專利名稱：分析芯片以及所述分析芯片用于測定分子結(jié)構(gòu)和功能的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于研究膜蛋白功能性以及它們與分子相互作用的分析芯片。更進一步地，本發(fā)明涉及分析在流體生物有效層(fluidbiological effective layer)中整合的非脂類分子，例如蛋白質(zhì)的功能性(functionality)的方法。此外，本發(fā)明涉及所述分析芯片的用途。
對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的詳細了解是理解生命分子過程的關(guān)鍵。依靠強大的分子克隆和基因表達技術(shù)，可以為分析研究目的制造出足夠量的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學目前是生命科學研究中非?；钴S的領(lǐng)域。最終目的是獲得對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的全面的理解。這種知識是對新藥進行合理設(shè)計的先決條件。G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)組成了細胞膜受體的最大亞組，它們中的大約一半被認為是藥物的靶。舉例而言，牛視紫紅質(zhì)(GPCR蛋白質(zhì)的一種模型)的實際結(jié)構(gòu)近來可在2.8A的分辨率下被測定。GPCRs具有糖基化的N-末端配體結(jié)合位點、七個跨膜螺旋以及細胞內(nèi)G-蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。結(jié)合到細胞外部分上的配體能誘導受體蛋白跨膜螺旋束中的構(gòu)象變化，導致與GPCR細胞內(nèi)區(qū)域結(jié)合的異源三體G-蛋白解離為α-和βγ-亞基。G-蛋白被共價錨定到脂雙層上，根據(jù)與不同目標膜蛋白(例如酶或離子通道)反應(yīng)的α-亞基的性質(zhì)，它們目前被分類為四個家族。G-蛋白解離之后，α-亞基在脂雙層內(nèi)橫向散開，與目標蛋白質(zhì)結(jié)合并對其進行激活。
因此，在任何類型的功能性分析和篩選方法中，脂雙層的組成和流動性都是關(guān)鍵的議題，當考慮為篩選目的的經(jīng)濟方法時，其尤其具有很高的興趣。
在微點(micro-spot)上固定的GPCRs的陣列近來已被用于研究與這種膜蛋白特異性結(jié)合的化合物。此類高通量技術(shù)使得篩選得以在受體家族間或家族內(nèi)進行，并且可能適用于針對孤兒(orphan)GPCRs的配體垂釣(ligand fishing)。目前大約140種孤兒GPCR受體的生物學應(yīng)答是未知的，這使得確定哪些配體是可能有用的藥物的過程難于進行。
對非olefatory GPCRs進行去孤兒化(deorphanization)目前是制藥工業(yè)中的焦點，近來已經(jīng)鑒定出了一些具有與癌癥和糖尿病相關(guān)的可能功能的受體。成功發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合化合物強烈依賴于目標蛋白的完全功能性，如同在活細胞中的情況那樣。較之激動劑結(jié)合位點，不覆蓋天然激動劑的結(jié)合位點的GPCR上的變構(gòu)位點具有大量理論上的好處，例如飽和性以及高的組織特異性。因此，對于通過增加或部分降低其活性來調(diào)控受體功能的藥物來說，變構(gòu)位點是具有吸引力的目標位點。變構(gòu)配體或調(diào)控蛋白的結(jié)合可以產(chǎn)生由若干組分構(gòu)成的膜蛋白復(fù)合體。此外，對于研究此類相互作用而言，需要高敏感度的功能分析系統(tǒng)，其中，目標膜蛋白在脂雙層膜內(nèi)必須是完全流動的，并且它們應(yīng)當非常容易接近(accessible)。
