專利名稱：鑒定用于細(xì)胞附著的配體的高通量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及高通量篩選方法的領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及高通量篩選方法，所述方法可用于鑒定在細(xì)胞中引發(fā)想要的生物學(xué)反應(yīng)的單一物質(zhì)(single agents)的混合物和這些混合物中的單一物質(zhì)。
背景技術(shù)：
已知附著依賴性細(xì)胞需要合適的允許細(xì)胞附著以使在體外細(xì)胞培養(yǎng)中存活的培養(yǎng)基質(zhì)。一般地，培養(yǎng)基中的蛋白任意地固定在細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的表面以形成細(xì)胞可以附著的層。細(xì)胞表面受體，例如，整聯(lián)蛋白，例如通過與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白例如纖連蛋白作用來介導(dǎo)細(xì)胞附著至該蛋白層上，所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白存在于該血清蛋白層中并且仍具有生物學(xué)活性。當(dāng)細(xì)胞通過細(xì)胞表面受體-配體相互作用附著在表面時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)了內(nèi)部信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最終確定所述細(xì)胞的命運(yùn)，例如存活、增殖或分化。與體內(nèi)生物學(xué)過程相反，由于非特異性地和任意地形成的血清蛋白層的原因，使用含于培養(yǎng)基中的血清蛋白將細(xì)胞附著在細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)上的不利方面是信號(hào)傳導(dǎo)途徑被非特異性地和任意地觸發(fā)。另一個(gè)不利方面是被吸附至來自培養(yǎng)基的基質(zhì)上的蛋白可溶解回培養(yǎng)基中，從而離開表面，其進(jìn)一步導(dǎo)致基質(zhì)表面不分明。
在其它常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞可附著的蛋白可以蛋白包被(protein coatings)的形式存在，在將細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)基之前，將所述蛋白包被應(yīng)用于培養(yǎng)容器。作為包被被吸附至培養(yǎng)表面的蛋白可溶解回培養(yǎng)基中，從而離開培養(yǎng)表面。
對(duì)于用于在治療中醫(yī)治或治療人疾病的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞保持在體外培養(yǎng)時(shí)，希望控制細(xì)胞命運(yùn)例如細(xì)胞存活、增殖和分化。因此控制細(xì)胞表面受體與存在于體外培養(yǎng)基質(zhì)上的配體的相互作用是必要的。為了控制細(xì)胞表面相互作用，可用不允許細(xì)胞附著的多聚物包被合適的培養(yǎng)基質(zhì)例如聚苯乙烯，即使在培養(yǎng)基中使用血清蛋白時(shí)。因此該包被消除了血清蛋白不受控制的和任意的吸附。然后將適合與細(xì)胞表面受體相互作用的生物學(xué)活性配體固定在該包被上，但同時(shí)保持所述配體的生物學(xué)活性。該概念是已知的。例如，已知使用透明質(zhì)酸或algenic酸作為表面包被(coating)，可通過使用導(dǎo)致包被與細(xì)胞附著配體之間形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的化學(xué)反應(yīng)將細(xì)胞附著配體固定在所述表面包被上。這防止了細(xì)胞附著配體溶解和離開表面。此外，所述包被自身不支持細(xì)胞附著。這描述于2002年9月30日提交的共同未決的、共同擁有的美國(guó)申請(qǐng)10/259,797。
已知研究一種被固定的配體和其在某個(gè)時(shí)刻對(duì)某種細(xì)胞類型的影響。然而，為了獲得想要的細(xì)胞命運(yùn)，很可能需要細(xì)胞附著配體和外部因子的混合物。已知大量的細(xì)胞附著配體并且其用于細(xì)胞附著研究中。因此找到置于細(xì)胞培養(yǎng)表面以最優(yōu)化給定細(xì)胞類型的細(xì)胞附著的恰當(dāng)?shù)募?xì)胞附著配體或細(xì)胞附著配體組合是件繁重的工作。
因此，在本領(lǐng)域存在對(duì)用于鑒定給定細(xì)胞類型的細(xì)胞附著配體和/或外部因子的更高通量的方法的需要。這對(duì)不能存活或只能通過在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中急劇改變其分化狀態(tài)才能存活的細(xì)胞是特別有益的，主要的實(shí)例是初級(jí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。特別地，在本領(lǐng)域存在對(duì)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，所述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可用于系統(tǒng)地研究因子混合物之間的相互作用，所述因子是為獲得給定的細(xì)胞類型的想要的命運(yùn)所必需的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于鑒定能夠在整個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生目的生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)(agent)的高通量方法。特別地，所述方法包括步驟提供具有培養(yǎng)表面的容器；根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)將單一物質(zhì)的不同的混合物放入選擇的容器中；和將該單一物質(zhì)的混合物固定在培養(yǎng)表面上。所述方法進(jìn)一步包括將被固定的物質(zhì)與完整的細(xì)胞接觸；和獲取表示被接觸細(xì)胞中目的生物學(xué)反應(yīng)的數(shù)據(jù)。所述方法也包括使用由獲得的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)模建(statistical modeling)來確定哪種單一物質(zhì)的混合物和/或這些混合物中的哪種單一物質(zhì)對(duì)在被接觸的細(xì)胞中產(chǎn)生目的生物學(xué)反應(yīng)有效。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是用于本發(fā)明的優(yōu)選的步驟的示意說明圖。
圖2是實(shí)例性受試孔的示意說明圖。
圖3是96孔板布局(layout)的示意說明圖，其包含單一物質(zhì)的不同的混合物。通過使用統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)產(chǎn)生該布局，其中設(shè)計(jì)中的總因子(generic factor)各代表單一物質(zhì)。
圖4是96孔板布局的示意說明圖，其包括單一物質(zhì)的不同的混合物。通過使用統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)建立該布局圖，其中設(shè)計(jì)中的總因子(genericfactor)各代表物質(zhì)的混合物。
圖5是可用于產(chǎn)生本發(fā)明方法的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的方案的示意說明圖。
圖6是可用于產(chǎn)生本發(fā)明方法的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的進(jìn)一步方案的示意說明圖。
圖7是數(shù)據(jù)表(spreadsheet)，其顯示使用圖6中的方案產(chǎn)生的96孔板布局的混合設(shè)計(jì)，其中按存在的因子的數(shù)目來分配孔中總的流體體積。
圖8顯示基于圖7中的數(shù)據(jù)表的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)建立的96孔板布局。
