專利名稱：快速富集痕量多肽或蛋白質(zhì)并實現(xiàn)鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生化分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽和蛋白質(zhì)痕量樣品快速富集和鑒定的方法。
背景技術(shù)：
在后基因組時代，蛋白質(zhì)組研究越來越受到國內(nèi)外科學(xué)工作者的密切關(guān)注，而基質(zhì)輔助激光解析離子源(MALDI)的發(fā)明和成功應(yīng)用，已使生物質(zhì)譜成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中重要的技術(shù)平臺。低豐度蛋白的分析與鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點和難點內(nèi)容之一。在生物體中承擔(dān)重要生命活動的蛋白往往都是低豐度蛋白，然而其極低的含量給后續(xù)的分析和檢測帶來困難，限制了人們對它們的研究和認識。因此低豐度蛋白的有效濃縮是實現(xiàn)其準(zhǔn)確分析和鑒定的重要條件之一。實際上在蛋白質(zhì)組學(xué)研究過程中許多方面都涉及到樣品的有效富集，以膠內(nèi)酶解樣品的分析為例酶解肽段提取液的體積太大，在質(zhì)譜分析前必須濃縮。目前最常用的樣品濃縮方法有溶劑蒸發(fā)法和色譜濃縮法。溶劑蒸發(fā)法多費時費力，在干燥過程中容器表面的吸附會造成大量的肽段損失，同時無機鹽等雜質(zhì)也會被濃縮，影響質(zhì)譜鑒定的靈敏度；色譜濃縮法是利用樣品與吸附劑之間的色譜相互作用對樣品進行濃縮，疏水性強的樣品難以被洗脫，而親水性的肽段由于與反相填料的作用力弱而回收率差，存在樣品岐視效應(yīng)，如反相色譜。
最近我們實驗室將納米沸石粒子成功的用于痕量蛋白/多肽濃縮-MALDI-MS直接分析。納米沸石具有豐富可調(diào)的表面性質(zhì)、外表面獨特的離子交換性、非常大的活性外表而、均勻分布的納米孔口吸附等特性，可以與多肽和蛋白溶液形成均勻穩(wěn)定的溶液，有利于樣品富集的進行。但是上述方法富集時間較長，達90分鐘；而且固體顆粒帶入質(zhì)譜，一方面會影響信號穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，另一方面由于納米顆粒的濺射容易污染質(zhì)譜離子光學(xué)通道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、效率高、速度快、重現(xiàn)性好的能對痕量蛋白或多肽進行富集并直接進行鑒定的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下利用記號為CaCO3-PMMA的以納米碳酸鈣粒子表面原位乳液聚合接枝包覆的聚甲基丙烯酸甲酯材料作為納米吸附劑對多肽和蛋白樣品吸附，對痕量多肽或蛋白進行富集后，通過去核保證多肽或蛋白質(zhì)的全提取并直接完成無固態(tài)顆粒化——基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜的分析檢測，具體步驟是(1)以CaCO3-PMMA作為納米吸附劑，對多肽或蛋白質(zhì)樣品的溶液進行富集，樣品溶液濃度是1×10-15mol/μL至1×10-10mol/μL，富集時間在10-12分鐘之間，富集溫度在25-37攝氏度之間，CaCO3-PMMA的溶液濃度在10-15mg/ml之間；(2)對富集了樣品的CaCO3-PMMA溶液進行離心、去核處理，將富集的多肽或蛋白質(zhì)及PMMA鏈混合物直接與有機基質(zhì)在靶板上均勻混合，形成均勻細致的結(jié)晶，進行基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜分析；(3)根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，鑒定多肽或蛋白質(zhì)。
上述方法中，所述去核處理，是將含有乙酸的乙腈溶液與經(jīng)離心處理后去除上清液而收集的下層固體相混合均勻，進行全提取。所述有機基質(zhì)可以是2-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)，用量為4-10mg/ml。
