專利名稱：：用于胞內(nèi)釋放藥理活性化合物的用作陽離子脂質(zhì)的l－肉堿或烷?；鵯－肉堿的酯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類新的L-肉堿和?；鵏-肉堿的酯以及它們作為適于幫助藥理活性化合物的胞內(nèi)釋放、促進(jìn)它們的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或促進(jìn)它們與特定細(xì)胞膜位點(diǎn)(受體)的相互作用的陽離子脂質(zhì)的用途。本發(fā)明還涉及作為上述新化合物用于相同目的的L-肉堿和?；鵏-肉堿的其他已知酯。術(shù)語“胞內(nèi)釋放”在本文中的意思是指用天然來源或經(jīng)過修飾賦予了治療活性的多核苷酸或質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染(基因釋放)，或者將藥物或免疫原性肽摻入到細(xì)胞中。
背景技術(shù)：
：許多藥理活性物質(zhì)，諸如象多肽和蛋白質(zhì)或藥物一般需要穿透到細(xì)胞中通過以亞細(xì)胞或分子水平影響細(xì)胞功能而發(fā)揮它們的作用。對(duì)于這些分子來說，細(xì)胞膜構(gòu)成了選擇性不透屏障。細(xì)胞膜事實(shí)上履行保護(hù)功能，阻止可能的毒性物質(zhì)進(jìn)入，但也阻止了具有治療活性的化合物通過。細(xì)胞膜的復(fù)合組成包括磷脂、糖脂和蛋白質(zhì)；其功能受到細(xì)胞漿組分如Ca++及其他離子、ATP、微絲、微管、酶和、與Ca++鍵合的蛋白質(zhì)的影響。不同的細(xì)胞類型顯示的選擇性和它們之間的選擇性是由于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞漿組分之間的相互作用和對(duì)外界信號(hào)的反應(yīng)造成的。通過將復(fù)合物中的物質(zhì)與再現(xiàn)天然來源的膜脂質(zhì)組分的脂質(zhì)制劑結(jié)合可以克服細(xì)胞膜的屏障效應(yīng)。這些脂質(zhì)可以與膜融合并釋放與其結(jié)合的物質(zhì)使之進(jìn)入細(xì)胞。這些脂質(zhì)復(fù)合物不僅能通過與膜融合的方式促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移，也能降低細(xì)胞膜與欲穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的分子之間的電荷排斥力。兩性脂質(zhì)，如膜磷脂，在水性系統(tǒng)中形成脂質(zhì)小囊或脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是一種小囊，其中水性體積被一或多層由脂質(zhì)分子-通常為磷脂-組成的膜完全包裹。磷脂有一個(gè)親水的頭和一對(duì)碳鏈(疏水性的尾)，它是生物膜的主要組分。在水溶液中，疏水性的尾自動(dòng)排斥水，而此時(shí)親水性頭與介質(zhì)相互作用，自然形成有不同直徑的小囊的群體。脂質(zhì)體一般是兩性離子，中性或陰離子。這些小囊可以作為藥物、小分子、蛋白質(zhì)、核苷酸和質(zhì)粒的載體。近年來，已廣泛使用陽離子脂質(zhì)體向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)，它是一類由合成脂質(zhì)制備的帶正電荷的小囊。DNA的陰性電荷可以與陽離子脂質(zhì)體相互作用，形成穩(wěn)定的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。此技術(shù)的簡(jiǎn)單性和通用性使脂質(zhì)體成為一種在人的基因療法中輸送基因的重要的載體。現(xiàn)在，用于基因療法和NIH重組顧問委員會(huì)(NIHRecombinantAdvisoryCommittee)批準(zhǔn)的多數(shù)載體包括病毒的和合成的系統(tǒng)。病毒感染包括一系列復(fù)雜的機(jī)制以能夠感染特定的細(xì)胞并攜帶DNA進(jìn)入細(xì)胞核。基因療法使用病毒載體的原理基于用對(duì)療效編碼的基因替換病毒基因，而不消除病毒顆粒感染細(xì)胞的能力。病毒療法受到免疫、細(xì)胞病變和基因重組等病毒因素(viralelements)的限制。非常希望在病毒療法中使用陽離子脂質(zhì)。這些載體與生物來源的相比具有非常大的潛力，因?yàn)樗鼈兏踩?、低毒并能夠結(jié)合大體積的基因。然而，與生物載體相比，它們的細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率較低。需牢記的是，這種轉(zhuǎn)染體系的應(yīng)用是在研究的初級(jí)階段。陽離子脂質(zhì)在DNA-脂質(zhì)復(fù)合物的形成、細(xì)胞與復(fù)合物的相互作用、與細(xì)胞膜的融合、在細(xì)胞內(nèi)釋放DNA和轉(zhuǎn)錄等過程中起非常重要的作用。脂質(zhì)體的體內(nèi)(in-vivo)應(yīng)用有重要的例子。病毒療法的第一個(gè)臨床試驗(yàn)是通過引入一個(gè)含有人脂質(zhì)體復(fù)合的HLA-B7基因表達(dá)載體用于治療黑素瘤。另一個(gè)重要的應(yīng)用涉及脂質(zhì)體復(fù)合的表達(dá)載體SV40C-FTR通過經(jīng)肺途徑或鼻腔噴霧給藥治療肺泡纖維變性。其他包括在癌癥的基因療法中使用脂質(zhì)體的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)展中。在陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)中通常鑒別四個(gè)構(gòu)成因素帶正電的陽離子頭，間隔區(qū)，錨狀脂質(zhì)(theanchorlipid)和連接鍵。陽離子頭導(dǎo)致陽離子脂質(zhì)體和DNA之間、DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物和細(xì)胞膜及細(xì)胞的其他組分之間的相互作用。它含有一個(gè)或多個(gè)可以被取代的陽離子基團(tuán)(決定于電荷數(shù)目)。間隔區(qū)是分子中分隔陽離子頭和疏水性尾的部分，并且它確保陽離子頭與DNA磷脂的陰離子電荷之間的最佳的接觸。錨狀脂質(zhì)是分子的非極性烴部分，并決定雙脂質(zhì)層的物理性質(zhì)，如其剛性和與膜脂質(zhì)的交換速率?！暹B接鍵″表示烴鏈和分子的其他部分之間的鍵。此鍵決定了陽離子脂質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性和生物降解能力。近年來脂質(zhì)體在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用穩(wěn)定增長(zhǎng)。脂質(zhì)體在此領(lǐng)域的成功是由于皮膚對(duì)這些化合物是非常耐受的。它們既作為活性成分的載體，也作為促進(jìn)活性成分吸收的化合物。在制備和使用脂質(zhì)體方面的科技和專利參考文獻(xiàn)是非常豐富的，然而僅有少量的參考文獻(xiàn)記載了肉堿衍生物在基因釋放中的應(yīng)用，對(duì)于藥物的傳遞，沒有涉及制備即使極少地相似于本發(fā)明的化合物的已知技術(shù)的文獻(xiàn)可供利用。專利申請(qǐng)EP0279887記載了肉堿載體的應(yīng)用，如磷脂酰基肉堿，可選地與其他磷脂和脂質(zhì)(膽固醇、磷脂?；憠A、磷脂?；z氨酸)組成混合物，制備脂質(zhì)體。在關(guān)于制備脂質(zhì)體的例子中，與普萘洛爾結(jié)合制備了磷脂?；鈮A脂質(zhì)體，普萘洛爾是一種已知具有抗高血壓、抗心絞痛和抗心律失?；钚缘乃幬铩４颂幨褂萌鈮A衍生物是基于肉堿顯著的心肌向性。此向性使脂質(zhì)體能避免被肝代謝而不能到達(dá)所需的靶部位。磷脂?；鈮A的存在也使脂質(zhì)體能夠口服，因?yàn)樗軐?duì)抗腸內(nèi)的脂酶。在《醫(yī)藥化學(xué)雜志》1998，6月18日；41(13)2207-15記載了一些用于基因釋放的L-肉堿的酯，但并未記載或提示它們作為藥物釋放的有用藥劑。WO96/39193記載了新的靶藥物制劑，其目的在于通過肉堿-酰基肉堿移位酶系統(tǒng)進(jìn)入線粒體，但未提示它們是制備脂質(zhì)體的有用藥劑。EP559625B1記載了一些有選擇性的胃腸道肌松弛活性的L-肉堿和酰基L-肉堿的酯。近年來分子生物學(xué)家已鑒定了一些導(dǎo)致人類遺傳疾病的染色體水平的缺損。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要方面涉及用基因療法方案治療由遺傳基因?qū)е碌募膊?。如已提及的，陽離子脂質(zhì)體廣泛用于在細(xì)胞內(nèi)傳遞藥物活性化合物，促進(jìn)跨膜輸送或促進(jìn)其與特定的細(xì)胞膜位點(diǎn)(受體)的相互作用。這些載體與源于生物的載體相比具有非常大的潛力，因?yàn)樗鼈兏踩?、低毒并且也能結(jié)合大體積的基因。然而，與生物載體相比，它們的細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率較低。此外，由常規(guī)的陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移需要質(zhì)粒DNA和陽離子脂質(zhì)保持分離，恰在基因轉(zhuǎn)移之前使其混合。使多核苷酸復(fù)合物穩(wěn)定的嘗試迄今為止是失敗的，未能產(chǎn)生令人鼓舞的結(jié)果；實(shí)際上，它們僅在短的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。在基因療法或基因釋放和藥物釋放領(lǐng)域，已認(rèn)識(shí)到非常需要穩(wěn)定、可再生的位點(diǎn)-特異性系統(tǒng)，它在一個(gè)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間周期后也具有活性。已發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的藥理學(xué)活性化合物在細(xì)胞內(nèi)傳送方面具有強(qiáng)大活性的一類陽離子脂質(zhì)含有新的L-肉堿和?；鵏-肉堿的酯。這些新化合物是穩(wěn)定和高選擇性的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诘竭_(dá)靶器官時(shí)具有位點(diǎn)特異性。此特性使它們能特別有效地將活性物質(zhì)直接傳遞到活性物質(zhì)可以發(fā)揮其藥理學(xué)活性的部位。