圖9是附著在96孔板的孔中的熒光標(biāo)記的細(xì)胞的熒光顯微圖象，所述96孔板具有圖8顯示的布局。
圖10是在分析圖9的顯微圖象后獲得的細(xì)胞核計(jì)數(shù)對(duì)孔編號(hào)的圖表。
圖11是使用來自圖6-10的信息的混合模型分析獲得的Ln(細(xì)胞計(jì)數(shù)-無血清+1)對(duì)來自參照混合物的偏差的圖表。
圖12是使用來自圖6-10的信息的混合模型分析獲得的Ln(細(xì)胞計(jì)數(shù)-10％血清+1)對(duì)來自參照混合物的偏差的圖表。
圖13是顯示用于96孔板布局的Plackett-Burman統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)表。
圖14顯示圖13中的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)中的因子的鑒定。
發(fā)明詳述如此處所定義的，“物質(zhì)(agent)”是結(jié)合細(xì)胞并調(diào)節(jié)靶細(xì)胞或組織存活、分化、增殖或成熟的生長(zhǎng)效應(yīng)物分子。用于本發(fā)明的合適物質(zhì)的實(shí)例包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子、肽、激素和細(xì)胞因子。
術(shù)語(yǔ)“固定物質(zhì)的材料”此處定義為可用作培養(yǎng)表面和某一物質(zhì)之間連接的生物相容性多聚物。
如此處所定義的，術(shù)語(yǔ)“固定”、“被固定的”等是指使物質(zhì)，即，生長(zhǎng)效應(yīng)物分子固定在培養(yǎng)表面，例如孔表面或包含于孔中的支架的表面。該術(shù)語(yǔ)包括所述物質(zhì)被動(dòng)吸附至培養(yǎng)表面和所述物質(zhì)直接或間接地共價(jià)附著至培養(yǎng)表面。
“因子”是實(shí)驗(yàn)中變量的名稱，其代表實(shí)驗(yàn)從一個(gè)試驗(yàn)或運(yùn)行(run)(針對(duì)例如，一個(gè)孔)到下一個(gè)發(fā)生變化的事物。在本發(fā)明中，“因子”是單一物質(zhì)或單一物質(zhì)混合物的總名稱(generic name)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)將因子組合以在實(shí)驗(yàn)中形成不同的混合物。
“統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)”，如此處所定義的是指實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，所述設(shè)計(jì)幫助用戶發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可調(diào)節(jié)變量(即，因子)組合，其顯著地減少獲得該目的所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)。本發(fā)明中，通過使用代表被測(cè)物質(zhì)的總因子名稱來產(chǎn)生合適的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。所述設(shè)計(jì)包括因子水平，所述因子水平可以是因子的量和/或濃度或可被轉(zhuǎn)化成因子的實(shí)際量和/或濃度。所述設(shè)計(jì)也包括被編號(hào)的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行(run)。實(shí)驗(yàn)運(yùn)行明確說明要被檢驗(yàn)的因子的組合和其水平，并且各對(duì)應(yīng)例如多孔板上的單個(gè)孔?？蓪?shí)驗(yàn)運(yùn)行標(biāo)繪在總的多孔板上的孔上。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“預(yù)處理”、“經(jīng)預(yù)處理的”是指在表面或其它基質(zhì)上加上官能團(tuán)，所述官能團(tuán)通過化學(xué)作用參與隨后與固定物質(zhì)的材料(即，生物相容性多聚物)形成的共價(jià)鍵。例如，可將微量滴定孔的表面進(jìn)行氨基-等離子(plasma)處理以產(chǎn)生在其上可連接固定物質(zhì)的材料的富含胺的表面。
如上所述，本發(fā)明涉及用于鑒定能夠在完整細(xì)胞中產(chǎn)生想要的生物學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)的高通量方法。該方法包括步驟提供具有培養(yǎng)表面的容器；根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)將單一物質(zhì)的不同混合物置于選擇的容器中；將單一物質(zhì)的混合物固定至培養(yǎng)表面；和將所述被固定的物質(zhì)與完整的細(xì)胞接觸；所述方法進(jìn)一步包括獲取表示被接觸的細(xì)胞中想要的生物學(xué)反應(yīng)的數(shù)據(jù)；和通過使用由獲得的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)模建來確定哪種單一物質(zhì)的混合物和/或這些混合物中的哪種單一物質(zhì)對(duì)在被接觸的細(xì)胞中產(chǎn)生想要的生物學(xué)反應(yīng)有效。在一個(gè)目的實(shí)施方案中，想要的生物學(xué)反應(yīng)可選自下列細(xì)胞附著、細(xì)胞存活、細(xì)胞分化、細(xì)胞成熟、細(xì)胞增殖和其組合。
如上所述，為獲得想要的細(xì)胞命運(yùn)可能需要單一物質(zhì)的混合物。已知大量的生長(zhǎng)效應(yīng)物。例如，結(jié)合細(xì)胞表面受體或通過離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被吸收并調(diào)節(jié)這些細(xì)胞存活、分化、增殖或成熟的生長(zhǎng)效應(yīng)物分子包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子、肽、激素和細(xì)胞因子，其中存在許多實(shí)例。因此找到置于細(xì)胞培養(yǎng)表面以獲得給定的細(xì)胞類型的想要的細(xì)胞命運(yùn)的恰當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)效應(yīng)物或生長(zhǎng)效應(yīng)物組合是件繁重的工作。
本發(fā)明通過提供更高通量的方法解決了本領(lǐng)域的需要，所述方法用于鑒定在給定的細(xì)胞類型中引起想要的生物學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)的混合物。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，單一物質(zhì)的混合物被共價(jià)地固定在培養(yǎng)表面例如容器表面上的固定物質(zhì)的材料上。本發(fā)明也涉及可將單一物質(zhì)的混合物被動(dòng)地吸附至培養(yǎng)表面。固定物質(zhì)的培養(yǎng)表面也可以是包含于容器內(nèi)的支架。
現(xiàn)參照?qǐng)D1，顯示了優(yōu)選的實(shí)施方案，其中容器10提供了表面12，所述表面可經(jīng)氨基-等離子處理以產(chǎn)生在其上可附著固定物質(zhì)的材料16的胺化表面14。如下面更詳細(xì)描述的，固定物質(zhì)的材料16優(yōu)選地是已與胺化的表面14連接的生物相容性多聚物。單一物質(zhì)20例如20a-d的混合物18理想地共價(jià)固定至固定物質(zhì)的材料16。