本發(fā)明使用的CaCO3-PMMA材料，其核心納米CaCO3顆粒粒徑在60-100nm范圍內(nèi)較為合適，其表面原位乳液聚合接枝包覆的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)以間同(rr)立構(gòu)結(jié)構(gòu)為主，其含量約10-30wt％。該組合納米材料不僅擁有較大的比表面積，而且通過疏水性相互作用等作用力對多肽或蛋白質(zhì)具有高效吸附作用，更重要的是該納米材料在固態(tài)時，PMMA鏈?zhǔn)前苍贑aCO3顆粒表面，而當(dāng)其被投入溶液中時，PMMA鏈會逐漸展開，并延伸至溶液的各個角落，就像海洋里章魚的觸腳一樣，可快速吸附多肽或蛋白質(zhì)；隨后的離心過程將吸附了樣品的CaCO3-PMMA材料離心至溶液底部，待棄除上清液，加入含有乙酸的乙腈溶液(4-5μL)混勻后，納米材料的核心CaCO3與酸反應(yīng)生成醋酸鈣沉淀，此時納米吸附劑的物理結(jié)構(gòu)被完全破壞，所以能夠基本實現(xiàn)多肽或蛋白樣品的全提取，離心后的上清含有富集的樣品和PMMA鏈，而PMMA鏈這種聚合物的存在會促使樣品與基質(zhì)形成更均勻細致的結(jié)晶。
本發(fā)明使用含有乙酸的乙腈溶液對富集有樣品的納米材料進行去核處理，同時完成被富集樣品的全提取，靶板上形成的均勻細致的結(jié)晶可以提高樣品的離子化效率，并保證了樣品分析的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
本發(fā)明使用的CaCO3-PMMA材料對多肽或蛋白都有吸附作用，可以與基質(zhì)形成均勻細致的結(jié)晶，保持基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析信號的穩(wěn)定性。本方法操作簡單、快速、效率高、質(zhì)譜重現(xiàn)性好。
本發(fā)明利用納米碳酸鈣球表面原位聚合聚甲基丙烯酸甲酯材料，對多肽和蛋白樣品進行快速、高效富集，通過去核操作，對所富集的樣品進行無固態(tài)顆?；|(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜的分析和鑒定，避免了樣品損失，增強了系統(tǒng)的耐鹽性。
本發(fā)明對多肽的富集效率可高達240倍以上。含有100×10-3mol/L碳酸氫氨的5×10-15mol/μL的蛋白質(zhì)酶解樣品也可以通過本發(fā)明闡述的方法獲得鑒定。


圖1為本富集方法流程示意圖。
圖2為1fmol/μL三個標(biāo)準(zhǔn)多肽混合物樣品的MALDI-TOF-MS譜圖。(a)是富集前，(b)是1mL樣品溶液富集后得到的。(b)得到的樣品信號的信噪比是富集前(a)的240-260倍。
圖3為500fmol/μL細胞色素c蛋白的MALDI-TOF-MS譜圖。(a)是1mL樣品溶液富集后得到的，(b)是富集前得到的。(a)相當(dāng)于未富集的90pmol/μL蛋白樣品得到的譜圖。
圖4為600fmol/μL馬心肌紅蛋白的MALDI-TOF-MS譜圖。(a)富集前得到的，(b)是10分鐘富集、離心后上清液得到的，(c)是1mL樣品溶液富集后得到的。(a)相當(dāng)于未富集的100pmol/μL蛋白樣品得到的譜圖。(b)顯示出經(jīng)過10分鐘富集后，絕大部分蛋白都被富集、離心至固態(tài)相中，上清液中殘余很少。
圖5為5fmol/μL馬心肌紅蛋白酶解肽段樣品的MALDI-TOF-MS譜圖。(a)是富集前得到的信號，(b)是人為加入100mM的碳酸氫氨作為干擾污染物后得到的信號。(c)是鹽存在的情況下富集后得到的信號?？梢钥吹皆谶@么大濃度鹽的干擾下，傳統(tǒng)方法根本測不到這么痕量的肽段，而CaCO3-PMMA材料卻可以得到非常好的信號。富集前不加鹽的溶液只測到4條肽，覆蓋率只有10％，而被污染溶液富集后卻能測到10條肽，覆蓋率達到70％。
