測(cè)定禽蛋胚胎性別。此外，本發(fā)明的實(shí)施方案 可緩解與目前性別鑒定技術(shù)有關(guān)的問(wèn)題，其包括但不限于試劑費(fèi)用、 處理費(fèi)用、設(shè)備費(fèi)用、設(shè)備復(fù)雜性和測(cè)定速度。請(qǐng)參看圖4,其闡明了按本發(fā)明某些實(shí)施方案測(cè)定蛋內(nèi)禽胚胎性別的方法。獲得尿嚢液樣品(框110)，然后將其與結(jié)合有竟?fàn)巹┓肿?例如雌激素類固醇化合物，例如雌二醇)的微粒(例如5|Ll的聚苯乙烯珠粒)和特異性結(jié)合雌激素類固醇化合物的熒光標(biāo)記的(例如藻紅蛋白標(biāo)記)結(jié)合蛋白(例如單克隆抗體)混合在一起(框120)。可如上所述讓混合物 儲(chǔ)存一段時(shí)間(框130)。然后將混合物在容器(例如上述樣品盤(pán)的孔)中 放置一段足以讓微粒沉降到混合物底部的時(shí)間(框140)。 一旦微粒沉降 了 ，則經(jīng)由熒光顯微鏡方法通過(guò)檢測(cè)已結(jié)合到沉降微粒的熒光標(biāo)記結(jié) 合蛋白來(lái)測(cè)定樣品中雌激素類固醇化合物的存在情況(框150)。若樣品 中存在高水平的雌激素類固醇化合物(即雌性蛋)，則熒光標(biāo)記結(jié)合蛋 白表現(xiàn)出與珠粒弱結(jié)合。若樣品中存在低水平的雌激素類固醇化合物 (即雄性蛋)，則熒光標(biāo)記結(jié)合蛋白表現(xiàn)出與珠粒強(qiáng)結(jié)合。在按照本發(fā)明測(cè)定蛋內(nèi)禽胚胎性別的具體方法中，如上所述測(cè)定 了熒光標(biāo)記的沉降微粒數(shù)，也如上所述與截止值比較。熒光標(biāo)記的粒 子數(shù)低于截止值則說(shuō)明樣品中存在高于閥值量的雌激素類固醇化合 物，胚胎為雌性。在測(cè)定禽蛋中禽胚胎性別的代表性實(shí)施方案中，使來(lái)自禽蛋的尿 囊液樣品與結(jié)合有雌二醇的微粒(例如5p聚苯乙烯珠粒)和特異性結(jié)合雌二醇的熒光標(biāo)記單克隆抗體混合在一起?；蛘?，該方法可使用熒光 標(biāo)記的雌激素受體以檢測(cè)尿嚢液樣品中雌激素類固醇化合物的濃度。 按照具體實(shí)施方案，本發(fā)明方法相當(dāng)靈敏，可檢測(cè)樣品中低至約500、 250、 150、 100、 50 pg/ml或更低的雌激素類固醇化合物。當(dāng)被分析物為雌激素類固醇化合物時(shí)，該方法可進(jìn)一步包括處理 樣品以釋放未衍生化的化合物。例如，酶處理(例如葡糖普酸酶和/或 硫酸酯酶)可用于從雌二醇和雌酮的葡糖苷酸衍生物和硫酸酯衍生物 釋放雌二醇和雄酮，這些衍生物通?？稍诶缒驀耙褐邪l(fā)現(xiàn)。請(qǐng)參看圖5，其闡明了按本發(fā)明某些實(shí)施方案檢測(cè)樣品中被分析 物存在情況的方法。獲得液態(tài)樣品材料(框210)，然后使其與能漂浮的 結(jié)合有竟?fàn)巹┓肿拥奈⒘：吞禺愋越Y(jié)合被分析物的熒光標(biāo)記結(jié)合蛋 白混合在一起(框220)?；旌衔锟扇缟纤鰞?chǔ)存一段時(shí)間(框230)。然 后將混合物在容器(例如上述樣品盤(pán)孔)中放置一段足以讓能漂浮的微 粒漂浮到液態(tài)混合物表面附近的時(shí)間(框240)。 一旦微粒漂浮到表面附 近，則經(jīng)由熒光顯微鏡方法通過(guò)檢測(cè)結(jié)合到微粒的熒光標(biāo)記結(jié)合蛋 白，測(cè)定樣品中被分析物的存在情況(框250)。在這種情況下，通過(guò)容 器(例如樣品孔)的開(kāi)口端來(lái)實(shí)施熒光顯微鏡方法。在加入試劑之后，本發(fā)明實(shí)施方案不需對(duì)樣品進(jìn)行處理。測(cè)定結(jié) 果可直接從樣品容器中讀取。另一優(yōu)勢(shì)是在具體實(shí)施方案中，儀器可 為相對(duì)易于維護(hù)的設(shè)備用卣素或LED照明的常規(guī)顯微鏡系統(tǒng)。上文闡明了本發(fā)明，其不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。盡管業(yè)已闡 述了本發(fā)明的幾個(gè)例示性實(shí)施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解， 在本質(zhì)上不偏離本發(fā)明的新穎教導(dǎo)和優(yōu)勢(shì)的情況下，可以對(duì)例示性實(shí) 施方案進(jìn)行很多修改。因此，所有這樣的修改意欲包括在權(quán)利要求所 界定的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明由以下權(quán)利要求來(lái)界定，其中包括所述 權(quán)利要求的等同方案。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中被分析物存在情況的方法，其包括使樣品、多種結(jié)合有競(jìng)爭(zhēng)劑分子的微粒、和特異性結(jié)合被分析物的熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白混合在一起；讓所述混合物在容器中放置一段足以讓所述微粒沉降的時(shí)間；和經(jīng)由熒光顯微鏡方法，通過(guò)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)視野中熒光標(biāo)記的沉降微粒數(shù)量并將所述熒光標(biāo)記的微粒數(shù)量與預(yù)定值比較，來(lái)測(cè)定所述樣品中所述被分析物的存在情況，其中數(shù)量低于預(yù)定值則說(shuō)明所述樣品中存在高于閥值水平的所述被分析物。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述容器包括顯微鏡玻片。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述容器包括孔，其中所述孔的底部為光學(xué)透明的，其中所述微粒^:降到所述孔底。