在下述體外分析系統(tǒng)的幾乎全部情況下，未知組分的生物膜被固定于固體支持物上，這通常導致脂雙層的流動性受限以及膜蛋白的結(jié)構(gòu)紊亂。因為此原因，在廣泛的分析操作活動(assay processingcampagnes)中，這些情況是非常不想要的，因為為進行藥物篩選過程，蛋白質(zhì)的天然功能可能被嚴重擾亂。
膜蛋白的第二大重要的類是離子通道。真核細胞的電壓門控鈉通道是復(fù)雜的膜蛋白，它由超過2000個氨基酸殘基組成。細菌的鈉通道要簡單得多，其由34kD的一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其可以以高比率表達，因此對于分析技術(shù)發(fā)展來說非常地有用。高通量篩選分析使用結(jié)合脂雙層膜的敏感報道分子或融合構(gòu)建體(由綠色熒光蛋白和離子通道構(gòu)成)。通過使用提出的高復(fù)雜度的分析系統(tǒng)，將能獲得對目標膜蛋白功能的更深刻的認識。學術(shù)研究和藥物探索都能從這種知識獲益。
基于細胞的分析很適合用于監(jiān)測GPCRs在其天然環(huán)境下的生物學應(yīng)答，它們被廣泛用于在藥物探索過程中鑒定出先導化合物。為理解分子機制，需要進行體外試驗，其中，涉及到的組分的數(shù)量有所減少。膜蛋白在體內(nèi)的功能性依賴于很多因素脂雙層膜的組成、生物活化反應(yīng)(例如磷酸化)或細胞內(nèi)的Ca++濃度。用于膜蛋白的強有力的功能性仿生體外試驗的發(fā)展是高要求、高度學科融合的領(lǐng)域。第一步是將純化表達的重組蛋白質(zhì)重新構(gòu)建于脂雙層膜中，以使它們成為具有功能的形式。由脂雙層構(gòu)成的囊(vesicle)通常被用于在緩沖溶液中保持活性膜蛋白。使用表面等離子共振作為探測方法，當它們結(jié)合到傳感器表面上時，已能對配體與囊中存在的蛋白質(zhì)的結(jié)合進行監(jiān)測。但是，此類囊制劑可能需要非常大量的蛋白質(zhì)，以在測量中獲得足夠高的敏感性，而且它們不適合研究很多種功能方面。因此，發(fā)展出了若干種類型的雜交系統(tǒng)，其中，平面脂雙層膜被固定于固體支持物上。
在Teflon支持物上跨越一個洞的獨立的(free-standing)膜呈現(xiàn)為黑色。此類黑色的脂雙層膜難于制備，并且非常脆弱，因為4nm厚的脂雙層必須跨越200μm至1mm范圍內(nèi)的洞。對研究實驗而言，這種限制可能是可以接受的，但是，對藥物探索中的實際應(yīng)用而言，分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性是很重要的問題。因此，大約20年來，為獲得更高的穩(wěn)定性，用支持物發(fā)展出了多種技術(shù)。膜蛋白已通過脂質(zhì)囊的融合被固定到被支持的脂雙層上，或被直接固定到SiO2上。從吸附到親水表面(例如云母)的囊形成的平面雙層可被觀察到。
但是，當被支持時，脂雙層有所改變的物理性質(zhì)會嚴重影響到嵌入的膜蛋白的功能。為克服這些問題，已通過系鏈(tether)將脂雙層膜固定到表面上。得到的脂雙層膜與固體支持物之間的裂縫模仿了細胞內(nèi)空間，跨膜蛋白質(zhì)的想要的功能性被部分保留。使用熒光探測技術(shù)，已能對配體與脂雙層中膜蛋白的結(jié)合進行監(jiān)測。還對阻抗進行測量，以確定被支持的離子通道的功能。含有離子載體的被支持的脂雙層膜的電導隨著配體的結(jié)合而改變。該效應(yīng)已被用于發(fā)展基于膜蛋白的生物傳感器。
