專利名稱：一種指示高劑量鉤狀效應的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及體外檢測技術領域，具體地涉及一種在免疫檢測血清樣本時指示高劑量鉤狀(HD-HOOK)效應的方法。
背景技術：
HD-HOOK效應是指在雙位點夾心免疫實驗中，其劑量反應曲線的高劑量(HIGH DOSE，HD)區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀(HOOK)，根據(jù)此現(xiàn)象寫實性地稱之為″HD-HOOK″效應(Miles LEM，Lipschitz DA，Bieber CP and Cook JDMeasurement of serum ferritinby a 2-site immunoradiometric assay.Analyt Biochem 61209-224，1974.)產生HD-HOOK效應的分子機理有″分子變構說″和″濃度效應″等推論(《臨床免疫學檢驗的進展》南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍醫(yī)學檢驗中心，武建國；《ELISA的質量管理》江蘇省臨床檢驗中心，許斌；《腫瘤標志物檢測的影響因素和應用原則》華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院，吳健民)。
HD-HOOK效應在免疫檢測中經(jīng)常發(fā)生，其發(fā)生率在占陽性樣本30％左右。由于HD-HOOK效應的存在導致被檢測樣本不能被正確區(qū)分為是由于其濃度超出檢測試劑盒的線性范圍還是本身濃度就是該值，以至于實驗誤診，尤其是導致假陰性率上升。
因此，本領域迫切需要開發(fā)新的簡便的、有效指示HD-HOOK效應的方法，提高雙位點夾心免疫測定的準確性，同時降低雙位點夾心免疫測定的假陰性率。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種簡便的、有效指示HD-HOOK效應的方法，提高雙位點夾心免疫測定的準確性，從而降低雙位點夾心免疫測定的假陰性率。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測樣品中目標抗原的免疫夾心檢測方法，包括以下步驟
(a)將樣品、檢測微球和標記了可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應體系，其中所述的檢測微球是如I式所示的第一抗體-微球的二元復合物，anti1X-bead(I)式中，“X”表示目標抗原，“anti1X”表示針對所述目標抗原“X”的第一抗體，“bead”表示微球，“-”表示第一抗體與微球之間的結合方式(如共價鍵或非共價鍵)，并且所述的第二抗體與第一抗體可同時結合于目標抗原的不同表位，從而形成“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復合物；(b)將指示微球加入到步驟(a)的體系中，其中指示微球是式II所示的目標抗原-微球的二元復合物，X-bead’ (II)式中，“bead’”表示可與“bead”互相區(qū)別的不同微球，“-”表示目標抗原X與微球之間的結合方式(如共價鍵或非共價鍵)，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成“第二抗體-抗原-微球”三元復合物；(c)檢測反應體系中所述四元復合物中微球上的可檢測信號，并與標準值或標準曲線比較，從而確定反應體系中目標抗原的存在與否和/或數(shù)量；并且檢測反應體系中所述三元復合物中微球上的可檢測信號，得到指示微球的信號值，并與無HD-HOOK效應時的指示微球信號值(正常值)比較，當指示微球測量值小于指示微球正常值時，則判定目標抗原的測定結果不可靠；如果指示微球測量值大于或等于指示微球正常值時，則判定樣品中目標抗原的濃度處于可測量范圍。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，目標抗原與微球之間的結合方式有共價鍵或配基反應或非特異性吸附。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，當指示微球測量值≤0.9×指示微球正常值時，則判定樣品存在HD-HOOK效應。
在另一優(yōu)選例中，目標抗原數(shù)量為1-100種。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗原是蛋白質。
在另一優(yōu)選例中，第一抗體與相應的第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2。
在另一優(yōu)選例中，所述的各種微球bead與bead’是帶不同熒光的微球。