發(fā)明內(nèi)容此處記載的本發(fā)明的化合物是有通式(I)的化合物其中n是1-3的整數(shù)；R是氫或直鏈或分支的、有2-6個(gè)碳原子的烷?；籖1和R2，可以相同或不同，代表有3-20個(gè)碳原子的飽和或不飽和直鏈?；?；并且X-是藥學(xué)可接受的酸的陰離子。R的例子是乙酰基、丙酰基、丁?；?、戊?；彤愇祯；?。R1和R2的例子是己?；⑹煌轷；?、肉豆蔻酰基、棕櫚?；蛴王；?。本發(fā)明優(yōu)選的化合物如-L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST770)；-乙?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST771)；-丙?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST772)；-異丁?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3二棕櫚?；视偷孽?ST773)；-異戊?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST774)；-L-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基十六烷基甘油的酯(ST810)；-乙?；鵏-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基乙?；视偷孽?ST809)；-丙酰基L-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基乙酰基甘油的酯(ST808)。藥理學(xué)上可以接受的酸的陰離子是指任何不導(dǎo)致不需要的毒性或副作用升高的酸的陰離子。這些酸是藥理學(xué)家和藥學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。這些陰離子的例子不僅限于以下列出的種類氯；溴；碘；門冬氨酸根；酸式門冬氨酸根；檸檬酸根；酸式檸檬酸根；酒石酸根；酸式酒石酸根；磷酸根；酸式磷酸根；延胡索酸根；酸式延胡索酸根；甘油磷酸根；葡萄糖磷酸根；乳酸根；順丁烯二酸根；酸式順丁烯二酸根；粘酸根；乳清酸根；草酸根；酸式草酸根；硫酸根；酸式硫酸根；三氯醋酸根；三氟醋酸根；甲磺酸根；雙羥萘酸根和酸式雙羥萘酸根。以脂質(zhì)體形式存在的式(I)化合物，作為在基因療法中傳遞天然來源的或經(jīng)修飾的質(zhì)粒或核苷酸的藥劑，或?yàn)樽鳛橐呙绲碾幕虻鞍踪|(zhì)編碼，或用于下列藥物的基因釋放，例如，抗癌劑，抗病毒劑，抗細(xì)菌劑，抗真菌劑，抗原生動(dòng)物劑，用于治療心血管系統(tǒng)疾病的藥物，免疫原性肽和其他用于治療的藥物。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)制備含有式(I)化合物的脂質(zhì)體；見AllenT.M.Drugs56，747-56(1998)的例子。也可以用脂質(zhì)體技術(shù)實(shí)踐中熟知的其他組分制備本發(fā)明的脂質(zhì)體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)體可以含有助性脂質(zhì)，此術(shù)語在本領(lǐng)域是可以理解的。助性脂質(zhì)例如膽固醇，1-棕櫚酰-2-油酰磷脂?；憠A或二油酰磷脂酰基膽堿。本發(fā)明的脂質(zhì)體適于以組合物形式存在。在屬于傳遞藥理學(xué)活性化合物的實(shí)施方案中，組合物理解為藥劑學(xué)上的種類，可選地含有藥學(xué)上可接受的載體和/或賦型劑。脂質(zhì)體形式的式(I)化合物，也可以用于制備化妝品組合物，脂質(zhì)體本身可以作為化妝品活性劑，也可以用于輸送化妝品活性物質(zhì)，如水合劑、營(yíng)養(yǎng)素、面部清潔劑、抗皺劑、抗蜂窩炎劑和抗拉伸紋劑(anti-stretch-markagents)。含有式(I)化合物的脂質(zhì)體可以通過口服、腸道外、肌內(nèi)、靜脈注射、皮下、經(jīng)皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。本發(fā)明也涉及另外具有通式(II)的陽離子脂質(zhì)，它們已知用于不同的用途(見上述EP559625)。根據(jù)本發(fā)明，式(II)化合物是L-肉堿的酯，用于制備在藥物釋放方面具有潛在活性的脂質(zhì)體，它與上述式(I)化合物相比，在到達(dá)靶器官方面表現(xiàn)出穩(wěn)定性和選擇性的特點(diǎn)。同樣有益的性質(zhì)適用于化妝品。這些化合物具有通式(II)其中R3是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的?；?；R4是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的烷基鏈；并且X-是藥理學(xué)可接受的酸的陰離子。R3優(yōu)選的例子是壬酰基、十二烷?；?、肉豆蔻酰基、棕櫚酰基、硬脂?；蛴王；?。R4優(yōu)選的例子是壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。本發(fā)明記載的特定的式(II)化合物的例子是-棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯(ST1055)；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1351)；-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1379)；-肉豆蔻酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1380)；-棕櫚酰L-肉堿溴化物十六烷基酯(ST1390)；-油基(oleyl)L-肉堿氯化物油基酯(ST1392)。上述《醫(yī)藥化學(xué)雜志》1998年6月18日；41(13)2207-15記載了一些式(II)化合物，即ST1380、ST1390和ST1392，作為制備用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的具有治療活性的脂質(zhì)體的有用藥劑，但未記載作為制備用于輸送藥物的脂質(zhì)體的有用藥劑。制藥領(lǐng)域具有一般經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員清楚地知道在制備脂質(zhì)體-藥物復(fù)合物方面面臨的困難；實(shí)際上，不能預(yù)測(cè)一個(gè)用于傳遞基因的脂質(zhì)體是否能用于傳遞藥物，這需要克服許多困難以得到能與藥物復(fù)合并將其優(yōu)先釋放到需要發(fā)揮治療作用的器官的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體形式的式(II)化合物，是有用的藥物釋放劑，可以輸送藥物如抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗原生動(dòng)物劑，或用于治療心血管疾病的藥物，或免疫原性肽，和其他用于治療的藥物。脂質(zhì)體形式的式(II)化合物，也可以用于制備化妝品組合物，脂質(zhì)體本身可以作為化妝品活性劑，也可以用于輸送化妝品活性物質(zhì)，如水合劑、營(yíng)養(yǎng)素、面部清潔劑、抗皺劑、抗蜂窩炎劑和抗拉伸紋劑(anti-stretch-markagents)。在含有式(II)化合物的脂質(zhì)體中，所述的脂質(zhì)體可選地含有助性脂質(zhì)。含有式(II)化合物的脂質(zhì)體可以通過口服、腸道外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。本發(fā)明也涉及另外具有通式(III)的陽離子脂質(zhì)，它們已知用于不同的用途(見上述EP559625)。根據(jù)本發(fā)明，式(III)化合物是L-肉堿的酯，用于制備在促進(jìn)藥物釋放方面具有潛在活性的脂質(zhì)體，它與上述式(I)化合物相比，在到達(dá)靶器官方面表現(xiàn)出穩(wěn)定性和選擇性的特點(diǎn)。這些化合物具有通式(III)其中R5是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的?；?；R6是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的烷基鏈；X-是藥理學(xué)可接受的酸的陰離子，具有如下限制條件當(dāng)R5是硬脂?；鶗r(shí)，R6不是硬脂基，當(dāng)R5是油?；鶗r(shí)，R6不是硬脂基，當(dāng)R5是棕櫚?；鶗r(shí)，R6不是棕櫚基，當(dāng)R5是肉豆蔻?；鶗r(shí)，R6不是肉豆蔻基，當(dāng)R5是月桂?；鶗r(shí)，R6不是月桂基，當(dāng)R5是油?；鶗r(shí)，R6不是油基?！夺t(yī)藥化學(xué)雜志》1988，41，2207-2215公開了僅用于基因釋放的放棄保護(hù)的脂質(zhì)體形式的化合物。R5優(yōu)選的例子是壬?；⑹轷；?、肉豆蔻?；?、棕櫚?；?、硬脂酰基或油酰基。R6優(yōu)選的例子是壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。本發(fā)明式(III)化合物的優(yōu)選的例子是-棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯(ST1055)；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1351)；-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1379)。式(III)化合物作為在基因療法中傳遞天然來源的或經(jīng)修飾的質(zhì)粒或核苷酸的藥劑，或?yàn)樽鳛橐呙绲碾幕虻鞍踪|(zhì)編碼。式(III)化合物可以通過口服、腸道外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。在以下反應(yīng)簡(jiǎn)圖中表示了制備本發(fā)明式(I)化合物的過程，它表示此簡(jiǎn)圖用于所有通式(I)化合物。由于所有必需的試劑都是市售的或已公開在文獻(xiàn)中，并且反應(yīng)條件通常適用于本發(fā)明任何變化的全部范圍，如果在常識(shí)范圍內(nèi)可以正常地滿足需求，技術(shù)人員可以容易地得到R、R1和R2代表的所有的基團(tuán)。參考以上反應(yīng)流程1，以下說明本申請(qǐng)的式(I)化合物的制備方法。例1丙?