本發(fā)明涉及與分子骨架(molecularscaffold)共價(jià)結(jié)合的多肽，使得在與骨架的連接點(diǎn)之間對(duì)接(subtend)兩個(gè)或多個(gè)肽環(huán)。特別地，本發(fā)明描述作為膜1型金屬蛋白酶(mt1-mmp)的高親和力結(jié)合劑的肽。本發(fā)明還描述包含所述肽的藥物綴合物，所述肽與可用于成像和靶向癌癥治療的一種或多種效應(yīng)子(effector)和/或官能團(tuán)綴合。
背景技術(shù)：
：環(huán)肽能夠以高親和力和靶向特異性結(jié)合于蛋白質(zhì)靶標(biāo)，因此是治療學(xué)發(fā)展的有吸引力的一類分子。事實(shí)上，臨床上已經(jīng)成功使用了幾種環(huán)肽，例如抗菌肽萬古霉素、免疫抑制劑藥物環(huán)孢菌素或抗癌藥奧曲肽(driggers等人(2008),natrevdrugdiscov7(7),608-24)。良好的結(jié)合性質(zhì)來源于肽和靶標(biāo)之間形成的相對(duì)大的相互作用表面以及環(huán)狀結(jié)構(gòu)的降低的構(gòu)象柔性。典型地，大環(huán)結(jié)合于數(shù)百平方埃的表面，例如環(huán)肽cxcr4拮抗劑cvx15(wu等人(2007),science330,1066-71)，結(jié)合整合蛋白αvb3的具有arg-gly-asp基序的環(huán)肽(xiong等人(2002),science296(5565),151-5)，或與尿激酶型纖溶酶原激活物結(jié)合的環(huán)肽抑制劑upain-1(zhao等人(2007),jstructbiol160(1),1-10)。由于其環(huán)狀構(gòu)型，肽大環(huán)化合物較線性肽柔性小，導(dǎo)致其與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)熵的損失較小并產(chǎn)生更高的結(jié)合親和力。降低的柔性還導(dǎo)致鎖定靶標(biāo)特異性構(gòu)象，與線性肽相比增加結(jié)合特異性。這種作用已經(jīng)通過一種有效的、選擇性基質(zhì)金屬蛋白酶8(mmp-8)抑制劑來例證，當(dāng)其環(huán)被打開時(shí)該抑制劑喪失對(duì)其它mmp的選擇性(cherney等人(1998),jmedchem41(11),1749-51)。通過大環(huán)化獲得的有利的結(jié)合性質(zhì)在具有一個(gè)以上肽環(huán)的多環(huán)肽中更為顯著，例如在萬古霉素、乳鏈菌肽和放線菌素中。不同的研究團(tuán)隊(duì)以前已經(jīng)將具有半胱氨酸殘基的多肽連接到合成分子結(jié)構(gòu)上(kemp和mcnamara(1985),j.org.chem；timmerman等人(2005),chembiochem)。meloen及其同事已經(jīng)使用三(溴甲基)苯和相關(guān)分子將多個(gè)肽環(huán)快速和定量地環(huán)化到合成骨架上，用于蛋白質(zhì)表面的結(jié)構(gòu)模擬(timmerman等人(2005),chembiochem)。wo2004/077062和wo2006/078161中公開了產(chǎn)生候選藥物化合物的方法，其中所述化合物通過將含半胱氨酸的多肽與分子骨架例如三(溴甲基)苯連接產(chǎn)生。已經(jīng)開發(fā)了基于噬菌體展示的組合方法以產(chǎn)生并篩選出對(duì)于目標(biāo)靶標(biāo)的雙環(huán)肽的大型文庫(heinis等人(2009),natchembiol5(7),502-7和wo2009/098450)。簡(jiǎn)言之，在噬菌體上展示含有三個(gè)半胱氨酸殘基和六個(gè)隨機(jī)氨基酸的兩個(gè)區(qū)域(cys-(xaa)6-cys-(xaa)6-cys)的線性肽的組合文庫，并通過將半胱氨酸側(cè)鏈共價(jià)連接至一個(gè)小分子(三(溴甲基)苯)而環(huán)化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種對(duì)mt1-mmp特異性的肽配體，其包含多肽和分子骨架，所述多肽含有至少三個(gè)半胱氨酸殘基，并被至少兩個(gè)環(huán)序列分隔；所述分子骨架與所述多肽的半胱氨酸殘基形成共價(jià)鍵，使得在所述分子骨架上形成至少兩個(gè)多肽環(huán)；其中所述肽配體包含式(i)的氨基酸序列：-ci-x-u/o-x-x-g-cii-e-d-f-y-x-x-ciii-(seqidno:1)(i)或其修飾的衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中：ci、cii和ciii分別代表第一、第二和第三半胱氨酸殘基；x代表任何氨基酸殘基；u代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基；和o代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供一種藥物綴合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)子和/或官能團(tuán)例如細(xì)胞毒性劑，特別是dm1和mmae綴合的如本文定義的肽配體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供一種綴合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)子和/或官能團(tuán)例如帶有螯合基團(tuán)的放射性核素，特別是dota綴合的如本文所定義的肽配體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含如本文定義的肽配體或藥物綴合物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供一種如本文定義的肽配體，其用于預(yù)防、抑制或治療癌癥，特別是實(shí)體瘤如非小細(xì)胞肺癌的用途。附圖說明圖1：17-69-07-n219的小鼠血漿穩(wěn)定性。如圖例中所示，監(jiān)測(cè)數(shù)個(gè)離子，以及mrm模式中的兩個(gè)轉(zhuǎn)換。離子之間存在很好的相關(guān)性。小鼠血漿中肽在37℃的半衰期為6小時(shí)。圖2：小鼠中雙環(huán)肽17-69-07-n004的pk曲線(profile)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2只動(dòng)物。圖3：兩種穩(wěn)定化的17-69-07分子(在9位具有4-溴苯丙氨酸：17-69-07-n244，在9位不具有4-溴苯丙氨酸：17-69-07-n231)的(a)小鼠和(b)人血漿穩(wěn)定性，與非穩(wěn)定化的17-69-07-n219相比。監(jiān)測(cè)給定分析物的數(shù)個(gè)mrm轉(zhuǎn)換，其彼此之間很好關(guān)聯(lián)。為了該圖的目的，僅顯示一個(gè)轉(zhuǎn)換。圖4：177lu17-69-07-n144在ht-1080異種移植小鼠中的生物分布。圖5：177lu17-69-07-n246在ht-1080異種移植小鼠中的生物分布。圖6：177lu17-69-07-n248在ht-1080異種移植小鼠中的生物分布。圖7：(a)：bt17bdc-1和9的平均腫瘤體積相對(duì)于時(shí)間的圖。在第0、2、4、7、9和11天施用劑量。(b)：治療期間的體重，其表明藥物相關(guān)的毒理學(xué)和整體動(dòng)物健康。圖8：使用具有17-69的固定環(huán)2個(gè)殘基的文庫的親和力成熟得出的序列輸出列表。右邊的序列標(biāo)志圖顯示了環(huán)1殘基1、2、3、4和5中的殘基的總體偏好。圖9：上圖：bt17bdc-17在ebc-1異種移植小鼠中平均腫瘤體積相對(duì)于時(shí)間的圖。在第0、2、4、7、9、11和14天施用劑量。下圖：治療期間的體重，其表明藥物相關(guān)的毒理學(xué)和整體動(dòng)物健康。圖10：上圖：bt17bdc-18在ebc-1異種移植小鼠中平均腫瘤體積相對(duì)于時(shí)間的圖。在第0、2、4、7、9、11和14天施用劑量。下圖：治療期間的體重，其表明藥物相關(guān)的毒理學(xué)和整體動(dòng)物健康。圖11：上圖：bt17bdc-19在ebc-1異種移植小鼠中平均腫瘤體積相對(duì)于時(shí)間的圖。在第0、2、4、7、9、11和14天施用劑量。下圖：治療期間的體重，其表明藥物相關(guān)的毒理學(xué)和整體動(dòng)物健康。圖12：上圖：bt17bdc-20在ebc-1異種移植小鼠中平均腫瘤體積相對(duì)于時(shí)間的圖。在第0、2、4、7、9、11和14天施用劑量。下圖：治療期間的體重，其表明藥物相關(guān)的毒理學(xué)和整體動(dòng)物健康。圖13：與特定bdc相關(guān)的腫瘤體積隨時(shí)間的曲線下面積(auc)相對(duì)于對(duì)應(yīng)劑量組的圖。使用標(biāo)準(zhǔn)ic50方程，使用在零時(shí)刻對(duì)腫瘤體積進(jìn)行歸一化的所有可用數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行曲線擬合。具體實(shí)施方式除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義，例如肽化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和噬菌體展示、核酸化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。