4. 權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括在將所述混合物置于容器之 前將所述混合物儲(chǔ)存一段時(shí)間。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中儲(chǔ)存包括使所述混合物儲(chǔ)存約1分鐘 -約45分鐘(l min. - 45 min.)。
6. 權(quán)利要求4的方法，其中儲(chǔ)存包括使所述混合物儲(chǔ)存超過(guò)約60 分鐘(60 min.)。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品為生物樣品。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述生物樣品來(lái)自禽蛋。
9. 權(quán)利要求7的方法，其進(jìn)一步包括在所述混合步驟之前獲得所 述生物樣品。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中所述生物樣品包括選自尿嚢液、卵 黃、尿、糞、血液、血漿、血清、羊水、胚下液、淋巴、腦脊髓液、 乳汁、組織、組織勻漿和其組合的材料。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒包括直徑小于約6微米(6n) 的大體^求形的J朱粒。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒包括直徑為約3-15微米(3p -15^1)的的大體球形的珠粒。
13. 權(quán)利要求l的方法，其中所述微粒包括選自聚苯乙烯、蜜胺、 尼龍、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、 二氧化硅、金和氧化鐵的材料。
14. 權(quán)利要求l的方法，其中所述結(jié)合蛋白為抗體。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體為多克隆抗體。
17. 權(quán)利要求l的方法，其中所述結(jié)合蛋白為受體。
18. 權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白用選自藻 膽蛋白、羅丹明染料或其衍生物、熒光素染料或其衍生物、Alexa Fluor⑧染料、BODIPY⑧染料、花青染料或其衍生物和德克薩斯紅的熒 光染沖+標(biāo)記。
19. 權(quán)利要求1的方法，其中所述被分析物選自蛋白質(zhì)、肽、肽 類生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、類固醇激素、蛋白質(zhì)激素、抗體、病原體、 環(huán)境污染物、爆炸物和違法物質(zhì)。
20. 權(quán)利要求l的方法，其中所述被分析物為選自雌二醇、雌酮、 雌二醇綴合衍生物、雌酮綴合衍生物和其組合的雌激素類固醇化合 物。
21. 權(quán)利要求1的方法，其中所述混合步驟包括首先使所述樣品 和結(jié)合蛋白混合在一起，隨后將所述微粒加入到所迷樣品-結(jié)合蛋白混 合物中。
22. 權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)由熒光顯微鏡方法測(cè)定所述 樣品中所述被分析物存在情況的步驟，包括經(jīng)由熒光顯微鏡成像而得 到所述混合物的一個(gè)或多個(gè)圖象。
23. 權(quán)利要求3的方法，其中經(jīng)由熒光顯微鏡方法測(cè)定所述樣品 中所述被分析物存在情況包括測(cè)定所述孔底的中值高度；和于高度分別高于和低于所述中值高度的焦平面獲得所述孔中混合 物的至少兩個(gè)圖像。
24. 權(quán)利要求3的方法，其中經(jīng)由熒光顯微鏡方法測(cè)定所述樣品 中所述被分析物存在情況包括測(cè)定所述孔底的中值高度；于高度分別高于和低于所述中值高度的焦平面獲得所述孔中混合 物的至少兩個(gè)圖像；和獲得所述孔中混合物的孔底焦平面圖像。
25. 權(quán)利要求3的方法，其中經(jīng)由熒光顯微鏡方法測(cè)定所述樣品 中所述被分析物存在情況包括獲得所述孔中混合物的孔底焦平面圖 像。
26. —種測(cè)定蛋中禽胚胎性別的方法，其包括使來(lái)自禽蛋的尿嚢液樣品與多種結(jié)合有竟?fàn)巹┓肿拥奈⒘：吞禺?性結(jié)合雌激素類固醇化合物的熒光標(biāo)記結(jié)合蛋白混合在一起；讓所述混合物在容器中放置一段足以讓所述微粒沉降的時(shí)間；和 經(jīng)由熒光顯微鏡方法，通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記的沉降微粒，來(lái)測(cè)定樣 品中被分析物的存在情況，其中所述樣品中存在高于閥值量的雌激素 類固醇化合物說(shuō)明所述禽胚胎為雌性。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中測(cè)定熒光標(biāo)記的沉降微粒數(shù)量并與 預(yù)定值比較，其中低于預(yù)定值的數(shù)量說(shuō)明在所述樣品中存在高于閥值 量的所述雌激素類固醇化合物。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述結(jié)合蛋白為抗體。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述結(jié)合蛋白為雌激素類固醇化合 物的受體。
全文摘要
本發(fā)明提供用熒光顯微鏡方法通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定來(lái)測(cè)量樣品中被分析物的方法。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)測(cè)定禽蛋胚胎液(例如尿囊液或血液)樣品中雌激素類固醇化合物的存在情況來(lái)測(cè)定蛋內(nèi)禽胚胎性別的方法(圖1)。
文檔編號(hào)G01N33/00GK101218506SQ200680025059
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者A·查爾克, D·馬哈托, J·特茨科夫斯基 申請(qǐng)人:恩布里克斯公司