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST772)a)制備1，3-二羥基丙-2-酮1，3-二棕櫚酸酯(1)在0℃(外部溫度)在無水氮?dú)饬髦袑⒍u基丙酮(7g；0.078mol)溶解在300mL無水氯仿中。向得到的溶液中滴加棕櫚酰氯(44g；0.16mol)和無水吡啶(15mL)。將溫度已上升至環(huán)境溫度的所得混合物攪拌24小時(shí)。按以下順序萃取混合物用0.5％鹽酸的水溶液300mL、5％碳酸氫鈉的水溶液300mL，最后用300mL水。用無水硫酸鈉使分離出的有機(jī)相脫水，用纖維素濾器過濾并濃縮至干，得到粗產(chǎn)物(1)。從500mL乙醇中結(jié)晶得到純品。得到30.4g產(chǎn)品(1)。產(chǎn)率73％熔點(diǎn)＝80-81℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；4.7(4H，s，-OCCH2-).b)制備1，2，3-三羥基丙烷-1，3-二棕櫚酸酯(2)將水(7.5mL)緩慢加到產(chǎn)品(1)(5g，9mmol)中，攪拌使之溶解在四氫呋喃(125mL)和甲苯(25mL)中。將所得的白色乳狀懸浮液的溫度調(diào)至5℃(外部溫度)，分次加入硼氫化鈉(500mg；13mmol)。在5℃將懸浮液保持?jǐn)嚢?0分鐘。然后緩慢加入冰醋酸直至不再有剩余的硼氫化鈉分解產(chǎn)生泡沫，最終得到一種溶液。向溶液中加入氯仿(100mL)，形成兩相系統(tǒng)。分離底層含有CHCI3的有機(jī)相，按以下順序萃取用水(25mL)，碳酸氫鈉(10％水溶液25mL)和水(25mL)。用硫酸鈉使含有(2)的有機(jī)相脫水，過濾并濃縮至干，得到一種蠟狀產(chǎn)物。用丙酮使蠟狀產(chǎn)物結(jié)晶得到產(chǎn)品(2)。得到4.8g產(chǎn)品(2)。產(chǎn)率94％。熔點(diǎn)＝71-72℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；4.2(5H，m，-CHCH2O-).c)制備1，3-二棕櫚酰-2-溴乙酰基甘油(3)在0℃和攪拌的條件下將產(chǎn)品(2)(2.5g；4.4mmol)溶解在無水氯仿(50mL)中(外部溫度)。向得到的溶液中緩慢加入吡啶(0.42ml)并滴加3ml含有溴代乙酰氯(0.43mL；5.2mmol)的氯仿溶液。將反應(yīng)混合物在0℃保持30分鐘(外部溫度)，并在環(huán)境溫度下保持30分鐘。然后按以下順序處理反應(yīng)混合物鹽酸的1％水溶液(約50mL)，碳酸氫鈉的5％水溶液(約50mL)和水。用丙酮結(jié)晶純化產(chǎn)物(3)，然后使反應(yīng)混合物脫水(用硫酸鈉)并濃縮至干。得到2.5g產(chǎn)品。產(chǎn)率89％。熔點(diǎn)＝46-47℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；3.9(2H，s，-OCH2COO-)4.2-4.4(5H，m，-CHCH2O-)；5.25(1H，m，CHCH2O-).。d)制備L-丙?；鈮A溴化物與2-羥乙酰-1，3-二棕櫚酰甘油的酯(4)將預(yù)先在40℃真空干燥的L-丙酰基肉堿內(nèi)鹽(0.95g，4.4mmol)懸浮在無水二甲基甲酰胺中(約20mL)。將產(chǎn)物(3)(3g，4.7mmol)分次小部分加入懸浮液中。將懸浮液緩慢加熱到38℃并保持此條件直至得到一種溶液。10分鐘后，使溶液達(dá)到0℃，保持30分鐘。得到一種沉淀，過濾，用乙酸乙酯洗滌并溶解在氯仿(100mL)中。將所得乳狀溶液(30mL)通過硅藻土過濾并濃縮。向后一溶液中加入己烷(100mL)，將得到的產(chǎn)品(4)的沉淀物過濾并在35℃真空干燥。得到3.19g標(biāo)題化合物。產(chǎn)率80％。熔點(diǎn)＝127-128℃[α]25D＝-3.9(C＝1％氯仿)C47H88BrNO10的元素分析<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="859">C％H％N％Br％計(jì)算值62.239.781.548.81實(shí)測(cè)值62.7310.150.798.77</table></tables>H1NMR(CDCl3)0.9-0.95(6H，t，CH3CH2CH2-)；1.1-1.2(3H，t，CH3CH2CO)；1.2-1.4(24H，m，CH2n＝24)；1.5-1.6(4H，m，-OCCH2CH2-)；2.3-2.4(4H，t，-OCCH2CH2-)；2.4-2.45(4H，d.d.，-CHCH2O-)；2.95(2H，d，-CH2COOCH2COO-)；3.5(9H，s，N(CH3)3)；4.2(4H，m，-CH2OCOCH2-)；4.35(2H，m，-CH2N-)；4，65(2H，d，d，-OCH2CO-)；5.25(1H，m，-OCH2CHCH2O-)；5.75(1H，m，-CHCH2N-).例2-7按與上述實(shí)施例相同的方法制備下述化合物-L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST770)；-乙酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST771)；-異丁?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3二棕櫚?；视偷孽?ST773)；-異戊?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST774)；-L-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基乙?；视偷孽?ST810)；-乙?；鵏-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基乙?；视偷孽?ST809)；-丙酰基L-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基乙?；视偷孽?ST808)；此處記載的本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括制備有抗癌藥物的脂質(zhì)體，尤其是作為喜樹堿的載體的脂質(zhì)體，如WO97/31003記載的。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有通式(IV)的傳遞喜樹堿的脂質(zhì)體其中R7是-C(R11)＝N-O(n)R10基團(tuán)，其中R10是氫，或是直鏈或分支的C1-C5烷基或C1-C5烯基基團(tuán)，或一個(gè)C3-C10環(huán)烷基基團(tuán)，或一個(gè)直鏈或分支的(C3-C10)環(huán)烷基(C1-C5)烷基基團(tuán)，或一個(gè)C6-C14芳基，或一個(gè)直鏈或分支的(C6-C14)芳基-C1-C5)烷基基團(tuán)，或雜環(huán)或直鏈或分支的雜環(huán)-(C1-C5)烷基基團(tuán)，所述的雜環(huán)基團(tuán)含有至少一個(gè)選自氮原子和/或氧和/或硫的雜原子，氮原子可選地被(C1-C5)烷基基團(tuán)取代；所述的烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、芳基-烷基、雜環(huán)或雜環(huán)-烷基基團(tuán)可選地被其它基團(tuán)取代，這些基團(tuán)選自鹵素、羥基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR12R13，其中R12和R13可以相同或不同，它們可以是氫、直鏈或分支的(C1-C5)烷基、-COOH基團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的一種酯；或-CONR14R15基團(tuán)，其中R14和R15，可以相同或不同，是氫、直鏈或分支的(C1-C5)烷基；或R10是C6-C10芳?；?，可選地被一或多個(gè)下述基團(tuán)取代鹵素，羥基，直鏈或分支的C1-C5烷基，直鏈或分支的C1-C5烷氧基，苯基，氰基，硝基，-NR16R17，其中R16和R17，可以相同或不同，是氫，直鏈或分支的C1-C5烷基；R10是聚氨基烷基殘基；或R10是葡萄糖殘基；n是0或1；R11是氫，直鏈或分支的C1-C5烷基，直鏈或分支的C1-C5烯基，C3-C10環(huán)烷基，直鏈或分支的(C3-C10)環(huán)烷基-(C1-C5)烷基，C6-C14芳基，直鏈或分支的(C6-C14)芳基-(C1-C5)烷基；R8和R9，可以相同或不同，是氫、羥基、直鏈或分支的C1-C5烷氧基；它們的N1-氧化物，單一異構(gòu)體，特別是-C(R11)＝N-O(n)R10基團(tuán)的順反異構(gòu)體，其可能的旋光對(duì)映體，非對(duì)映異構(gòu)體和相關(guān)的混合物，它們的藥學(xué)可接受的鹽及其活性代謝物。1999年3月9日申請(qǐng)的歐洲專利申請(qǐng)99830124.6記載了式(IV)化合物。至于式(IV)化合物，其中n是1，R10的定義如上，芳?；?，可以從喜樹堿7-醛(式IVa，R11氫)或喜樹堿7-酮(式IVa，R11不是氫)制備這些化合物。其中R7是-C(R11)＝O基團(tuán)，R11的定義如式(IV)，R8和R9的定義如式(IV)。式(IVa)化合物與式(Va)化合物R10O-NH2反應(yīng)，其中R10如上所述，產(chǎn)生式(I)化合物，其中R7是-C(R11)＝N-O-R10基團(tuán)，R10的定義如式(IV)，芳?；??？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行此反應(yīng)，此過程包括肟的正常生成。優(yōu)選地，喜樹堿7-醛或7-酮與羥胺的比例應(yīng)在1∶3-3∶1的范圍內(nèi)。也可以使用相關(guān)的羥胺鹽。在有堿存在的條件下進(jìn)行此反應(yīng)，如無機(jī)堿，例如碳酸鉀，或一種有機(jī)堿，如三乙胺或或二氮雜雙環(huán)壬烷，使用極性溶劑，優(yōu)選甲醇或乙醇，在從室溫至溶劑沸點(diǎn)溫度范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行反應(yīng)，可選地有脫水劑存在，如鈉或鎂的硫酸鹽，分子篩。如果需要，也可以在有催化劑如Lewis酸的條件下進(jìn)行此反應(yīng)。或者，可以從喜樹堿7-醛的肟(按Sawada等在《化學(xué)與藥學(xué)通報(bào)》39，2574(1991)記載的方法得到)，或喜樹堿7-酮的肟，或從相應(yīng)的7-?；矘鋲A，通過與一個(gè)R10-X鹵化物反應(yīng)制備上述化合物，其中X優(yōu)選碘，在極性溶劑如四氫呋喃或乙醇中，和在有堿如氫化鈉或碳酸鉀存在的條件下進(jìn)行此反應(yīng)。