在另一優(yōu)選例中，所述指示微球正常值是用以下方法確定的
(a’)將濃度已知且處于測量范圍的目標抗原標準品系列分別與所述檢測微球、所述帶有可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應體系，從而形成不同目標抗原標準品濃度的“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復合物；(b’)將所述的指示微球加入到步驟(a’)的體系中，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成不同目標抗原標準品濃度的“第二抗體-抗原-微球”三元復合物；(c’)檢測所述三元復合物中微球上的可檢測信號，以P+2SD為指示微球正常值，式中P表示不同目標抗原標準品濃度時，三元復合物中微球信號值的平均值，2SD為2倍的微球信號值的標準偏差。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測目標抗原的試劑盒，它包括多個容器，以及分別裝于容器中的下列物質(a)檢測微球，其中所述的檢測微球是如I式所示的第一抗體-微球的二元復合物，anti1X-bead(I)式中，“X”表示目標抗原，“anti1X”表示針對所述目標抗原“X”的第一抗體，“bead”表示微球，“-”表示第一抗體與微球之間的結合方式(如共價鍵或非共價鍵)；(b)帶有可檢測信號的第二抗體，其中，所述的第二抗體與第一抗體可同時結合于目標抗原的不同表位；(c)指示微球，所述指示微球是式II所示的目標抗原-微球的二元復合物，X-bead’ (II)式中，“bead’”表示可與“bead”互相區(qū)別的不同微球，“-”表示目標抗原X與微球之間的結合方式(如共價鍵或非共價鍵)。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒含有針對1-100種目標抗原的相應的檢測微球、帶有可檢測信號的第二抗體，和指示微球，并且所述的各種微球bead與bead’是帶不同熒光的微球。
本發(fā)明的其他方面，在閱讀了本申請之后，對于本領域技術人員而言是顯而易見的。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，通過設立HD-HOOK指示微球，可以簡便有效地排除雙位點夾心免疫測定中HD-HOOK效應所導致的假陰性率，從而提高雙位點夾心免疫測定的準確性。
如本文所用，術語“第一抗體”、“一抗”可互換使用，指可特異性結合于某一抗原(如腫瘤標志物)的一種抗體。
如本文所用，術語“第二抗體”、“二抗”可互換使用，指可特異性結合于某一抗原(如腫瘤標志物)的另一種抗體。例如，對于同一種抗原(如腫瘤標志物)而言，相應的第一抗體和第二抗體是不同的，并且可同時結合于所述的抗原的不同表位。
如本文所用，術語“抗原”指具有免疫原性的物質，例如蛋白質、多肽。代表性的抗原例子包括(但并不限于)細胞因子、腫瘤標志物、金屬蛋白類、心血管糖尿病相關蛋白等。
如本文所用，術語“腫瘤標志物”是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身所產生的或者是由機體對腫瘤細胞反應而產生的，反映腫瘤存在和生長的一類物質。代表性的腫瘤標志物包括(但并不限于)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)。
基本原理(a)雙抗夾心法的原理雙抗夾心免疫檢測法的基本原理是本領域技術人員所熟知的。常規(guī)的做法是將一抗固定于固相載體，然后一抗與抗原反應，洗滌后再與標有酶的二抗反應，洗滌，最后進行化學發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應檢測信號。
(b)Luminex xMAP法的原理Luminex xMAP是一個非常靈活的多功能技術平臺。其原理是把微小的乳膠顆粒(Beads，簡稱為“微球”)分別染成不同的熒光色，然后再把針對不同檢測物的蛋白(如抗原抗體)以共價方式結合到特定顏色的微球上。應用時，先把針對不同檢測物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測物(被測物可以是血清中的抗原、抗體、或酶等)。在懸液中的微球與被檢測物特異性地結合，并加上熒光標記。然后，微球成單列通過兩束激光，一束判定微球的顏色從而決定被測物的特異性(定性)；另一束測定微球上的熒光標記強度從而決定被測物的量(定量)，所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可以直接用來判斷結果。