對(duì)于分子生物學(xué)、遺傳和生物化學(xué)方法使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第三版,2001,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny；ausubel等人,shortprotocolsinmolecularbiology(1999)第四版,johnwiley&sons,inc.)，其通過引用并入本文。術(shù)語編號(hào)當(dāng)提及式(i)化合物中的氨基酸殘基的位置時(shí)，半胱氨酸殘基(ci、cii和ciii)的編號(hào)省略，因?yàn)槠涫遣蛔兊?，因此?i)化合物中的氨基酸殘基的編號(hào)如下所示：-ci-x1-u/o2-x3-x4-g5-cii-e6-d7-f8-y9-x10-x11-ciii-(seqidno:1)。對(duì)于本說明書的目的，假設(shè)所有雙環(huán)肽與tbmb(1,3,5-三(溴甲基)苯)環(huán)化得到三取代的1,3,5-三甲基苯結(jié)構(gòu)。在ci、cii和ciii上發(fā)生與tbmb的環(huán)化反應(yīng)。雙環(huán)肽核心序列對(duì)本文公開的每個(gè)雙環(huán)肽指定一個(gè)獨(dú)有的核心序列號(hào)，其被定義為第一n-末端半胱氨酸(ci)和最后一個(gè)c-末端半胱氨酸(ciii)之間的氨基酸序列。在標(biāo)識(shí)符17-69-07的例子中，核心序列是ciynefgciiedfydiciii(seqidno：2)，并且其被稱為“17-69-07”或“(17-69-07)”。肽編碼對(duì)本文公開的某些雙環(huán)肽也指定一個(gè)獨(dú)有的標(biāo)識(shí)符，使用肽編碼，例如17-69-07-n241，其中n241表示17-69-07雙環(huán)核心序列的特定衍生物。17-69-07的不同衍生物具有不同的n數(shù)字，即n001、n002、nxxx。分子格式將雙環(huán)核心序列的n-末端或c-末端延伸部分添加到核心序列的左側(cè)或右側(cè)，用連字符分隔。例如，n末端βala-sar10-ala尾部將被表示為：βala-sar10-a-(17-69-07)并且具有βala-sar10-a-cynefgcedfydic(seqidno：3)的全序列。修飾雙環(huán)核心序列中的非天然氨基酸取代在分子格式描述(molecularformatdescription)之后表示。例如，如果17-69-07中的酪氨酸1被d-丙氨酸取代，則描述為(17-69-07)d-ala1，并且全序列將被描述為c(d-ala1)nefgcedfydic(seqidno：4)。如果將n末端或c末端的尾部連接到還含有對(duì)核心序列的修飾的雙環(huán)肽，則以17-69-07-n241為例，分子格式描述是：βala-sar10-a-(17-69-07)dala11nal4dala5tbugly11。因此，17-69-07-n241的全氨基酸序列為：βala-sar10-a-c(d-ala)ne(1nal)(d-ala)cedfyd(tbugly)c(seqidno：5)。肽配體本文所述的肽配體是指與分子骨架共價(jià)結(jié)合的肽。典型地，這樣的肽包含能夠與骨架形成共價(jià)鍵的兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)(即，半胱氨酸殘基)，和所述反應(yīng)性基團(tuán)之間的對(duì)接的序列，所述序列被稱為環(huán)序列，因?yàn)楫?dāng)肽與骨架結(jié)合時(shí)其形成環(huán)肽。在這種情況中，肽包含至少三個(gè)半胱氨酸殘基(本文稱為ci、ci和ciii)，并在骨架上形成至少兩個(gè)環(huán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，式(i)的1、3、4、10和11位的x可以代表在丙氨酸掃描結(jié)果(參見表5)和選擇輸出(圖8)之后的任何氨基酸，其允許在這些位置良好耐受的取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的1位的x選自任何一種以下氨基酸：y、m、f或v。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，式(i)的1位的x選自y、m或f。在一個(gè)更進(jìn)一步實(shí)施方案中，式(i)的1位的x選自y或m。在一個(gè)依然更進(jìn)一步實(shí)施方案中，式(i)的1位的x選自y。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的2位的u/o選自u(píng)，例如n。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，式(i)的2位的u/o選自o，例如g。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的3位的x選自u(píng)或z，其中u代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基，并且z代表選自d或e的極性、帶負(fù)電荷的氨基酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，式(i)的3位的u選自q。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，式(i)的3位的z選自e。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的4位的x選自j，其中j代表選自f、w和y的非極性芳香族氨基酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，式(i)的4位的j選自f。在替代實(shí)施方案中，式(i)的4位的j選自y。在替代實(shí)施方案中，式(i)的4位的j選自w。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的10位的x選自z，其中z代表選自d或e的極性、帶負(fù)電荷的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的10位處的z選自d。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的11位的x選自o，其中o代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的11位的o選自i。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的化合物為式(ia)的化合物：-ci-y/m/f/v-u/o-u/z-j-g-cii-e-d-f-y-z-o-ciii-(seqidno：6)(ia)；其中，u、o、j和z如本文之前所定義。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的化合物為式(ib)的化合物：-ci-y/m/f/v-n/g-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：7)(ib)。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的化合物為式(ic)的化合物：-ci-y/m/f-n/g-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：8)(ic)。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的化合物為式(id)的化合物：-ci-y/m-n-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：9)(id)。在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)的化合物為式(ie)的化合物：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)(ie)。在一個(gè)更進(jìn)一步實(shí)施方案中，式(i)的肽包含選自以下的序列：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)；-ci-m-n-q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-12)(seqidno：10)；-ci-f-g-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-02)(seqidno：11)；-ci-v-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-03)(seqidno：12)；-ci-f-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-04)(seqidno：13)；-ci-y-n-e-y-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07-n057)(seqidno：14)；和-ci-y-n-e-w-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-44-n002)(seqidno：15)。