圖6為10μL10mg/mL的納米材料懸濁液置于1mL10fmol/μL的標(biāo)準(zhǔn)多肽1溶液中分別孵育不同的時間，離心不同時間后取上清液點靶用質(zhì)譜檢測肽段的分子信號。每個點的強度信號是單獨7次質(zhì)譜信號平均的結(jié)果。在10fmol/μL沒有放置納米材料的原始溶液中，肽的平均信號強度達到432.9，但是8-9分鐘的時候質(zhì)譜的信號以相當(dāng)微弱，9-10分鐘以后質(zhì)譜已無法在上清液中檢測到肽段信號。從中我們可以發(fā)現(xiàn)納米材料具有快速的富集特性，能在8-10分鐘內(nèi)就將肽段分子基本富集完全。
圖7為傳統(tǒng)基質(zhì)點樣與納米材料富集樣品后點樣兩組質(zhì)譜數(shù)據(jù)的對照。我們選取了質(zhì)譜信號強度相當(dāng)?shù)膬山M溶液點樣A曲線是使用傳統(tǒng)方法采用基質(zhì)CHCA直接點覆0.5μL200fmol/μL的多肽1溶液，B曲線是使用納米材料富集1mL 1fmol/μL多肽1溶液后取上清液0.5μL和等體積CHCA基質(zhì)混合點樣的方法而得到的，每種方法各做20個樣點，每個樣點的質(zhì)譜數(shù)據(jù)是800個Laser Shots取得的。從中我們可以明顯的看出采用納米CaCO3-PMMA材料富集樣品后的方法相比傳統(tǒng)基質(zhì)方法具有更好的樣點-樣點間重現(xiàn)性。
圖中標(biāo)號1為PMMA，2為CaCO3，3是將CaCO3-PMMA材料放入溶液中，4為樣品溶液，5為37攝氏度孵育富集過程，6為離心后棄除上清液，7為二次離心，8為點靶送至MALDI-MS質(zhì)譜分析，9是第一次離心，10是加入含有乙酸的乙腈溶液并混勻。
具體實施例方式
下面的實例是對本發(fā)明提出的利用納米材料快速富集痕量多肽或蛋白質(zhì)并實現(xiàn)無固態(tài)顆?；|(zhì)譜分析的方法的進一步說明。
實施例1CaCO3-PMMA材料對多肽的吸附行為的研究配制1fmol/μL級別的多肽混合液(標(biāo)準(zhǔn)多肽1、2、3溶于50％ACN50％H2O中)，取0.5μL溶液與等體積的α-CHCA基質(zhì)溶液(0.1％TFA的50％乙腈水溶液)在MALDI靶板上混合，干燥結(jié)晶后進行MALDI-TOF/MS分析，見圖2a。將納米CaCO3-PMMA材料在上述溶液中孵育10分鐘后離心10分鐘，棄除上清液，然后取5μL含乙酸(0.2μL)的乙腈溶液重新混勻固定相，離心5分鐘，取上清液(最終的含有肽/PMMA鏈的ACN上清溶液)0.5μL與等體積的α-CHCA基質(zhì)溶液(0.1％TFA的50％乙腈水溶液)在MALDI靶板上混合干燥結(jié)晶后進行MALDI-TOF/MS分析，結(jié)果見圖2b。
實施例2CaCO3-PMMA材料對細胞色素c蛋白的吸附研究調(diào)整樣品溶液為500fmol/μL的細胞色素c蛋白溶液(50％ACN50％H2O)，其它條件不變，重復(fù)上述富集實驗。得到的結(jié)果參見附圖3所示。
實施例3CaCO3-PMMA材料對馬心肌紅蛋白的吸附研究調(diào)整樣品溶液為600fmol/μL的馬心肌紅蛋白溶液(50％ACN50％H2O)，其它條件不變，重復(fù)上述富集實驗。得到的結(jié)果參見附圖4a和c所示。圖4b是是納米CaCO3-PMMA材料在上述溶液中孵育10分鐘后離心10分鐘，然后取上清液0.5μL與等體積的α-CHCA基質(zhì)溶液(0.1％TFA的50％乙腈水溶液)在MALDI靶板上混合干燥結(jié)晶后進行MALDI-TOF/MS分析的結(jié)果。
實施例4對蛋白質(zhì)酶解物及耐鹽性的研究調(diào)整樣品溶液為加了100mM濃度碳酸氫氨的5fmol/μL馬心肌紅蛋白酶解肽段溶液(溶劑為50％乙腈、50％水)，其它條件不變，重復(fù)上述富集實驗。得到的結(jié)果參見附圖5所示?？梢钥吹皆谶@么大濃度鹽的干擾下，傳統(tǒng)方法根本測不到這么痕量的肽段(圖5b)，而CaCO3-PMMA材料卻可以得到非常好的信號(圖5c)。富集前不加鹽的溶液只測到4條肽，覆蓋率只有10％，而被污染溶液富集后卻能測到10條肽，覆蓋率達到70％。
實施例5快速富集的驗證將10μL10mg/mL的納米材料懸濁液置于1mL10fmol/μL的多肽1溶液中分別孵育不同的時間，離心不同時間后取上清液點靶用質(zhì)譜檢測肽段分子信號，詳情見圖6，圖6中每個點的強度信號是單獨7次質(zhì)譜信號平均的結(jié)果。在10fmol/μL沒有放置納米材料的原始溶液中，肽的平均信號強度達到432.9，但是8-9分鐘的時候質(zhì)譜的信號以相當(dāng)微弱，9-10分鐘以后質(zhì)譜已無法在上清液中檢測到肽段信號。從圖6中我們可以發(fā)現(xiàn)納米材料具有快速的富集特性，能在8-10分鐘內(nèi)就將肽段分子基本富集完全。
