專利名稱：基于膜的測定裝置中鉤效應(yīng)的減小的制作方法
背景技術(shù)：
多種不同的分析方法和設(shè)備普遍用于流通測定中，用于確定測試樣品中可能存在的分析物的存在和/或濃度。例如，免疫測定法利用免疫系統(tǒng)機制，其中抗體是響應(yīng)作為有機體的病原或外源的抗原的存在而產(chǎn)生的。這些抗體和抗原即免疫反應(yīng)物能夠彼此結(jié)合，借此產(chǎn)生能夠用來確定生物樣品中特定抗原的存在或濃度的高度特異性反應(yīng)機制。
有幾種公知的免疫測定法，這些方法利用由可檢測的成分標(biāo)記的免疫反應(yīng)物，從而能夠?qū)Ψ治鑫镞M(jìn)行分析檢測。例如，“夾心型”測定法一般涉及使測試樣品與可檢測的探針(例如染色乳膠或放射性同位素)混合，這些探針與分析物的特異性結(jié)合部分綴合。綴合探針(conjugated probes)與分析物形成復(fù)合物。這些復(fù)合物然后到達(dá)固定抗體區(qū)，在此處抗體與分析物之間發(fā)生結(jié)合，從而形成三元的“夾心復(fù)合物”。夾心復(fù)合物位于用于檢測分析物的區(qū)域。此技術(shù)用來獲得定量或半定量結(jié)果。這些夾心型測定的一些實例在Grubb等人的U.S.4,168,146和Tom等人的U.S.4,366,241中有所描述。
然而，許多傳統(tǒng)的“夾心型”測定形式在暴露到較高的分析物濃度時都遇到明顯不準(zhǔn)確的問題。具體地說，當(dāng)分析物以高濃度存在時，測定樣品中的大部分分析物不與綴合探針形成復(fù)合物。這樣，未復(fù)合的分析物在到達(dá)檢測區(qū)之后，就與復(fù)合的分析物競爭結(jié)合位點。由于未復(fù)合的分析物沒有用探針標(biāo)記，因此不能檢測到。據(jù)此，如果相當(dāng)大量的結(jié)合位點都被未復(fù)合的分析物所占據(jù)，那么測定就可表現(xiàn)出“假陰性”。該問題被普遍稱作“鉤效應(yīng)(hook effect)”已經(jīng)提出多種用于減小免疫測定中的“鉤效應(yīng)”的技術(shù)。例如，Neumann等人的U.S.6,184,042中描述了一種用于減小夾心測定中的鉤效應(yīng)的技術(shù)。該技術(shù)涉及在帶有至少兩種能夠結(jié)合分析物的受體的固相存在下培養(yǎng)分析物。第一受體是選自抗體、抗體片段及其混合物的結(jié)合分子的低聚體。第二受體結(jié)合或能夠結(jié)合到固相上?？扇苄缘途劭贵w的使用據(jù)說能夠減小“鉤效應(yīng)”。
然而，對以簡單、有效和相對廉價的方式來減小“鉤效應(yīng)”的改進(jìn)技術(shù)，仍然存在需求。
發(fā)明概述按照本發(fā)明的一個實施方案，公開了一種用于檢測測試樣品中分析物的存在或數(shù)量的流通測定裝置。這種流通測定裝置包括與能夠產(chǎn)生檢測信號的綴合檢測探針相通的多孔膜。此多孔膜限定出層析區(qū)，在層析區(qū)內(nèi)固定有多個微孔顆粒。這些微孔顆粒能夠在相互之間限定出多個空間，這些空間的平均尺寸大于微孔的平均尺寸。在一些實施方案中，微孔的平均尺寸比空間的平均尺寸至少小約100％，而在一些實施方案中，至少小約150％，在一些實施方案中，至少小約250％。微孔顆?？蛇x自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈；硅珠、以及這些物質(zhì)的組合，并且其表面對于分析物可以是化學(xué)惰性的。
多孔膜還限定出位于層析區(qū)上游的檢測區(qū)。捕獲試劑固定在檢測區(qū)內(nèi)，該試劑被構(gòu)造成能夠結(jié)合到綴合檢測探針上。在檢測區(qū)內(nèi)，綴合檢測探針能夠產(chǎn)生檢測信號，其中由所述檢測信號來確定測試樣品內(nèi)分析物的量。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，公開了一種用于檢測測試樣品中分析物的存在或含量的流通夾心測定裝置。這種測定裝置包括與能夠產(chǎn)生檢測信號的綴合檢測探針相通的多孔膜。綴合檢測探針被構(gòu)造成在與測試樣品中的分析物接觸時能夠與其結(jié)合，從而形成分析物/探針復(fù)合物和未復(fù)合的分析物。多孔膜限定出層析區(qū)，在層析區(qū)內(nèi)固定有眾多微孔顆粒。這些微孔顆粒被構(gòu)造成使未復(fù)合的分析物以比分析物/探針復(fù)合物慢的速率流過層析區(qū)。多孔膜還包括位于層析區(qū)下游的檢測區(qū)。捕獲試劑固定在檢測區(qū)內(nèi)，所述捕獲試劑被構(gòu)造成能夠結(jié)合到分析物/探針復(fù)合物上，從而復(fù)合物在檢測區(qū)內(nèi)產(chǎn)生檢測信號，其中由檢測信號來確定測試樣品內(nèi)分析物的量。
本發(fā)明公開了一種用于檢測測試樣品中分析物的存在或數(shù)量的方法。該方法包括i)提供一種流通測定裝置，該裝置包括與能夠產(chǎn)生檢測信號的綴合檢測探針相通的多孔膜，此多孔膜限定出層析區(qū)和位于層析區(qū)下游的檢測區(qū)，在層析區(qū)內(nèi)固定有多個微孔顆粒，其中捕獲試劑固定在檢測區(qū)內(nèi)；ii)使含有分析物的測試樣品與綴合檢測探針接觸，從而形成分析物/探針復(fù)合物和未復(fù)合的分析物；以及iii)使分析物/探針復(fù)合物和未復(fù)合的分析物到達(dá)層析區(qū)，然后到達(dá)檢測區(qū)，其中分析物/探針復(fù)合物在未復(fù)合的分析物之前到達(dá)檢測區(qū)。