現(xiàn)參照?qǐng)D2，根據(jù)本發(fā)明，將單一物質(zhì)不同的混合物置于根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的容器中，所述設(shè)計(jì)在下面進(jìn)行更詳細(xì)的描述。如圖2所顯示的，容器10a中的物質(zhì)20a-d的組合物與第二容器10b中的不同，在容器10b中組合物包含單一物質(zhì)20e-h。然而要注意的是，一個(gè)以上的容器可以包含相同的物質(zhì)。例如，本發(fā)明涉及當(dāng)被某種其它物質(zhì)組合包圍時(shí)給定的物質(zhì)可對(duì)獲得想要的細(xì)胞命運(yùn)起正效應(yīng)，而當(dāng)被不同的物質(zhì)組合包圍時(shí)該相同的物質(zhì)可能對(duì)獲得想要的細(xì)胞命運(yùn)起中性效應(yīng)或不起作用，因此，提供物質(zhì)與其它物質(zhì)的不同組合對(duì)獲得這些效應(yīng)是有益的。再次參照?qǐng)D2，根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，當(dāng)將物質(zhì)20以不同的混合物放置在不同的容器10中時(shí)，這些混合物18與完整細(xì)胞22接觸。物質(zhì)20結(jié)合細(xì)胞22并且能夠在被接觸的細(xì)胞中產(chǎn)生一種或多種想要的生物學(xué)反應(yīng)?；讷@得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定關(guān)于給定的物質(zhì)混合物或混合物內(nèi)單一物質(zhì)對(duì)在細(xì)胞類型中引起想要的反應(yīng)的效果的測(cè)定。使用方法，包括但不限于免疫細(xì)胞化學(xué)分析、顯微鏡法或功能性測(cè)定法，可獲得所述數(shù)據(jù)。
現(xiàn)參照?qǐng)D3-6，現(xiàn)更詳細(xì)地描述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)方面。特別地參照?qǐng)D3，顯示了對(duì)應(yīng)于96孔板24的孔的容器10。該96孔板由A-H行和1-12列組成。如圖3所示，由總因子名稱代表圖1和2中單一物質(zhì)20或混合物18的鑒定是本發(fā)明的一個(gè)方面。所述因子是實(shí)驗(yàn)中的變量。
例如，如圖3所顯示的，總因子(generic factor)1-10代表10個(gè)在框28中標(biāo)出的單個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。在該實(shí)例中，總因子1是I型膠原蛋白、總因子2是III型膠原蛋白等。這些因子中的各因子可與一種或一種以上其它因子組合產(chǎn)生用于板布局的混合物。
現(xiàn)參考圖4，本發(fā)明也涉及這些總因子1-10可能各代表一種以上的物質(zhì)。例如，如框30中標(biāo)明的，在該實(shí)例中總因子1表示I型膠原蛋白和纖連蛋白的混合物；總因子2表示III型膠原蛋白和玻連蛋白的混合物等。這些總因子中各因子可類似地與其它總因子組合產(chǎn)生用于板布局的復(fù)雜混合物。
現(xiàn)就圖3顯示的實(shí)施方案描述圖5和6，其中總因子1-10中的每一個(gè)對(duì)應(yīng)著給定濃度的單一物質(zhì)。
如在圖5中示意性顯示的，提供了如下的方案，其中容器10中的總流體體積被分配至10個(gè)等體積的區(qū)室32中。96孔板的各孔可包含所有10個(gè)因子(例如，單一物質(zhì))或這些因子的子集(subset)。如圖5a中顯示的，在第1種情況中，存在所有10個(gè)因子，并且10個(gè)因子占據(jù)了流體區(qū)室32。圖5a顯示的孔10中的總因子濃度是[10/10]＝[1]。這提供了每孔等于[1]的因子總濃度。圖5b表實(shí)例如相同96孔板上的不同孔。在該情況(第2種情況)下，只出現(xiàn)10個(gè)因子中的5個(gè)。同樣，將流體體積分配至10個(gè)相等的區(qū)室32中。在第2種情況下，當(dāng)因子存在時(shí)，流體區(qū)室填充有該因子。然而，在第2種情況下，10個(gè)體積區(qū)室外中有5個(gè)未填充有因子，而是填充有“位置支架(place holder)”，例如培養(yǎng)基。在圖5b的第2種情況中，總因子濃度等于
。因此，顯示于圖5b中的孔中的總因子濃度是每孔
因子。第1種情況中的總因子濃度與第2種情況中的總因子濃度不相等。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，各容器中的總物質(zhì)濃度可以是不同的。此外，在第1和第2種情況中，孔之間的單一因子的濃度是相同的。例如，可代表單一I型膠原蛋白配體的因子1的濃度在孔之間是相同的。
現(xiàn)參照?qǐng)D6，提供了另一種方案，其中對(duì)表面化學(xué)要求給出了特別的考慮。特別是在該方案中，因子的總密度在各孔間保持恒定，并且只允許孔間的因子組成發(fā)生變化。換句話說，因子的濃度在孔間可以不同，但各孔具有相同數(shù)量的總的被固定的因子。如圖6所顯示的，基于存在的因子數(shù)目分配存在于給定的孔中的總流體體積。同樣，為了簡(jiǎn)化，我們可假定一個(gè)因子對(duì)應(yīng)于一個(gè)單一物質(zhì)，盡管本發(fā)明不限于該種情況。如圖6a所顯示的，存在所有10個(gè)因子并且總因子濃度等于[10/10]＝[1]，總因子濃度為每孔[1]因子。在圖6b中，10個(gè)因子中只有5個(gè)存在，但這5個(gè)因子中各因子的流體體積32是圖6a顯示的各因子體積32的2倍。因此，顯示于圖6b中的總因子濃度與圖6a中顯示的相同，總濃度為每孔[1]因子。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，各容器中物質(zhì)的總濃度是相同的?；趫D6，可以看出盡管顯示于圖6a的孔和顯示于圖6b中的孔之間的總因子濃度是恒定的，但這些孔間的單一因子的濃度可以是不同的。特別地，對(duì)于可表示I型膠原蛋白的因子1，圖6b中該單一物質(zhì)的濃度將是圖6a中顯示的濃度的2倍。因此，在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，容器間的單個(gè)物質(zhì)的濃度不同。
要注意的是，描述于圖5和6中的各方案是可行的并且可用于篩選細(xì)胞附著配體，但使用顯示于圖6中的方案進(jìn)行下面的實(shí)施例部分提出的經(jīng)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明提供了如下的方法，所術(shù)方法使用形式例如96孔板形式就物質(zhì)在細(xì)胞中引發(fā)想要的反應(yīng)的能力平行地篩選大量物質(zhì)的不同的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)將物質(zhì)不同的混合物放入多孔板的選擇的孔中。所述方法可進(jìn)一步包括將單一物質(zhì)放入其它的孔中的步驟。隨后將所述物質(zhì)固定至培養(yǎng)表面，例如孔表面。所述方法也包括將含有細(xì)胞類型的流體樣品遞送至孔。在合適的溫育時(shí)間后，在不同孔中的細(xì)胞和樣品之間，可直接或間接地檢測(cè)到細(xì)胞和孔成分之間相互作用的跡象。例如，使用功能性測(cè)定法、免疫細(xì)胞化學(xué)法或顯微鏡法可獲得數(shù)據(jù)。
用于本發(fā)明的合適的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)包括(但不限于)下列分級(jí)析因設(shè)計(jì)(fractional factorial design)、D-最優(yōu)化設(shè)計(jì)(D-optimal design)、混合設(shè)計(jì)(mixture design)和Plackett-Burman設(shè)計(jì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)是混合設(shè)計(jì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)是基于范圍標(biāo)準(zhǔn)(coverage criteria)、點(diǎn)陣設(shè)計(jì)(lattice design)或拉丁方設(shè)計(jì)(latin square design)的空間充滿設(shè)計(jì)(space-fillingdesign)。
在想要的實(shí)施方案中，用固定物質(zhì)的材料包被可能經(jīng)預(yù)處理的培養(yǎng)表面。所述固定物質(zhì)的材料理想地是生物相容性多聚物，其不支持細(xì)胞附著并可用作培養(yǎng)表面和物質(zhì)之間的柔性連接(系鏈(tether))。合適的多聚物的實(shí)例包括合成的多聚物如聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酰胺和天然的多聚物例如透明質(zhì)酸和algenic酸。
在想要的實(shí)施方案中，培養(yǎng)表面選自，但不限于下列聚苯乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚環(huán)氧乙烷、玻璃、聚硅酸鹽、聚碳酸鹽、聚四氟乙烯、氟碳和尼龍。本發(fā)明也涉及培養(yǎng)基質(zhì)可完全或部分地包含生物可降解材料例如聚酐、聚乙醇酸、多羥基酸例如聚乳酸、聚乙醇酸和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚原酸酯、聚羥基丁酸酯、含磷腈、聚富馬酸丙酯和生物可降解聚氨基甲酸酯。
