專利名稱：新型乙型肝炎病毒表面抗原確認試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis Virus B SurfaceAntigen，簡稱HBsAg)免疫檢測方法與試劑盒，特別涉及HBsAg酶免疫檢測呈“陽性”(有反應(yīng)性)或在“灰區(qū)”范圍內(nèi)的樣本檢測結(jié)果得到確認的檢測方法與試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，簡稱HBV)是乙型肝炎的病原體。HBsAg是HBV的重要血清學標志。在血清(或其他體液)中存在HBsAg表明受檢者感染HBV。HBsAg實驗室檢測方法主要為免疫測定，常用的是放射免疫法(RIA)和酶免疫檢測(EIA)，目前尤以酶免疫檢測使用最為廣泛。
HBsAg酶免疫檢測的基本原理和操作步驟如下(參見

圖1)在聚苯乙烯微板的反應(yīng)孔內(nèi)包被針對HBsAg的特異性抗體(抗-HBs)，在反應(yīng)孔中加入待測樣本，保溫反應(yīng)、洗滌后加入酶標記的抗-HBs，如果樣本中含有HBsAg，則在反應(yīng)孔上通過橋接，形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs·酶復(fù)合物，再通過酶催化底物進行顯色反應(yīng)。樣本的吸光度值大于Cutoff值(臨界值)為陽性(有反應(yīng)性)，小于Cutoff值為陰性。
在以上經(jīng)典的兩步法酶免疫檢測中有兩個特異性的抗原抗體反應(yīng)，第一個是樣本中的HBsAg與反應(yīng)孔上包被的抗-HBs反應(yīng)，洗滌去除樣本中未結(jié)合到反應(yīng)孔上的物質(zhì)，再加入酶標記抗-HBs進行第二個反應(yīng)，即反應(yīng)孔上的HBsAg與酶標記抗-HBs的反應(yīng)。
由于抗原抗體反應(yīng)和酶與底物反應(yīng)的強度與反應(yīng)的時間和溫度在一定范圍內(nèi)成正比，因此酶免疫檢測的敏感性與測定中反應(yīng)的溫度和時間有直接關(guān)系。
為了簡化檢測步驟和縮短檢測時間，國產(chǎn)的HBsAg酶免疫檢測試劑多采用一步快速法，即將樣本和酶標記抗-HBs同時加入，兩次抗原抗體反應(yīng)合并為一次，如圖2。
這種一步快速法總體上講也能滿足臨床需要，但由于缺乏了兩步法中第一步反應(yīng)后的洗滌，樣本中如有非特異性干擾物存在，測定中可能促發(fā)假陽性反應(yīng)。另外，為了縮短反應(yīng)時間，快速法試劑成份的改變也增加了非特異性反應(yīng)出現(xiàn)的可能性。
在HBsAg的酶免疫檢測中，很多原因可導致假陽性反應(yīng)。例如樣本中可能存在非特異性的干擾物質(zhì)。此外，如果HBsAg酶免疫檢測試劑的包被抗體和酶標記抗體都使用了鼠源性單克隆抗體，則部分人群體內(nèi)含有的人抗鼠抗體(HAMA)會橋接包被抗體和酶標記抗體，也能造成假陽性反應(yīng)。由于HBsAg陽性可作為HBV感染的一種依據(jù)，國外對于HBsAg酶免疫檢測呈陽性的樣本稱為有反應(yīng)性，一般都要進行確認，排除假陽性反應(yīng)后才能報告HBsAg陽性。
國外HBsAg酶免疫檢測試劑的實際敏感度一般顯著高于其標示的敏感度，加之國外試劑的精密度較好(Cutoff值附近的變異系數(shù)小于10％)，因此低于Cutoff值的樣本即可判為HBsAg陰性，而高于或等于Cutoff值的樣本則須進行確認以排除假陽性。
國產(chǎn)HBsAg酶免疫檢測試劑由于采用了短反應(yīng)時間的一步法，更增加了出現(xiàn)非特異性反應(yīng)的可能。國產(chǎn)HBsAg酶免疫檢測試劑的實際敏感度一般與其標示的敏感度相接近，精密度也略差(出廠時要求變異系數(shù)小于15％，臨床測定中的變異系數(shù)可能更高)，因此測定數(shù)值在Cutoff值上下一定范圍內(nèi)的樣本就無法確定其是有反應(yīng)性還是無反應(yīng)性，而出現(xiàn)所謂的“灰區(qū)”問題。為此，樣本檢測結(jié)果如在此“灰區(qū)”范圍內(nèi)，HBsAg的確認試驗不僅要確認屬于“有反應(yīng)性”的樣本是否為HBsAg陽性，也要排除實際屬于“無反應(yīng)性”的HBsAg陰性樣本。因此與國外的試劑盒比較，對國產(chǎn)HBsAg酶免疫檢測試劑盒有反應(yīng)性的(即所謂的“陽性”)檢測結(jié)果的確認更加復(fù)雜并十分必要。