雜交系統(tǒng)的優(yōu)點是能獲得穩(wěn)定性以及切實可行的制備過程。通過囊與被支持的磷脂單層的融合形成被支持的平面脂雙層膜的過程已被建立。為對配體結(jié)合進行光學探測，已在烷基化的羧化右旋糖苷聚合物上制備出了脂雙層膜，其被以高密度固定到傳感器表面。在使用微圖案化(micropatterned)的表面的研究中顯示，親水-疏水邊緣能促進囊的融合。此外，短鏈醇、Ca++離子和PEG的融合作用是本領(lǐng)域已知的。這些研究表明，囊的組成、融合試劑、親水性、表面的拓撲學和化學性質(zhì)以及溫度是影響從吸附到固體支持物上的囊形成脂雙層膜的最重要的因素。
根據(jù)前文所述的方法獲得的被支持的系鏈化脂雙層膜也具有一些重大缺點。脂雙層膜和支持物之間的貯庫(reservoir)中流體的組成很難被控制，固定的脂雙層膜的流動性就受到了限制。這構(gòu)成了極大的缺陷，因為膜蛋白的功能性與脂雙層的流動性以及它們在其中的可動性相關(guān)。此外，具有大的跨膜環(huán)的膜蛋白(例如，乙酰膽堿受體，具有5nm的大的細胞內(nèi)部分)的摻入會受到阻礙，因為通過系鏈獲得的支持物和脂雙層之間的細胞內(nèi)空間對于更大的跨膜環(huán)來說太小了。
此外，系鏈化的脂雙層膜僅有一側(cè)是可接近的，這使對跨膜變化或分子轉(zhuǎn)運的探測難于進行。非天然環(huán)境可能導致功能性受損，在篩選中，生理受體功能可能不會被探測到。
下文中，不同的膜類型，例如制備出的具有預(yù)先確定的組分的脂雙層、細胞來源的組分大部分未知的生物膜或超分子集合體(supramolecular assembly)的功能層，籠統(tǒng)地被稱為生物有效層。
因此，本發(fā)明的一個特殊目的就是提供一種具有作為膜的生物有效層的設(shè)備，其具有可靠的高穩(wěn)定性，存在方式使得其流動性能被保持，以將非脂類分子整合進所述的層，并保持其完整的生物功能性。
該目的將根據(jù)本發(fā)明來獲得，這是通過一種分析芯片實現(xiàn)的，所述芯片用于研究非脂類分子的功能性以及它們與分子的相互作用，所述分析芯片包含a)具有多個納米孔(nanopore)的納米孔基底；b)合適的、基本上平面化的支持物層，其放置于(deposited on)所述具有多個納米孔的納米孔基底上，與所述納米孔基底對應(yīng)；c)生物有效層，能接納至少一種非脂類分子或功能分子，其被放置于所述支持物層上，覆蓋所述多個納米孔，產(chǎn)生從生物有效層的兩側(cè)均可接近的納米孔用于測量。
該分析芯片提供了具有肉眼可見的橫向尺寸的納米孔陣列，由此提供了用于穩(wěn)定生物有效層(被定義為能保持其中接納的非脂類分子的完全的功能性的層)例如脂雙層膜的支持區(qū)域，以及高密度存在的孔，其中生物有效層保持完全流動性。該分析芯片因此提供了用于多種應(yīng)用的通用系統(tǒng)，例如藥物篩選、功能蛋白質(zhì)分析、毒性分析等。由于Si3N4層的厚度很薄，具有納米孔的分別的Si3N4膜也很薄，由于應(yīng)用的加工技術(shù)，這些Si3N4膜在機械上是穩(wěn)定的。孔直徑與納米陣列厚度的給定縱橫比(aspect ratio)允許大分子向脂類層的膜和整合進去的非脂類分子(例如，膜蛋白)的擴散不被阻礙。此外，機械上穩(wěn)定的生物有效層(指具有納米孔的Si3N4膜的固體支持物層和在上面固定的生物有效層)提供了從所述生物有效層的兩側(cè)的自由接近，這允許對分子(例如天然配體)的復(fù)雜相互作用或與人工效應(yīng)物分子(例如藥物)和功能性整合進去的膜蛋白的相互作用加以研究，以闡釋信號轉(zhuǎn)導的機制。由于從兩側(cè)的可接近性，可在微腔系統(tǒng)中，即，在兩區(qū)室系統(tǒng)中，對由轉(zhuǎn)運蛋白通過生物有效層對離子、分子和顆粒的運送加以研究。表面圖案化和微打點(microspotting)技術(shù)將允許展示出(address)特殊的納米陣列。此外，膜蛋白在空間上不會受到阻礙，因為它們的移動性得以被保持，因此能直接對它們對變構(gòu)效應(yīng)的反應(yīng)加以研究，這對于發(fā)展以GCPRs為目標的新藥來說很重要。納米結(jié)構(gòu)化的總表面積在下述范圍內(nèi)一方面，存在有足夠大量的膜蛋白分子，從而可以用肉眼可見的方法，通過熒光手段或其它敏感的探測方法來探測明顯的結(jié)合。另一方面，珍貴的膜蛋白和/或結(jié)合化合物的量相對較低，用于獲得想要的篩選方法。