在對(duì)于mt1-mmp的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的親和力成熟后該實(shí)施方案的肽被鑒定為有效的候選物(參見實(shí)施例1和表1和8)。在一個(gè)依然更進(jìn)一步實(shí)施方案中，式(i)的肽包含選自以下的序列：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)；和-ci-m-n-q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-12)(seqidno：10)。在對(duì)于mt1-mmp的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的親和力成熟，合成核心雙環(huán)序列，和使用競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)定量測(cè)量親和力后，本實(shí)施方案的肽被鑒定為最高親和力的候選物(參見實(shí)施例1和表1-3)。在一個(gè)依然更進(jìn)一步實(shí)施方案中，式(i)的肽包含選自-ci-y-n-e-f-g-ci-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)的序列。該實(shí)施方案的肽被鑒定為式(i)中肽配體家族中最有效和穩(wěn)定的成員(參見實(shí)施例1至4)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的某些肽配體與鼠、狗、食蟹猴和人mt1-mmp完全交叉反應(yīng)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明的具體示例的肽配體與鼠、狗、食蟹猴和人mt1-mmp完全交叉反應(yīng)。例如，本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明17-69-07的非穩(wěn)定和穩(wěn)定的衍生物(即17-69-07-n219和17-69-07-n241)都是完全交叉反應(yīng)的(參見表13)。在一個(gè)更進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽配體對(duì)mt1-mmp是選擇性的，但不與mmp-1、mmp-2、mmp-15和mmp-16交叉反應(yīng)。本文呈現(xiàn)數(shù)據(jù)證明17-69-07核心序列和穩(wěn)定變體17-69-07-n258對(duì)于mt1-mmp是唯一選擇性的(參見表14)。肽配體的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的某些雙環(huán)肽具有許多有利的性質(zhì)，使得它們被認(rèn)為是用于注射、吸入、鼻、眼、口服或局部施用的合適的藥物樣分子。這些有利的性質(zhì)包括：-物種交叉反應(yīng)。這是臨床前藥代動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估的典型要求；-蛋白酶穩(wěn)定性。理想的雙環(huán)肽配體應(yīng)該證明對(duì)血漿蛋白酶、上皮(“膜錨定的”)蛋白酶、胃和腸蛋白酶、肺表面蛋白酶、細(xì)胞內(nèi)蛋白酶等的穩(wěn)定性。應(yīng)保持不同物種之間的蛋白酶穩(wěn)定性，使得可以在動(dòng)物模型中開發(fā)雙環(huán)先導(dǎo)候選物并且可以有信心地施用給人類；-理想的溶解度曲線。這是帶電荷的和親水的殘基對(duì)于疏水殘基和分子內(nèi)/分子間氫鍵的比例的函數(shù)，這對(duì)于制劑和吸收目的很重要；和-循環(huán)中最佳的血漿半衰期。根據(jù)臨床指征和治療方案，可能需要在急性疾病管理情況中開發(fā)用于短時(shí)間暴露的雙環(huán)肽，或開發(fā)具有增強(qiáng)的循環(huán)保留性的雙環(huán)肽，因此對(duì)于更慢性的疾病狀態(tài)的管理是最佳的。驅(qū)使合意的血漿半衰期的其它因素是用于最大治療功效的持續(xù)暴露相對(duì)于由于藥劑的持續(xù)暴露引起的所伴隨的毒理學(xué)的要求。藥學(xué)上可接受的鹽將理解鹽形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且提及式(i)的化合物則包括所述化合物的鹽形式。本發(fā)明的鹽可以通過常規(guī)的化學(xué)方法，例如pharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse,p.heinrichstahl(編輯),camilleg.wermuth(編輯),isbn:3-90639-026-8,hardcover,388頁,2002年8月中描述的方法，由含有堿或酸部分的母體化合物合成。通常，這些鹽可以通過將這些化合物的游離酸或堿形式與適當(dāng)?shù)膲A或酸在水中或在有機(jī)溶劑中或在兩者的混合物中反應(yīng)制備。酸式加成鹽(單鹽或二鹽)可以用各種酸(無機(jī)和有機(jī)酸)形成。酸式加成鹽的示例包括與選自以下的酸形成的單鹽或二鹽：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗壞血酸(例如l-抗壞血酸)、l-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟腦酸、樟腦磺酸、(+)-(1s)-樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、檸檬酸、環(huán)己氨磺酸、十二烷基磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、甲酸、富馬酸、半乳糖酸、龍膽酸、葡庚糖酸、d-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如d-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如l-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、馬尿酸、氫鹵酸(如氫溴酸、鹽酸、氫碘酸)、羥乙磺酸、乳酸(如(+)-l-乳酸、(±)-dl-乳酸)、乳糖酸、馬來酸、蘋果酸、(-)-l-蘋果酸、丙二酸、(±)-dl-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、煙酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、l-焦谷氨酸、水楊酸、4-氨基-水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、丹寧酸、(+)-l-酒石酸、硫氰酸、對(duì)甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及?；被岷完栯x子交換樹脂。一組特別的鹽包括由乙酸、鹽酸、氫碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、蘋果酸、羥乙磺酸、富馬酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸鹽)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖醛酸形成的鹽。一種特別的鹽是鹽酸鹽。另一種特別的鹽是乙酸鹽。如果化合物是陰離子的或具有可以是陰離子的官能團(tuán)(例如，-cooh可以是-coo-)，則可以用產(chǎn)生適當(dāng)?shù)年栯x子的有機(jī)或無機(jī)堿形成鹽。合適的無機(jī)陽離子的示例包括但不限于堿金屬離子如li+、na+和k+，堿土金屬陽離子如ca2+和mg2+，以及其它陽離子如al3+或zn+。合適的有機(jī)陽離子的示例包括但不限于銨離子(即nh4+)和取代的銨離子(例如，nh3r+、nh2r2+、nhr3+、nr4+)。一些合適的取代銨離子的示例為衍生自：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二環(huán)己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、芐胺、苯基芐胺、膽堿、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如賴氨酸和精氨酸的那些。常見的季銨離子的示例是n(ch3)4+。當(dāng)式(i)的化合物含有胺官能團(tuán)時(shí)，例如根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法通過與烷基化劑反應(yīng)，它們可以形成季銨鹽。這樣的季銨化合物在式(i)的范圍內(nèi)。