專利名稱：流式細胞術細胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性t細胞的方法
技術領域：
流式細胞術細胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性T細胞的方法，屬于免疫學分析檢測技術領域。
背景技術：
乙型肝炎病毒(HBV)感染后，決定病情嚴重程度及病程轉歸的一個主要因素是機體的免疫反應能力。其中患者體內乙肝病毒特異性T細胞(cytotoxic Tlympho-cyte，CTL，下稱HBV特異性CTL)在清除病毒方面發(fā)揮重要的功能。T細胞中CD4+細胞在抗原刺激下可分化為特異性T輔助細胞(Th)，Th能促進HBV特異性CTL產生，并對維持HBV特異性CTL活性、產生持續(xù)性細胞免疫起重要作用。T細胞中CD8+細胞在抗原刺激下可分化為HBV特異性CTL。研究表明HBV特異性CTL在控制HBV感染中起關鍵作用(1)在機體的防御體系中，CTL是清除細胞內病原體的主要因素；(2)HBV持續(xù)感染均伴有HBV特異性CTL的缺乏，病毒感染的控制與HBV特異性CTL數量和活性呈正相關；(3)通過DNA疫苗免疫、DC疫苗治療等方法可以激活HBV特異性CTL，進而清除病毒感染；(4)直接過繼免疫輸入HBV特異性CTL可以清除感染病毒。
研究表明急性HBV感染的患者中，HBV特異性CTL反應是強有力的，但在臨床恢復及血清轉換發(fā)生后，很低水平的HBVDNA仍可持續(xù)存在幾十年。長期存在的微量HBV DNA與長期存在的HBV特異性CTL有關。與急性自限性HBV感染相比較，慢性乙肝患者，通過51Cr釋放法，外周血中很難檢測出HBV特異性CTL反應。通過同樣的技術，病毒復制活躍、肝臟炎癥明顯的慢性HBV感染患者血液中HBV特異性CTL缺乏，肝組織中HBV特異性CTL頻度較低；而病毒復制不活躍、肝臟炎癥輕微的慢性HBV感染者，血液和肝組織中HBV特異性CTL頻度較高。國外研究還發(fā)現慢性乙肝在經歷自發(fā)的或干擾素誘導的部分或完全恢復的患者，能形成在強度和特異性方面類似于急性乙肝患者具有的CTL對乙肝的反應。在經過拉米夫定治療的患者，通過51Cr釋放法和Te-tramer技術，發(fā)現HBV特異性CTL頻度明顯地升高，差異顯著。這個提高的HBV特異性CD8+細胞活性可以導致CD4+細胞的活性恢復，同時導致HBV病毒載量的下降。因此拉米夫定對慢性乙肝患者的治療，能夠使HBV特異性CTL功能恢復。在拉米夫定治療后，通過獲得多種抗原表位的特異性，使HBV特異性CTL功能得到恢復。以上結果提示，通過提高HBV特異性CTL反應為乙肝的免疫治療提供了可能。
常用的CTL檢測法有同位素細胞毒性分析，如51Cr釋放法、125I-UdR釋放法及3H-UdR釋放法等；單細胞水平測定CTL活性，如細胞內細胞因子染色、特異T細胞受體(TCR)的PCR、有限稀釋分析法(limiting dilution analysis，LDA)等。由于特異性CTL在外周血淋巴細胞中的比率很低，檢測這些低水平的特異性CTL需要有高度敏感的方法。傳統的51Cr釋放分析法和LDA法，間接檢測抗原特異性CTL，需要大量的CTLs作為效應細胞，必須在體外先進行擴增，整個過程周期長、敏感性低、費時、費力，難以廣泛應用。
近年發(fā)展起來的檢測γ干擾素(IFN-γ)等細胞因子分泌細胞數量的酶聯免疫斑點法(Enzyme-linked immunospot assay，Elispot)和檢測T細胞特異性抗原受體數量的四聚體檢測法(Te-tramer)因其具有很高的靈敏度，可以檢出(15～20)/106的低頻度特異性CTL，越來越受到重視和較廣泛的應用。但在實際運用中還存在一些不足。ELISPOT檢測陽性細胞的條件更為嚴格，刺激時間長，需要不斷補充細胞生長物質；Te-tramer檢測特異性，但是不作用于T細胞。
運用流式細胞術細胞因子檢測法(cytokine flow cytometry，CFC)是指流式細胞儀細胞內因子檢測法，此法的特點是利用流式細胞儀的多參數同時分析的功能，精確識別目標細胞并檢測其內因子的分泌情況。