這種具有納米結(jié)構(gòu)化的氮化硅膜的分析芯片能支持生物有效層，因此能對細胞骨架進行生物模擬。
用作為合適的支持物層的材料是氮化硅(Si3N4)或硅氧化物(SiO2)，納米孔基底可能是含碳和硅的材料，也可以是聚合物、金屬、電介質(zhì)(dielectrica)、玻璃或陶瓷。合適在本發(fā)明中被理解為下述定義支持材料的性質(zhì)允許推想的將被支持物層支持的脂類層附著。此外，應(yīng)當指出，支持物層可以具有能促進脂類層融合到支持物層上的化學和拓撲學性質(zhì)。
為提高或誘導流體脂雙層在支持物層上形成和/或融合和/或固定至想要的程度，可對支持物層的表面加以修飾，得到一種促進層(promotion layer)，即，使用化學活化的疏水或親水性硅烷或其它組分來進行修飾，以及對物理性質(zhì)的修飾，例如拓撲性的修飾或電學修飾。可根據(jù)待支持的脂雙層的性質(zhì)，以及按照用于脂雙層形成的機制來設(shè)計促進層。
在大分子的自由擴散性和穩(wěn)定性的方面，可對納米孔陣列部件中支持物層的厚度以及納米孔的直徑加以選擇，以使得縱橫比在0.25至5的范圍內(nèi)。通常，一個納米孔陣列部件(section)包含納米孔，每個孔的直徑都在50至2000nm范圍內(nèi)，優(yōu)選地，100至2000nm范圍內(nèi)，納米孔陣列部件的厚度在50至2000nm范圍內(nèi)。納米孔陣列部件的區(qū)域具有1×10-6mm2至1mm2范圍內(nèi)的面積。例如，200nm的孔直徑需要支持物層的厚度為400nm厚，用于匹配上2的縱橫比。優(yōu)選地，該縱橫比可以在0.75至2的范圍內(nèi)。因此，非常合適的孔直徑可以在100至400nm的區(qū)間內(nèi)。該尺寸提供了生物有效層和支持物層機械穩(wěn)定性之間非常好的平衡，并且，其還能保持液體雙層膜的流動性以及整合進去的膜蛋白的完全的功能性。此外，目前宏觀探測方法所需要的膜蛋白的量被限制為經(jīng)濟上合理的程度。
在獲得生物有效層的有效面積的方面，其使納米孔中獨立的脂雙層膜面積和被支持的脂雙層膜面積保持適當?shù)年P(guān)系，所述的孔互相之間的間隔在它們直徑的0.5至5倍的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，在0.8至2倍的范圍內(nèi)。
實踐中，可從天然來源分離出生物有效層，主要是從原核或真核細胞中分離，生物有效層也可以是從脂類囊及它們稍后的融合制備來的脂雙層。
重新構(gòu)建的雙層的脂類組分可以選自含有磷脂、心磷脂(cardiolipid)、溶血磷脂、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂、腦苷脂、糖脂、類固醇和鞘脂類的組。
生物有效層包含至少一種非脂類和/或功能分子，其中，非脂類分子可選自含有蛋白質(zhì)、多肽、肽或合成化合物(例如，具有仿生功能的)的組；蛋白質(zhì)可以是酶、轉(zhuǎn)運蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、受體、細胞因子、激素、毒素、抑制劑或伴侶分子。這些非脂類分子可以從天然來源例如真核生物或原核生物的細胞分離或純化。此外，非脂類分子可以是合成的化合物。
生物有效層包含至少一種非脂類和/或功能分子，其中，功能分子可以來自人造來源，例如重組DNA或RNA技術(shù)。
生物有效層可以用至少一種完整的活細胞形成。取決于納米孔陣列的實際幾何形狀，可以使用多于一種的細胞。細胞可以被嵌入到生物有效層中，生物有效層被預(yù)先放置(deposited)到納米孔陣列上。如果沒有此類的層被放置，那么細胞則代表生物有效層自身。