因此為進一步確認HBsAg酶免疫檢測的有反應(yīng)性的結(jié)果，排除目前該檢測方法中存在的假陽性，本發(fā)明旨在建立一種HBsAg的確認方法并生產(chǎn)開發(fā)出相應(yīng)的確認試劑，對HBsAg酶免疫檢測結(jié)果呈有反應(yīng)性(陽性)或在“灰區(qū)”范圍內(nèi)的樣本進行確認，從而克服目前不能對國產(chǎn)HBsAg酶免疫檢測試劑有反應(yīng)性的樣本進行確認的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過使用特異性抗體(抗-HBs)中和檢測樣本中的HBsAg，再進行HBsAg免疫檢測，以達到對HBsAg免疫檢測有反應(yīng)性的樣本進行確認的目的。
本發(fā)明的第一方面涉及一種確認HBsAg有反應(yīng)性的檢測樣本為HBsAg陽性的免疫檢測方法，包括向所述樣本中加入特異性抗-HBs抗體；另外向所述樣本中加入不含特異性抗-HBs抗體的對照試劑作為對照；對所述加入特異性抗-HBs抗體的樣本及不加入特異性抗-HBs抗體的對照分別進行HBsAg免疫檢測；及將加入所述特異性抗-HBs抗體的樣本檢測結(jié)果與不加入所述特異性抗-HBs抗體的對照檢測結(jié)果進行比較，其中加入所述特異性抗-HBs抗體的樣本檢測結(jié)果比對照的免疫檢測結(jié)果有至少30％的下降，優(yōu)選下降至少為50％，提示所述樣本為HBsAg陽性。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述免疫檢測是HBsAg酶免疫檢測，所述檢測結(jié)果為吸光度值。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述抗-HBs試劑的濃度可選范圍為500IU/L至5000IU/L。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述方法進一步包括在免疫檢測前將所述樣本用溶劑進行稀釋的步驟。優(yōu)選所述稀釋的比例為1∶50，1∶100，1∶1000，1∶10000，或在此范圍內(nèi)的稀釋度。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述有反應(yīng)性為HBsAg酶免疫檢測結(jié)果在“灰區(qū)”范圍。
在本發(fā)明的一個實施方案中，當所述有反應(yīng)性為HBsAg酶免疫檢測結(jié)果在“灰區(qū)”范圍時，優(yōu)選將所述檢測結(jié)果的吸光度值提高至高于“灰區(qū)”的上限，其包括選自以下的步驟1)延長所述樣本與所述特異性抗體的反應(yīng)時間至30分鐘～2小時；2)提高所述樣本與所述特異性抗體的反應(yīng)溫度至35℃～42℃；3)對所述樣本與所述特異性抗體反應(yīng)后進行洗滌，然后再加入所述酶標記抗體；4)延長加入所述酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)時間至30分鐘～4小時；5)提高加入所述酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)溫度至35℃～42℃；6)延長所述酶標記抗體與底物的反應(yīng)時間至30分鐘～1小時；以及7)加大所述樣本的加入量至50μl～500μl。
本發(fā)明的第二方面涉及一種對HBsAg酶免疫檢測結(jié)果為有反應(yīng)性的樣本進行HBsAg確認的試劑盒，該試劑盒包括特異性抗-HBs抗體試劑；及說明本發(fā)明所述對有反應(yīng)性的樣本進行HBsAg確認的操作步驟與檢測結(jié)果的說明書。
本發(fā)明試劑盒待確認樣本的有反應(yīng)性是指HBsAg酶免疫檢測結(jié)果在“灰區(qū)”范圍或高于“灰區(qū)”范圍。