修飾的衍生物應(yīng)當(dāng)理解，如本文定義的肽配體的修飾的衍生物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種合適的修飾的衍生物的示例包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的修飾：n-末端和/或c-末端修飾；用一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(例如用一個(gè)或多個(gè)等排或等電子氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)極性氨基酸殘基；用其它非天然的等排或等電子氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)非極性氨基酸殘基)；加入間隔子基團(tuán)；用一個(gè)或多個(gè)抗氧化氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)氧化敏感性氨基酸殘基；用丙氨酸替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，用一個(gè)或多個(gè)d-氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)l-氨基酸殘基；雙環(huán)肽配體中一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵的n-烷基化；用替代鍵(surrogatebond)替換一個(gè)或多個(gè)肽鍵；肽骨架(peptidebackbone)長度修飾；用另一個(gè)化學(xué)基團(tuán)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的α-碳上的氫，用合適的胺、硫醇、羧酸和酚反應(yīng)性試劑修飾氨基酸如半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和酪氨酸，以功能化所述氨基酸，和引入或替換氨基酸，所述氨基酸引入適合于官能化的正交反應(yīng)，例如攜帶氨基酸的疊氮化物或炔烴基團(tuán)分別允許攜帶炔烴或疊氮化物的部分的官能化。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含在氨基酸1位和/或9位的修飾。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示這些位置，特別是存在酪氨酸的位置對(duì)蛋白水解降解最為敏感。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含n-末端和/或c-末端修飾。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，其中所述修飾的衍生物包含使用合適的氨基反應(yīng)性化學(xué)的n-末端修飾，和/或使用合適的羧基反應(yīng)性化學(xué)的c-末端修飾。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述n-末端或c-末端修飾包含加入效應(yīng)子基團(tuán)，包括但不限于細(xì)胞毒性劑、放射螯合劑(radiochelator)或發(fā)色團(tuán)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含n-末端修飾。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，n-末端修飾包含n-末端乙酰基，例如本文公開的17-69-07-n004。在該實(shí)施方案中，在肽合成期間，n-末端半胱氨酸基團(tuán)(該基團(tuán)本文中稱為ci)被乙酸酐或其它合適的試劑封端，導(dǎo)致n-末端乙?；姆肿印Ｔ搶?shí)施方案提供了除去氨基肽酶的潛在識(shí)別位點(diǎn)并避免雙環(huán)肽降解潛力的優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，n-末端修飾包含加入有助于效應(yīng)子基團(tuán)綴合和保持雙環(huán)肽對(duì)其靶標(biāo)的效力的分子間隔子基團(tuán)，例如ala、g-sar10-a或bala-sar10-a基團(tuán)。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示將這些基團(tuán)加入雙環(huán)肽17-69-07不會(huì)改變對(duì)靶蛋白的效力(表11-12)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含c-末端修飾。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，c-末端修飾包含酰胺基。在該實(shí)施方案中，c-末端半胱氨酸基團(tuán)(該基團(tuán)本文中稱為ciii)在肽合成期間被合成為酰胺，導(dǎo)致c末端酰胺化的分子。該實(shí)施方案提供了除去羧肽酶的潛在識(shí)別位點(diǎn)并降低雙環(huán)肽的蛋白水解降解潛力的優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含用一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。在該實(shí)施方案中，可以選擇非天然氨基酸，其具有不被降解蛋白酶識(shí)別，也不對(duì)靶標(biāo)效力產(chǎn)生任何副作用的等排/等電子側(cè)鏈?？商娲?，可以使用具有約束的氨基酸側(cè)鏈的非天然氨基酸，使得在構(gòu)象和空間上阻礙鄰近肽鍵的蛋白水解。特別地，這些涉及脯氨酸類似物、大體側(cè)鏈、cα-二取代衍生物(例如，氨基異丁酸，aib)、和環(huán)氨基酸、為氨基-環(huán)丙基羧酸的簡(jiǎn)單的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，非天然氨基酸殘基取代于4位。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示在該位置上許多非天然氨基酸殘基被良好耐受(參見表8)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于4位的那些，選自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸、苯基甘氨酸、叔丁基甘氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸和高苯丙氨酸。在一個(gè)更進(jìn)一步實(shí)施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于4位的那些，選自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯丙氨酸。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示與未修飾的野生型序列相比，這些取代增加了親和力(參見表8)。在一個(gè)更進(jìn)一步實(shí)施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于4位的那些，選自：1-萘基丙氨酸。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示與野生型相比，該取代提供了最大程度的親和力增強(qiáng)(大于7倍)(參見表8)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將非天然氨基酸殘基引入9位和/或11位。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示在這些位置上許多非天然氨基酸殘基被良好耐受(參見表9)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于9位的那些，選自：4-溴苯丙氨酸、五氟-苯丙氨酸。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于11位的那些，選自：叔丁基甘氨酸。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于9位的那些，選自：4-溴苯丙氨酸。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示tyr9蛋白水解識(shí)別點(diǎn)的改變(參見表9)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于11位的那些，選自：叔丁基甘氨酸。本文提供的數(shù)據(jù)顯示活性增強(qiáng)，并通過空間位阻強(qiáng)力保護(hù)鄰近氨基酸骨架免受蛋白水解(參見表9)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含多個(gè)上面提及的修飾，例如2、3、4或5個(gè)或更多個(gè)修飾。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含2、3、4或5個(gè)或更多個(gè)以下修飾，例如所有以下5個(gè)修飾：1位和5位的d-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸，9位的4-溴苯丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。本文提供的數(shù)據(jù)顯示該多取代(17-69-07-n252、17-69-07-n244和17-69-07-n255)與優(yōu)于野生型的效力相一致(參見表10-12)。