根據(jù)本發(fā)明，對于在此類分析芯片中的整合到生物有效層中的非脂類分子或功能分子的功能性加以研究的合適程序包含如下步驟a)將含有分子的流體應(yīng)用到流體生物有效層的一側(cè)，以允許所述分子結(jié)合，以與非脂類分子相互作用；b)通過測量分析芯片正面或反面的物理或化學變化，對流體生物有效層中結(jié)合分子的相互作用和/或效應(yīng)物結(jié)合誘導的非脂類分子的應(yīng)答加以監(jiān)測。
因此，上述分析芯片可根據(jù)本發(fā)明用于藥物探索過程，這針對膜蛋白的響應(yīng)于將要篩選的可能的藥物化合物的完全功能性來進行。結(jié)合可以在生物有效層的正面作為例如熒光淬滅被觀察到，或者可以在反面被觀察到，這可以通過測量pH、K+、Na+濃度，測量小體積中的染料或放射活性來進行。
下述描述將闡釋一些優(yōu)選的實施方式，它們不用于限制本發(fā)明；下文的描述還會引用下面的附圖，用于闡述本發(fā)明。因此，下面給出了對附圖的簡單的描述。


圖1是流體脂雙層中發(fā)生的生物機制的示意圖。
圖2是根據(jù)本發(fā)明的一種特殊的實施方式中，具有納米孔陣列的分析芯片的設(shè)計及其尺寸的示意圖；以及圖3是根據(jù)本發(fā)明一種實施方式的具有納米孔陣列的分析芯片的制造過程的示意圖。
根據(jù)圖1，顯示了分析芯片2的一部分，以闡述膜蛋白3的生物學功能。分析芯片2是用于對膜蛋白3的結(jié)合活性加以研究的必需先決條件，其聯(lián)合了上文所述的被支持的4和獨立的脂雙層膜5的優(yōu)點。分析芯片2包含陣列基底28和300nm厚的氮化硅層6，氮化硅層6具有直徑在50nm至2μm范圍內(nèi)的孔8的陣列7形式的部件(sections)。用于支持的該氮化硅層6被支持促進層9進行了化學修飾，其中使用了經(jīng)活化的疏水硅烷。分別位于支持物層6或支持促進層9表面上的平面脂雙層膜4可以多種方式形成。在這種實施方式中，脂類囊的疏水鏈10與疏水的支持促進層9相互作用，自發(fā)地形成雙層4。在第二個步驟中，具有完整膜蛋白3的脂類囊11被加入，其與固定的脂雙層4發(fā)生相互作用。粘附到支持物促進層9上以及在第二個步驟中粘附到形成的雙層上的脂類囊11的融合12可以在合適的條件下自發(fā)地發(fā)生?；蛘?，可使用融合劑來誘導融合?？梢允褂霉鈱W、熒光和掃描探針顯微鏡或電化學方法來監(jiān)測融合過程。
當用純凈的(neat)脂類囊11獲得沒有缺陷的連續(xù)脂雙層膜4時，可對具有商業(yè)可獲得的Na+和Ca++離子載體的脂雙層膜加以研究。在第二階段，按照下文所述對膜蛋白加以研究?；蛘?，溶解的膜蛋白3可被直接包括進制備的脂雙層膜4，膜4位于納米孔陣列部件7上。膜蛋白3被預(yù)計能優(yōu)選地在納米孔8中的脂雙層5的獨立區(qū)域上聚集。
所提出的概念允許在第一個步驟中在囊懸浮液11中制備膜蛋白3，以及在第二個步驟12中將囊加入到制備得到的脂雙層膜4中。得到的獨立的(free standing)脂雙層膜4具有足夠高的機械穩(wěn)定性以及長范圍(long-range)流動性，這是獲得跨膜蛋白制劑的完全的功能性所需要的。
分析芯片2用于研究跨膜蛋白3(例如GPCRs)的功能性以及它們與其它膜蛋白(例如離子通道13)的相互作用。為說明流體脂雙層對于膜蛋白活性的大致的重要性，詳細列出GPCRs的功能。在天然配體14與其結(jié)合位點15結(jié)合之后(用箭頭16表示)，GPCR獲得了催化活性，導致了特殊的三體G-蛋白分子18在α-19和βγ20亞基的解離17，這是在當其從脂雙層膜4的另一側(cè)結(jié)合到該膜蛋白3(箭頭21)的時候發(fā)生的。G-蛋白18的亞基19和20通過脂類的錨共價偶聯(lián)到脂雙層膜4，它們可以在脂雙層膜4內(nèi)橫向擴散到目標膜蛋白13。此外，變構(gòu)效應(yīng)物分子22與膜蛋白3的變構(gòu)位點對接(docking)(由箭頭24代表)的作用可被監(jiān)測，所述監(jiān)測針對其作為增強子、激動劑和拮抗劑調(diào)節(jié)受體功能的作用來進行。膜蛋白13中被誘導的結(jié)構(gòu)變化導致了若干生物化學反應(yīng)，例如，磷酸化、c-AMP產(chǎn)生，這取決于α-亞基19的類型。在該特殊的實施方式中，目標蛋白13是離子通道，通過脂雙層4以高特異性轉(zhuǎn)運K+離子，這可以用有效的K+特異性冠醚指示劑的熒光加以監(jiān)測。