在一個實施方案中，當所述待確認樣本的有反應(yīng)性在“灰區(qū)”范圍時，試劑盒的說明書還包括說明能夠使檢測結(jié)果的吸光度提高至高于“灰區(qū)”的上限的選自以下的步驟1)延長所述樣本與所述特異性抗體的反應(yīng)時間至30分鐘～2小時；2)提高所述樣本與所述特異性抗體的反應(yīng)溫度至35℃～42℃；3)對所述樣本與所述特異性抗體反應(yīng)后進行洗滌，然后再加入所述酶標記抗體；4)延長加入所述酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)時間至30分鐘～4小時；5)提高加入所述酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)溫度至35℃～42℃；6)延長所述酶標記抗體與底物的反應(yīng)時間至30分鐘～1小時；以及7)加大所述樣本的加入量至50μl～500μl。
附圖的簡要說明圖1所示為兩步法EIA測定HBsAg的示意圖。
圖2所示為一步快速法EIA測定HBsAg的示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明是在HBsAg免疫檢測試劑盒尤其是在HBsAg酶免疫檢測試劑盒與檢測方法的基礎(chǔ)上開發(fā)出的新產(chǎn)品與新方法。目的是使HBsAg免疫檢測結(jié)果，尤其是HBsAg酶免疫檢測試劑盒檢測結(jié)果呈有反應(yīng)性(所謂“陽性”)或在“灰區(qū)”范圍內(nèi)的樣本得到HBsAg確認。
本發(fā)明中，所述檢測結(jié)果在HBsAg酶免疫檢測中以吸光度值(A值)表示，吸光度值大于Cutoff值(臨界值)為有反應(yīng)性(即所謂的“陽性”)，小于Cutoff值為陰性。
本發(fā)明中，所述的HBsAg酶免疫檢測檢測方法包括兩步法、一步法及快速一步法，優(yōu)選快速一步法。
本發(fā)明所述的“灰區(qū)”，為本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公認的可疑陽性和可疑陰性區(qū)間，這一區(qū)間根據(jù)HBsAg酶免疫檢測的不精密度(變異系數(shù))等的不同而變。例如在某一特定條件下將“灰區(qū)”定義為對HBsAg測得的吸光度值介于Cutoff值×0.7至Cutoff值×2之間，即“灰區(qū)”。根據(jù)國家或各地方相關(guān)規(guī)定，更大或更小的“灰區(qū)”也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明試劑盒含有或方法中使用抗-HBs的特異性抗體試劑，可選擇地，所述抗-HBs可是單克隆或多克隆抗體，該抗體可以是人源或動物源抗體，例如人源抗-HBs、大鼠抗-HBs、小鼠抗-HBs、兔抗-HBs、山羊抗-HBs、綿羊抗-HBs、馬抗-HBs、猴抗-HBs等，本發(fā)明優(yōu)選使用多克隆抗體。
本發(fā)明的抗-HBs的特異性抗體試劑在進行檢測時，可選擇地與利用抗體檢測HBsAg的試劑聯(lián)合使用，例如HBsAg酶免疫檢測試劑盒(以下簡稱HBsAg EIA Kit)。因此優(yōu)選地本發(fā)明的試劑盒或方法是聯(lián)合HBsAgEIA Kit或方法使呈HBsAg有反應(yīng)性或在“灰區(qū)”范圍內(nèi)的血清或血漿樣本得到確認檢測，即證明其是HBsAg陽性。
本發(fā)明的試劑盒還涉及聯(lián)合使用HBsAg EIA Kit的方法，包括兩步法、一步法及快速一步法的HBsAg EIA Kit方法均可以用于本發(fā)明所述試劑盒的操作程序中。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，可在HBsAg EIA Kit(以麗珠HBsAgELISA試劑盒為例)的微孔板上加入所述樣本后，向其中分別加入不含抗-HBs的對照試劑或含抗-HBs的特異性抗體試劑與樣本進行反應(yīng)，加入不含抗-HBs與含抗-HBs的微孔分別設(shè)為對照孔和檢測孔；也可向所述樣本中加入不含抗-HBs的對照試劑和含抗-HBs的特異性抗體試劑與樣本進行反應(yīng)后，再分別加入到所述HBsAg EIA Kit(以麗珠HBsAg ELISA試劑盒為例)的微孔板中(分別設(shè)為對照孔和檢測孔)。