可對(duì)物質(zhì)可吸附的或連接的培養(yǎng)表面進(jìn)行預(yù)處理。例如，通過多聚物在氨環(huán)境中的等離子放電處理可制備帶伯胺的細(xì)胞培養(yǎng)表面。然后通過使用標(biāo)準(zhǔn)的固定化學(xué)將固定物質(zhì)的材料共價(jià)地附著至這些胺化的表面，如在2002年9月30日提交的共同未決的、共同擁有的美國(guó)申請(qǐng)10/259,797中所描述的，其全文在此引用作為參考。商業(yè)上用于產(chǎn)生組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯的兩個(gè)方法是大氣等離子處理法(atmospheric plasma treatment)(也稱作冠狀放電法(coronadischarge))和真空等離子處理法，各方法在本領(lǐng)域是熟知的。等離子是氣態(tài)離子和自由基的高反應(yīng)性混合物。氨基等離子處理或氧/氮等離子處理可用于產(chǎn)生富含胺的表面，通過使用如美國(guó)申請(qǐng)10/259,797中所描述的碳二亞胺生物綴合化學(xué)法可將生物相容性多聚物例如透明質(zhì)酸(HA)或algenic酸(AA)通過羧基基團(tuán)連接在所述表面上。所得的表面不允許細(xì)胞附著，即使在細(xì)胞培養(yǎng)基中存在高濃度例如10-20％血清蛋白濃度的情況下?？捎糜谕ㄟ^固定物質(zhì)的材料共價(jià)連接物質(zhì)的經(jīng)預(yù)處理的組織培養(yǎng)聚苯乙烯產(chǎn)品的實(shí)例是PRIMARIATM組織培養(yǎng)產(chǎn)品(Becton Dickinson Labware)，其是通過使用氧聚苯乙烯的氧-氮等離子處理產(chǎn)生的并且其導(dǎo)致包含氧和氮的官能團(tuán)例如氨基和酰胺基團(tuán)的摻入。
然后可將物質(zhì)例如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、肽等共價(jià)地連接至上述的HA或AA表面，通過利用蛋白/肽上的胺基團(tuán)和HA或AA上的羧基基團(tuán)或通過使用例如高碘酸鈉氧化作用在HA或AA上產(chǎn)生的醛基來實(shí)現(xiàn)連接。
例如，人胎盤的透明質(zhì)酸的末端糖可通過描述于E.Junowicz和S.Charm，″The Derivatization of Oxidized Polysaccharides forProtein Immobilization and Affinity Chromotography，″Biochimicaet.Biophysica Acta，Vol.428157-165(1976)的高碘酸鹽方法激活，所述文獻(xiàn)此處引用作為參考。該方法要求向透明質(zhì)酸溶液中加入高碘酸鈉或高碘酸鉀，從而激活末端糖，其可化學(xué)交聯(lián)至物質(zhì)的游離氨基例如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上的末端氨基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用碳二亞胺作為交聯(lián)劑可將生物相容性多聚物(例如，HA或AA)上的游離羧基基團(tuán)化學(xué)交聯(lián)至物質(zhì)的游離氨基。其它標(biāo)準(zhǔn)的固定化學(xué)方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且可用于將培養(yǎng)表面與生物相容性多聚物連接和將生物相容性多聚物與物質(zhì)連接。例如，參見″ProteinImmobilizationFundamentals and Applications″Richard F.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991)或2002年9月30日提交的共同未決的美國(guó)申請(qǐng)10/259,797。
要注意的是，盡管通過生物相容性多聚物將試劑與胺化的組織培養(yǎng)表面連接包括本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，但可以使用標(biāo)準(zhǔn)的固定化學(xué)法通過生物相容性多聚物將這些物質(zhì)連接至羧化表面或羥化表面。附著劑的實(shí)例是溴化氰、琥珀酰亞胺、醛、甲苯磺酰氯、親和素-生物素、可光致交聯(lián)劑、環(huán)氧化物和馬來酰亞胺。
如上所述，在選擇的容器內(nèi)包含物質(zhì)混合物是本發(fā)明的一個(gè)方面。此外，其它容器可含有單一物質(zhì)是本發(fā)明的其它方面?？蓪⑦@些物質(zhì)單獨(dú)地或與以組合方式連接至經(jīng)預(yù)處理的組織培養(yǎng)表面。所述物質(zhì)可以任何所需的比例組合?？赏ㄟ^例如包被組合物中物質(zhì)的濃度來控制存在于培養(yǎng)表面的不同物質(zhì)的相對(duì)量?？蛇x擇地，通過調(diào)節(jié)結(jié)合至培養(yǎng)表面的生物相容性多聚物的能力來控制荷載密度。這可以通過例如控制多聚物上可與所述物質(zhì)反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)數(shù)目或通過控制培養(yǎng)表面上生物相容性多聚物的密度來實(shí)現(xiàn)。此外，首先可將所述物質(zhì)分別地連接至生物相容性多聚物(系鏈)，然后以所需的比例混合“已荷載”系鏈，并將其連接到經(jīng)預(yù)處理的基質(zhì)上。
如上所述，優(yōu)選地通過生物相容性多聚物將所述物質(zhì)共價(jià)固定在經(jīng)預(yù)處理的組織培養(yǎng)表面，理想地其富含胺。然而，要注意的是，本發(fā)明涉及非共價(jià)地將所述物質(zhì)固定在表面，以這種方式可通過將所述物質(zhì)被動(dòng)地吸附至表面來將所述物質(zhì)固定在培養(yǎng)表面(例如，孔表面)。本發(fā)明也涉及可將所述物質(zhì)固定在支架上或注入支架內(nèi)，所述支架可放置于容器內(nèi)并且與包含細(xì)胞的流體接觸。用于本發(fā)明的合適支架和將物質(zhì)固定于其上或其內(nèi)的方法描述于2002年9月30日提交的共同未決、共同擁有的美國(guó)申請(qǐng)10/259,817，其全文在此引用作為參考。
除了理想地是組織培養(yǎng)皿、多孔板、培養(yǎng)瓶、試管和滾瓶外，用于本發(fā)明的容器可采用任何常用的形式。構(gòu)型如微量滴定孔和試管的裝置在本發(fā)明中特別有用，其允許以有效和方便的方式手工進(jìn)行大量樣品的同時(shí)測(cè)定。通過使用例如微量滴定孔也可以自動(dòng)化進(jìn)行，由于自動(dòng)移液器和平板讀出計(jì)的存在使得測(cè)定能夠更廣泛地自動(dòng)化。也可使用其它固相，特別是其它塑料固體支持物。
要注意的是，本發(fā)明的方法步驟可以容易地自動(dòng)化。對(duì)于以微量滴定板為形式的尤其如此。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，容器可以包括96孔微量滴定板的孔。用于微量滴定板的自動(dòng)化的移液設(shè)備(用于試劑的加入和清洗步驟)和顏色讀出計(jì)也已存在。用于進(jìn)行本發(fā)明的自動(dòng)化設(shè)備的實(shí)例可以包括移液臺(tái)和檢測(cè)裝置，所述的移液臺(tái)能夠在恒溫環(huán)境(即，溫控環(huán)境)中在特定的時(shí)間點(diǎn)上向孔加入或移出試劑。
如上所述，用于本發(fā)明的物質(zhì)是能結(jié)合細(xì)胞表面上的受體的或通過離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被吸收的并且調(diào)節(jié)靶細(xì)胞或組織生長(zhǎng)、增殖或分化的生長(zhǎng)效應(yīng)物分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些物質(zhì)是細(xì)胞附著配體和/或外部因子。在理想的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)可以是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白片段、肽、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其組合。