下面更詳細(xì)地論述本發(fā)明的其它特征和方面。
附圖簡述本發(fā)明的全面和可實施的公開內(nèi)容，包括其最佳方式，針對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，都參照附圖在說明書的剩余部分得到更加具體的闡述，其中

圖1是本發(fā)明的流通測定裝置的一個實施方案的透視圖；圖2圖示出將抗體共價綴合到羧基化納米顆粒上的一個實施方案；圖3是本發(fā)明的流通測定裝置的一個實施方案的示意圖，是在未復(fù)合的分析物穿過層析區(qū)之前示出的；圖4是圖3的實施方案的示意圖，是在未復(fù)合的分析物穿過層析區(qū)之后示出的；圖5是圖1所示層析區(qū)的分解圖。
附圖標(biāo)記在本說明書和附圖中的重復(fù)使用意味著其代表本發(fā)明的相同或類似特征或部件。
代表性實施方案詳述定義正如本文所用的，術(shù)語“分析物”通常是指待檢測的物質(zhì)。例如，分析物可包括抗原性物質(zhì)、半抗原、抗體以及這些物質(zhì)的組合。分析物包括但不限于毒素、有機化合物、蛋白質(zhì)、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、類固醇、維生素、藥物(包括那些為了治療目的而施用的藥物和那些為了違法目的而施用的藥物)、藥物中間體或副產(chǎn)物、細(xì)菌、病毒顆粒以及任何上述物質(zhì)的代謝物或抗體。一些分析物的具體實例包括鐵蛋白；肌酸激酶MIB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥；卡馬西平；萬古霉素；慶大霉素；茶堿；丙戊酸；奎尼定；促黃體生成激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇、黃體酮；C-反應(yīng)蛋白；lipocalins；IgE抗體；維生素B2微球蛋白；糖化血紅蛋白(Gly、Hb)；氫化可的松；毛地黃毒苷；N-乙酰普魯卡因酰胺(NAPA)；普魯卡因酰胺；風(fēng)疹抗體，例如風(fēng)疹-IgG和風(fēng)疹I(lǐng)gM；毒胞質(zhì)抗體，例如毒胞質(zhì)IgG(Toxo-IgG)和毒胞質(zhì)IgM(Toxo-IgM)；睪酮；水楊酸鹽；乙酰氨基苯酚；乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝核心抗原的抗體，例如抗-乙肝核心抗原IgG和IgM(抗-HBC)；人免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人T-細(xì)胞白血病病毒1和2(HTLV)；乙肝e抗原(HBeAg)；乙肝e抗原的抗體(抗-HBe)；促甲狀腺素(TSH)；甲狀腺素(T4)；全三碘甲狀腺原氨酸(全T3)；游離三碘甲狀腺原氨酸(游離T3)；癌胚抗原(CEA)；以及α-胎兒蛋白(AFP)。濫用和受控物質(zhì)的藥物包括但不限于麻黃堿；脫氧麻黃堿；巴比妥酸鹽，例如異戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯二氮雜類，例如利眠寧和安定；大麻素類，例如印度大麻和大麻；可卡因；芬太尼；LSD；安眠酮；鴉片制劑，例如海洛因、嗎啡、可待因、鹽酸二氫嗎啡酮、氫可酮、美沙酮、氧可酮、氧嗎啡酮和鴉片；苯環(huán)利定；和丙氧吩。其它潛在的分析物在Everhart等人的U.S.6,436,651和Tom等人的U.S.4,366,241中有所描述。
本文所用術(shù)語“測試樣品”通常是指被懷疑含有分析物的材料。測試樣品可從源體獲得后直接使用，或者進(jìn)行預(yù)處理以改善樣品的特性。測試樣品可來自任何生物源，例如生理流體，包括血液、間質(zhì)液、唾液、眼晶狀體液、腦脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水、raucous、滑液、腹膜液、陰道液、羊膜液等。測試樣品在使用前可預(yù)處理，例如用血液制備血漿、稀釋粘稠液等。處理方法包括過濾、沉淀、稀釋、蒸餾、濃縮、干擾成分的滅活、以及試劑的加入。除了生理流體之外，還可以使用其它液態(tài)樣品，例如用于環(huán)境或食品生產(chǎn)性能測定的水、食品等。此外，被懷疑含有分析物的固體材料也可用作測試樣品。在一些情況下，有益的是，改善固體測試樣品以形成液態(tài)介質(zhì)或釋放分析物。
詳細(xì)描述現(xiàn)在詳細(xì)參照本發(fā)明的多個不同實施方案，其中的一個或多個實例在以下列出。每個實例都是為了解釋本發(fā)明，而對本發(fā)明沒有限定作用。事實上，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離本發(fā)明的范圍或精髓的情況下能夠?qū)Ρ景l(fā)明作出多種修改和變型。例如，作為實施方案的一部分而闡述或描述的特征可用在另一個實施方案上，從而產(chǎn)生又一個實施方案。于是，本發(fā)明意在覆蓋這樣的修改和變型，即它們在所附的權(quán)利要求書及其等同物的范圍內(nèi)。