在一個優(yōu)選例中，充分利用了一抗固定在不同流動微球(Beads)的特點，同時優(yōu)化藻紅蛋白(PE)標記的二抗的濃度，將交聯(lián)了一抗的微球溶液與血清樣本或抗原標準質控品液、PE標記的二抗溶液依次或同時一并加入反應容器中，從而發(fā)生以下反應①微球上的一抗與血清或標準質控品液中相應的抗原(即腫瘤標志物抗原)結合，形成“腫瘤標志物-第一抗體-微球”三元復合物，②二抗與血清或標準質控品液中相應的抗原(即腫瘤標志物抗原)結合，最終形成“第二抗體-腫瘤標志物-第一抗體-微球”四元復合物(包括微球交聯(lián)的一抗-血清相應抗原-PE標記的復合物或微球交聯(lián)的一抗-標準質控品液的抗原-PE標記的復合物)，反應過程中不須離心洗滌，在液相中即可通過Luminex xMAP檢測復合物的熒光，達到從反應到定性定量分析一步完成的效果，即一步法。
在Luminex檢測儀上，這些微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的編碼從而決定被測腫瘤標志物的種類；另一束測定微球上PE的熒光強度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出被測腫瘤標志物的含量。
關于Luminex xMAP的技術平臺詳細資料，請參見產品說明書或文獻，(1)Cancer Chemotherapy and Pharmacology，51321-327，(2)Journal ofImmunological Methods，22741-52；(3)www.luminexcorp.com。
(c)指示HD-HOOK方法的原理一方面，在本發(fā)明方法中，首先在1種熒光編碼的微球(稱為1號球)上以共價鍵方式交聯(lián)針對某種抗原的一抗；加入血清樣本或標準質控品液、藻紅蛋白(PE)標記的對應于該種抗原的二抗溶液(正常檢測這種抗原濃度，與普通的、不具有HD-HOOK效應指示功能的方法相同)。這時同時發(fā)生以下反應①1號微球上的一抗與血清或標準質控品液中相應的抗原結合，②二抗與血清或標準質控品液中相應的抗原結合，最終形成“1號熒光編碼微球交聯(lián)的一抗-血清相應抗原-PE標記的二抗”構成的四元復合物，或“1號熒光編碼的微球交聯(lián)的一抗-標準質控品液的抗原-PE標記的二抗”構成的四元復合物。
在Luminex檢測儀上，熒光編碼的微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的編碼從而決定被測抗原的種類；另一束測定微球上PE的熒光強度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出被測抗原的含量。
另一方面，在2號熒光編碼的微球上以共價鍵方式交聯(lián)被檢測抗原純品。在1號交聯(lián)有一抗的微球和樣本、二抗-PE反應結束之后，將所述交聯(lián)有抗原的2號熒光編碼的微球(稱為“HD-HOOK指示微球”)加入反應系統(tǒng)中。
此時，如果樣品中待檢測抗原的濃度處于非HD-HOOK區(qū)(即樣品中含有待檢測抗原的數(shù)量并不明顯大于檢測體系中二抗的數(shù)量，因此有一部分或較多的二抗呈未結合狀態(tài))，那么會發(fā)生以下反應2號微球上的抗原與反應系統(tǒng)中剩余的游離的二抗-PE結合，最終形成“2號熒光編碼微球交聯(lián)的抗原-PE標記的二抗”的三元復合物。這導致后續(xù)檢測中，可檢測到一定數(shù)量的所述三元復合物。
與此相反，如果樣品中待檢測抗原的濃度超過檢測的線性區(qū)域而處于HD-HOOK區(qū)(即樣品中含有目標抗原的數(shù)量明顯大于檢測體系中二抗的數(shù)量，則幾乎所有的二抗都結合于樣品中的目標抗原，故體系中沒有或基本上沒有未結合狀態(tài)的二抗)，那么2號微球上的抗原將很難遇到與反應系統(tǒng)中剩余的游離的二抗-PE結合，因此難以形成“2號熒光編碼微球交聯(lián)的抗原-PE標記的二抗”構成的三元復合物。這導致后續(xù)檢測中，檢測不到“2號熒光編碼微球交聯(lián)的抗原-PE標記的二抗”構成的三元復合物或讀數(shù)很低。
在Luminex檢測儀上，熒光編碼的2號與1號微球同時進行處理，微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的編碼從而決定為HD-HOOK指示微球；另一束測定微球上PE的熒光強度，根據(jù)熒光信號強弱判斷該血清樣本是否為HD-HOOK血清樣本。如果來自2號微球(HD-HOOK指示微球)的熒光強度較低(如低于無HD-HOOK效應時的指示微球熒光信號值(正常值)的90％，較佳地低于50％，更佳地低于30％，最佳地低于10％)，則可判定樣品中待測抗原的濃度處于HD-HOOK區(qū)，即樣品是HD-HOOK樣品。
以下，以抗原是腫瘤標志物的情況為例，進一步說明本發(fā)明的相關操作細節(jié)。