優(yōu)選的物質(zhì)是生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)分子。生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括，但不限于，血管內(nèi)皮來源的生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板來源生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFα、TGFβ)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝素結(jié)合因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子I或II、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素神經(jīng)生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、肌形態(tài)發(fā)生蛋白和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的因子。其它合適的生長(zhǎng)因子描述于例如″Peptide Growth Factors and Their Receptors I″M.B.Sporn和A.B.Roberts，Eds.(Springer-Verlag，NY，1990)。
使用本領(lǐng)域已知的方法可從組織中分離生長(zhǎng)因子。例如，可從組織中分離生長(zhǎng)因子或通過重組方法產(chǎn)生生長(zhǎng)因子。例如，可從小鼠的頜下腺分離EGF，Genentech(South San Francisco，CA.)通過重組方法產(chǎn)生TGF-β。其它生長(zhǎng)因子也可以天然的和重組的形式從供貨商例如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)、R&D Systems(Minneapolis，MN.)、BD Biosciences(San Jose，Ca.)和InvitrogenCorporation(Carlsbad，CA.)商購(gòu)獲得。
用于本發(fā)明的合適的細(xì)胞外基質(zhì)分子的實(shí)例包括玻連蛋白、腱生蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白和蛋白聚糖。其它細(xì)胞外基質(zhì)分子描述于Kleinman等人，″Use of ExtracellularMatrix Components for Cell Culture，″Analytical Biochemistry 1661-13(1987)，或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。
用于本發(fā)明的另外的試劑包括細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素和GM集落刺激因子，和激素例如胰島素。這些描述于文獻(xiàn)中并且可商購(gòu)獲得。
用于本發(fā)明的細(xì)胞可以是任何能夠有效地對(duì)所述物質(zhì)起反應(yīng)或其生長(zhǎng)需要所述物質(zhì)的細(xì)胞。例如，可從已建立的細(xì)胞系獲得細(xì)胞或從分離的組織中分離細(xì)胞。合適的細(xì)胞包括大多數(shù)上皮和內(nèi)皮細(xì)胞類型，例如，實(shí)質(zhì)細(xì)胞例如肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、外分泌細(xì)胞、腸來源的細(xì)胞、膽管細(xì)胞、甲狀旁腺細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、腎上腺-下丘腦-垂體通路(access)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、腎基底膜細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞、血管細(xì)胞、形成骨和軟骨的細(xì)胞和平滑和骨骼肌細(xì)胞。其它有用的細(xì)胞可包括干細(xì)胞，其可經(jīng)歷響應(yīng)選擇的物質(zhì)混合物而產(chǎn)生的表型變化。其它合適的細(xì)胞包括血細(xì)胞、臍帶血來源的細(xì)胞、臍帶血來源的干細(xì)胞、臍帶血來源的祖細(xì)胞、臍帶來源的細(xì)胞、胎盤來源的細(xì)胞、骨髓來源的細(xì)胞和羊膜液來源的細(xì)胞。所述細(xì)胞可經(jīng)遺傳工程改造。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用如下物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞，所述物質(zhì)能通過生物相容性性多聚物連接至培養(yǎng)基質(zhì)例如96孔微量滴定板的孔表面?？墒褂迷S多熟知的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)例如描述于Freshney，″Cell Culture，A Manual of Basic Technique″第3版(Wiley-Liss，NY，1994)中的技術(shù)中的任一種培養(yǎng)這些細(xì)胞。其它細(xì)胞培養(yǎng)基和技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的并且可用于本發(fā)明。
現(xiàn)描述根據(jù)本發(fā)明的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例實(shí)施例1透明質(zhì)酸與富含胺的組織培養(yǎng)表面的連接Becton Dickinson Labware使用氧/氮等離子體產(chǎn)生PRIMARIATM組織培養(yǎng)產(chǎn)品。特別地，聚苯乙烯產(chǎn)品的氧/氮等離子體處理導(dǎo)致含有氧和氮的官能團(tuán)例如氨基和酰胺基團(tuán)的摻入。為進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，使用本領(lǐng)域熟知的碳二亞胺生物綴合化學(xué)法將HA通過HA上和羧基基團(tuán)連接至PRIMARIATM多孔板上富含胺的表面，例如描述于″ProteinImmobilizationFundamentals and Applications″Richard S.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991)或描述于2002年9月30日提交的共同未決的美國(guó)申請(qǐng)10/259,797中的方法。
實(shí)施例2ECM蛋白與透明質(zhì)酸的連接將ECM物質(zhì)共價(jià)地附著在與培養(yǎng)表面連接的HA多聚物上。特別地，通過使用描述于E.Junowicz和S.Charm，″The Derivatization ofOxidized Polysaccharides for Protein Immobilization and AffinityChromotography，″Biochimica et.Biophysica Acta，第428卷157-165(1976)的高碘酸鹽方法進(jìn)行氧化反應(yīng)在HA上產(chǎn)生醛基基團(tuán)。該方法要求向HA溶液中加入高碘酸鈉，從而激活末端糖。接著，通過使用標(biāo)準(zhǔn)的固定化學(xué)方法例如描述于″Protein ImmobilizationFundamentals and Applications″Richard F.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991)或2002年9月30日提交的共同未決的美國(guó)申請(qǐng)10/259,797中的方法將激活的HA與ECM蛋白上的胺基連接。
實(shí)施例3使用統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)(混合設(shè)計(jì))同時(shí)篩選10種不同的ECM蛋白在本實(shí)施例中，統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)是混合設(shè)計(jì)。該設(shè)計(jì)被用于鑒定對(duì)細(xì)胞反應(yīng)具有正效應(yīng)的因子對(duì)或單一因子，并允許我們觀察兩個(gè)ECM之間的相互作用。在該實(shí)施例中，使用10種單一的ECM(各代表單一“因子”)產(chǎn)生ECM混合物，用于如圖3所示將所述混合物置入96孔板的孔中。所述ECM共價(jià)地附著在培養(yǎng)表面的生物相容性多聚物上(參見實(shí)施例1和2)。要注意的是，如果沒有針對(duì)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，將需要進(jìn)行210(1024)個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)或需要11個(gè)96孔板來檢驗(yàn)與其它針對(duì)給定的細(xì)胞類型的因子一起的10種ECM的每一個(gè)。