至于式(IV)化合物，其中n是1，R10是芳?；?，定義如式(IV)中所述，可以從喜樹堿7-肟制備這些化合物，在以上段落記載了其制備方法，用R10-COCl?；然铮跇O性溶劑中，在有堿存在的條件下，優(yōu)選吡啶，或直接在吡啶中進(jìn)行反應(yīng)，方法如Cho等在《有機(jī)化學(xué)雜志》62，2230(1997)所記載。至于式(IV)化合物，其中n是0，并且R10的定義如上，芳?；猓梢詮南矘鋲A7-醛(式IVa，R11氫)或喜樹堿7-酮(式IVa，R11不是氫)制備此化合物。其中R7是-C(R11)＝O基團(tuán)，R11如式(IV)的定義，R8和R9的定義如式(IV)中所定義。式(IVa)化合物與式(Vb)化合物R10-NH2反應(yīng)，其中R10的定義如上，產(chǎn)生式(IV)化合物，其中R7是-C(R11)＝N-R10基團(tuán)，R10的定義如式(IV)中所定義，芳?；??？梢杂盟帉W(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行此反應(yīng)，此過程包括正常形成亞胺。優(yōu)選地，喜樹堿7-醛或7-酮與亞胺的摩爾比應(yīng)在1∶3-3∶1的范圍。也可以使用相關(guān)的胺鹽。在有堿存在的條件下進(jìn)行此反應(yīng)，如一種無機(jī)堿，例如碳酸鉀，或一種有機(jī)堿，如三乙胺或二氮雜雙環(huán)壬烷，使用極性溶劑，優(yōu)選甲醇或乙醇，在從室溫至溶劑沸點(diǎn)溫度范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行反應(yīng)，可選地有脫水劑存在，如鈉或鎂的硫酸鹽，分子篩。如果需要，也可以在有催化劑如Lewis酸的條件下進(jìn)行此反應(yīng)，如Moretti和Torre在《合成》，1970，141，或Kobayashi等在《Synlett》1977，115記載的。歐洲專利申請(qǐng)EP0056692和上述Sawada等在《化學(xué)與藥學(xué)通報(bào)》39，2574(1991)發(fā)表的文章記載了喜樹堿7-醛和喜樹堿7-肟。按已知的異芳香氮氧化法制備式(IV)化合物的N1氧化物，優(yōu)選用醋酸或三氟醋酸和過氧化氫進(jìn)行氧化，或通過與有機(jī)過氧化酸反應(yīng)而進(jìn)行(A.Albini和S.Pietra，《雜環(huán)N-氧化物》，CRC，1991).關(guān)于R10的不同的意義，在不同的式V試劑中有所不同，這些試劑可以由市售得到，或可以按文獻(xiàn)記載的方法制備，本領(lǐng)域的專家可以借助這些文獻(xiàn)，補(bǔ)充他們所擁有的此領(lǐng)域的知識(shí)。用文獻(xiàn)記載的常規(guī)方法可以得到藥學(xué)上可接受的鹽，這不需要進(jìn)一步的描述。例87-芐氧基亞氨甲基喜樹堿(CPT172)500mg(1.33mmol)7-甲?；矘鋲A溶解在100ml乙醇中。加入15ml吡啶和638mg(4mmol)O-芐基羥胺鹽酸鹽。將溶液回流5小時(shí)。真空蒸發(fā)溶劑，在硅膠上用快速色譜法(flashchromatography)純化得到的殘余物，洗脫劑為己烷與乙酸乙酯4∶6的混合物。產(chǎn)率65％熔點(diǎn)200-205℃。得到的產(chǎn)品含有順式和反式異構(gòu)體比例為8∶2的混合物(異構(gòu)體ARf0.32；異構(gòu)體B，Rf0.19，使用Merck60F254硅膠；洗脫劑己烷∶乙酸乙酯為3∶7)。HPLC用安裝四元泵(quaternarypump)的儀器進(jìn)行此分析(HP1050)，使用Rheodyne注射器(20μl回路)和二極管陣列檢測(cè)器(HP1050)，使用HPLC-ChemStation程序進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。在200-600nm范圍內(nèi)得到光譜，并在360和400nm記錄色譜。使用有RP18預(yù)柱的C18反向色譜柱(RaininC18；25×0.4cm，Varian)。線性洗脫梯度進(jìn)行分析，從乙腈∶水＝30∶70開始在20分鐘內(nèi)達(dá)到乙腈100％，流速為1ml/分鐘。保留時(shí)間為異構(gòu)體B12.51分鐘，異構(gòu)體A為14.48分鐘。1H-NMR(300MHz；DMSO-d6)δ0.88(t，H3-18A+H3-18B)，1.878m，(H2-19A+H2-19B)，5.18(s，H2-5B)，5.21(8s，H2-PhB)，5.30(H2-PhA)，5.40(s，H2-5A)，5.45(s，H2-17A+H2-17B)，6.53(s，-OHA+-OHB)，7.3-7.6(m，ArA+ArB+H-14A+H-14B)，7.75(m，H-11A+H-11B)，7.85-7-95(m，H-10A+H-10B)，7.98(dd，H-12B)，8.18-8.27(m，H-12A+H9-B)，8.45(s，CH＝NB)，8.59(dd，H-9A)，9.38(s，CH＝NA).Massm/z481(M+100)374(30)330(70)300(30)273(20)243(20)91(34).例97-丁氧基亞氨基甲基喜樹堿(CPT184)將400mg(1.06mmol)7-甲?；矘鋲A溶解在80ml乙醇中。加入12ml砒啶和400mg(3.18mmol)O-t-丁基羥胺鹽酸鹽。溶液回流4小時(shí)。真空蒸發(fā)溶劑，在硅膠上用快速色譜法(flashchromatography)純化得到的殘余物，洗脫劑為己烷與乙酸乙酯4∶6的混合物。得到322mg(0.72mmol)黃色固體。產(chǎn)率68％熔點(diǎn)250℃。得到的產(chǎn)品含有順式和反式異構(gòu)體比例為約8∶2的混合物(異構(gòu)體ARf0.31；異構(gòu)體B，Rf0.24，Merck60F254硅膠；洗脫劑己烷∶乙酸乙酯為3∶7)。HPLC用安裝四元泵的儀器進(jìn)行此分析(HP1050)，使用Rheodyne注射器(20μl回路)和二極管陣列檢測(cè)器(HP1050)，使用HPLC-ChemStation程序進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。在200-600nm范圍內(nèi)得到光譜，并在360和400nm記錄色譜。使用有RP18預(yù)柱的C18反向色譜柱(RaininC18；25×0.4cm，Varian)。線性洗脫梯度進(jìn)行分析，從乙腈∶水＝30∶70開始在20分鐘內(nèi)達(dá)到乙腈100％，流速為1ml/分鐘。保留時(shí)間為異構(gòu)體B12.92分鐘，異構(gòu)體A為14.61分鐘。1H-NMR(300MHz；DMSO-d6)δ0.88(t，H3-18A+H3-18B)，1.30(s，t-but.B)，1.47(s，t-but.A)，1.87(m，H2-19A+H2-19B)，5.18(s，H2-5B)，5.37(H2-5A)，5.42(s，H2-17A+H2-17B)，6.54(s，-OHA+-OHB)，7.35(sH-14A)，7.36(s，H-14B)7.69-7.83(m，H-11A+H-11B)，7.85-7.98(m，H-10A+H-10B)，8.07(dd，H-9B)，8.16-8.27(m，H-9A+H-12B)8.40(s，CHB)，8.62(dd，H-12A)，9.31(s，CHA).Massm/z448(M+28)391(40)374(100)362(40)330(34)57(17).制備脂質(zhì)體本發(fā)明的化合物可以用來制備多層脂質(zhì)體(MLV)和單層脂質(zhì)體(SUV)，可以是干粉狀或水溶液中的懸浮物。用本發(fā)明的化合物，如例1-7所制備的，按以下方法制備脂質(zhì)體。將適宜量的化合物溶解在氯仿中；在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將溶液真空濃縮至干，直至得到一層脂質(zhì)膜。在高真空度下干燥脂質(zhì)膜直至除去最后的殘余溶劑，然后將脂質(zhì)膜溶解在叔丁醇或水中。將溶液冷凍干燥，得到一種柔軟的干燥粉末。用適宜量的水溶液將粉末水化，得到所用化合物的脂質(zhì)體，然后與多核苷酸或所需的藥物復(fù)合。另一種制備脂質(zhì)體的方法包括將一個(gè)脂質(zhì)膜吸附在一個(gè)適宜的惰性載體如山梨醇、甘露醇或其他藥學(xué)可接受的碳水化物上，此脂質(zhì)膜中包含一種溶解在溶劑中的本發(fā)明的化合物。將此混合物真空干燥，得到一種固體，在使用之前它可以方便而快速地水化。干燥粉末形式的制劑呈現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定性方面的改善，并且易于使用。另外，可以按以下步驟用本發(fā)明的化合物制備干粉狀的與DNA或所需藥物復(fù)合的脂質(zhì)體。將本發(fā)明的化合物溶解在叔丁醇或水中；將得到的溶液與DNA或所需藥物混合，將混合物冷凍干燥，得到一種柔軟的干燥粉末狀的復(fù)合物，我們將其定義為前脂質(zhì)體-DNA或前脂質(zhì)體-藥物。可以用得到的粉末(前脂質(zhì)體)制備通過氣霧劑形式給藥的藥物組合物，或當(dāng)其與水或適宜的緩沖溶液重組時(shí)，可以經(jīng)胃腸外或口服給藥。也可以用上述方法通過將脂質(zhì)膜吸附在惰性載體如山梨醇、甘露醇或其他碳水化物上，得到固體形式的與DNA或藥物復(fù)合的脂質(zhì)體。測(cè)試脂質(zhì)體的形成按以下步驟，使用水溶性染料，用比色法測(cè)定脂質(zhì)體的形成。得到一種水溶性染料偶氮胂III的水溶液(m.w.＝776.37；2.3mg/mL)。用此溶液替代水以水化用上述方法得到的脂質(zhì)膜。用水將一份含有包裹染料的脂質(zhì)體的懸浮液稀釋100倍。使用2mL此脂質(zhì)體懸浮液在660nm得到第一光學(xué)密度讀數(shù)；與定義為空白的相同的樣品進(jìn)行比較得到讀數(shù)。將200μlCaCl2溶液(15mg/mL；100mM)加入第一樣品中，在660nm以空白為背景測(cè)定光密度，向其中加入200μl水。將所得的吸收值作為讀數(shù)2。向樣品中加入100μl三硝基甲苯X-100(5％v/v；0.26％終濃度)溶液，向空白中加入200μl水；在660nm得到的對(duì)應(yīng)于光密度值的讀數(shù)定義為讀數(shù)3。用以下公式計(jì)算被包裹的染料的百分?jǐn)?shù)被包裹染料的百分?jǐn)?shù)提供了一個(gè)脂質(zhì)體形成的測(cè)定尺度，其平均值為40％；用激光散射法檢測(cè)脂質(zhì)體的體積，得到陽性結(jié)果。