在這種實施方式中，納米孔具有大約140nm的寬度，這使得本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道，在描述中膜蛋白3被很大程度地放大了，從而能對生物機制進行示例性描述。箭頭25表示，膜蛋白3在沿著獨立的孔區(qū)域5內(nèi)的脂雙層4移動時，保留了其柔度(flexibility)。事實上，膜蛋白3的大小僅為若干nm，這意味著在同樣的孔區(qū)域可以容納大量的多種膜蛋白3，從而允許在其尺寸的大倍數(shù)的范圍內(nèi)進行平均的自由橫向移動。在本實施例中在1的范圍內(nèi)的縱橫比由此允許甚至更大的分子26能不受阻礙地擴散(箭頭27)到獨立的孔區(qū)域5中并實際上到達脂雙層4中整合的膜蛋白3的受體位點。
圖2以示意圖的方式描述了對分析芯片2的設(shè)計，在該實施方式中，所述芯片包含總面積為100mm2的陣列基底28，其具有300nm厚的氮化硅層6，氮化硅層6具有實際的納米孔陣列7。具有實際的納米孔陣列7的氮化硅膜部件29的尺寸為大約1mm2。400×400μm的納米孔陣列部件7包含納米孔8，納米孔8具有50至2000nm范圍內(nèi)的直徑(在30處顯示)。納米孔8互相之間的距離(間距(pitch))被選取為在它們直徑31的范圍內(nèi)。這既確保了脂雙層4在合適的支持物層6上的足夠的穩(wěn)定性，又確保了膜蛋白3和待篩選的化合物(4，22)的相當高的分子密度，這樣徹底地減小了膜蛋白3以及待篩選的化合物的量。為支持該論點，下面給出一種簡單的估計納米孔被安排于400×400μm的面積上(相應(yīng)于0.16mm2)，其具有125nm的直徑，相互之間是相同的距離。這使得在所述面積上有2×106個孔。假設(shè)在每個納米孔8中，將容納10個直徑大約5nm的膜蛋白分子3，這導致膜蛋白分子總量為2×107個，或3×10-7mol，以及0.2％的低填充因子。取決于各種膜分子的分子量，假設(shè)分子具有30kD的分子量，對各種分子的需要量即在每分析芯片1pg的范圍內(nèi)。單個離子通道給出大約1pA的電流，其對應(yīng)于107個離子/秒。100秒內(nèi)所有離子通道的流量(turnover)將為大約10-7mol離子，在估計為大約10μl的液體體積中，其對應(yīng)大約1毫摩爾的濃度。很多其它膜蛋白的活性將更低，但是在提到的小體積中，待探測的化合物的濃度將在毫摩爾至微摩爾的范圍內(nèi)。這種估計明顯揭示，通過使用該分析芯片設(shè)計，僅需要非常小量的各種分子，因此對于通過肉眼水平上的探測方法，例如熒光和阻抗來監(jiān)測濃度變化而言，該數(shù)量仍是足夠的。針對其功能性以及與天然配體結(jié)合分子和/或變構(gòu)效應(yīng)物分子發(fā)生的反應(yīng)或作為天然配體結(jié)合分子和/或變構(gòu)效應(yīng)物分子進行分析的各種分子的小量使得下述構(gòu)想成為現(xiàn)實對任何類型的藥物探索或篩選過程而言，該分析芯片完全是目前最好的選擇。