未見運用流式細胞術細胞因子檢測法檢測慢性乙肝(CHB)患者外周血和肝組織中HBV特異性CTL的應答的報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種流式細胞術細胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性T細胞的方法，是一種靈敏度高，檢測對象不受限制，成本低的用于HBV特異性CTL的檢測。
本發(fā)明的技術方案運用流式細胞術細胞因子檢測法(cytokine flowcytometry，CFC)對全血進行檢測。在有細胞因子封閉劑布雷菲德菌素A的環(huán)境下，在全血中加刺激抗原和協同刺激劑進行抗原刺激。通常在刺激的六小時后洗滌，識別淋巴細胞并裂解紅細胞。隨后進行洗滌和破膜。最后使用熒光標記抗體對細胞內細胞因子進行熒光標記染色，完成后上流式細胞儀分析。
我們的檢測方案是基于使用協同刺激劑(CD28/CD49d)、多色試劑(CD8PerCP-Cy5.5)檢測及兩種細胞因子(INF-r與CD69)的檢測。
儀器Beckman coulter-3XL流式細胞儀，二氧化碳培養(yǎng)箱(HRCP-海爾公司)，離心機。
主要試劑①細胞因子封閉劑布雷菲德菌素A(Brefeldin A)，Sigma公司產品。
②協同刺激劑CD28/CD49d，Sigma公司產品。
③刺激抗原HBcAg特異性多肽18-27，(氨基酸序列FLPSDFFPSV)，上海森工生物技術有限公司合成，并向公眾出售。
④淋巴細胞CD8探針CD8PerCP-Cy5.5，(異硫氰酸-CY5.5復合熒光素標記CD8抗體)，BD公司產品。
⑤溶血素Lysing Solution，BD公司產品。
⑥破膜劑permeabilizing solution，BD公司產品。
⑦r-干擾素抗體熒光標記IFN-r FITC，BD公司產品。
⑧淋巴細胞CD69細胞活化探針CD69-PE，(PE標記的CD69抗體)，BD公司產品。
⑨陰性對照劑IgG2a FITC/IgG1 PE，BD公司產品。
⑩磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)，自配。
檢測過程①抗原刺激在流式細胞測定管中加入全血100μl，布雷菲德菌素A10μl，CD28/CD49d 2.5μl和HBcAg特異性多肽1μl，將測定管置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，5％CO2、37℃條件下增殖6小時。
②洗滌用預冷的PBS液2ml洗滌1次，離心1500rpm/分，棄上清液。去除剩余的布雷菲德菌素A、CD28/CD49d和HBcAg特異性多肽，留下淋巴細胞和紅細胞。
③淋巴細胞識別加CD8PerCP-Cy5.510μl、CD69 PE 10μl避光30分鐘，識別CD8陽性且已被抗原活化的淋巴細胞。
④裂解紅細胞加溶血素2ml，避光15分鐘。
⑤離心、洗滌離心1500rpm/分，棄上清液，用預冷的PBS液2ml重復洗滌2次，去除紅細胞。
⑥破膜加破膜劑0.5ml，避光10分鐘。對淋巴細胞的細胞膜進行打孔，使得細胞因子抗體能夠自由出入細胞，同時保證細胞內物質并不外泄。
⑦洗滌用預冷的PBS液洗滌1次，離心1500rpm/分，棄上清液。去除破膜劑。
⑧染色加IFN-r FITC 10μl，避光30分鐘，使胞漿內的γ-干擾素被抗γ-干擾素熒光抗體標記染色。
⑨流式細胞儀測定。調節(jié)流式細胞儀前向(FS)、側向(SS)兩參數的電壓值，使絕大多數淋巴細胞顯示在FS/SS雙參數點圖中。構建CD8PerCP-Cy5.5與CD69PE直方圖，在圖中識別出已被活化的CD8+/CD69+細胞。構建IFN-rFITC單參數直方圖，并設定陰性區(qū)域后檢測陽性樣本，如出現陽性顆粒，便識別為對乙肝抗原肽有特異性反性的T細胞本發(fā)明的有益效果
CFC和ELISPOT比較CFC法是指流式細胞儀細胞內因子檢測法，此法的特點是利用流式細胞儀的多參數同時分析的功能，精確識別目標細胞并檢測其內因子的分泌情況。CFC和ELISPOT檢測細胞因子都是基于單個細胞。兩者的區(qū)別是(1)信號輸出的技術(流式細胞儀為多參數)；(2)刺激的時間長短和條件(通常在ELISPOT膜底部刺激PBMCs 24小時；CFC檢測用的聚丙烯管中刺激全血或PBMCs6小時)。(3)CFC檢測到的陽性細胞是ELISPOT的三到四倍。這可能部分因為ELISPOT檢測陽性細胞的條件要更為嚴格。