制備脂質(zhì)體的實(shí)施例制備以下形式的棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)a)冷凍干燥粉末在100mL燒瓶中將65mg，0.11mmol棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。蒸發(fā)溶液直至得到脂質(zhì)膜，將其真空干燥3小時(shí)。將得到的產(chǎn)物溶解在叔丁醇中，用液氮將此溶液快速冷卻至-70℃并冷凍干燥24小時(shí)。得到海綿狀柔軟白色固體。b)吸附的粉末將143mg，0.231mmol棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在10mL氯仿中。將得到的溶液以小部分分次倒入含有750mg山梨醇的100mL燒瓶中。加完各部分氯仿溶液后，快速蒸發(fā)氯仿。將得到的固體真空干燥3小時(shí)。得到893mg白色固體產(chǎn)物。使用前，用適當(dāng)體積的水將產(chǎn)物快速水化得到一等滲的溶液。c)MLV懸浮液在一100ML燒瓶中，將65mg，0.11mmol棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。將得到的溶液蒸發(fā)直至得到脂質(zhì)膜，將其真空干燥3小時(shí)。在30℃用10mL水將脂質(zhì)膜水化3小時(shí)，得到MLV懸浮液。將MLV懸浮液適當(dāng)稀釋，與多核苷酸或藥物復(fù)合，進(jìn)行生物測(cè)定。e)SUV懸浮液在100mL燒瓶中，將65mg，0.11mmol棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。將得到的溶液蒸發(fā)直至得到一脂質(zhì)膜，將其真空干燥3小時(shí)。在30℃，用10mL水將得到的脂質(zhì)膜水化3小時(shí)，得到MLV懸浮液。用孔徑為200nm的聚碳酸酯濾器將MLV懸浮液過濾10次。將如此得到的單層脂質(zhì)體懸浮液與多核苷酸或藥物復(fù)合并進(jìn)行生物測(cè)定。f)測(cè)定脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性用周期為30天的比濁法測(cè)定脂質(zhì)體懸浮液的物理穩(wěn)定性。每間隔一定時(shí)間，在600nm測(cè)定每個(gè)將被測(cè)試的懸浮液的吸收度。被測(cè)制劑在0時(shí)測(cè)得的平均吸收值保持不變。在考察期間內(nèi)被考察的分子呈現(xiàn)一致的值。可以通過將本發(fā)明的化合物與助性脂質(zhì)如膽固醇、1-棕櫚酰基-2-油?；字；憠A(POPC)或二油基磷脂?；憠A(DOPE)結(jié)合制備MLV和SUV脂質(zhì)體懸浮液?；衔锱c助性脂質(zhì)結(jié)合以得到具有更穩(wěn)定膜的脂質(zhì)體。以下在記載脂質(zhì)體制備的部分，給出了一個(gè)制備例，其中本發(fā)明的化合物與助性脂質(zhì)如膽固醇或POPC結(jié)合。制備傳遞藥物的脂質(zhì)體的實(shí)施例例10制備紫杉醇-ST983MLV脂質(zhì)體(1∶40)將20mg，0.0234mmol紫杉醇和556mg，0.9417mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿，將20mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液分成19份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時(shí)。每份固體含有紫杉醇(1.05mg)和ST983(29.2mg)。為得到最終的脂質(zhì)體懸浮液，在使用時(shí)將冷凍干燥產(chǎn)物用水(450μL)或其他鹽溶液水合，攪拌10分鐘，靜置30分鐘以完成膨脹(水合)過程。得到了MLV脂質(zhì)體。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測(cè)定脂質(zhì)體懸浮液的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測(cè)定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測(cè)定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。測(cè)定制劑中紫杉醇的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測(cè)定紫杉醇的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱μBondapackC-18洗脫劑乙腈∶水70∶30檢測(cè)器UV-VIS227nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間4.5分鐘針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得的紫杉醇的濃度為2.13mg/mL。被包裹的紫杉醇的濃度為98％。例11制備紫杉醇-ST983SUV脂質(zhì)體將20mg，0.0234mmol紫杉醇和556mg，0.9417mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿，將20mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液分成19份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時(shí)。每份固體含有紫杉醇(1.05mg)和ST983(29.2mg)。為得到最終的SUV脂質(zhì)體懸浮液，在0℃將已用PBS溶液(1mL)水合的冷凍干燥產(chǎn)物聲處理20分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性。用比濁法測(cè)定脂質(zhì)體懸浮液的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測(cè)定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測(cè)定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。測(cè)定制劑中紫杉醇的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測(cè)定紫杉醇的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱μBondapackC-18Eluent乙腈∶水70∶30檢測(cè)器UV-VIS227nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間4.5分鐘對(duì)SUV脂質(zhì)體懸浮液的HPLC分析產(chǎn)生與在同樣條件下相應(yīng)的MLV脂質(zhì)體懸浮液相同的結(jié)果，被包裹的紫杉醇的百分率為98％.24小時(shí)后重復(fù)進(jìn)行HPLC分析，除紫杉醇峰外，沒有新峰出現(xiàn)，顯示了活性成分的穩(wěn)定性。例12制備紫杉醇-ST983-膽固醇脂質(zhì)體(1∶15)制備這些類型的脂質(zhì)體以得到具有穩(wěn)定膜的復(fù)合物。將6mg，0.0101mmol紫杉醇，62.2mg，0.105mmolST983和40mg膽固醇溶解在10mL氯仿中。濃縮所得溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將6.3mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液分成5份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時(shí)。每份固體含有紫杉醇(1.2mg)和ST983(12.44mg)和膽固醇(8mg)。為得到最終的脂質(zhì)體懸浮液，在使用時(shí)將冷凍干燥產(chǎn)物用水(1000μL)或其他鹽溶液水合，攪拌10分鐘并靜置30分鐘以完成膨脹(水合)過程。得到MLV脂質(zhì)體。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測(cè)定脂質(zhì)體懸浮液的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測(cè)定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測(cè)定時(shí)間為6小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。例13制備紫杉醇-ST772SUV脂質(zhì)體(1∶70)將20mg，0.0234mmol紫杉醇和1485mg，1.638mmolST772溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將20mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中。為得到澄清的溶液，必須將其加熱到60℃。立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。為得到最終的SUV脂質(zhì)體懸浮液，將已用PBS溶液(20mL)水合的冷凍干燥產(chǎn)物在0℃聲處理20分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性。用比濁法測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測(cè)定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測(cè)定時(shí)間為6小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。例14制備CPT83-ST983MLV脂質(zhì)體(1∶40)將6.3mg，0.0168mmolCPT83(7-腈喜樹堿，記載于WO97/31003)和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液細(xì)分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。每份固體含有CPT83(0.525mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的脂質(zhì)體懸浮液，在使用時(shí)將冷凍干燥產(chǎn)品用水(1000μL)或其它鹽溶液水合，并攪拌10分鐘。得到MLV脂質(zhì)體。