圖3示意性地顯示了制造納米孔以獲得芯片32的方法，所述芯片32包含基底28和具有納米孔8的支持物層6。首先，通過熱浮雕(hotembossing)技術(shù)復(fù)制納米孔8將印章33(圖3A)印到旋涂的(spin-coated)PMMA 34(分子量25kg/mol)上，至厚度為330nm，PMMA 34位于Si3N4(260nm)/Si(300至360μm)/Si3N4(260nm)/Cr(40nm)基底35上。使用掃描電子束，用Leiea LION-LV1電子束直寫機(writer)在PMMA抗蝕劑34上寫上孔陣列，來制作硅母板(silicon master)(用作為浮雕印章的方形硅片，邊長為13.5mm)。此處，孔直徑是通過孔徑大小和電子束散焦來確定的，孔周期(poreperiod)是通過掃描步長來確定的。母板制作的最后步驟包括將Cr移走以產(chǎn)生點陣列掩模，并且RIE二氧化硅，以產(chǎn)生高度為130nm的、印章中的支柱陣列?；追疵娴腟i3N4是用方形開孔(邊長1×1mm)預(yù)先賦予結(jié)構(gòu)的，以被用作為最終的Si3N4-膜制造步驟的掩模(圖3B)。在基底正面的Si3N4-層包括對準標記(13.5×13.5mm框)，以對準浮雕母板，使得納米孔與Si3N4-膜一致，其還包括分割線(10×10mm框)，以從晶片上移出最終的10×10mm芯片，這樣能允許改進的操作得以進行。浮雕之后，使用O2等離子體移去PMMA殘余層，用Cl2/CO2等離子體將孔轉(zhuǎn)移到Cr層上(圖3C)。然后用O2等離子體移去PMMA掩模，之后用CHF3/O2等離子體將孔轉(zhuǎn)移到Si3N4中。用KOH浴在70℃對Si進行蝕刻，以開啟氮化硅膜的背側(cè)(圖3D)，用Cl2/CO2蝕刻除去Cr掩模，以得到最終的芯片(圖3E)。
權(quán)利要求
1.一種分析芯片(2)，所述芯片用于研究非脂類分子的功能性以及它們與分子的相互作用，所述分析芯片包含a)具有多個納米孔(8)的納米孔基底(28)；b)合適的基本上平面化的支持物層(6)，其放置于所述具有多個納米孔(8)的納米孔基底(28)上，與所述納米孔基底(28)的所述納米孔相對應(yīng)；c)生物有效層(4)，其能接納至少一種非脂類分子或功能分子，其被放置于所述支持物層(6)上，并且覆蓋所述多個納米孔(8)，產(chǎn)生從生物有效層(4)的兩側(cè)均可接近的納米孔(8)用于測量。
2.如權(quán)利要求1所述的分析芯片(2)，其特征在于，通過例如被活化的疏水或親水硅烷或其它組分對支持物層(6)的表面加以化學修飾，得到支持物促進層(9)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分析芯片(2)，其特征在于，合適的支持物層(6)選自含有氮化硅(Si3N4)或硅氧化物(SiO2)基底的組，所述基底(28)選自包括含硅和碳的材料、聚合物、金屬、電介質(zhì)、玻璃或陶瓷的組。
4.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的分析芯片，其特征在于，所述基底的厚度與所述納米孔(8)的直徑被選擇以得到在0.25至5的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，在0.75至2的范圍內(nèi)的縱橫比。
5.如權(quán)利要求4所述的分析芯片，其特征在于，所述納米孔(8)的直徑在50至2000nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，100至2000nm的范圍內(nèi)。
6.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的分析芯片，其特征在于，所述納米孔被布置于多個面積在1×10-6mm2至1mm2范圍內(nèi)的納米孔陣列部件(7)中，所述部件位于總面積為1×10-6mm2至10mm2的獨立的氮化硅膜(29)上。
7.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的分析芯片，其特征在于，所述納米孔(8)相互之間的距離在它們直徑的0.5至5倍范圍內(nèi)，優(yōu)選地，在它們直徑的0.8至2倍的范圍內(nèi)。