第一抗體-微球的二元復合物在本發(fā)明中，第一抗體-微球的二元復合物具有式(I)結構anti1X-bead(I)式中，X表示腫瘤標志物，anti1X表示抗腫瘤標志物X的第一抗體，bead表示微球，-表示第一抗體與微球之間的共價鍵；一抗與微球的交聯(lián)針對不同腫瘤標志物抗原的一抗(anti1X，X代表腫瘤標志物抗原)與微球共價交聯(lián)的詳細操作程序可用常規(guī)方法，例如按照Luminex公司的產品說明書或網(wǎng)站www.luminexcorp.com中所述的方法進行偶連，從而得到不同微球與相應一抗形成偶連物anti1X-Beads。
分別取針對不同腫瘤標志物的anti1X-Beads，按一定比例混合就可得到第一抗體溶液(簡稱為A液)。
抗原-微球的二元復合物(HD-HOOK指示微球)按上述類似方法，將被檢測抗原純品與另一種號碼的微球共價交聯(lián)，形成抗原-微球的二元復合物(即HD-HOOK指示微球)，相應的溶液簡稱為H液(HD-HOOK效應指示微球懸液)。
二抗的標記雖然二抗可用各種本領域已知的可檢測信號進行標記。然而，優(yōu)選的是用熒光信號進行標記，尤其是通過生物素-親和素連接方式標記PE。
在一優(yōu)選例中，二抗的生物素(Biotin)標記方法如下分別取針對不同腫瘤標志物抗原的二抗(anti2X，X代表腫瘤標志物抗原)透析純化后加入生物素二甲基亞砜(DMSO)溶液，避光反應，透析去除未反應的生物素，保存?zhèn)溆谩?br> 分別取針對不同腫瘤標志物抗原的生物素標記的anti2X，按比例混合，加入親和素(Streptavidin)標記的PE，使生物素與Streptavidin結合，生成帶熒光素標記的第二抗體(即PE-anti2X，其中PE表示藻紅蛋白)，得到第二抗體溶液(簡稱為C液)。
質控或標準為了消除假陽性和假陰性，宜在檢測過程中設置質控。用某種抗原的標準品配制一定濃度范圍內的標準品溶液，為B液。
此外，為了獲得定量結果，可以在檢測過程中設置含已知濃度的多個腫瘤標志物的標準品。
例如，抗原標準(STDn，n＝0～5)和質控品(質控1、質控2)溶液的配制可按下表配制表1混合抗原標準質控品溶液配制表

表中第1列為不同的腫瘤標志物，STD0表示該標準溶液中的所有腫瘤標志物的濃度均為0，為標準曲線的起始點；STD1表示該標準溶液中的不同腫瘤標志物的濃度分別為C1-1、C2-1、C3-1……C40-1，為標準曲線的第2點；依此類推STD2、STD3、STD4、STD5的含義；質控1表示該標準溶液中的不同腫瘤標志物的濃度分別為C1-6、C2-6、C3-6……C40-6，介于STD0和STD5之間，為內部質控點；質控2表示該標準溶液中的不同腫瘤標志物的濃度分別為C1-7、C2-7、C3-7……C40-7，介于STD0和STD5之間，為另1內部質控點。STD0～STD5及質控1和質控2構成質控液(簡稱為B液)。
將上述的第一抗體溶液、質控液和第二抗體溶液(即A、B和C液)依次或同時混勻，然后充分反應(如在37±5℃反應10-100min)，隨后在luminex100上讀數(shù)，即可得到多條標準曲線(具體數(shù)目由腫瘤標志物組合中不同的腫瘤標志物數(shù)目決定)。
樣品的檢測可用本發(fā)明方法檢測的樣品沒有特別限制，可以是任何含有腫瘤標志物的樣品，代表性的例子包括血清樣本、尿液樣本、唾液樣本等。優(yōu)選的樣品是血清樣品。
(a)測定無HD-HOOK效應時2號微球的熒光信號值以僅檢測一種抗原為例，1號微球為交聯(lián)有一抗的微球(稱為檢測微球)；2號微球為交聯(lián)有抗原的微球(HD-HOOK指示微球)，其中HD-HOOK指示微球的編碼熒光不同于檢測微球的檢測熒光。將A、B和C液混勻，37℃反應30min，然后加入H液，37℃反應10min，在luminex100上讀數(shù)，1號微球上得到不同抗原濃度與對應的熒光信號作標準曲線；2號微球上對應的為無HD-HOOK效應時的指示微球信號值(正常值)；(b)HD-HOOK效應的指示和樣本中抗原的定量檢測將A、人血清樣本和C液混勻，37℃反應30min，然后加入H液，37℃反應10min，在luminex100上讀數(shù)，1號微球上的熒光信號根據(jù)標準曲線換算出某種抗原的濃度。2號微球上的熒光信號與上述步驟確定HD-HOOK效應陰性的熒光信號值比較其大小。
如果指示微球的熒光信號值等于或小于無HD-HOOK效應時的指示微球信號值(正常值)的90％(較佳地等于或低于50％，更佳地等于或低于30％，最佳地等于或小于10％))，則判斷該樣本為HD-HOOK效應陽性。
如果同時檢測樣品中的多種抗原，可以相應地使用多種檢測微球和HD-HOOK指示微球，即對每一種可以使用一種檢測微球和HD-HOOK指示微球，并且各種檢測微球和指示微球的具有不同的編碼熒光，從而可以相互區(qū)分。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)顯著提高雙位點夾心免疫測定的準確性，同時降低雙位點夾心免疫測定的假陰性率。
(b)操作簡單。