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性。用比濁法測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測(cè)定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測(cè)定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。測(cè)定制劑中CPT83的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測(cè)定CPT83的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測(cè)器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間4.033分鐘針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的CPT83濃度為0.502mg/mL。被包裹的CPT83百分率為99％。例15制備CPT83-ST983SUV脂質(zhì)體(1∶40)將6.3mg，0.0168mmolCPT83和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液細(xì)分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。每份固體含有CPT83(0.525mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的SUV脂質(zhì)體懸浮液，將冷凍干燥產(chǎn)品用水(1000L)水合，并在0℃聲處理40分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測(cè)定制劑中CPT83的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測(cè)定CPT83的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測(cè)器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間4.033分鐘針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的CPT83濃度為0.3mg/mL。被包裹的CPT83的百分率為59％。在24小時(shí)后重復(fù)進(jìn)行HPLC分析，除CPT83峰外未顯示新的峰，表明了化合物的穩(wěn)定性。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在600nm測(cè)定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測(cè)定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。例16制備CPT184-ST983MLV脂質(zhì)體(1∶40)將7.29mg，0.0168mmolCPT184和400mg，0.677mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液細(xì)分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。每份固體含有CPT184(0.607mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的脂質(zhì)體懸浮液，將冷凍干燥產(chǎn)品用水(1000μL)或其它鹽溶液水合，并攪拌10分鐘。得到MLV脂質(zhì)體。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在600nm測(cè)定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測(cè)定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。測(cè)定制劑中CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測(cè)定CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測(cè)器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間25.5分鐘針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得CPT184濃度為0.600mg/mL。包裹的CPT184百分率為99％。例17制備CPT184-ST983SUV脂質(zhì)體(1∶40)將7.29mg，0.0168mmolCPT184和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液細(xì)分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。每份固體含有CPT184(0.607mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的SUV脂質(zhì)體懸浮液，將冷凍干燥產(chǎn)品用水(1000L)水合，并在0℃聲處理40分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測(cè)定制劑中CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測(cè)定CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測(cè)器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間25.5分鐘針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的CPT184濃度為0.36mg/mL。被包裹的CPT184的百分率為70％。在24小時(shí)后重復(fù)進(jìn)行HPLC分析，除CPT184峰外未顯示新的峰，表明了活性成分的穩(wěn)定性。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在600nm測(cè)定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測(cè)定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。在以下實(shí)施例中，使用助性脂質(zhì)和/或低溫防護(hù)劑制備脂質(zhì)體。例18制備CPT184-ST983脂質(zhì)體在2L燒瓶中，向20mgCPT184和600mgST983中加入100ml甲基氯仿，并稍加熱直至完全溶解。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮得到的溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜，并在高效真空泵中干燥2小時(shí)。用乳糖溶液(6g/300ml水)在45℃將脂質(zhì)膜水合，在一個(gè)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中攪拌2小時(shí)。然后將懸浮液聲處理2小時(shí)，每個(gè)周期持續(xù)半小時(shí)。隨后將產(chǎn)品通過200nm濾器過濾并冷凍干燥。測(cè)定制劑中CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法確定CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性。產(chǎn)品在實(shí)驗(yàn)的24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測(cè)定制劑的物理穩(wěn)定性。在24小時(shí)的測(cè)定過程中，產(chǎn)品穩(wěn)定。顆粒體積也是穩(wěn)定的(平均值為100nm)。例19制備CPT184-ST983脂質(zhì)體按以下步驟制備1ml脂質(zhì)體(POPC-1-棕櫚?；?2-油?；字；憠A5mM；ST9831.25mM；CPT1840.25和海藻糖150mM)0.11mg，0.25μmolCPT184溶解在250μL乙酸乙酯中，3.79mg，4.89μmolPOPC溶解在100μL乙醇中，0.74mg，1.25μmolST983溶解在100μL乙醇中。將此三溶液混合在一起并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。在室溫及80mbar的條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸發(fā)除去。在暗處將脂質(zhì)膜干燥2小時(shí)。將脂質(zhì)膜懸浮在1ml的150mMD(+)海藻糖二水合物溶液中(Fluka，HPLC99％)，通過0.22nm濾器滅菌，并旋轉(zhuǎn)2分鐘。使懸浮液通過200nm聚碳酸酯濾器21次。將過濾后的脂質(zhì)體懸浮液在液氮中冷凍，并冷凍干燥2夜。得到白色固體。例20制備CPT184-ST983脂質(zhì)體使用例19的方法，不同的是使用500mM海藻糖。ST983脂質(zhì)體-抗癌劑復(fù)合物的抗癌活性如下所述，ST983脂質(zhì)體主要蓄積在肺部。此部位特異性使其在鼠科模型肺癌發(fā)生方面的應(yīng)用具有優(yōu)勢(shì)。此例中使用的抗癌劑是紫杉醇。為誘發(fā)體內(nèi)腫瘤，未麻醉的Balb/c小鼠在右后爪的股四頭肌處接受注射0.1mlRPMI-1640(Sigma)，其中有3×105細(xì)胞的鼠肺癌M109。植入腫瘤10天后，用磷酸鹽-緩沖鹽溶液(PBS，SIGMA，P-4417)稀釋脂質(zhì)體-紫杉醇復(fù)合物并以2.5mg/mLST983和75μg/mL紫杉醇的濃度靜脈注射。紫杉醇(paclitaxelINDENA)作為空白，以20mg/mL的濃度溶解在cremophor載體EL(BASF)中并在+4℃避光儲(chǔ)存另外24小時(shí)。使用時(shí)，用磷酸鹽-緩沖鹽溶液(PBS，SIGMA)稀釋并用和ST983脂質(zhì)體輸送的紫杉醇相同的體積和濃度靜脈注射。按1∶1的比例用乙醇稀釋制備cremophor。從接種腫瘤后的第10天開始連續(xù)給藥7天。持續(xù)觀察動(dòng)物直至接種后第17天，并脫頸椎處死動(dòng)物，取出肺測(cè)定轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目。