在該實(shí)施例中，選擇一組10個(gè)附著配體和選擇96孔板用作該篩選形式。為消除由于不均勻蒸發(fā)造成的邊際效應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)中只使用96孔板的內(nèi)部60個(gè)孔。從而在板的較外側(cè)的行和列中的孔可用于合適的對(duì)照。
基于其用作細(xì)胞培養(yǎng)試劑的常見用途、商業(yè)可購(gòu)得性和價(jià)格，選擇下列10種附著配體I型膠原蛋白(CI)、III型膠原蛋白(CIII)、IV型膠原蛋白(CIV)、VI型膠原蛋白(CVI)、彈性蛋白(ELA)、纖連蛋白(FN)、玻連蛋白(VN)、層粘連蛋白(LAM)，多聚賴氨酸(PL)和聚鳥氨酸(PO)。
特別考慮到表面化學(xué)要求開發(fā)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。特別地，在該實(shí)驗(yàn)中，使用圖6所示的方案，其中在各孔間保持恒定的總附著配體密度并且只允許改變附著配體的組成。換句話說，孔與孔間的單一附著配體的濃度可以不同，但各孔具有相同的總的被固定的附著配體量。上面更詳細(xì)地描述了該方案。該設(shè)計(jì)的實(shí)例顯示了圖7中的電子數(shù)據(jù)表。圖7中的最上行列出了10種用于該特定篩選的細(xì)胞附著配體。第1列是實(shí)驗(yàn)點(diǎn)目錄，其可翻譯成96孔板中(例如在該情況下是52個(gè)孔)的孔。電子數(shù)據(jù)表中的數(shù)字是加入至特定孔中的因子的實(shí)際體積(以μL計(jì))。在該特定的設(shè)計(jì)中，將因子以三種體積例如5μL、25μL或50μL加入孔。在該情況下總的孔體積是50μL。因此，對(duì)于在其中以50μL加入一種因子的孔，最終的孔組合物包含共價(jià)地固定在孔表面的單一附著配體。因此，如果將25μL因子加入孔，那么也加入25μL第二因子，最終孔組合物將包含共價(jià)地固定在孔表面的兩種不同細(xì)胞附著配體的混合物。當(dāng)加入5μL因子時(shí)，也將其它9種因子以各5μL加入，從而導(dǎo)致在孔中包含孔表面的所有10種細(xì)胞附著配體的混合物。這些含有所有10種附著配體的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)稱作“中點(diǎn)(mid point)”并且是該實(shí)施例中統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的完整部分(integral part)。
參照?qǐng)D8，顯示了96孔板布局，其從圖7所示的特定統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)翻譯過來。特別地，96孔板包含圖7中所示的孔組合物，例如固定在各孔底部的細(xì)胞附著配體組合。特別地，圖7中的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行如下對(duì)應(yīng)著圖8中的行/列圖7設(shè)計(jì)中的運(yùn)行1-10分別對(duì)應(yīng)著圖8中的平板布局中的B行，2-11列；運(yùn)行11-20表示C行，2-11列；運(yùn)行21-30表示D行，2-11列；運(yùn)行31-40表示E行，2-11列；運(yùn)行41-50表示F行，2-11列；運(yùn)行51和52分別表示G行，第2和3列。如圖7中的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)和圖8中相應(yīng)的96孔板布局所示，除了物質(zhì)的混合物外，也可將單一試劑置于容器中也是本發(fā)明的實(shí)施方案。
實(shí)施例4特異性針對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的ECM篩選MC3T3-E1細(xì)胞，來源于Dr.L.D.Quarles，Duke University，和由University of North Carolina at Chapel Hill的Dr.Gale Lester友好提供。使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)這些細(xì)胞。MC3T3-E1是良好表征的和快速生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞細(xì)胞系，其之所以被選擇是因?yàn)槠溲杆俚馗街链蠖鄶?shù)普遍使用的組織培養(yǎng)表面。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法使用胰蛋白酶-EDTA將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中移下來。計(jì)算細(xì)胞數(shù)目，離心并重懸于不含血清的培養(yǎng)基中或重懸于含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基中。根據(jù)圖8所示的和上面實(shí)施例3中描述的布局將細(xì)胞置于96孔板的孔中。播種密度大約為每孔10,000個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞在平板上37℃下溫育過夜。第二天，除去培養(yǎng)基和任何未附著在被在孔表面上被固定的物質(zhì)上的細(xì)胞。通過將任何附著的細(xì)胞暴露于甲醛中至少15分鐘進(jìn)行固定。使用碘化丙錠(propidium iodite)熒光標(biāo)記所述的被固定的附著細(xì)胞的核。使用熒光顯微鏡(Discovery-1，Universal Imaging Corporation，a subsidiary of Molecular Devices，Downingtown，PA.)獲取附著在ECM篩選板的孔上的熒光標(biāo)記的細(xì)胞的圖象。獲自96孔板的圖象的實(shí)例顯示于圖9中。特別地，該布局與圖8中顯示的相同，除了G行，4-11列用作對(duì)照孔。在圖9中，將存在于含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基中的MC3T3-E1細(xì)胞放入含有物質(zhì)混合物的孔中，所述物質(zhì)混合物已被連接至透明質(zhì)酸表面，除了孔G4-G9只含有透明質(zhì)酸表面和孔G10和G11只包含組織培養(yǎng)級(jí)的聚苯乙烯。如所期望的，只有孔G4-G9中的透明質(zhì)酸表面阻止細(xì)胞附著。在該實(shí)施例中，在孔G10和G11中對(duì)聚苯乙烯表面的細(xì)胞附著非常少。相反地，如可通過大量的白點(diǎn)觀察到的，一些含有細(xì)胞附著配體的孔顯示很強(qiáng)的細(xì)胞附著，各點(diǎn)代表附著細(xì)胞的細(xì)胞核。
使用圖象分析軟件包(Meta Morph，Universal ImagingCorporation，a subsidiary of Molecular Devices，Downingtown，PA.)對(duì)圖9中熒光標(biāo)記的細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)，在不含胎牛血清的培養(yǎng)基和含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基中的細(xì)胞核計(jì)數(shù)結(jié)果顯示于圖10。在圖10中，孔1-10對(duì)應(yīng)于圖9中的B行，2-11列；圖10中的孔11-20對(duì)應(yīng)于圖9中的C行，2-11列等。
在圖10中，在10％胎牛血清存在的情況下，在許多孔中觀察到細(xì)胞附著。在無血清的情況下，細(xì)胞附著減少，但仍能在許多孔中觀察到細(xì)胞附著。在兩種情況中，在一些根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)的含有細(xì)胞附著配體的孔中的細(xì)胞附著超過培養(yǎng)在普通的(plain)組織培養(yǎng)級(jí)聚苯乙烯(圖9中的孔59和60)中的細(xì)胞的細(xì)胞附著。所得結(jié)果使得能夠鑒定大量?jī)?yōu)于組織培養(yǎng)級(jí)聚苯乙烯(最常用的細(xì)胞培養(yǎng)支持物)的支持MC3T3-E1附著的表面。