(c)非常適用于同時檢測樣品中的多種抗原。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例材料抗原和抗體來源


微球(Beads)購自美國Luminex公司，規(guī)格為5.0μm，微球表面為-COOH修飾，其他常規(guī)試劑為市售品。
實施例110種腫瘤標志物并行檢測(無HD-HOOK指示)1.準備1.1一抗預先去除含氨基小分子和雜蛋白(透析或過層析柱)，測量其濃度。
1.2在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-hydroxysulfosuccinimide(NHS)，備用(防潮)。
1.3在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-ethyl-N’(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC)，備用(防潮)。
2.微球(Beads)活化2.1微球原液旋渦混旋儀混懸20秒，移取200μL微球(相當于2.5×106微球)于1.5ml聚丙烯離心管中。
2.2 15000rpm離心2分鐘(設置3分鐘)，移去上清液。
2.3加入100μL蒸餾水，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.4重復2.3。
2.5加入80μL 0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)，pH 6.2，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.6用蒸餾水將(NHSS)稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用)2.7取10μL 50mg/ml(NHSS)加到Beads溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.8用蒸餾水將EDC稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用)2.9取10μL 50mg/ml EDC加到Beads溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.10避光、37℃孵育20分鐘。
2.11 15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.12加入250μL 50mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)(MES)pH5.0。
2.13 15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.14重復2.12，2.13，馬上進行下步實驗。
3.交聯(lián)、封閉和儲存3.1加20μg已處理的一抗到已活化的Beads中，旋渦混旋儀混懸20秒。
3.2避光、37℃反應2小時，每十五分鐘混勻一次。
3.3加入1ml PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液(PBS-TBN的組成為10mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液、0.02％吐溫20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05％疊氮鈉)。
3.4加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液。
3.5加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒。
3.6 2-8℃避光保存。
4.二抗(anti2X)的生物素標記4.1二抗預處理

4.2生物素標記反應取上述預處理的二抗25μL，加入25μL的1mg/ml NHSS-biotin DMSO溶液，混勻，4℃冰箱避光反應2小時。
5.混合抗原標準、質控品(B液)的配制

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液按上表配制B液。