總體上，本發(fā)明涉及一種用于檢測測試樣品中分析物的存在或數(shù)量的基于膜的測定裝置。該裝置采用層析區(qū)，多個微孔顆粒位于層析區(qū)上。層析區(qū)能夠以簡單、有效和相對廉價的方式有效減小“鉤效應(yīng)”。尤其是，眾多微孔顆粒允許大尺寸的分析物/探針復(fù)合物在未復(fù)合的分析物之前到達(dá)檢測區(qū)。由于基本上抑制了未復(fù)合的分析物與復(fù)合物在檢測區(qū)競爭結(jié)合位點，因此可以限制“假陰性”的發(fā)生，甚至在分析物的濃度較高的情況下。
例如，參照圖1，現(xiàn)在更詳細(xì)地描述按照本發(fā)明形成的流通測定裝置20的一個實施方案。如圖所示，裝置20包含任選由剛性材料21支撐著的多孔膜23。通常，多孔膜23可以由測試樣品能夠通過的任何材料制成。例如，用來形成多孔膜23的材料可包括但不限于天然材料、合成材料、或者天然存在的被合成改性的材料，例如多糖(諸如紙和纖維素衍生物之類的纖維素材料，例如醋酸纖維素和硝基纖維素)；聚醚砜；尼龍膜；硅石；均勻分散在多孔聚合物基質(zhì)中的無機材料，例如去活氧化鋁、硅藻土、MgSO4或其它無機精細(xì)材料，其中聚合物為例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；布，包括天然存在的(例如棉花)及合成的(例如尼龍或人造纖維)；多孔凝膠，例如硅膠、瓊脂糖、右旋糖苷和明膠；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺等等。在一個特定實施方案中，多孔膜23是由硝基纖維素和/或聚酯砜材料形成的。應(yīng)該理解，術(shù)語“硝基纖維素”是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨的硝基纖維素，或者是硝酸與其它酸(例如具有1-7個碳原子的脂肪族羧酸)的混合酯。
裝置20還可以包含芯吸(wicking)墊28。芯吸墊28通常接收已經(jīng)通過整個多孔膜23遷移的流體。正如本領(lǐng)域內(nèi)所公知的，芯吸墊28有助于促進(jìn)毛細(xì)作用和通過膜23的流體流動。
為了在測試樣品內(nèi)啟動分析物的檢測，使用者可直接將測試樣品加入到一部分多孔膜23上，然后樣品可通過膜23移動?；蛘呤?，測試樣品可以先加到與多孔膜23以流體相通的取樣墊(未示出)上?？捎脕硇纬扇訅|的一些適宜材料包括但不限于硝基纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊和玻璃纖維濾紙。如果需要的話，取樣墊還可含有擴散地或非擴散地附著到其上的一種或多種測定預(yù)處理試劑。
在圖示的實施方案中，測試樣品從取樣墊(未示出)移動到以與取樣墊一端相通的方式放置的綴合墊22上。綴合墊22由測試樣品能夠通過的材料形成。例如，在一個實施方案中，綴合墊22由玻璃纖維形成。雖然僅僅示出一個綴合墊22，但是應(yīng)該理解，其它綴合墊也可用于本發(fā)明。
為了易于準(zhǔn)確檢測測試樣品內(nèi)分析物的存在或缺乏，將探針施加在裝置20的多個不同部位。如以下更詳細(xì)描述的，探針可用于分析物的檢測和校正。通常能夠產(chǎn)生可目視檢測或通過儀器設(shè)備檢測的信號的任何物質(zhì)都可以用作探針。各種合適的物質(zhì)包括發(fā)色團(tuán)；催化劑；熒光化合物；化學(xué)發(fā)光化合物；磷光化合物；放射性化合物；直接目視標(biāo)記物，包括膠狀金屬(例如金)和非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、或有機聚合物膠乳顆粒；脂質(zhì)體或含有信號生成物的其它囊泡等等。例如，適合用作探針的一些酶公開在Litman等人的U.S.4,275,149中，該文獻(xiàn)在此作為參考全部引入本文。酶/底物系統(tǒng)的一個實例是酶堿性磷酸酶和底物硝基藍(lán)四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽、或者這些物質(zhì)的衍生物或類似物、或者底物4-甲基傘形基(umbelliferyl)-磷酸鹽。其它合適的探針在Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459中有所描述，這些文獻(xiàn)在此作為參考全部引入本文。
在一些實施方案中，探針可含有產(chǎn)生可檢測信號的熒光化合物。熒光化合物可以是熒光分子、聚合物、樹枝狀物質(zhì)、顆粒等等。合適熒光分子的一些實例例如包括但不限于熒光素、銪螯合物、藻膽蛋白質(zhì)、若丹明以及這些物質(zhì)的衍生物和類似物。可目視檢測的有色化合物也能夠用作探針，借此在無需其它信號生成試劑的情況下，提供了樣品中分析物的存在或濃度的直接有色讀數(shù)。