為了最優(yōu)化表面，可遵從兩個(gè)指導(dǎo)，例如，“最優(yōu)孔”組成或“最優(yōu)因子”。根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定“最優(yōu)因子”。
在“最優(yōu)孔”方法中，選擇具有最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的孔進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。在圖10所示的實(shí)施例中，可選擇具有最多細(xì)胞核數(shù)目的孔40(或孔E11)。根據(jù)圖8所示的平板布局圖，該孔含有VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白的混合物?；谧畛醯氖褂媚Ｐ虴CM(纖連蛋白)用MC3T3-E1進(jìn)行的濃度依賴性研究，選擇用于ECM篩選板制備中的固定步驟中的VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白的濃度。要注意的是，在研究中對(duì)一種細(xì)胞類型最優(yōu)的濃度可能對(duì)另一種細(xì)胞類型不是最優(yōu)的。此外，對(duì)給定的細(xì)胞類型來說是最優(yōu)的特定ECM濃度可能對(duì)另一種ECM來說不是最優(yōu)的濃度，即使使用了相同的細(xì)胞類型。類似地，“hit孔”中的混合物組成可能不是最優(yōu)的。例如，孔E11(其是“最優(yōu)孔”)的表面包含50/50的VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白的混合物?？蛇M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)以最優(yōu)化選擇用于固定步驟的兩種配體的濃度以及最優(yōu)化與給定的細(xì)胞類型的“hit”孔表面結(jié)合的混合物的組成(50/50混合物可能不是最優(yōu)組成)。
在“最優(yōu)因子”方法中，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)模型分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于上述實(shí)施例，MC3T3-E1數(shù)據(jù)的混合模型分析顯示如圖11所示，在無血清的情況下，當(dāng)大量存在時(shí)，膠原蛋白IV、層粘連蛋白和多聚L賴氨酸(邊際效應(yīng))表現(xiàn)增加細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有線都交叉的點(diǎn)對(duì)應(yīng)于中點(diǎn)(mid-point)，其中存在所有10種ECM，各5μL。該圖提供了關(guān)于細(xì)胞計(jì)數(shù)如何變化的指示，其依賴于孔組成偏離該參照“中點(diǎn)”混合物多遠(yuǎn)。如可以看到的，隨著IV型膠原或?qū)诱尺B蛋白量的增加，細(xì)胞計(jì)數(shù)也增加。
現(xiàn)參照?qǐng)D12，在10％血清的情況下，圖11中看到的多聚L賴氨酸的任何效應(yīng)減少，只有IV型膠原和層粘連蛋白繼續(xù)顯示對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的正效應(yīng)。
要注意的是，“最優(yōu)孔”和“最優(yōu)因子”方法都是有效的，但各方法可導(dǎo)致不同的表面組成。在本實(shí)施例中，“最優(yōu)孔”方法將導(dǎo)致包含VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白的表面，而“最優(yōu)因子”方法可導(dǎo)致含有VI型膠原蛋白和層粘連蛋白的表面。
實(shí)施例5使用根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)(Plackett-Burman設(shè)計(jì))篩選30種不同的物質(zhì)設(shè)計(jì)本實(shí)施例描述如圖13(a-d)中所示的通過使用從SAS Institute(Cary，NC)商購(gòu)獲得的軟件包JMPTM產(chǎn)生的Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)。特別地，使用SAS/JMP V4.0.5中的定制設(shè)計(jì)功能產(chǎn)生篩選設(shè)計(jì)。所述軟件包是GUI導(dǎo)向的軟件包，因此不顯示代碼。參照?qǐng)D13a，第1列是實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(運(yùn)行(runs))的目錄，其可翻譯成96孔板(例如在該情況下是60孔)上的孔。電子數(shù)據(jù)表中的數(shù)字(-1或1)自身(圖13a-d)指示因子水平。在該實(shí)施例中，“1”表示因子存在而“-1”表示因子不存在。此外，在該實(shí)施例中，如果因子存在于給定的孔中，對(duì)于孔的總體積，其總是以相同的濃度存在。物質(zhì)的總濃度在孔與孔間可基于相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行內(nèi)包含的物質(zhì)數(shù)目發(fā)生變化。在圖13a-d的最上行提供了總因子名稱。圖14顯示本實(shí)驗(yàn)中總因子F01-F30中的每一個(gè)的鑒定。例如，在第1列中的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行1可代表96孔板的孔1。根據(jù)圖13(a-d)所示的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，可看到下列因子存在(即，水平“1”)于孔1中F04、F08、F09、F11、F12、F14、F16、F20、F23、F25、F26、F27和F29。
建議的數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)圖13(a-d)的電子數(shù)據(jù)表所示的設(shè)計(jì)將細(xì)胞置于96孔板的孔中。播種密度大約為每孔10,000個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃下在板上溫育過夜。第二天，除去培養(yǎng)基和任何沒有附著在被固定在孔表面的物質(zhì)上的細(xì)胞，并將任何附著的細(xì)胞暴露于甲醛中15分鐘進(jìn)行固定。將經(jīng)固定的附著細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo)記，如上在實(shí)施例4中所描述的，用熒光顯微鏡獲取圖象。使用圖象分析軟件包(Meta Morph，UniversalImaging Corporation)計(jì)算熒光標(biāo)記的細(xì)胞核數(shù)目并獲得所述細(xì)胞的細(xì)胞核計(jì)數(shù)結(jié)果?；谶@些結(jié)果，選擇具有最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(例如，最多細(xì)胞核數(shù)目)的孔以進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。通過檢查給出最優(yōu)結(jié)果的孔的內(nèi)含物，獲得關(guān)于產(chǎn)生有利效果的因子和/或因子組的信息。通過將許多因子包含設(shè)計(jì)中，可更有效地確定因子之間的復(fù)雜相互作用。后續(xù)的篩選實(shí)驗(yàn)可集中于在第一輪篩選中發(fā)現(xiàn)的特別有意義的因子組合上。