檢測孔中的特異性抗體與微孔反應(yīng)板上的固相抗體競爭樣本中的HBsAg，從而使結(jié)合到微孔反應(yīng)板上的HBsAg量減少；而對照孔中不存在競爭，因此樣本中的HBsAg能正常地結(jié)合到微孔反應(yīng)板上。隨后按一般酶免疫檢測，加入酶標記抗-HBs反應(yīng)后加底物液顯色，用酶標儀測得吸光度值(A值)。如樣本中有HBsAg存在，則檢測孔的A值會明顯低于對照孔，若檢測孔中和后的抑制率較高，例如至少為30％，優(yōu)選至少為50％，則樣本中的HBsAg存在得到確認，即該有反應(yīng)性的檢測結(jié)果成為陽性檢測結(jié)果。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通常采用一般操作程序，該操作程序特別適合當有反應(yīng)性的樣本檢測A值＞Cutoff值×2(超過“灰區(qū)”上限)時的HBsAg檢測；當A值介于Cutoff值×0.7至Cutoff值×2之間時，即檢測值可能位于“灰區(qū)”，可附加采用“灰區(qū)”操作程序(在不同的地區(qū)、不同的實驗室及使用不同的HBsAg EIA Kit時，“灰區(qū)”范圍可有所不同)。
在本發(fā)明的實施方案中，通常按一般操作步驟，其包括將向原倍樣本和/或稀釋樣本中加入含本發(fā)明特異性抗-HBs(檢測孔)或不含該抗體(對照孔)的試劑；然后對上述加入含有或不含有特異性抗-HBs試劑的樣本進行HBsAg酶免疫檢測；比較所述加入含有或不含有特異性抗-HBs試劑的樣本的吸光度值。
如果含有特異性抗-HBs比不含有特異性抗-HBs的檢測值優(yōu)選降低50％(抑制率)，可確認為HBsAg陽性。本領(lǐng)域所述技術(shù)人員應(yīng)理解，由于加入特異性抗-HBs的目的是與HBsAg酶標抗體競爭結(jié)合HBsAg，因此降低50％是比較安全的檢測值，但是低于此降低值的其它的能夠說明有競爭抑制關(guān)系的降低值也是本發(fā)明的范圍，例如至少30％。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述操作程序還包括對陽性參考品進行上述檢測的平行分析。例如，在HBsAg EIA Kit中檢測到的參考陽性對照孔A值應(yīng)較高，優(yōu)選必須大于0.50和小于1.50，且抑制率必須大于50％，優(yōu)選大于80％，否則上述實驗結(jié)果無效。所述陽性參考品選自經(jīng)確認為HBsAg陽性的人血清。
在本發(fā)明的實施方案中，可利用稀釋生物樣本的溶劑對樣本進行稀釋。不改變樣本的檢測性質(zhì)的稀釋溶劑是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的，例如人血清、各種動物血清或動物血清蛋白溶液、PBS、生理鹽水等等。所述稀釋比例為1∶50、1∶100、1∶1000、1∶10000的稀釋或在此范圍內(nèi)的稀釋度。優(yōu)選1∶100。
在本發(fā)明的一個實施方案中，若1∶100比例的稀釋樣本的抑制率＜50％，而其對照孔的檢測值較高，例如A值≥2.0，則應(yīng)對該樣本進行更大倍數(shù)(例如1000倍、10000倍)的稀釋，再重復(fù)上述一般操作程序。
在本發(fā)明的另一實施方案中，若原倍樣本的抑制率＜50％，1∶100倍稀釋樣本的對照孔檢測值較低，例如A值＜Cutoff值×2，則應(yīng)對該樣本進行1∶50倍稀釋，再重復(fù)一般操作步驟。
本發(fā)明的另一實施方案還涉及“灰區(qū)”操作程序。如果本發(fā)明所述待確認樣本HBsAg檢測結(jié)果在“灰區(qū)”范圍內(nèi)，且檢測值例如A值較低時，在加本發(fā)明所述特異性抗-HBs抗體后的HBsAg測定中難于用計算抑制率的方法進行確認，那么須改變反應(yīng)條件，使對照孔的檢測值超出“灰區(qū)”范圍。使對照孔的檢測值超出“灰區(qū)”范圍的方法的特征是1)延長樣本與特異性抗體(抗-HBs)的反應(yīng)時間(30分鐘～2小時)；2)提高樣本與特異性抗體(抗-HBs)的反應(yīng)溫度(35℃～42℃)；3)樣本與特異性抗體(抗-HBs)反應(yīng)后進行洗滌，然后再加入酶標記抗體；4)延長加入酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)時間(30分鐘～4小時)；5)提高加入酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)溫度(35℃～42℃)；6)延長酶標記抗體與底物的反應(yīng)時間(30分鐘～1小時)；和7)加大樣本的加入量(50μl～500μl)。