探針，諸如如上所述的探針，可單獨使用或與微粒(有時稱作“珠”或“微珠”)結(jié)合使用。例如，可使用天然存在的微粒，例如晶核、支原體、質(zhì)粒、質(zhì)體、哺乳動物細(xì)胞(例如紅細(xì)胞血影)、單細(xì)胞微生物(例如細(xì)菌)、多糖(例如瓊脂糖)等等。此外，還可采用合成微粒。例如，在一個實施方案中，采用用熒光染料或有色染料標(biāo)記的膠乳微粒。雖然任何膠乳微粒都可用于本發(fā)明，但是膠乳微粒一般是由以下物質(zhì)形成的聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-馬來酐共聚物、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚對苯二甲酸丁二酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或者這些物質(zhì)的酐、羧基、氨基、羥基或酰肼衍生物。其它合適的微粒在Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459中有所描述，這些文獻(xiàn)在此作為參考全部引入本文。一些商業(yè)上可購得的合適熒光顆粒的實例包括商品名為“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)、由Molecular Probes，Inc.出售的熒光羧基化微球，以及也是由Molecular Probes，Inc.出售的“Texas Red”和5-及6-羧基四甲基若丹明。商業(yè)上可購得的合適有色膠乳微粒的實例包括由Bang’s Laboratory，Inc.出售的羧基化膠乳珠。
在一些情況下，需要用一些方式來給探針改性，以便使探針能夠更容易地結(jié)合到分析物上。在這樣的情況下，探針用某些粘附到其上的特異性結(jié)合部分來改性，以形成綴合探針。特異性結(jié)合部分通常是指特異性結(jié)合對，即兩個不同的分子，其中一個分子化學(xué)和/或物理結(jié)合到第二個分子上的一員。例如，免疫反應(yīng)特異性結(jié)合部分可包括抗原、半抗原、適體(aptamers)、抗體和這些物質(zhì)的復(fù)合物，包括那些通過DNA重組方法或肽合成而形成的物質(zhì)?？贵w可以是單克隆或多克隆抗體、重組蛋白質(zhì)或其混合物或片段，以及抗體和其它特異性結(jié)合部分的混合物。這些抗體的制備細(xì)節(jié)和它們用作特異性結(jié)合部分的適宜性是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。其它常用的特異性結(jié)合對包括但不限于生物素和親和素、糖類和凝集素、互補核苷酸序列(包括用于DNA雜交測定中的探針和捕獲核酸序列，用于檢測靶核酸序列)、互補肽序列(包括用重組方法形成的那些互補肽序列)、效應(yīng)子和受體分子、激素和激素結(jié)合蛋白、酶輔因子和酶、酶抑制劑和酶等。此外，特異性結(jié)合對可包括作為原始特異性結(jié)合部分類似物的部分。例如，可使用分析物的衍生物或片段，即分析物-類似物，只要它具有至少一個與分析物共同的表位即可。
特異性結(jié)合部分一般可利用任何各種公知技術(shù)附著到探針上。例如，特異性結(jié)合部分對探針(例如微粒)的共價附著，可利用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙?；?、巰基、環(huán)氧基和其它反應(yīng)性或連接性官能團(tuán)以及殘余的游離基和游離基陽離子來實現(xiàn)，通過這些基團(tuán)可完成蛋白偶合反應(yīng)。還可包括作為官能化共聚單體的表面官能團(tuán)，因為微粒的表面可含有較高表面濃度的極性基團(tuán)。此外，雖然微粒探針經(jīng)常在合成之后官能化，在某些情況下例如為聚(苯硫酚)，但是微粒能夠與蛋白質(zhì)直接共價連接，而無需進(jìn)一步改性。例如，參照圖2，該圖表示出用于共價綴合探針的本發(fā)明的一個實施方案。如圖所示，綴合的第一個步驟是，用碳二亞胺活化探針表面上的羧基。在第二個步驟中，活化的羧酸基團(tuán)與抗體的氨基反應(yīng)，從而形成酰胺鍵?；罨?或抗體偶合可發(fā)生在緩沖液中，例如磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)(例如pH為7.2)或2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)(例如pH為5.3)。如圖所示，所獲得的探針然后可例如用乙醇胺封閉，從而形成探針綴合物。除了共價鍵合之外，其它附著技術(shù)，例如物理吸附，也可用于本發(fā)明。
如上所示，測試樣品中的一些分析物可以不用所需的方式復(fù)合到綴合探針上，尤其是當(dāng)分析物以高濃度存在于測試樣品中時。該未復(fù)合的分析物隨后與復(fù)合的分析物在檢測區(qū)31競爭捕獲試劑(如下所述)，借此對測定裝置20的準(zhǔn)確度具有不利影響。為了抵消該影響，多孔膜23包含層析區(qū)35，眾多微孔顆粒50分布在層析區(qū)上。如圖3-5所示，微孔顆粒50的存在允許層析區(qū)35作為“凝膠滲透”柱，較大的分子以比較小分子快的速率通過層析區(qū)35。具體地說，如圖5所示，尺寸大于微孔顆粒50的微孔51的分子不能通過，由此被迫流過顆粒50之間的空間52，即通過膜23的孔(如方向箭頭L2所示)。由于顆粒50的微孔51在顆粒結(jié)構(gòu)內(nèi)形成“曲折路徑”(即具有復(fù)雜形狀的路徑)，因此分子通過微孔51比通過顆粒50之間的空間52花費的時間要長。據(jù)此，當(dāng)通過層析區(qū)35時，較大尺寸的分子首先出去。中間尺寸的分子根據(jù)其尺寸不同程度地滲透過微孔顆粒50。最后，非常小的分子流過顆粒50的微孔51(如方向箭頭L1所示)，并最終由此排出色譜區(qū)35。一般來說，分析物/探針復(fù)合物的尺寸大于未復(fù)合的分析物的尺寸。因此，復(fù)合物能夠在未復(fù)合的分析物到達(dá)檢測區(qū)31之前到達(dá)檢測區(qū)31并與其上含有的捕獲試劑結(jié)合。以這種方式，復(fù)合的與未復(fù)合的分析物之間的競爭得到抑制。