8.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的分析芯片，其特征在于，所述生物有效層是優(yōu)選從原核或真核細胞分離出的生物膜，或者，所述脂雙層是通過制備脂類囊以及其后的融合形成的，或是超分子集合體的功能層。
9.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的分析芯片，其特征在于，所述非脂類分子來自天然來源，例如真核生物或原核生物的細胞。
10.如權(quán)利要求9所述的分析芯片，其特征在于，所述非脂類分子是合成的化合物。
11.如權(quán)利要求8所述的分析芯片，其特征在于，生物膜和脂雙層都包含至少一種非脂類和/或功能分子(3)，其中，所述功能分子(3)是用重組DNA或RNA技術(shù)制造的。
12.如權(quán)利要求8所述的分析芯片，其特征在于，所述生物有效層是從至少一種完整的活細胞來制備的。
13.一種方法，用于分析非脂類分子或功能分子(3)的功能性，所述分子被整合于前述權(quán)利要求1至12中任意一項所述的分析芯片的生物有效層(4)中，所述方法包括a)將含有結(jié)合化合物(14，22)的流體應(yīng)用到流體生物有效層的一側(cè)，以允許所述結(jié)合化合物(14，22)與所述非脂類分子相互作用；b)通過測量分析芯片(2)正面或反面的物理或化學變化，對流體生物有效層中通過與結(jié)合分子(13)的相互作用和/或效應(yīng)物結(jié)合(14，22)誘導的非脂類分子(3)的應(yīng)答加以監(jiān)測。
14.如前述權(quán)利要求1至12中任意一項所述的分析芯片在藥物探索過程中的用途，所述藥物探索過程針對膜蛋白(3，13)應(yīng)答于待篩選的可能藥物與膜蛋白(3)在激動劑位點(15)或變構(gòu)位點(23)的結(jié)合的功能性。
15.如權(quán)利要求1至14所述的分析芯片的用途，用于膜蛋白制劑，以使用顯微和納米顯微方法(局部探針顯微方法)或測量光(特別是熒光)、離子、電流、放射性和機械信號來對分子和分子簇進行成像。
16.如權(quán)利要求1至14所述的分析芯片的用途，用于以下應(yīng)用通過肉眼可見的方式研究或探測兩個區(qū)室間的分子過程，其中，所述體積在亞毫升至微升范圍內(nèi)的兩個區(qū)室作為(微)流體系統(tǒng)的部分，通過所述生物有效層被分離開，任選地，所述生物有效層整合有蛋白質(zhì)，其中，所述蛋白質(zhì)是跨膜的、完整的、通過肽連接的或連接到脂類錨上的，或通過非共價方式粘附到所述脂雙層(4)上。
全文摘要
一種分析芯片(2)，用于研究膜蛋白質(zhì)的功能性以及它們與分子的相互作用，所述分析芯片包含具有多個納米孔(8)的納米孔陣列(7)，其位于放置于所述納米孔基底(28)上的合適的支持物層(6)中，所述支持物層(6)是基本上平面化的支持物層(6)，其具有多個納米孔(8)，與所述納米孔基底(28)的所述納米孔(8)相對應(yīng)；生物有效層(4)，其能接納至少一種非脂類分子或功能分子，其被放置于所述支持物層(6)上，覆蓋所述多個納米孔(8)，產(chǎn)生從生物有效層(4)的兩側(cè)均可接近的納米孔(8)，用于測量或成像。本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)化的支持物層，其允許產(chǎn)生生物有效膜，例如脂雙層膜，它們具有可靠的高穩(wěn)定性，使得其流動性被保持，以在所述脂雙層中使整合的膜蛋白保持其完全的生物學功能性。
文檔編號G01N33/543GK1902497SQ200480038567
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月23日
發(fā)明者L·蒂菲瑙爾, K·布蘭德 申請人:保羅·謝勒學院, 萊斯特加工技術(shù)公司