實施例6質(zhì)譜數(shù)據(jù)重復(fù)性方面的實驗為了說明納米CaCO3-PMMA材料富集樣品對于質(zhì)譜數(shù)據(jù)重復(fù)性方面的貢獻，我們做了傳統(tǒng)基質(zhì)點樣與納米材料富集樣品后點樣兩組數(shù)據(jù)的對照，實驗結(jié)果呈現(xiàn)于圖7。我們選取了最終質(zhì)譜信號強度相當(dāng)?shù)膬山M溶液點樣A曲線是使用傳統(tǒng)方法采用基質(zhì)CHCA直接點覆0.5μL200fmol/μL的多肽1溶液，B曲線是使用納米材料富集1mL 1fmol/μL多肽1溶液后取上清液0.5μL和等體積CHCA基質(zhì)混合點樣的方法而得到的，每種方法各做20個樣點，每個樣點的質(zhì)譜數(shù)據(jù)是800個Laser Shots取得的。從圖7中我們可以明顯的看出采用納米PMMA-CaCO3材料富集樣品后的方法相比傳統(tǒng)基質(zhì)方法具有更好的樣點-樣點間重現(xiàn)性。A方法得到的樣品肽段分子強度從2000到11000變化，是由于金屬靶板上的微區(qū)多樣性、溶劑揮發(fā)時間不同等因素干擾導(dǎo)致不同部位樣品分子/基質(zhì)分子比的重大差異從而導(dǎo)致重現(xiàn)性較差。而B方法得到的樣品質(zhì)譜信號強度則基本穩(wěn)定在5000-7000之間，保持了較好的質(zhì)譜信號。這是由于采用納米材料富集肽段溶液后，點樣的溶液是富集有肽段的PMMA線性鏈，這種線性鏈在溶液中的存在形態(tài)有利于在各區(qū)域形成穩(wěn)定的樣品分子/基質(zhì)分子比，從而得到較好的樣點-樣點間重現(xiàn)性。
下表是實施例中使用的三種標(biāo)準(zhǔn)多肽和兩種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的性質(zhì)

權(quán)利要求
1.一種快速富集痕量多肽或蛋白質(zhì)并實現(xiàn)無固態(tài)顆?；|(zhì)譜分析的方法，其特征是利用記號為CaCO3-PMMA的以納米碳酸鈣粒子表面原位乳液聚合接枝包覆的聚甲基丙烯酸甲酯材料作為納米吸附劑對多肽和蛋白樣品吸附，對痕量多肽或蛋白進行富集后，通過去核保證多肽或蛋白質(zhì)的全提取并直接完成無固態(tài)顆?；|(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜的分析檢測，具體步驟是(1)以CaCO3-PMMA作為納米吸附劑，對多肽或蛋白質(zhì)樣品的溶液進行富集，樣品溶液濃度是1×10-15mol/μL至1×10-10mol/μL，富集時間在10-12分鐘之間，富集溫度在25-37攝氏度之間，CaCO3-PMMA的溶液濃度在10-15mg/ml之間；(2)對富集了樣品的CaCO3-PMMA溶液進行離心、去核處理，將富集的多肽或蛋白質(zhì)及PMMA鏈混合物可直接與有機基質(zhì)在靶板上均勻混合，形成均勻細致的結(jié)晶，進行基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜分析；(3)根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，鑒定多肽或蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述CaCO3-PMMA中CaCO3平均粒徑為60-100nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述去核處理是利用含有乙酸的乙腈溶液與經(jīng)離心處理后去除上清液而收集的下層固體相混合均勻，進行樣品全提取。
全文摘要
本發(fā)明是一種以納米碳酸鈣粒子表面原位聚合聚甲基丙烯酸甲酯材料(簡稱CaCO
文檔編號G01N30/72GK1811406SQ200610023670
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日
發(fā)明者賈韋韜, 陸豪杰, 陳雪花, 楊芃原 申請人:復(fù)旦大學(xué)