因此本發(fā)明所述的“灰區(qū)”操作程序基本與一般操作步驟相同，優(yōu)選地其與一般操作步驟的不同點為加入酶標記物后溫育時間相對延長，例如120分鐘。
在本發(fā)明的實施方案中，檢測吸光度值的儀器是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的，例如酶標儀。
實施例實施例1一般操作程序A.操作步驟取出確認試劑盒及HBsAg酶免疫檢測試劑盒(麗珠HBsAg EIA Kit)，平衡(15-20分鐘)至室溫。
每次試驗設(shè)空白孔一孔，空白孔中僅加入對照試劑100μl。
用生理鹽水1∶100稀釋樣本，檢測時需同時測定原倍樣本及稀釋樣本。
原倍樣本需設(shè)定對照孔和檢測孔各1孔，100倍稀釋樣本也需設(shè)定對照孔和檢測孔各1孔(見表1)。
每次實驗設(shè)參考陽性1份，同樣設(shè)置對照孔和檢測孔各1孔(見表1)。
在對照孔中加入對照試劑50μl，檢測孔中加入特異性抗體試劑50μl(見表1)。
將100倍稀釋樣本加入到1孔對照孔(孔1)和1孔檢測孔(孔2)中，每孔50μl；將原倍樣本加入到1孔對照孔(孔3)和1孔檢測孔(孔4)中，每孔50μl(見表1)。
將陽性參考品(HBsAg強陽性以及HIV、HCV，TP抗體陰性的血清，經(jīng)滅活后稀釋制得，含約5ng/ml HBsAg)加入到參考陽性的對照孔(孔5)和檢測孔中(孔6)，每孔50μl(見表1)。
輕拍混勻，或置于振蕩器上混勻(10-15秒)；置37℃溫育30分鐘。
每孔加入酶標記物(HBsAg EIA Kit組分)50μl；輕拍混勻，或置于振蕩器上混勻(10-15秒)。
溫育，參照HBsAg EIA Kit說明書(見附件1)。
洗板，手洗或采用洗板機洗板，參照HBsAg EIA Kit說明書。
顯色，參照HBsAg EIA Kit說明書。
終止，參照HBsAg EIA Kit說明書。
比色，用空白孔校零，再讀取各孔A值。
表1

B.一般程序的結(jié)果計算

注檢測孔的A值大于對照孔的A值時，抑制率按0計算。
C.一般操作程序的結(jié)果判定1.參考陽性對照孔A值必須大于0.50，且抑制率必須大于80％，否則實驗結(jié)果無效。
2.若原倍樣本對照孔A值＜Cutoff值×2，則采用原倍樣本按“灰區(qū)”操作程序進行試驗。
3.若原倍樣本或100倍稀釋樣本的抑制率＞50％，則可確認為HBsAg陽性。
4.若原倍樣本的抑制率＜50％；100倍稀釋樣本的抑制率＜50％且其對照孔的A值＜2.0；則可確認為HBsAg陰性。
5.若100倍稀釋樣本的抑制率＜50％，而其對照孔的A值≥2.0，則應(yīng)對該樣本進行更大倍數(shù)(1000倍、10000倍)的稀釋，再重復(fù)一般確認操作程序。
6.若原倍樣本的抑制率＜50％，100倍稀釋樣本的對照孔A值＜Cutoff值×2，則應(yīng)對該樣本進行1∶50稀釋，再重復(fù)一般確認操作程序。50倍稀釋樣本的抑制率≥50％可確認為HBsAg陽性，＜50％可確認為HBsAg陰性。
實施例2“灰區(qū)”操作程序A.具體操作如下取出確認試劑盒及HBsAg酶免疫檢測試劑盒(麗珠HBsAg EIA Kit)，平衡(15-20分鐘)至室溫。
每次試驗設(shè)空白孔一孔，空白孔中僅加入對照試劑100μl。
每個樣本設(shè)定對照孔和檢測孔各1孔。
每次實驗設(shè)參考陽性1份，同樣設(shè)置對照孔和檢測孔各1孔。
在對照孔中加入對照試劑50μl，檢測孔中加入特異性抗體試劑50μl。
將原倍樣本加入到1孔對照孔和1孔檢測孔中，每孔50μl。
將陽性參考品加入到參考陽性的對照孔和檢測孔中，每孔50μl。
輕拍混勻，或置于振蕩器上混勻(10-15秒)；置37℃溫育30分鐘。
每孔加入酶標記物(HBsAg EIA Kit組分)50μl。