在一個(gè)更進(jìn)一步實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含以下修飾：1位和5位的d-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示該多取代(17-69-07-n239)與優(yōu)于野生型的效力相一致(參見表11)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含加入間隔子基團(tuán)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含向n-末端半胱氨酸(ci)和/或c-末端半胱氨酸(ciii)加入間隔子基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含用一個(gè)或多個(gè)抗氧化氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)氧化敏感性氨基酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含用萘基丙氨酸或丙氨酸殘基替換色氨酸殘基。該實(shí)施方案提供改善所得到的雙環(huán)肽配體的藥物穩(wěn)定性特征的優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含用一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)帶電荷的氨基酸殘基。在替代實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含用一個(gè)或多個(gè)帶電荷的氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸殘基。帶電荷的氨基酸殘基對(duì)于疏水性氨基酸殘基的正確平衡是雙環(huán)肽配體的重要特征。例如，疏水性氨基酸殘基影響血漿蛋白結(jié)合的程度，因此影響血漿中游離可利用級(jí)分的濃度，而帶電荷的氨基酸殘基(特別是精氨酸)可以影響肽與磷脂膜在細(xì)胞表面的相互作用。兩者組合可以影響肽藥物的半衰期、分布容積和暴露容積，并可以根據(jù)臨床終點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整。另外，帶電荷的氨基酸殘基對(duì)于疏水性氨基酸殘基的正確組合和數(shù)量可以減少注射部位的刺激(如果肽藥物已經(jīng)被皮下施用)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含用一個(gè)或多個(gè)d-氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)l-氨基酸殘基。據(jù)信該實(shí)施方案通過空間位阻增加蛋白水解穩(wěn)定性并通過d-氨基酸的傾向來穩(wěn)定β-轉(zhuǎn)角的構(gòu)象(tugyi等人(2005)pnas,102(2),413–418)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，將1位的氨基酸殘基替換為d-氨基酸，例如d-丙氨酸。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明效力保留而不會(huì)導(dǎo)致降解(參見表6)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，將5位的氨基酸殘基替換為d-氨基酸，例如d-丙氨酸或d-精氨酸。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示了效力保留而不會(huì)導(dǎo)致降解(參見表7)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的衍生物包含除去任何氨基酸殘基和用丙氨酸的取代。該實(shí)施方案提供除去潛在的蛋白水解攻擊位點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)注意，上述提及的每種修飾用于有意地改善肽的效力或穩(wěn)定性。基于修飾的進(jìn)一步的效力改善可以通過以下機(jī)制來實(shí)現(xiàn)：-合并入展現(xiàn)疏水效應(yīng)并導(dǎo)致降低速率的疏水部分，從而實(shí)現(xiàn)更高的親和力；-合并入展現(xiàn)長期離子相互作用的帶電荷基團(tuán)，導(dǎo)致速率更快和更高的親和力(參見例如schreiber等人,rapid,electrostaticallyassistedassociationofproteins(1996),naturestruct.biol.3,427-31)；和-通過例如正確地約束氨基酸的側(cè)鏈，從而使靶標(biāo)結(jié)合后的熵?fù)p失最小化；約束骨架的扭轉(zhuǎn)角，從而使靶標(biāo)結(jié)合后的熵?fù)p失最小化；和出于相同的原因而在分子中引入另外的環(huán)化，在肽中合并入另外的約束。(綜述參見gentilucci等人,curr.pharmaceuticaldesign,(2010),16,3185-203,和nestor等人,curr.medicinalchem(2009),16,4399-418)。同位素變體本發(fā)明包括本發(fā)明的所有藥學(xué)上可接受的(放射性)同位素標(biāo)記的化合物，即式(i)的化合物，其中一個(gè)或多個(gè)原子被具有相同原子數(shù)的原子代替，但原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于通常在自然界中發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)，和式(i)的化合物，其中連接能夠保持住相關(guān)的(放射性)同位素的金屬螯合基團(tuán)(稱為“效應(yīng)子”)，和式(i)的化合物，其中某些官能團(tuán)被相關(guān)的(放射性)同位素或同位素標(biāo)記的官能團(tuán)共價(jià)替換。適合于包含在本發(fā)明化合物中的同位素的示例包括氫的同位素，如2h(d)和3h(t)，碳，如11c、13c和14c，氯，如36cl，氟，如18f，碘，如123i、125i和131i，氮，如13n和15n，氧，如15o、17o和18o，磷，如32p，硫，如35s，銅，如64cu，鎵，如67ga或68ga，釔，如90y，和镥，如177lu，鉍，如213bi。某些同位素標(biāo)記的式(i)的化合物，例如合并入放射性同位素的化合物，可用于藥物和/或底物組織分布研究，并臨床評(píng)估患病組織如腫瘤和其它地方的mt1-mmp靶標(biāo)的存在和/或不存在。式(i)的化合物可以進(jìn)一步具有有價(jià)值的診斷性質(zhì)，因?yàn)樗鼈兛捎糜跈z測(cè)或鑒定標(biāo)記化合物與其它分子、肽、蛋白質(zhì)、酶或受體之間的復(fù)合物的形成。檢測(cè)或鑒定方法可以使用用標(biāo)記試劑如放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)(例如魯米諾、魯米諾衍生物、熒光素、發(fā)光蛋白和熒光素酶)標(biāo)記的化合物。放射性同位素氚，即3h(t)和碳-14，即14c，鑒于其容易合并入和現(xiàn)有的檢測(cè)手段，而特別用于該目的。用較重的同位素如氘(即2h(d))取代可以提供由更大的代謝穩(wěn)定性，例如增加的體內(nèi)半衰期或降低的劑量需求產(chǎn)生的某些治療優(yōu)勢(shì)，因此在一些情況下可能是優(yōu)選的。用正電子發(fā)射同位素(如11c、18f、15o和13n)取代可用于正電子發(fā)射斷層掃描(pet)研究以檢查靶標(biāo)占有率。將同位素合并入金屬螯合效應(yīng)子基團(tuán)(如64cu、67ga、68ga和177lu)可用于使用pet或spect成像顯現(xiàn)腫瘤特異性抗原。特別地，這樣的生物分布數(shù)據(jù)在本文實(shí)施例3中呈現(xiàn)。將同位素合并入金屬螯合效應(yīng)子基團(tuán)(例如，但不限于90y、177lu和213bi)可提供靶向放射治療的選擇，其中攜帶金屬螯合劑的式(i)的化合物將治療性放射性核素?cái)y帶至靶蛋白和作用位點(diǎn)。同位素標(biāo)記的式(i)的化合物通常可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)或通過類似于所附實(shí)施例中所述的方法，使用適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記的試劑替代之前采用的未標(biāo)記的試劑制備。結(jié)合活性在本文中，特異性是指配體與其同源靶標(biāo)結(jié)合或以其他方式相互作用以排除與靶標(biāo)相似的實(shí)體的能力。例如，特異性可以指配體抑制人酶而不是來自不同物種的同源酶的相互作用的能力。使用本文描述的方法，可以調(diào)節(jié)特異性，即增加或減少特異性，以使配體或多或少地能夠與預(yù)期靶標(biāo)的同源物或旁系同源物相互作用。特異性并不意味著與活性、親和力或親合力同義，并且配體對(duì)其靶標(biāo)的作用的效力(如，例如結(jié)合親和力或抑制水平)不一定與其特異性相關(guān)。如本文所使用，結(jié)合活性是指來源于結(jié)合試驗(yàn)的定量結(jié)合測(cè)量，例如如本文所述。因此，結(jié)合活性是指在給定靶標(biāo)濃度下結(jié)合的肽配體的量。多重特異性是結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)的能力。典型地，由于其構(gòu)象性質(zhì)，結(jié)合肽能夠結(jié)合單個(gè)靶標(biāo)，例如抗體情況下的表位。