色譜區(qū)35一般提供一個明顯不同的區(qū)域(例如，線、點等)，盡管本發(fā)明肯定包含多個區(qū)域。例如，在圖示的實施方案中，采用一條線。當(dāng)采用這條線的時候，線寬通常是可變的。例如，在一些實施方案中，分析物流動方向L上的線寬為，從施加分析物的部位(例如綴合墊22)到檢測區(qū)31所測總距離的約10％-約100％，并且在一些實施方案中，為約10％-約50％。而且，這條線可位于基本上垂直于測試樣品通過裝置20的流動的方向上。同樣地，在一些實施方案中，這條線可位于基本上平行于測試樣品通過裝置20的流動的方向上。
用于給定測定中的合適微孔顆粒50的選擇標(biāo)準(zhǔn)包括各種因素，例如感興趣的分析物的性質(zhì)、測試條件、所采用的探針性質(zhì)等。一般，期望微孔顆粒50具有相對均勻的孔和粒徑分布以及良好的機械和化學(xué)穩(wěn)定性。此外，一般還期望，微孔顆粒50的表面對測定裝置20的其它組件保持化學(xué)惰性。例如，微孔顆粒50的表面相對于分析物通常是化學(xué)惰性的?？捎糜诒景l(fā)明的微孔顆粒50的一些實例包括但不限于合成的聚合顆粒，例如聚苯乙烯(例如高度交聯(lián)的聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈；硅珠等。一些適宜的合成微孔顆粒50的具體實例在諸如Stoy的U.S.4,110,529；Ley等人的U.S.4,940,734；和Gooke等人的U.S.5,314,923中有所描述，這些文獻(xiàn)在此作為參考全部并入本文。在探針也是微孔顆粒的實施方案中，應(yīng)該理解，層桿區(qū)35的微孔顆粒50可以與探針相同。
微孔顆粒50的平均直徑通?？砂葱枰獊砀淖?。例如，在一些實施方案中，顆粒50的平均直徑可為約0.1-約1000微米，在一些實施方案中，為約0.1-約100微米，在一些實施方案中，為約1-約10微米。一般，顆粒50基本上是球形的(即珠)，盡管包括但不限于板、棒、條、不規(guī)則形狀等的其它形狀也適用于本發(fā)明。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所領(lǐng)會的，顆粒50的成分、形狀、尺寸和/或密度可廣泛變化。
一般來說，顆粒50的微孔51的平均尺寸(即直徑)小于由多孔膜23的孔52形成的顆粒50之間的空間。具體地說，微孔51的平均尺寸一般比上述空間的平均尺寸至少小約100％，在一些實施方案中，至少小約150％，在一些實施方案中，至少小約250％。例如，在一些實施方案中，微孔51具有小于約100納米的平均尺寸，在一些實施方案中，為約5-約100納米，在一些實施方案中，為約10-約60納米。作為對照，多孔膜23的孔52一般具有大于約200納米的平均尺寸，在一些實施方案中，為約200-約5000納米，在一些實施方案中，為約200-約2500納米。
測定裝置20還可包含檢測區(qū)31，在檢測區(qū)31上固定有能夠結(jié)合到綴合探針上的捕獲試劑。例如，在一些實施方案中，捕獲試劑可以是生物捕獲試劑。這些生物捕獲試劑在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，并且可包括但不限于抗原、半抗原、抗體、蛋白A或G、親和素、鏈霉親和素、二級抗體、以及這些物質(zhì)的復(fù)合物。在許多情況下，期望這些生物捕獲試劑能夠與探針上存在的特異性結(jié)合部分(例如抗體)結(jié)合。此外，還期望用各種非生物材料作為捕獲試劑。例如，在一些實施方案中，捕獲試劑可包括聚電解質(zhì)。聚電解質(zhì)可具有凈的正或負(fù)電荷，以及通常為中性的凈電荷。例如，具有凈正電荷的聚電解質(zhì)的一些合適實例包括但不限于聚賴氨酸(在商業(yè)上從Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.of St.Louis，MO購得)、聚乙烯亞胺；環(huán)氧氯丙烷官能化的聚胺和/或聚酰胺型胺類，例如聚(二甲基胺-共-環(huán)氧氯丙烷)；聚二烯丙基二甲基-氯化銨；陽離子纖維素衍生物，例如用季銨鹽水溶性單體接枝的纖維素共聚物或纖維素衍生物等等。在一個特定實施方案中，可采用作為含有季銨鹽水溶性單體的纖維素衍生物的CelQuatSC-230M或H-100(從National Starch&Chemical，Inc.購得)。此外，具有凈負(fù)電荷的聚電解質(zhì)的一些適宜實例包括但不限于聚丙烯酸，例如聚(乙烯-共-甲基丙烯酸，鈉鹽)等等。還應(yīng)該理解，其它聚電解質(zhì)也可使用，例如兩親聚電解質(zhì)(即具有極性和非極性部分)。例如，合適的兩親聚電解質(zhì)的一些實例包括但不限于聚(苯乙烯基-b-N-甲基2-乙烯基碘化吡啶鎓)和聚(苯乙烯基-b-丙烯酸)，它們可從Polymer Scource，Inc.of Dorval，Canada購得。