輕拍混勻，或置于振蕩器上混勻(10-15秒)，置37℃溫育120分鐘。
洗板，手洗或采用洗板機洗板，參照HBsAg EIA Kit說明書。
顯色，參照HBsAg EIA Kit說明書。
終止，參照HBsAg EIA Kit說明書。
比色，用空白孔校零，再讀取各孔A值。
B.灰區(qū)”操作程序的結(jié)果計算同一般程序的結(jié)果計算。
C.“灰區(qū)”操作程序的結(jié)果判定參考陽性對照孔A值必須大于1.0，且抑制率必須大于80％，否則實驗結(jié)果無效。
原倍樣本的抑制率＞50％，且對照孔A值＞Cutoff值×2(本實施例認定的“灰區(qū)”上限)，則可確認為HBsAg陽性。
原倍樣本的抑制率＜50％，且對照孔A值＞Cutoff值×2，則可確認為HBsAg陰性。
原倍樣本的抑制率＞50％，對照孔A值＜Cutoff值×2，表明該樣本仍為可疑陽性。
實施例3樣本試驗一某份血清樣本，用麗珠HBsAg EIA Kit測得的A值為2.493。麗珠HBsAg EIA Kit的Cutoff值為0.105，該樣本的A值大于Cutoff值×2，采用一般確認操作程序。試驗中，參考陽性對照孔A值為0.520(大于0.5)，檢測孔A值為0.022，按公式計算抑制率為95.77％(大于80％)，實驗有效；原倍樣本的對照孔A值為2.121，檢測孔A值為0.097，抑制率為95.43％；100倍稀釋樣本的對照孔A值為0.034，檢測孔A值為0.005，抑制率為85.3％。原倍樣本和100倍稀釋樣本經(jīng)中和試驗后的抑制率均大于50％，故該份血清樣本被確認為HBsAg陽性。
實施例4樣本試驗二某份血清樣本，用麗珠HBsAg EIA Kit測得的A值為2.929。該樣本的A值大于Cutoff值×2，采用一般操作程序。試驗中，參考陽性對照孔A值為0.520(大于0.5)，檢測孔A值為0.022，抑制率為95.77％(大于80％)，實驗有效；原倍樣本的對照孔A值為2.668，檢測孔A值為2.797，抑制率為0；100倍稀釋樣本的對照孔A值為0.880，檢測孔A值為0.038，抑制率為95.68％。經(jīng)中和試驗后，原倍樣本的抑制率小于50％，但100倍稀釋樣本的抑制率大于50％，故該份血清樣本被確認為HBsAg陽性。
實施例5樣本試驗三某份血清樣本，用麗珠HBsAg EIA Kit測得的A值為3.172。該樣本的A值大于Cutoff值×2，采用一般操作程序。試驗中，參考陽性對照孔A值為0.655(大于0.5)，檢測孔A值為0.031，抑制率為95.27％(大于80％)，實驗有效；原倍樣本的對照孔A值為3.017，檢測孔A值為2.998，抑制率為0.63％；1∶100倍稀釋樣本的對照孔A值為2.860，檢測孔A值為1.870，抑制率為34.62％，可基本確認為HBsAg陽性。但原倍樣本和100倍稀釋樣本經(jīng)中和試驗后的抑制率均小于50％，且100倍稀釋樣本對照孔的A值大于2.0，故對該份樣本再進行1∶1000稀釋后重復(fù)進行操作。1000倍稀釋樣本的對照孔A值為2.399，檢測孔A值為0.091，抑制率為96.21％，大于50％，故該份血清樣本被確認為HBsAg陽性。
實施例6樣本試驗四某份血漿樣本，用麗珠HBsAg EIA Kit測得的A值為0.576。該樣本的A值大于Cutoff值×2，采用一般操作程序。試驗中，參考陽性對照孔A值為0.655(大于0.5)，檢測孔A值為0.031，抑制率為95.27％(大于80％)，實驗有效；原倍樣本的對照孔A值為0.567，檢測孔A值為1.062，抑制率為0；100倍稀釋樣本的對照孔A值為0.389，檢測孔A值為0.535，抑制率為0。原倍樣本和100倍稀釋樣本的抑制率均小于50％，且100倍稀釋樣本對照孔的A值＜2.0，故該份血漿樣本被確認為HBsAg陰性(假陽性)。
實施例7樣本試驗五某份血清樣本，用麗珠HBsAg EIA Kit測得的A值為0.174。麗珠HBsAg EIA Kit的Cutoff值為0.105，該樣本的A值小于Cutoff值×2，但大于Cutoff值×0.7，采用“灰區(qū)”操作程序。試驗中，參考陽性對照孔A值為1.172(大于1.0)，檢測孔A值為0.062，抑制率為94.71％(大于80％)，實驗有效；樣本的對照孔A值為0.753，超過了Cutoff值×2的“灰區(qū)”上限，檢測孔A值為0.021，抑制率為97.21％，大于50％，故該份血清樣本被確認為HBsAg陽性。