然而，可以開發(fā)肽，其可以結(jié)合兩個(gè)或更多靶標(biāo)的肽，雙重特異性抗體，例如，如本領(lǐng)域已知的如上所述。在本發(fā)明中，肽配體能夠結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)，因此是多重特異性的。適當(dāng)?shù)?，它們與兩個(gè)靶標(biāo)結(jié)合，并且是雙重特異性的。結(jié)合可以是獨(dú)立的，這意味著肽上的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)上不受一種或另一種靶標(biāo)的結(jié)合的阻礙。在這種情況下，兩個(gè)靶標(biāo)可以獨(dú)立地結(jié)合。更一般地，預(yù)期一個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合將至少部分地阻礙另一個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合。雙重特異性配體和包含兩個(gè)相關(guān)靶標(biāo)的具有特異性的配體之間存在根本區(qū)別。在第一種情況下，配體對(duì)于兩個(gè)靶標(biāo)單獨(dú)具有特異性，并且以特定方式與每個(gè)靶標(biāo)相互作用。例如，配體中的第一環(huán)可以與第一靶標(biāo)結(jié)合，而第二環(huán)與第二靶標(biāo)結(jié)合。在第二種情況下，配體是非特異性的，因?yàn)樗粎^(qū)分兩個(gè)靶標(biāo)，例如通過與兩者共同的靶標(biāo)的表位相互作用。在本發(fā)明的上下文中，對(duì)于例如靶標(biāo)和同源物具有活性的配體有可能是雙重特異性配體。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，配體不是雙重特異性的，但是具有不太精確的特異性，使得其結(jié)合靶標(biāo)和一種或多種同源物。一般地，由于缺少針對(duì)雙重特異性的選擇性壓力，尚未針對(duì)靶標(biāo)和同源物選擇的配體不太可能是雙重特異性的。在提供調(diào)節(jié)的結(jié)合表面從而可以獲得良好的靶標(biāo)和同源物交叉反應(yīng)性，同時(shí)保持對(duì)較少相關(guān)同系物的高選擇性中，雙環(huán)肽中的環(huán)長度可以是決定性的。如果配體是真正的雙重特異性的，在一個(gè)實(shí)施方案中，配體的至少一種靶標(biāo)特異性在選擇的配體中是常見的，并且該特異性的水平可以通過本文公開的方法調(diào)節(jié)。第二或進(jìn)一步的特異性不需要分享，也不必是本文所述程序的主題。靶標(biāo)是肽配體與其結(jié)合或以其它方式相互作用的分子或其部分。雖然結(jié)合被認(rèn)為是大多數(shù)種類的活性的先決條件，而且其本身可能是一種活性，但也可以設(shè)想其它活性。因此，本發(fā)明不需要直接或間接地測(cè)量結(jié)合。分子骨架是能夠在多個(gè)位點(diǎn)連接肽以賦予肽一種或多種結(jié)構(gòu)特征的任何分子。優(yōu)選地，分子骨架包含至少三個(gè)肽的連接點(diǎn)，稱為骨架反應(yīng)性基團(tuán)。這些基團(tuán)能夠與肽上的半胱氨酸殘基(ci、cii和ciii)反應(yīng)以形成共價(jià)鍵。它們不僅形成二硫鍵(其經(jīng)歷還原性裂解并伴隨分子分解)，還形成穩(wěn)定的共價(jià)硫醚鍵。分子骨架的優(yōu)選結(jié)構(gòu)如下所述。分子骨架分子骨架表述于例如wo2009/098450和本文引用的參考文獻(xiàn)，特別是wo2004/077062和wo2006/078161中。如上述文獻(xiàn)中所指出的，分子骨架可以是小分子，例如小的有機(jī)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子骨架可以是或可以基于天然單體，例如核苷、糖或類固醇。例如，分子骨架可以包含這樣實(shí)體的短聚合物，例如二聚體或三聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子骨架是已知毒性的化合物，例如低毒性的化合物。合適的化合物的示例包括膽固醇、核苷酸、類固醇或現(xiàn)有的藥物如他馬西泮。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子骨架可以是大分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子骨架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物組成的大分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子骨架包含能夠與多肽的官能團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的反應(yīng)性基團(tuán)。分子骨架可以包括與肽形成連接的化學(xué)基團(tuán)，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烴、炔烴、疊氮化物、酸酐、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、烷基鹵化物和?；u化物。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子骨架可以包含三(溴甲基)苯，特別是1,3,5-三(溴甲基)苯(‘tbmb’)或其衍生物，或可以由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子骨架是2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。該分子類似于1,3,5-三(溴甲基)苯，但含有三個(gè)另外與苯環(huán)連接的甲基。這具有以下優(yōu)點(diǎn)：另外的甲基可以與多肽形成進(jìn)一步的聯(lián)系，并因此增加另外的結(jié)構(gòu)約束。本發(fā)明的分子骨架含有允許本發(fā)明編碼文庫的多肽的官能團(tuán)與分子骨架形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。所述化學(xué)基團(tuán)選自多種官能團(tuán)，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烴、炔烴、酸酐、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、疊氮化物、烷基鹵化物和酰基鹵化物?？捎糜诜肿庸羌苌吓c半胱氨酸的巰基反應(yīng)的骨架反應(yīng)性基團(tuán)是烷基鹵化物(或也稱為鹵代烴或鹵代烷)。示例包括溴甲基苯(以tbmb為例的骨架反應(yīng)性基團(tuán))或碘乙酰胺。用于選擇性地將化合物與蛋白質(zhì)中的半胱氨酸偶聯(lián)的其它骨架反應(yīng)性基團(tuán)是馬來酰亞胺。可用作本發(fā)明分子骨架的馬來酰亞胺的示例包括：三-(2-馬來酰亞氨基乙基)胺、三-(2-馬來酰亞氨基乙基)苯、三-(馬來酰亞氨基)苯。硒代半胱氨酸也是與半胱氨酸具有相似反應(yīng)性的天然氨基酸，并可用于相同的反應(yīng)。因此，無論何時(shí)提及半胱氨酸，除非上下文另有說明，否則通常可以替換硒代半胱氨酸。效應(yīng)子和官能團(tuán)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供一種藥物綴合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)物和/或官能團(tuán)綴合的如本文定義的肽配體。效應(yīng)子和/或官能團(tuán)可以連接于例如多肽的n和/或c末端、多肽內(nèi)的氨基酸、或分子骨架。合適的效應(yīng)子基團(tuán)包括抗體及其部分或片段。例如，除了一個(gè)或多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域之外，效應(yīng)子基團(tuán)可以包括抗體輕鏈恒定區(qū)(cl)、抗體ch1重鏈結(jié)構(gòu)域、抗體ch2重鏈結(jié)構(gòu)域、抗體ch3重鏈結(jié)構(gòu)域、或其任何組合。效應(yīng)子基團(tuán)還可以包含抗體的鉸鏈區(qū)(通常在igg分子的ch1和ch2結(jié)構(gòu)域之間發(fā)現(xiàn)這種區(qū)域)。在本發(fā)明該方面的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的效應(yīng)子基團(tuán)是igg分子的fc區(qū)。有利地，根據(jù)本發(fā)明的肽配體-效應(yīng)子基團(tuán)包含具有一天或更多、兩天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多、6天或更多、或7天或更多的tβ半衰期的肽配體fc融合物，或由其組成。最有利地，根據(jù)本發(fā)明的肽配體包含具有一天或更多的tβ半衰期的肽配體fc融合物，或由其組成。官能團(tuán)通常包括結(jié)合基團(tuán)、藥物、用于連接其它實(shí)體的反應(yīng)性基團(tuán)、有助于將大環(huán)肽攝取入細(xì)胞中的官能團(tuán)等。肽透入細(xì)胞的能力將允許肽針對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)是有效的?？