6.A液的配制取10種不同Beads的下列anti1β-HCG-Beads，anti1PEree-PSA-Beads，anti1total-PSA-Beads，anti1NSE-Beads，anti1CA15-3-Beads，anti1CA19-9-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CA242-Beads，anti1APEP-Beads，anti1CEA-Beads溶液，按4×105個/種混合，加在pH7.4PBS中，體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 7.混合二抗-PE混合物(C液)配制分別取標記好biotin的PEree-PSA，total-PSA，NSE，CA242，CA19-9，CA125，β-HCG，CA15-3，APEP，CEA二抗加入pH7.4PBS中，每種二抗終濃度為5μg/ml，同時加入PE總濃度為60μg/ml，混合二抗-PE混合物總體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 8.病人血清消化道腫瘤標志物含量檢測8.1收集病人血樣10份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，備用。
8.2分別加入A液于96孔酶標板，50μl/孔；然后加入標準品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、質控品(Contol1、Contol2)、血清樣品1-9號，5μl/孔；再加入C液，50μl/孔。在旋渦混旋儀上充分混勻，放入37℃搖床孵育40min.
8.3孵育完成后于旋渦混旋儀上充分混勻在Luminex100上讀數(shù)。
8.4檢測結果見下表

注表格中粗斜體部分為標準品檢測結果，其他為樣本檢測結果。
結果表明，用本發(fā)明方法可同時獲得多個腫瘤標志物的定量測定結果，例如第7號樣品中存在大量的腫瘤標志物t-PSA，從而可為臨床診斷提供輔助性的參考指標。
實施例2人血清樣本HD-HOOK效應的指示和血清中甲胎蛋白(AFP)定量的檢測針對AFP的一抗和二抗由上海第二軍醫(yī)大學提供，AFP抗原純品由Biodesign提供，微球由Luminex公司提供，常規(guī)試劑為市售品。
1.準備1.1一抗和AFP抗原預先去除含氨基小分子和雜蛋白(透析或過層析柱)，測量其濃度。
1.2在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-hydroxysulfosuccini-mide(NHS)，備用(防潮)。
1.3在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-(3-dimethylainopropyl)-N-ethyl-carbodiimide(EDC)，備用(防潮)。
2.微球活化2.1分別取33號和51號微球(Luminex公司)原液旋渦混旋儀混懸20秒，移取200μL微球(相當于2.5×106微球)于兩個1.5ml聚丙烯離心管中。
2.2 15000rpm離心2分鐘(設置3分鐘)，移去上清液。
2.3加入100μL蒸餾水，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.4重復2.3。
2.5在兩管中分別加入80μL 0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)，pH 6.2，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.6用蒸餾水將(NHSS)稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用)2.7分別取10μL 50mg/ml(NHSS)加到兩種微球溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.8用蒸餾水將EDC稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用)2.9分別取10μL 50mg/ml EDC加到兩種微球溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.10避光、37℃孵育20分鐘。
2.11 15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.12分別加入250μL 50mmol/L 2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid(MES)pH5.0。
2.13 15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.14重復2.12，2.13，馬上進行下步實驗。
3.交聯(lián)、封閉和儲存3.1取20μg已處理好的AFP一抗加入到已活化的33號微球中；取20μg已處理好的AFP抗原加入到已活化的51號微球中。旋渦混旋儀混懸20秒。
3.2避光、37℃反應2小時，每十五分鐘混勻一次。
3.3分別加入1ml PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液(PBS-TBN的組成為10mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液、0.02％吐溫20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05％疊氮鈉)。