實施例8樣本試驗六某份血清樣本，用麗珠HBsAg EIA Kit測得的A值為0.107。麗珠HBsAg EIA Kit的Cutoff值為0.105，該樣本的A值小于Cutoff值×2，但大于Cutoff值×0.7，采用“灰區(qū)”操作程序。試驗中，參考陽性對照孔A值為1.172(大于1.0)，檢測孔A值為0.062，抑制率為94.71％(大于80％)，實驗有效；樣本的對照孔A值為0.196，超過了Cutoff值，但未超過Cutoff值×2的“灰區(qū)”上限，故該份血清樣本為可疑陽性。
權(quán)利要求
1.一種確認HBsAg為陽性的免疫檢測方法，包括提供HBsAg免疫測定結(jié)果為有反應(yīng)性的樣本；向所述樣本中加入特異性抗-HBs抗體；另外向所述樣本中加入不含特異性抗-HBs抗體的對照試劑作為對照；對所述加入特異性抗-HBs抗體的樣本及不加入特異性抗-HBs抗體的對照分別進行HBsAg免疫檢測；及將加入所述特異性抗-HBs抗體的樣本檢測結(jié)果與不加入所述特異性抗-HBs抗體的對照檢測結(jié)果進行比較，其中加入所述特異性抗-HBs抗體的樣本檢測結(jié)果比對照的免疫檢測結(jié)果下降至少30％，提示所述樣本為HBsAg陽性。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其中所述免疫檢測是HBsAg酶免疫檢測，所述檢測結(jié)果為吸光度值。
3.如權(quán)利要求1或2所述方法，其中所述下降至少為50％。
4.如權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的方法，還包括在免疫檢測前將所述樣本用溶劑進行稀釋的步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述稀釋的比例為1∶50，1∶100，1∶1000，1∶10000，或在此范圍內(nèi)的稀釋度。
6.如權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述有反應(yīng)性也包括HBsAg酶免疫檢測的結(jié)果在“灰區(qū)”范圍的情況。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的“灰區(qū)”的下限為Cutoff值×0.7，“灰區(qū)”的上限為Cutoff值×2。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，還包括選自以下的能夠使檢測結(jié)果的吸光度值提高至高于“灰區(qū)”的上限的步驟1)延長所述樣本與所述特異性抗體的反應(yīng)時間至30分鐘～2小時；2)提高所述樣本與所述特異性抗體的反應(yīng)溫度至35℃～42℃；3)對所述樣本與所述特異性抗體(抗-HBs)反應(yīng)后進行洗滌，然后再加入所述酶標記抗體；4)延長加入所述酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)時間至30分鐘～4小時；5)提高加入所述酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)溫度至35℃～42℃；6)延長所述酶標記抗體與底物的反應(yīng)時間至30分鐘～1小時；以及7)加大所述樣本的加入量至50μl～500μl。
9.如權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的特異性抗-HBs抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的抗體為來源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、馬、兔、羊的抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的抗體與HBsAg酶免疫檢測步驟中所用的抗體為相同或不相同來源。