捕獲試劑用作分析物/探針復(fù)合物的固定結(jié)合位點。具體地說，分析物，例如抗體、抗原等，一般具有兩個結(jié)合位點。在到達(dá)檢測區(qū)31之后，這些結(jié)合位點之一被綴合探針的特異性結(jié)合部分所占據(jù)。然而，分析物的游離結(jié)合位點能夠結(jié)合到固定捕獲試劑上。在結(jié)合到固定捕獲試劑上之后，復(fù)合探針形成新的三元夾心復(fù)合物。
檢測區(qū)31通?？删哂腥魏螖?shù)目的不同檢測區(qū)，以便使用者能夠更好地確定測試樣品內(nèi)特定分析物的濃度。每個區(qū)域可含有相同的捕獲試劑，或者可含有用于捕獲多種分析物的不同捕獲試劑。例如，檢測區(qū)31可包括兩個或更多個不同的檢測區(qū)(例如線、點等)。檢測區(qū)可以線的形式位于基本上垂直于通過測定裝置20的測試樣品流的方向上。同樣，在一些實施方案中，檢測區(qū)可以線的形式位于基本上平行于通過測定裝置20的測試樣品流的方向上。
雖然檢測區(qū)31可指示出分析物的存在，但是僅利用檢測區(qū)31經(jīng)常難以確定測試樣品內(nèi)分析物的相對濃度。于是，測定裝置20還可包括校正區(qū)32。在該實施方案中，校正區(qū)32形成在多孔膜23上，并位于檢測區(qū)31的下游。校正區(qū)32配有捕獲試劑，該試劑能夠結(jié)合穿過膜23的長度的任何剩余的未捕獲探針。校正區(qū)32中所采用的捕獲試劑可與檢測區(qū)31中所用的捕獲試劑相同或不同。而且，與檢測區(qū)31類似，校正區(qū)32還可在任何方向上提供任何數(shù)目的不同校正區(qū)，以便使用者能夠更好地確定測試樣品內(nèi)特定分析物的濃度。每個區(qū)域可含有相同的捕獲試劑，或者可含有用于捕獲不同探針的不同捕獲試劑。
校正區(qū)可以用不同量的捕獲試劑預(yù)先裝載到多孔膜23上，以便在探針遷移后由每個校正區(qū)產(chǎn)生不同的信號強度。通過采用不同尺寸的校正區(qū)和/或通過改變每個校正區(qū)內(nèi)的捕獲試劑的濃度或體積，能夠改變每個校正區(qū)內(nèi)結(jié)合物的總量。如果需要的話，將過量的探針用于測定裝置20，以便每個校正區(qū)達(dá)到其完全預(yù)定的信號強度電位。也就是說，沉積在校正區(qū)上的探針的量是預(yù)定的，因為校正區(qū)上采用的捕獲試劑的量設(shè)定在預(yù)定的已知水平上。
總之，可按照本發(fā)明構(gòu)建各種流通測定裝置。關(guān)于這一點，現(xiàn)在更詳細(xì)地描述本發(fā)明的多個不同的實施方案。然而，應(yīng)該理解，下述實施方案僅僅是示范性的，本發(fā)明還包括其它實施方案。例如，參照圖3-4，這些圖表示出一個特定實施方案，其中探針41用于檢測，探針43用于校正。在該實施方案中，檢測探針41和校正探針43加入到綴合墊22上，并且在以與測試樣品相通的方式放置時，由此能夠流過裝置20(如方向箭頭L所指示的)。檢測探針41與分析物A的特異性結(jié)合部分90綴合，因此，在探針41與分析物A接觸之后就結(jié)合到其上，從而形成分析物/探針復(fù)合物49。
如圖3所示，探針/分析物復(fù)合物49、任何游離的分析物A以及校正探針43從綴合墊22通過多孔膜23，直到到達(dá)層析區(qū)35為止，在層析區(qū)上有多個微孔顆粒50。較大的復(fù)合物49和校正探針43容易流過顆粒50之間的空間52，而較小的未復(fù)合的分析物A以較慢的速率流到顆粒50的微孔內(nèi)。分析物/探針復(fù)合物49然后流過裝置20，直到其到達(dá)檢測區(qū)31為止，在檢測區(qū)31，它們結(jié)合到捕獲試劑91(例如抗體)上，形成夾心復(fù)合物53。而且，校正探針43流到校正區(qū)32并與捕獲試劑(未示出)例如聚電解質(zhì)結(jié)合。其后，如圖4所示，未復(fù)合的分析物A穿過層析區(qū)35，到達(dá)檢測區(qū)31。然而，由于復(fù)合物49已經(jīng)結(jié)合到捕獲試劑上，因此分析物A穿過檢測區(qū)31和校正區(qū)32，直到其到達(dá)芯吸墊28為止。這樣，在檢測區(qū)31，能夠由檢測探針41的信號強度確定分析物的量。如果需要的話，此信號強度可以用校正區(qū)32中的校正探針43的信號強度來校正。信號強度可目視測定或借助于設(shè)備例如熒光讀數(shù)器來測定。
雖然上面已經(jīng)描述了裝置結(jié)構(gòu)的多個不同的實施方案，但是應(yīng)該理解，本發(fā)明的裝置一般可具有任何所需的結(jié)構(gòu)，并且不必含有上述所有部件。各種其它裝置結(jié)構(gòu)和/或測定形式，例如在Lambotte等人的U.S.5,395,754；Jou等人的U.S.5,670,381；和Malick等人的U.S.6,194,220中有所描述，這些文獻(xiàn)在此作為參考全部并入本文。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，層析區(qū)在測定裝置的多孔膜上的存在，能夠以簡單、有效和相對廉價的方式有效減小“鉤效應(yīng)”。尤其是，多個微孔顆粒位于層析區(qū)上，使得較大尺寸的分析物/探針復(fù)合物在任何未復(fù)合的分析物之前到達(dá)檢測區(qū)。據(jù)此，未復(fù)合的分析物不與復(fù)合物競爭檢測區(qū)上有用的結(jié)合位點。由于抑制了未復(fù)合的分析物占據(jù)檢測區(qū)的大多數(shù)結(jié)合位點，因此可限制“假陰性”的發(fā)生，甚至在較高的分析物濃度時。