在5mlBouin’s溶液中將肺培養(yǎng)10天進(jìn)行染色，以測(cè)定轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目，Bouin’s溶液中含有71％苦味酸飽和溶液、4.8％冰醋酸(Merck)，和24％的10％甲醛(Fluka)。在Bouin’s溶液中培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)移瘤計(jì)數(shù)。與未經(jīng)處理的對(duì)照小鼠比較，由cremophor輸送的紫杉醇未顯示降低肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目的效果，雖然后者小于未經(jīng)處理的對(duì)照鼠，然而與ST983脂質(zhì)體復(fù)合的紫杉醇顯示出降低肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目和體積的顯著效果。用針對(duì)未配對(duì)數(shù)據(jù)的Mann-Whitney無參數(shù)試驗(yàn)法對(duì)肺移植瘤數(shù)目進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得結(jié)果示于以下表1。表1在BALB/c小鼠體內(nèi)接種腫瘤M109和用紫杉醇及紫杉醇/脂質(zhì)體ST983處理后第17天的肺轉(zhuǎn)移瘤M＝平均值(1-2mm直徑)S＝小(＜1mm直徑)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)在96孔平板上測(cè)定對(duì)HeLa和M109細(xì)胞的毒性。鋪平板后，用所測(cè)定的分子對(duì)細(xì)胞再處理48小時(shí)。然后用PBS洗滌細(xì)胞，并將其置于正常的生長(zhǎng)條件下48小時(shí)。除去生長(zhǎng)介質(zhì)后，在冰上用16％TCA培養(yǎng)細(xì)胞，在水中洗滌3次，用硫氰酸胺(sulforhodamine)B(SRB)在1％醋酸中的溶液處理細(xì)胞30分鐘，在單純的1％醋酸中洗滌細(xì)胞3次，在pH10.5的TRIS10mM中培養(yǎng)20分鐘，最后在540nm讀取讀數(shù)。測(cè)定CPT83的細(xì)胞毒性進(jìn)行CPT83細(xì)胞毒性的體外測(cè)定以評(píng)價(jià)與脂質(zhì)體復(fù)合的抗癌劑的細(xì)胞毒性，作為對(duì)有效活性的初步預(yù)測(cè)。使用上述硫氰酸胺B試驗(yàn)評(píng)價(jià)在體外在M109細(xì)胞中脂質(zhì)體輸送CPT83的能力。另外，也評(píng)價(jià)了溶解在二甲亞砜(DMSO)中的CPT83的細(xì)胞毒性，以與和ST983脂質(zhì)體復(fù)合的相同分子的毒性進(jìn)行比較。在細(xì)胞毒性測(cè)定中使用脂質(zhì)體-CPT83復(fù)合物，其濃度示于以下表2.1，2.2和3.3，它是SUV和MLV構(gòu)型。所用的摩爾比為脂質(zhì)體∶CPT83＝40∶1。SUV和MLV構(gòu)型的ST983-CPT83復(fù)合物的細(xì)胞毒性平均值示于表2.1，2.2和2.3，它提示ST983脂質(zhì)體能以非常近似于DMSO的方式輸送CPT83，并顯示同樣數(shù)量等級(jí)的細(xì)胞毒性。表2.1ST983SUV-CPT83的細(xì)胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數(shù)。表2.2ST983MLV-CPT83的細(xì)胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數(shù)。表2.3DMSO-CPT83的細(xì)胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數(shù)。ST983脂質(zhì)體-CPT184復(fù)合物的生物活性測(cè)定例18脂質(zhì)體(以下命名為脂質(zhì)體A)和例20脂質(zhì)體(以下命名為脂質(zhì)體B)的生物活性。對(duì)健康小鼠的毒性按q4d×4(每日4次，給藥4天)的方案，以1.2mg/kg的劑量口服、靜脈注射脂質(zhì)體A和B，與游離的CPT184相比較。兩種脂質(zhì)體對(duì)體重、肺、脾和腎沒有顯著影響。靜脈注射脂質(zhì)體B，口服脂質(zhì)體A，與游離的CPT184相似，對(duì)胸腺產(chǎn)生影響。靜脈注射脂質(zhì)體A僅有小的影響。24小時(shí)后兩種脂質(zhì)體未使血液學(xué)參數(shù)顯示顯著的變化。，按qd5的方案靜脈注射脂質(zhì)A顯示與游離的CPT184相似的毒性。脂質(zhì)體的肺向性脂質(zhì)體A和B顯示主要在肺水平聚集。靜脈注射1.2mg/kg劑量的脂質(zhì)體。將溶解在DMSO中的游離CPT184以1.2mg/kg的劑量口服給藥。在最后一次給藥后24小時(shí)處死動(dòng)物，即健康小鼠。從動(dòng)物體取出肺在液氮中冷凍。當(dāng)融化后，將組織匯集并在0.1％醋酸/乙腈溶液中1∶5均質(zhì)化。將勻漿分成3份，2份加入CPT184測(cè)定回收率。在16,000g將3份樣品離心5分鐘。收集上清液并用二氯甲烷提取。用speedvac將有機(jī)相干燥，殘余物再次溶解在乙腈中以在50μL中含有相當(dāng)于一只動(dòng)物的量，在HPLC上加樣。在WatersSymmetryC183.5μm(4.6×7.5mm)上進(jìn)行HPLC。使用在370nm激發(fā)和510nm發(fā)射的Merck熒光計(jì)作為檢測(cè)器。洗脫劑是水/乙腈60∶40，等度洗脫。樣品體積為50μL。CPT184的回收率約為70％。脂質(zhì)體A和B的CPT184聚集水平高于DMSO中游離的CPT184，如圖3所示?；騻鬟f制備脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物將脂質(zhì)體和質(zhì)粒DNA分別適當(dāng)稀釋在PBS中。然后將DNA加到脂質(zhì)體中，將脂質(zhì)體DNA復(fù)合物在約4℃保持約30min以促進(jìn)形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體-DNA相互作用體。在體外試驗(yàn)中，使用1，2-二油?；?3-三甲基-銨丙烷(DOTAP)作為參考的陽離子脂質(zhì)；每2×105HeLa細(xì)胞使用2.5μg質(zhì)粒DNA，脂質(zhì)體濃度為9μM。在體內(nèi)試驗(yàn)中，使用DOTAP和[2，3(二油?；?丙基]三甲基銨(DOTMA)作為參考的陽離子脂質(zhì)。結(jié)果中的摩爾比定義為每毫克NDA中各陽離子脂質(zhì)的nmol濃度。在體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中，每只動(dòng)物使用25μg質(zhì)粒DNA。在這些試驗(yàn)中使用的質(zhì)粒pCMVluc含有受巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制的蟲螢光素酶基因cDNA。螢光素酶活性的定量測(cè)定用BoehringerMannheimkit(catno.1669893)方法測(cè)定細(xì)胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)螢光素酶活性。在PBS中洗滌細(xì)胞3次，然后從平板中移出，在溶胞緩沖液(lysisbuffer)(100mM磷酸鉀pH7.8.1mM二硫蘇糖醇-DTT)中散布成一層，然后進(jìn)行3次連續(xù)的冷凍融化循環(huán)。在1.5mLEppendorf試管中離心后，上清液在提取蛋白質(zhì)后5小時(shí)內(nèi)進(jìn)行發(fā)光試驗(yàn)。用在562nm的發(fā)光計(jì)測(cè)定發(fā)射出的光。在液氮中首次冷凍后細(xì)細(xì)研磨得到粉末。將組織再次懸浮在溶胞緩沖液中，在冰中培養(yǎng)10-15分鐘。然后將樣品在2mlEppendorf試管中離心，測(cè)定上清液的熒光素酶活性。斑點(diǎn)印跡分析按Sanbrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis在MolecularCloning(分子克隆)1989記載的堿性溶胞過程提取細(xì)胞DNA。使用Biorad斑點(diǎn)印跡裝置將從細(xì)胞中提取得到的5μgDNA預(yù)吸附在尼龍濾器(Boehringer)上。在65℃將這些濾器與含有0.5M焦磷酸鈉(NaPi)，1mMEDTA，7％SDS的溶液預(yù)雜交4小時(shí)。用質(zhì)粒pCMVlucDNA作模板和隨機(jī)接觸過抗原的AmershamKit制備32P(α)標(biāo)記的探針。使用1×106CPM/ml在42℃將濾器在同樣的預(yù)雜交緩沖液中雜交12小時(shí)。然后在65℃，在含有40mMNaPi，1％SDS的緩沖液中將濾器洗滌3次，每次10分鐘。借助磷光劑成像進(jìn)行放射自顯影分析，使用由β射線活化的磷光屏(phosphorscreens)，借助與圖像分析程序結(jié)合的光電倍增管系統(tǒng)讀數(shù)和測(cè)量。使用IP-LabGel圖像分析程序在斑點(diǎn)印跡上進(jìn)行的光密度法。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試驗(yàn)在體內(nèi)和體外進(jìn)行了一些質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。使用DOTAP和DOTMA作為參考陽離子脂質(zhì)，Abkenet等在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1993，90，6518充分表征和記載了其轉(zhuǎn)染效率。在體內(nèi)試驗(yàn)中，分析了陽離子脂質(zhì)與質(zhì)粒DNA各種不同的摩爾比，以測(cè)定各陽離子脂質(zhì)的活性和各自對(duì)于基因轉(zhuǎn)移最有效的濃度。用pCMVluc質(zhì)粒中含有的熒光素酶基因轉(zhuǎn)運(yùn)體評(píng)價(jià)了各種脂質(zhì)體體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)染能力，即以用于快速定量的相對(duì)發(fā)光單位(RLU)(以上已敘述)表述的其活性。