12.一種HBsAg確認試劑盒，用于對HBsAg酶免疫檢測結(jié)果為有反應(yīng)性的樣本進行HBsAg的確認，該試劑盒包括特異性抗-HBs抗體試劑；及說明權(quán)利要求1或2所述的方法的操作步驟與檢測結(jié)果的說明書。
13.如權(quán)利要求12所述的HBsAg確認試劑盒，還含有HBsAg酶免疫檢測試劑盒試劑。
14.如權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述檢測樣本的檢測結(jié)果比對照樣本的檢測結(jié)果下降至少為50％時，所述樣本為HBsAg陽性。
15.如權(quán)利要求12-14任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述說明書進一步包括在免疫檢測前將所述樣本用溶劑進行稀釋的步驟并將稀釋樣本進行同樣的檢測的說明。
16.如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述稀釋比例選自1∶50，1∶100，1∶1000，1∶10000，或在此范圍內(nèi)的稀釋度。
17.如權(quán)利要求12-14任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述有反應(yīng)性包括HBsAg酶免疫檢測的結(jié)果在“灰區(qū)”范圍的情況。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述“灰區(qū)”的下限為Cutoff值×0.7，所述“灰區(qū)”的上限為Cutoff值×2。
19.如權(quán)利要求17或18所述的試劑盒，其中所述試劑盒的說明書還包括選自以下的能夠使檢測結(jié)果的吸光度值提高至高于“灰區(qū)”的上限的步驟1)延長所述樣本與所述特異性抗體的反應(yīng)時間至30分鐘～2小時；2)提高所述樣本與所述特異性抗體的反應(yīng)溫度至35℃～42℃；3)對所述樣本與所述特異性抗體(抗-HBs)反應(yīng)后進行洗滌，然后再加入所述酶標記抗體；4)延長加入所述酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)時間至30分鐘～4小時；5)提高加入所述酶標記抗體后的抗原抗體反應(yīng)溫度至35℃～42℃；6)延長所述酶標記抗體與底物的反應(yīng)時間至30分鐘～1小時；以及7)加大所述樣本的加入量至50μl～500μl。
20.如權(quán)利要求12-19中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述的特異性抗-HBs抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
21.如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述的抗體為來源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、馬、兔、羊的抗體。
22.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述的抗體與HBsAg酶免疫檢測步驟中的抗體為相同或不同來源。
全文摘要
本發(fā)明涉及聯(lián)合應(yīng)用抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的特異性抗體(抗－HBs抗體)和HBsAg免疫檢測試劑對HBsAg免疫檢測結(jié)果為有反應(yīng)性的樣本進行確認的檢測方法及相關(guān)的檢測試劑盒，以確定有反應(yīng)性的樣本是否為陽性，即真正含有HBsAg。本發(fā)明還涉及HBsAg酶免疫檢測結(jié)果在“灰區(qū)”范圍內(nèi)的樣本的確認檢測方法及相關(guān)檢測試劑盒。
文檔編號G01N21/31GK1916634SQ20051009841
公開日2007年2月21日 申請日期2005年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月6日
發(fā)明者儲迅濤, 宋小冬, 張久春 申請人:珠海麗珠試劑有限公司