雖然已經(jīng)就本發(fā)明的具體實施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在領(lǐng)會上述內(nèi)容之后，容易構(gòu)思這些實施方案的替換形式、變型和等同物。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)該由所附的權(quán)利要求書及其等同物來確定。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測測試樣品中分析物的存在或數(shù)量的流通測定裝置，所述流通測定裝置包括多孔膜，所述多孔膜與能夠產(chǎn)生檢測信號的綴合檢測探針相通，所述多孔膜限定出層析區(qū)，在所述層析區(qū)內(nèi)固定有多個微孔顆粒；以及位于所述層析區(qū)下游的檢測區(qū)，其中捕獲試劑固定在所述檢測區(qū)內(nèi)，所述捕獲試劑被構(gòu)造成結(jié)合到所述綴合檢測探針上，其中在所述檢測區(qū)內(nèi)，所述綴合檢測探針能夠產(chǎn)生檢測信號，由所述檢測信號來確定測試樣品內(nèi)分析物的量。
2.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述微孔顆粒在相互之間限定出多個空間，所述空間的平均尺寸大于所述顆粒的微孔的平均尺寸。
3.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約100％。
4.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約150％。
5.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約250％。
6.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述微孔的平均尺寸小于約100納米。
7.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述微孔的平均尺寸為約10-約60納米。
8.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述微孔顆粒選自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、硅珠、以及這些物質(zhì)的組合。
9.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述微孔顆粒的表面對于分析物是化學(xué)惰性的。
10.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述綴合檢測探針包括選自以下的物質(zhì)發(fā)色團(tuán)、催化劑、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目視標(biāo)記物、脂質(zhì)體、以及這些物質(zhì)的組合。
11.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述多孔膜還包括能夠產(chǎn)生校正信號的校正區(qū)，其中由所述校正信號校正的所述檢測信號來確定測試樣品內(nèi)分析物的量。
12.如權(quán)利要求11所述的流通測定裝置，其中所述多孔膜與校正探針相通，所述校正探針在存在于所述校正區(qū)內(nèi)時產(chǎn)生所述校正信號。
13.如權(quán)利要求1所述的流通測定裝置，其中所述裝置是夾心型測定裝置。
14.一種用于檢測測試樣品中分析物的存在或數(shù)量的流通夾心測定裝置，所述測定裝置包括多孔膜，所述多孔膜與能夠產(chǎn)生檢測信號的綴合檢測探針相通，所述綴合檢測探針被構(gòu)造成在與測試樣品中的分析物接觸時能夠與其結(jié)合，從而形成分析物/探針復(fù)合物和未復(fù)合的分析物，所述多孔膜限定出層析區(qū)，在所述層析區(qū)內(nèi)固定有多個微孔顆粒，所述微孔顆粒被構(gòu)造成使所述未復(fù)合的分析物以比所述分析物/探針復(fù)合物慢的速率流過所述層析區(qū)；以及位于所述層析區(qū)下游的檢測區(qū)，其中捕獲試劑固定在所述檢測區(qū)內(nèi)，所述捕獲試劑被構(gòu)造成結(jié)合到所述分析物/探針復(fù)合物上，從而在所述檢測區(qū)內(nèi)，所述復(fù)合物產(chǎn)生檢測信號，其中由所述檢測信號來確定測試樣品內(nèi)分析物的量。
15.如權(quán)利要求14所述的流通夾心測定裝置，其中所述微孔顆粒在相互之間限定出多個空間，所述空間的平均尺寸大于所述顆粒的微孔的平均尺寸。