3.4分別加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液。
3.5分別加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒。
3.6用顯微鏡計數(shù)兩種微球的濃度分別是33號1×106個/ml，51號1×106個/ml。
3.7 2-8℃避光保存。
4.二抗的生物素標記4.1二抗預處理

4.2生物素標記反應取上述預處理的AFP二抗10μL，加入25μL的1mg/ml生物素DMSO溶液，混勻，4℃冰箱避光反應2小時。透析過夜備用。
5.抗原標準品(B液)的配制用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制濃度為0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、200ng/ml、500ng/ml的AFP標準品液。
6.A液的配制取上述標記了一抗的33號微球加入到1ml pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使溶液中約含10000個微球。
7.二抗-PE(C液)的配制取上述標記好生物素AFP二抗，加入pH7.4磷酸鹽緩沖液中，二抗終濃度為5μg/ml，同時加入鏈親和素標記的PE總濃度為60μg/ml，二抗-PE總體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 8.H液的配制取上述標記了AFP抗原的51號微球加入到1ml pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使1ml溶液中約含10000個微球。
9.HD-HOOK效應的指示和人血清中AFP的檢測9.1收集AFP檢測高值＞20000ng/ml的人血清樣本5份和AFP檢測高值＜1000ng/ml的人血清樣本5份，2ml/份，5000rpm×5min，取上清，備用。
9.2在96孔反應板的5個反應孔內依次加入5個不同濃度的B液各5μL，每孔再分別加入25μL A液及25μL C液，混勻；另選10孔分別加入10種上述人血清樣本5μL/孔和25μL/孔A液及25μL/孔C液，混勻；于37℃避光孵箱反應30mins，然后加入5μL/孔的H液，混勻；于37℃避光孵箱反應10mins。
9.3孵育完成后于旋渦混旋儀上充分混勻，在Luminex100上讀數(shù)。
9.4檢測結果如下

9.5實驗結果判斷51#微球(指示微球)在不同抗原標準品濃度時熒光信號數(shù)值的平均值為11209.7，2SD為151.0，故指示微球的正常值為11360.7；樣品1到5的反應系統(tǒng)中指示微球熒光信號值均低于指示微球正常值的90％(10224.63)，因此指示樣品1到5的血清樣本有HD-HOOK效應。其中樣品1有輕微的HOOK效應，導致讀數(shù)偏低，而樣品2-4有顯著的HOOK效應(低于正常值的10％)，導致讀數(shù)嚴重偏低，造成假陰性。而樣品6到10為HD-HOOK陰性(即測定的數(shù)值是可信的，可排除HD-HOOK效應引起的假陰性)。
實施例35種腫瘤標志物并行檢測(帶HD-HOOK指示)基本上按照實施例1和2的步驟，進行帶HD-HOOK指示的5種腫瘤標志物并行檢測，不同點在于選用SCCA、CA125、CA15-3、CEA、β-HCG作為待檢測的抗原。針對每一種使用一種檢測微球和HD-HOOK指示微球，并且5種檢測微球和5種指示微球的具有不同的編碼熒光。
另外，混合抗原標準(B液)的配制濃度如下

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液按上表配制B液。
另外，A液、C液和H液的配制同實施例1和2。
8.3用制備的微球對病人血清消化道腫瘤標志物含量進行檢測，方法同實施例2。
檢測結果見下表

檢測結果判斷表格中粗斜體部分為標準品檢測結果，其他為樣本檢測結果，帶下劃線的數(shù)值表明樣品有HOOK效應。