梢员痪哂型溉爰?xì)胞能力的肽接近的靶標(biāo)包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子如酪氨酸激酶和參與細(xì)胞凋亡途徑的分子。能夠穿透細(xì)胞的官能團(tuán)包括已經(jīng)加入肽或分子骨架的肽或化學(xué)基團(tuán)。肽，如衍生自如vp22、hiv-tat、果蠅(觸角足突變(antennapedia))的同源盒蛋白的那些，例如，如chen和harrison,biochemicalsocietytransactions(2007)volume35,part4,p821；gupta等人，advanceddrugdiscoveryreviews(2004)volume579637中所描述。已經(jīng)顯示在通過質(zhì)膜的易位中有效的短肽的示例包括來自觸角足突變果蠅蛋白的16個(gè)氨基酸穿透肽(derossi等人(1994)jbiol.chem.volume269p10444)、18個(gè)氨基酸的“模型兩親肽”(oehlke等人(1998)biochimbiophysactsvolume1414p127)和hivtat蛋白的富含精氨酸的區(qū)域。非肽方法包括使用可以容易地連接到生物分子上的小分子模擬物或smoc(okuyama等人(2007)naturemethodsvolume4p153)。將胍基添加到分子中的其它化學(xué)策略也增強(qiáng)細(xì)胞穿透(elson-scwab等人(2007)jbiolchemvolume282p13585)?？梢詫⑿》肿恿糠肿尤珙惞檀技尤氲椒肿庸羌苤幸栽鰪?qiáng)細(xì)胞攝取?？梢耘c肽配體連接的一類官能團(tuán)包括抗體及其結(jié)合片段，如fab、fv或單結(jié)構(gòu)域片段。特別地，可以使用與蛋白質(zhì)結(jié)合的能夠增加體內(nèi)肽配體的半衰期的抗體。也可以合并入與許多細(xì)胞上存在的整合蛋白結(jié)合的rgd肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽配體-效應(yīng)子基團(tuán)具有選自12小時(shí)或更多、24小時(shí)或更多、2天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多、6天或更多、7天或更多、8天或更多、9天或更多、10天或更多、11天或更多、12天或更多、13天或更多、14天或更多、15天或更多、或20天或更多的tβ半衰期。有利地，根據(jù)本發(fā)明的肽配體-效應(yīng)子基團(tuán)或組合物將具有12至60小時(shí)范圍內(nèi)的tβ半衰期。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，其將具有一天或更長的tβ半衰期。在一個(gè)依然進(jìn)一步實(shí)施方案中，它將在12至26小時(shí)的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述官能團(tuán)選自金屬螯合劑，其適合于絡(luò)合具有藥用相關(guān)性的金屬放射性同位素。當(dāng)與所述放射性同位素絡(luò)合時(shí)，這樣的效應(yīng)子可以呈現(xiàn)用于癌癥治療的有用試劑。合適的示例包括dota、nota、edta、dtpa、heha、sarar等(targetedradionuclidetherapy,todspeer,wolters/kluverlippincottwilliams&wilkins,2011)。可能的效應(yīng)子基團(tuán)還包括酶，例如用于酶/前藥治療的羧肽酶g2，其中肽配體替換adept中的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述官能團(tuán)選自藥物，例如用于癌癥治療的細(xì)胞毒性劑。合適的示例包括：烷化劑如順鉑和卡鉑，以及奧沙利鉑、氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺；抗代謝物，包括嘌呤類似物硫唑嘌呤和巰嘌呤或嘧啶類似物；植物生物堿和萜類化合物，包括長春花生物堿類，如長春新堿、長春花堿、長春瑞濱和長春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)，最初稱為紫杉醇(taxol)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括喜樹堿：伊立替康和拓?fù)涮婵?，以及ii型抑制劑，包括安丫啶、依托泊苷，依托泊苷磷酸酯和替尼泊苷。其它試劑可以包括抗腫瘤抗生素，其包括免疫抑制劑放線菌素(用于腎移植)、多柔比星、表柔比星、博來霉素、刺胞霉素等。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步特別的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑選自美登木素生物堿類(如dm1)或單甲基奧里斯他汀類(例如mmae)。dm1是一種細(xì)胞毒性劑，其是美登素的含巰基衍生物，并具有以下結(jié)構(gòu)：?jiǎn)渭谆鶌W里斯他汀e(mmae)是合成的抗腫瘤劑，并具有以下結(jié)構(gòu)：在本文的實(shí)施例4和5中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明了與包含dm1或mmae的毒素綴合的肽配體的作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑通過可裂解的鍵(例如二硫鍵或蛋白酶敏感鍵)與雙環(huán)肽連接。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，與二硫鍵相鄰的基團(tuán)被修飾以控制二硫鍵的阻礙，并且由此控制細(xì)胞毒性劑的裂解和伴隨釋放的速率。已發(fā)表的工作確定了通過在二硫鍵的任一側(cè)引入空間位阻來改變二硫鍵的還原敏感性的潛力(kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717)。更大程度的空間位阻降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和細(xì)胞外(全身的)還原劑的還原速率，從而降低了細(xì)胞內(nèi)外釋放毒素的容易程度。因此，可以通過仔細(xì)選擇二硫鍵的任一側(cè)的阻礙程度來實(shí)現(xiàn)循環(huán)中二硫化物穩(wěn)定性(其使毒素的不良副作用最小化)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的有效釋放(其最大化治療效果)的最佳選擇。通過在分子構(gòu)建物的靶向?qū)嶓w(這里是雙環(huán)肽)或毒素這側(cè)上引入一個(gè)或多個(gè)甲基來調(diào)節(jié)二硫鍵的任一側(cè)的阻礙。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑為選自式(ii)的化合物的美登木素生物堿：其中n代表選自1至10的整數(shù)；和r1和r2獨(dú)立地代表氫、c1-6烷基或碳環(huán)基或雜環(huán)基。本文所用的術(shù)語c1-6烷基是指分別含有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基團(tuán)。這些基團(tuán)的示例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基或己基等。除非上下文另有說明，本文所用的術(shù)語“雜環(huán)基”和“碳環(huán)基”包括芳香族和非芳香族環(huán)系統(tǒng)。因此，例如，術(shù)語“雜環(huán)基基團(tuán)”和“碳環(huán)基基團(tuán)”在其范圍內(nèi)包括芳香族、非芳香族、不飽和、部分飽和和完全飽和的碳環(huán)基或雜環(huán)基環(huán)系統(tǒng)。一般地，除非上下文另有說明，這些基團(tuán)可以是單環(huán)或雙環(huán)(包括稠合和橋連的雙環(huán)基團(tuán))，并且可以含有例如3至12個(gè)環(huán)成員，更通常為5至10個(gè)環(huán)成員。在式(ii)的化合物的一個(gè)實(shí)施方案中，r1和r2獨(dú)立地代表氫或甲基。在式(ii)的化合物的一個(gè)實(shí)施方案中，n代表1，并且r1和r2均代表氫(即美登素衍生物dm1)。在式(ii)的化合物的一個(gè)替代實(shí)施方案中，n代表2，r1代表氫并且r2代表甲基(即美登素衍生物dm3)。在式(ii)的化合物的一個(gè)實(shí)施方案中，n代表2，并且r1和r2均代表甲基(即美登素衍生物dm4)。應(yīng)當(dāng)理解，式(ii)的細(xì)胞毒性劑可以形成二硫鍵，并且在具有式(i)的雙環(huán)肽的綴合物結(jié)構(gòu)中，巰基-毒素(ii)和巰基-雙環(huán)肽(iii)之間的二硫鍵連接是通過數(shù)種可能的合成方案引入的，兩種在方案ii或方案iii中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物的雙環(huán)肽組分具有式(iii)所示的結(jié)構(gòu)：其中m代表選自0至10的整數(shù)，和r3和r4獨(dú)立地代表氫、c1-6烷基或碳環(huán)基或雜環(huán)基。在式(iii)的化合物的一個(gè)實(shí)施方案中，r3和r4獨(dú)立地代表氫或甲基。