CFC和MHC-Ig四聚物(或二聚物)染色比較MHC-肽段四聚物和MHC-Ig二聚物是肉眼觀察抗原特異性T細胞的有力工具。四聚物和二聚物與CFC檢測觀察的區(qū)別是(1)四聚物和二聚物檢測T細胞特異性反應只通過一個肽-MHC抗原決定簇，但是CFC能用于測量復雜抗原的反應；(2)四聚物和二聚物檢測有特異性，但是不作用于T細胞，反之，CFC檢測抗原特異性細胞產生的細胞因子。
本發(fā)明建立新型免疫分析技術，用于HBV特異性CTL的檢測，明顯優(yōu)于51Cr測定法、有限稀釋法(LAD)、MHC-四聚體(二聚體)法，本發(fā)明方法不僅靈敏度高，檢測對象不受限制，成本低，還能直接檢測特異性CTL的功能性細胞因子的表達，可廣泛用于臨床檢測。
具體實施例方式
實施例1取正常對照者全血100μl，按說明書上述測定方法進行檢測操作。測得HBV特異性CTL值為0.2％。
實施例2取急性乙型肝炎患者全血100μl，按說明書上述測定方法進行檢測操作。測得HBV特異性CTL值為1.8％。
實施例3取慢性乙型肝炎患者全血100μl，按說明書上述測定方法進行檢測操作。測得HBV特異性CTL值為0.8％。
權利要求
1.一種流式細胞術細胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性T細胞的方法，其特征是運用流式細胞術細胞因子檢測法對全血進行檢測，在有細胞因子封閉劑布雷菲德菌素A的環(huán)境下，在全血中加刺激抗原和協同刺激劑進行抗原刺激，刺激六小時后洗滌，識別淋巴細胞并裂解紅細胞，隨后進行洗滌和破膜，最后使用熒光標記抗體對細胞內細胞因子進行熒光標記染色，完成后上流式細胞儀分析；①抗原刺激在流式細胞測定管中加入全血100μl，布雷菲德菌素A10μl，CD28/CD49d 2.5μl和HBcAg特異性多肽1μl，將測定管置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，5％CO2、37℃條件下增殖6小時；②洗滌用預冷的PBS液2ml洗滌1次，離心1500rpm/分，棄上清液，去除剩余的布雷菲德菌素A、CD28/CD49d和HBcAg特異性多肽，留下淋巴細胞和紅細胞；③淋巴細胞識別加CD8PerCP-Cy5.5 10μl，CD69 PE10μl避光30分鐘，識別CD8陽性且已被抗原活化的淋巴細胞；④裂解紅細胞加溶血素2ml，避光15分鐘；⑤離心、洗滌離心1500rpm/分，棄上清液，用預冷的PBS液2ml重復洗滌2次，去除紅細胞；⑥破膜加破膜劑0.5ml，避光10分鐘，對淋巴細胞的細胞膜進行打孔，使得細胞因子抗體能夠自由出入細胞，同時保證細胞內物質并不外泄；⑦洗滌用預冷的PBS液洗滌1次，離心1500rpm/分，棄上清液，去除破膜劑；⑧染色加IFN-r FITC，避光30分鐘，使胞漿內的γ-干擾素被抗γ-干擾素熒光抗體標記染色；⑨流式細胞儀測定調節(jié)流式細胞儀前向FS、側向SS兩參數的電壓值，使絕大多數淋巴細胞顯示在FS/SS雙參數點圖中，構建CD8PerCP-Cy5.5與CD69PE直方圖，在圖中識別出已被活化的CD8+/CD69+細胞，構建IFN-rFITC單參數直方圖，并設定陰性區(qū)域后檢測陽性樣本，如出現陽性顆粒，便識別為對乙肝抗原肽有特異性反性的T細胞。
全文摘要
流式細胞術細胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性T細胞的方法，屬于免疫學分析檢測技術領域。本發(fā)明運用流式細胞術細胞因子檢測法對全血進行檢測，在有細胞因子封閉劑布雷菲德菌素A的環(huán)境下，在全血中加刺激抗原和協同刺激劑進行抗原刺激，刺激六小時后洗滌，識別淋巴細胞并裂解紅細胞。隨后進行洗滌和破膜。最后使用熒光標記抗體對細胞內細胞因子進行熒光標記染色，完成后上流式細胞儀分析。本發(fā)明建立新型免疫分析技術，用于HBV特異性CTL的檢測，明顯優(yōu)于51Cr測定法、有限稀釋法(LAD)、MHC－四聚體(二聚體)法，本發(fā)明方法不僅靈敏度高，檢測對象不受限制，成本低，還能直接檢測特異性CTL的功能性細胞因子的表達，可廣泛用于臨床檢測。
文檔編號G01N21/00GK1811452SQ20061003781
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月13日 優(yōu)先權日2006年1月13日
發(fā)明者裴豪, 楊小娟, 錢金娟 申請人:無錫市傳染病醫(yī)院