實施例4檢測試劑盒將實施例1-2中制備的33號檢測微球和51號HD-HOOK指示微球分別裝于容器中，制得一可指示HD-HOOK效應的試劑盒。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種檢測樣品中目標抗原的免疫夾心檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將樣品、檢測微球和標記了可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應體系，其中所述的檢測微球是如I式所示的第一抗體-微球的二元復合物，anti1X-bead (I)式中，“X”表示目標抗原，“anti1X”表示針對所述目標抗原“X”的第一抗體，“bead”表示微球，“-”表示第一抗體與微球之間的結合方式，并且所述的第二抗體與第一抗體可同時結合于目標抗原的不同表位，從而形成“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復合物；(b)將指示微球加入到步驟(a)的體系中，其中指示微球是式II所示的目標抗原-微球的二元復合物，X-bead’ (II)式中，“bead’”表示可與“bead”互相區(qū)別的不同微球，“-”表示目標抗原X與微球之間的結合方式，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成“第二抗體-抗原-微球”三元復合物；(c)檢測反應體系中所述四元復合物中微球上的可檢測信號，并與標準值或標準曲線比較，從而確定反應體系中目標抗原的存在與否和/或數(shù)量；并且檢測反應體系中所述三元復合物中微球上的可檢測信號，得到指示微球的信號值，并與無HD-HOOK效應時的指示微球信號值(正常值)比較，當指示微球測量值小于指示微球正常值時，則判定目標抗原的測定結果不可靠；如果指示微球測量值大于或等于指示微球正常值時，則判定樣品中目標抗原的濃度處于可測量范圍。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，目標抗原與微球之間的結合方式有共價鍵或配基反應或非特異性吸附。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，當指示微球測量值≤0.9×指示微球正常值時，則判定樣品存在HD-HOOK效應。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，目標抗原數(shù)量為1-100種。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗原是蛋白質。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，第一抗體與相應的第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的各種微球bead與bead’是帶不同熒光的微球。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述指示微球正常值是用以下方法確定的(a’)將濃度已知且處于測量范圍的目標抗原標準品系列分別與所述檢測微球、所述帶有可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應體系，從而形成不同目標抗原標準品濃度的“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復合物；(b’)將所述的指示微球加入到步驟(a’)的體系中，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成不同目標抗原標準品濃度的“第二抗體-抗原-微球”三元復合物；(c’)檢測所述三元復合物中微球上的可檢測信號，以P+2SD為指示微球正常值，式中P表示不同目標抗原標準品濃度時.三元復合物中微球信號值的平均值，2SD為2倍的微球信號值的標準偏差。
9.一種用于檢測目標抗原的試劑盒，其特征在于，它包括容器，以及分別裝于容器中的下列物質(a)檢測微球，其中所述的檢測微球是如I式所示的第一抗體-微球的二元復合物，anti1X-bead (I)式中，“X”表示目標抗原，“anti1X”表示針對所述目標抗原“X”的第一抗體，“bead”表示微球，“-”表示第一抗體與微球之間的結合方式，(b)帶有可檢測信號的第二抗體，其中，所述的第二抗體與第一抗體可同時結合于目標抗原的不同表位，(c)指示微球，所述指示微球是式II所示的目標抗原-微球的二元復合物，X-bead’(II)式中，“bead’”表示可與“bead”互相區(qū)別的不同微球，“-”表示目標抗原X與微球之間的結合方式。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，它含有針對1-100種目標抗原的相應的檢測微球、帶有可檢測信號的第二抗體，和指示微球，并且所述的各種微球bead與bead’是帶不同熒光的微球。
全文摘要
本發(fā)明涉及體外檢測技術領域，具體地涉及一種在免疫檢測樣本時指示高劑量鉤狀(HD－HOOK)效應的方法和相應的試劑盒。
文檔編號G01N21/00GK1880959SQ20051002687
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月17日 優(yōu)先權日2005年6月17日
發(fā)明者姚見兒, 周雪雷, 羅朝領, 茅柳娟 申請人:上海透景生命科技有限公司