16.如權(quán)利要求14所述的流通夾心測定裝置，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約100％。
17.如權(quán)利要求14所述的流通夾心測定裝置，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約150％。
18.如權(quán)利要求14所述的流通夾心測定裝置，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約250％。
19.如權(quán)利要求14所述的流通夾心測定裝置，其中所述微孔顆粒選自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、硅珠、以及這些物質(zhì)的組合。
20.如權(quán)利要求14所述的流通夾心測定裝置，其中所述微孔顆粒的表面對于分析物是化學(xué)惰性的。
21.如權(quán)利要求14所述的流通夾心測定裝置，其中所述多孔膜還包括能夠產(chǎn)生校正信號的校正區(qū)，其中由所述校正信號校正的所述檢測信號來確定測試樣品內(nèi)分析物的量。
22.如權(quán)利要求21所述的流通夾心測定裝置，其中所述多孔膜與校正探針相通，所述校正探針在存在于所述校正區(qū)內(nèi)時產(chǎn)生所述校正信號。
23.一種用于檢測測試樣品中分析物的存在或數(shù)量的方法，所述方法包括i)提供一種流通測定裝置，所述裝置包括多孔膜，所述多孔膜與能夠產(chǎn)生檢測信號的綴合檢測探針相通，所述多孔膜限定出層析區(qū)和位于所述層析區(qū)下游的檢測區(qū)，在所述層析區(qū)內(nèi)固定有多個微孔顆粒，其中捕獲試劑固定在所述檢測區(qū)內(nèi)；ii)使含有分析物的測試樣品與所述綴合檢測探針接觸，從而形成分析物/探針復(fù)合物和未復(fù)合的分析物；以及iii)使所述分析物/探針復(fù)合物和所述未復(fù)合的分析物到達(dá)所述層析區(qū)，然后到達(dá)檢測區(qū)，其中所述分析物/探針復(fù)合物在所述未復(fù)合的分析物之前到達(dá)所述檢測區(qū)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述微孔顆粒在相互之間限定出多個空間，所述空間的平均尺寸大于所述顆粒的微孔的平均尺寸。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約100％。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約150％。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述微孔的平均尺寸比所述空間的平均尺寸至少小約100％。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述微孔顆粒選自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、硅珠、以及這些物質(zhì)的組合。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述微孔顆粒的表面對于分析物是化學(xué)惰性的。
30.如權(quán)利要求23所述的方法，其中還包括測定所述檢測區(qū)內(nèi)產(chǎn)生的檢測信號的強度。
31.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述多孔膜還包括能夠產(chǎn)生校正信號的校正區(qū)，其中由所述校正信號校正的所述檢測信號來確定測試樣品內(nèi)分析物的量。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述多孔膜與校正探針相通，所述校正探針在存在于所述校正區(qū)內(nèi)時產(chǎn)生所述校正信號。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中還包括通過針對多個預(yù)定的分析物濃度繪制由校正信號的強度校正的檢測信號的強度來產(chǎn)生校正曲線。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測測試樣品中分析物的存在或數(shù)量的基于膜的測定裝置。該裝置采用其上具有多個微孔顆粒的層析區(qū)。層析區(qū)能夠以簡單、有效和相對廉價的方式有效減小“鉤效應(yīng)”。尤其是，多個微孔顆粒使得較大尺寸的分析物/探針復(fù)合物在未復(fù)合的分析物之前到達(dá)檢測區(qū)。由于基本上抑制了未復(fù)合的分析物與復(fù)合物競爭檢測區(qū)中的結(jié)合位點，因此可限制“假陰性”的發(fā)生，甚至在分析物濃度較高的時候。
文檔編號G01N33/538GK1720455SQ200380105276
公開日2006年1月11日 申請日期2003年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者衛(wèi)寧, 黃延賓 申請人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司