如上所述，作為一種選擇，通過對(duì)從預(yù)吸收在硝酸纖維素濾器上(斑點(diǎn)印跡)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取并與32P-標(biāo)記的質(zhì)粒DNA標(biāo)記物雜交DNA樣品進(jìn)行光密度分析(磷光劑成像)，評(píng)價(jià)了一些陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率對(duì)ST983脂質(zhì)體∶DNA摩爾比的依賴性在此試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了肝、肺和心的轉(zhuǎn)染效率對(duì)ST983脂質(zhì)體∶質(zhì)粒DNA摩爾比的依賴性。對(duì)以下與每μgDNA對(duì)應(yīng)的納摩爾(nmol)脂質(zhì)體的比例12∶1，24∶1，36∶1和48∶1進(jìn)行了測(cè)定。小鼠每組6只，體重約為20g，用分散在200μlPBS中的上述數(shù)量的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物對(duì)其靜脈注射，在并在給予復(fù)合物24小時(shí)后處死。從肺、心和肝組織中提取的熒光素酶活性顯示了在所測(cè)定的所有摩爾比的情況下，熒光素酶主要在肺分布。實(shí)際上，從三種組織中提取得到的熒光素酶約99％分布在肺中。已證明最優(yōu)的脂質(zhì)體∶DNA摩爾比為12∶1。所得結(jié)果示于下表3。表3作為ST983∶DNA摩爾比(μgDNA)的函數(shù)的ST983體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率對(duì)SRT983脂質(zhì)體制劑之間的差異的依賴性將表示為相對(duì)發(fā)光單位(RLU)的熒光素酶活性值，報(bào)告于表4，所測(cè)試的蟲熒光素酶是從接受靜脈注射不同的ST983脂質(zhì)體制劑的Balb/c小鼠的肺提取得到的，脂質(zhì)體制劑中脂質(zhì)體∶DNA的摩爾比例為12∶1。所得數(shù)據(jù)，除證明ST983脂質(zhì)體能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒DNAI，其效率高于和/或類似于DOTMA外，也顯示了在不同ST983制劑之間的一定程度的變異性。這可能是由于一些物理化學(xué)特性如脂質(zhì)體囊的體積、或與不同的ST983制劑的單層(SUV)或多層結(jié)構(gòu)相關(guān)的囊的有關(guān)性質(zhì)造成的。實(shí)際上，R.I.Mahato等在《人類基因療法》9.19982083已充分說明了以上列出的物理化學(xué)參數(shù)，它們是達(dá)到最佳體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染效率的決定因素。表4ST983的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率(不同的制劑)<tablesid="table8"num="008"><tablewidth="733">脂質(zhì)體平均RLU/mg蛋白質(zhì)±s.d.肺ST983∶DNA摩爾比ST983/#72ST983/#73ST983/#4對(duì)照DOTMA3118235±1847267285835±8270671022117±604021523±983410125±18952012∶112∶112∶112∶1</table></tables>體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率對(duì)ST983-DNA脂質(zhì)體復(fù)合物預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的依賴性表5列出了從接受靜脈注射ST983脂質(zhì)體的小鼠的肝、肺、心提取得到的相對(duì)發(fā)光單位，此脂質(zhì)體在給藥前與質(zhì)粒DNA預(yù)培養(yǎng)30分鐘或3小時(shí)。用與DNA預(yù)培養(yǎng)3小時(shí)的ST983處理的動(dòng)物與用預(yù)培養(yǎng)30分鐘的相同脂質(zhì)體處理的動(dòng)物相比，在肺和心的熒光素酶活性方面顯示增長(zhǎng)到5倍。此結(jié)果提示穩(wěn)定的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的形成具有時(shí)間依賴性，并且在測(cè)定體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率方面具有關(guān)鍵的作用。表5ST983的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率作為脂質(zhì)體/DNA預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的函數(shù)<tablesid="table9"num="009"><tablewidth="832">脂質(zhì)體時(shí)間平均RLU/mg蛋白質(zhì)±s.d.T983∶DNA摩爾比肝肺心ST983ST98330分鐘3h3526±2602497±682874882±659174225656±2117318118±26337100±185312∶112∶1</table></tables>ST772脂質(zhì)體在HeLa細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染圖1和2顯示ST772脂質(zhì)體在HeLa細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率。為此目的，從ST272轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取DNA進(jìn)行了光密度分析，用DOTAP作為對(duì)照陽離子脂質(zhì)。斑點(diǎn)分析的結(jié)果顯示質(zhì)粒DNA的數(shù)量與由DOTAP得到的結(jié)果在相同數(shù)量級(jí)。權(quán)利要求1.含有式(II)化合物的脂質(zhì)體的用途，用于輸送藥物或有化妝品活性的物質(zhì)，其中R3是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的酰基鏈；R4是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的烷基鏈；并且X-是藥理學(xué)可接受的酸的陰離子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中R3優(yōu)選壬?；⑹轷；?、肉豆蔻?；⒆貦磅；⒂仓；蛴王；?。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中R4優(yōu)選壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中X-選自氯、溴、碘、門冬氨酸根、酸式門冬氨酸根、檸檬酸根、酸式檸檬酸根、酒石酸根、酸式酒石酸根、磷酸根、酸式磷酸根、延胡索酸根、酸式延胡索酸根、甘油磷酸根、葡萄糖磷酸根、乳酸根、順丁烯二酸根、酸式順丁烯二酸根、粘酸根、乳清酸根、草酸根、酸式草酸根、硫酸根、酸式硫酸根、三氯醋酸根、三氟醋酸根、甲磺酸根、雙羥萘酸根和酸式雙羥萘酸根。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的用途，其中的化合物選自-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯；-棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯；-肉豆蔻?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯；-棕櫚酰基L-肉堿溴化物十六烷基酯；-油?；鵏-肉堿氯化物油基酯.6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物選自抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗原生動(dòng)物劑，具有心血管系統(tǒng)活性的化合物，或免疫原性肽。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述的藥物是抗癌劑或抗血管生成劑.8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述的抗癌劑選自紫杉醇或喜樹堿的衍生物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述的喜樹堿的衍生物選自-7-芐氧基亞氨甲基喜樹堿或-7-丁氧基亞氨基甲基喜樹堿。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中脂質(zhì)體還含有輔助性脂質(zhì)。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中的輔助性脂質(zhì)選自膽固醇，1-棕櫚?；?2-油酰基磷脂?；憠A或二油基磷脂?；憠A。12.含有根據(jù)權(quán)利要求1所述脂質(zhì)體的組合物，用于輸送藥物或具有化妝品活性的物質(zhì)。13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中所述的藥物選自抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗原生動(dòng)物劑，具有心血管系統(tǒng)活性的藥物，或免疫原性肽。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的組合物，可以通過口服、腸道外、肌內(nèi)、靜脈注射、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。全文摘要公開了L－肉堿和烷?；鵏－肉堿的酯，它們可以作為陽離子脂質(zhì)用于細(xì)胞內(nèi)釋放藥理學(xué)的活性化合物。也公開了具有式(II)結(jié)構(gòu)的L－肉堿和烷?；鵏－肉堿的新酯，其中R基團(tuán)的定義如說明書所述。文檔編號(hào)C07C229/00GK1823731SQ200510129598公開日2006年8月30日申請(qǐng)日期2000年4月11日優(yōu)先權(quán)日1999年4月13日發(fā)明者C·匹薩諾,M·O·廷提,M·圣塔尼羅,L·克里泰利,G·薩爾瓦托利申請(qǐng)人:希格馬托制藥工業(yè)公司