在第一輪篩選后，估計(jì)和再檢查主效應(yīng)。“主效應(yīng)”是指獨(dú)立地起作用的單一物質(zhì)的效應(yīng)。相互作用效應(yīng)是指一個(gè)以上的單一物質(zhì)的組合效應(yīng)，此時(shí)所述物質(zhì)協(xié)同(非獨(dú)立地)地發(fā)揮作用。在這點(diǎn)上，在統(tǒng)計(jì)學(xué)模型中一般不估計(jì)物質(zhì)間的關(guān)聯(lián)相互作用，但物質(zhì)間的相互作用預(yù)期導(dǎo)致最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行，即，最優(yōu)孔。在第一輪篩選后，鑒定最優(yōu)孔和包含于這些孔(水平＝“1”)中的因子?？墒褂冒谒隹字械乃幸蜃訉?duì)各最優(yōu)孔進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，無論其在最初的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中具有正、中性或負(fù)效應(yīng)?？捎迷谧顑?yōu)孔中鑒定的物質(zhì)子集重復(fù)實(shí)驗(yàn)以獲得最優(yōu)的用于在細(xì)胞中產(chǎn)生想要的反應(yīng)的因子子集。此外，可重復(fù)所述實(shí)驗(yàn)，其中改變最優(yōu)孔中物質(zhì)的濃度。也可用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的主效應(yīng)的單一試劑的子集或通過將最優(yōu)單一試劑的子集與在最優(yōu)混合物中鑒定的物質(zhì)的子集組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
已經(jīng)提出通過細(xì)胞外條件對(duì)細(xì)胞表型的控制是由細(xì)胞外環(huán)境中因子間高度有序的相互作用決定的。此處提供的Plackett-Burman設(shè)計(jì)據(jù)信提供了良好的主效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)并且也提供了在其實(shí)驗(yàn)運(yùn)行之間觀察到不同組的因子組合的機(jī)會(huì)。在這種情況下，預(yù)期更高度有序的相互作用會(huì)導(dǎo)致作為“最優(yōu)孔”的特異的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行，其超過和高于可由最優(yōu)孔中的物質(zhì)的個(gè)體主效應(yīng)預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行。
權(quán)利要求
1.用于鑒定能夠在完整的細(xì)胞中產(chǎn)生想要的生物學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)的高通量方法，所述方法包括步驟(a)提供具有培養(yǎng)表面的容器；(b)根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)將包含單一所述物質(zhì)的不同混合物放入選擇的所述容器中；(c)將所述單一物質(zhì)的混合物固定在所述培養(yǎng)表面上；(d)將所述來自(c)的物質(zhì)與所述完整的細(xì)胞接觸；(e)獲取表示所述被接觸的細(xì)胞中的想要的生物學(xué)反應(yīng)的數(shù)據(jù)；和(f)使用所述獲得的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)模建來鑒定哪種所述單一物質(zhì)的混合物和/或所述混合物中的哪種單一物質(zhì)對(duì)在被接觸的細(xì)胞中產(chǎn)生所述想要的生物學(xué)反應(yīng)有效。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將單一所述物質(zhì)放入其它的所述容器的步驟。
3.權(quán)利要求1的方法，其中用固定物質(zhì)的材料包被所述培養(yǎng)表面。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述固定物質(zhì)的材料是選自透明質(zhì)酸、algenic酸、聚環(huán)氧乙烷、聚甲基丙烯酸羥乙酯和其組合的生物相容性多聚物。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述固定物質(zhì)的材料含有用于共價(jià)固定所述物質(zhì)的反應(yīng)性基團(tuán)。
6.權(quán)利要求3的方法，其中在所述培養(yǎng)表面上的所述固定物質(zhì)的材料不支持細(xì)胞附著。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述物質(zhì)是細(xì)胞附著配體和/或外部因子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述物質(zhì)選自細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白片段、肽、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其組合。
9.權(quán)利要求1的方法，其中通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析法、顯微鏡檢術(shù)或功能性測(cè)定法獲得所述數(shù)據(jù)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述想要的生物學(xué)反應(yīng)選自細(xì)胞附著、細(xì)胞存活、細(xì)胞分化、細(xì)胞成熟、細(xì)胞增殖和其組合。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述容器是96孔板的孔。
12.權(quán)利要求1的方法，其中在各容器中所述物質(zhì)的總濃度相同。
13.權(quán)利要求1的方法，其中在各容器中所述物質(zhì)的總濃度不同。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述各容器之間單一所述物質(zhì)的濃度不同。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)選自分級(jí)析因設(shè)計(jì)、d-最優(yōu)化設(shè)計(jì)、混合設(shè)計(jì)和Plackett-Burman設(shè)計(jì)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)是基于范圍標(biāo)準(zhǔn)、點(diǎn)陣設(shè)計(jì)或拉丁方設(shè)計(jì)的空間充滿設(shè)計(jì)。
17.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括用所述經(jīng)鑒定的單一物質(zhì)的混合物的子集重復(fù)所述步驟。
18.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括重復(fù)所述步驟，其中在所述經(jīng)鑒定的混合物中物質(zhì)的濃度改變。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述統(tǒng)計(jì)學(xué)模建是用于將所述獲得的數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)比較的算法。
全文摘要
提供了用于鑒定能夠在完整的細(xì)胞中產(chǎn)生想要的生物學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)的高通量方法。所述方法包括步驟提供具有培養(yǎng)表面的容器；根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)將不同的包含單一所述物質(zhì)的不同混合物放入選擇的容器中；和將所述單一物質(zhì)混合物固定在所述培養(yǎng)表面上。所述方法進(jìn)一步包括將被固定的物質(zhì)與完整的細(xì)胞接觸；和獲取表示被接觸細(xì)胞中想要的生物學(xué)反應(yīng)的數(shù)據(jù)。所述方法也包括使用獲得的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)模建來確定哪種單一物質(zhì)的混合物和/或這些混合物中的哪種單一物質(zhì)對(duì)在被接觸的細(xì)胞中產(chǎn)生想要的生物學(xué)反應(yīng)有效。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1853102SQ200480026584
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2004年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日
發(fā)明者A·利布曼－芬松, J·A·羅利, C·H·博迪利, M·A·海達(dá)蘭 申請(qǐng)人:貝克頓·迪金森公司