其中r3和r4均為氫的式(iii)的化合物被認(rèn)為是不受阻礙的，并且其中r3和r4中的一個(gè)或全部代表甲基的式(iii)的化合物被認(rèn)為是受阻礙的。應(yīng)當(dāng)理解，式(iii)的雙環(huán)肽可以形成二硫鍵，并且在具有式(ii)的細(xì)胞毒性劑的綴合物結(jié)構(gòu)中，巰基-毒素(ii)和巰基-雙環(huán)肽(iii)之間的二硫鍵連接是通過數(shù)種可能的合成方案引入的，一種在方案ii中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過式(iv)定義的連接子將細(xì)胞毒性劑與雙環(huán)肽連接：其中r1、r2、r3和r4代表氫、c1-6烷基或碳環(huán)基或雜環(huán)基；毒素指本文定義的任何合適的細(xì)胞毒性劑；雙環(huán)代表本文定義的任何合適的雙環(huán)肽；n代表選自1至10的整數(shù)；和m代表選自0至10的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，r1、r2、r3和r4代表氫或甲基。當(dāng)r1、r2、r3和r4各自為氫時(shí)，二硫鍵最不受阻礙并且最易于還原。當(dāng)r1、r2、r3和r4各自為甲基時(shí)，二硫鍵最受阻礙并且最不易于還原。氫和甲基的部分取代產(chǎn)生抗還原作用的逐漸增加，以及伴隨的毒素裂解和釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物(iv)的毒素是美登素，并且綴合物包含式(v)的化合物：其中r1、r2、r3和r4代表氫、c1-6烷基或碳環(huán)基或雜環(huán)基；雙環(huán)代表本文定義的任何合適的雙環(huán)肽；n代表選自1至10的整數(shù)；和m代表選自0至10的整數(shù)。在式(v)的化合物的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，n代表1并且r1、r2、r3和r4各自代表氫，即式(v)a的化合物：式(v)a的bdc被稱為bt17bdc-17。bdcbt17bdc-17中不受阻礙的二硫化合物相當(dāng)于bt17bdc-9，其差異在于雙環(huán)肽部分：bt17bdc-9采用非穩(wěn)定化序列(17-69-07-n219)，而bt17bdc-17采用與毒素-二硫化物構(gòu)建體酰胺鍵合的穩(wěn)定的雙環(huán)肽配對(duì)物(17-69-07-n241)。n＝1的美登素的這種非阻礙性衍生物被稱為dm1。在式(v)的化合物的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，n代表1，r1代表甲基，并且r2、r3和r4各自代表氫，即式(v)b的化合物：式(v)b的bdc被稱為bt17bdc-18，并且在雙環(huán)肽這側(cè)含有單個(gè)阻礙甲基，并且在抗體藥物綴合物的情況下，其對(duì)還原劑如二硫蘇糖醇的敏感性降低7倍(與非阻礙二硫化物相比)(kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717)。降低的還原敏感性與較低的毒素釋放速率相關(guān)。n＝1的美登素的這種非阻礙性衍生物被稱為dm1。bt17bdc-18采用其與毒素-二硫化物構(gòu)建體酰胺鍵合的穩(wěn)定的雙環(huán)肽配對(duì)物(17-69-07-n241)。在式(v)的化合物的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，n代表2，r1和r2均代表氫，并且r3和r4均代表甲基，即式(v)c的化合物：式(v)c的bdc被稱為bt17bdc-19，并且在美登素這側(cè)含有兩個(gè)受阻的甲基，并且在抗體藥物綴合物的情況下，其對(duì)還原劑如二硫蘇糖醇的敏感性降低14倍。降低的還原敏感性與較低的毒素釋放速率相關(guān)。n＝2的美登素的這種受阻礙的衍生物被稱為dm4。bt17bdc-19采用與毒素-二硫化物構(gòu)建體酰胺鍵合的穩(wěn)定的雙環(huán)肽配對(duì)物(17-69-07-n241)。在式(v)的化合物的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，n代表2，r1和r3均代表甲基，并且r2和r4均代表氫，即式(v)d的化合物：式(v)d的bdc被稱為bt17bdc-20，并且在美登素這側(cè)含有一個(gè)阻礙的甲基，和在雙環(huán)肽這側(cè)含有一個(gè)阻礙的甲基，并且在抗體藥物綴合物的情況下，其對(duì)還原劑如二硫蘇糖醇的敏感性降低170倍。降低的還原敏感性與較低的毒素釋放速率相關(guān)。n＝2的美登素的這種受阻礙的衍生物被稱為dm3。bt17bdc-20采用與毒素-二硫化物構(gòu)建體酰胺鍵合的穩(wěn)定的雙環(huán)肽配對(duì)物(17-69-07-n241)。實(shí)際上，在抗體藥物綴合物的情況下，動(dòng)物模型中功效對(duì)于耐受性的平衡顯示其最佳值與某些水平的阻礙相關(guān)，即dm4的情況(kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717)，這在bt17bdc-19中也是如此。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物選自bt17bdc-9、bt17bdc-17(式(v)a的化合物)、bt17bdc-18(式(v)b的化合物)、bt17bdc-19(式(v)c的化合物)和bt17bdc-20(式(v)d的化合物)。在實(shí)施例5和表16和17中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明bt17bdc-9、bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的有益性質(zhì)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，綴合物選自bt17bdc-9、bt17bdc-17(式(v)a的化合物)、bt17bdc-18(式(v)b的化合物)和bt17bdc-19(式(v)c的化合物)。實(shí)施例5和表16和17中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明這些綴合物被認(rèn)為是用于靶向癌癥治療的合適分子。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，綴合物選自bt17bdc-17(式(v)a的化合物)、bt17bdc-18(式(v)b的化合物)和bt17bdc-19(式(v)c的化合物)。實(shí)施例5和表16和17中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明這些綴合物被認(rèn)為是用于靶向癌癥治療的合適分子，并且在有效劑量下具有良好的耐受性。合成本發(fā)明的肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成制備，然后在體外與分子骨架反應(yīng)。當(dāng)進(jìn)行此操作時(shí)，可以使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法。這使得能夠快速大規(guī)模制備可溶性材料用于進(jìn)一步的下游實(shí)驗(yàn)或驗(yàn)證。這樣的方法可以使用例如timmerman等人(同上)中公開的常規(guī)化學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明還涉及如本文所述選擇的多肽或綴合物的制備，其中制備包括如下說明的任選的進(jìn)一步步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些步驟在通過化學(xué)合成制得的最終產(chǎn)物多肽/綴合物上進(jìn)行。當(dāng)制備綴合物或復(fù)合物時(shí)，目標(biāo)多肽中的氨基酸殘基任選可以被取代。肽也可以被延伸，以合并入例如另一個(gè)環(huán)，因此引入多個(gè)特異性。為了延伸肽，可以使用標(biāo)準(zhǔn)固相或溶液相化學(xué)法，使用正交保護(hù)的賴氨酸(和類似物)，簡(jiǎn)單地在其n-末端或c-末端或在環(huán)內(nèi)化學(xué)延伸。可以使用標(biāo)準(zhǔn)(生物)綴合技術(shù)來引入活化的或可活化的n-或c-末端。可替代地，可以通過片段縮合或天然化學(xué)連接進(jìn)行添加(例如，如(dawson等人1994.synthesisofproteinsbynativechemicalligation.science266:776-779)中所述)，或通過酶，例如使用如(chang等人procnatlacadsciusa.1994dec20；91(26):12544-8或hikari等人bioorganic&medicinalchemistrylettersvolume18,issue22,15november2008,pages6000-6003)中描述的subtiligase進(jìn)行添加?？商娲?，可以通過二硫鍵進(jìn)一步綴合來延伸或修飾肽。這具有允許第一和第二肽在細(xì)胞的還原環(huán)境中彼此分離一次的另外的優(yōu)點(diǎn)。在這種情況下，可以在第一肽的化學(xué)合成期間加入分子骨架(例如tbmb)，以使得與三個(gè)半胱氨酸基團(tuán)反應(yīng)；然后可以將另外的半胱氨酸或硫醇附加到第一肽的n或c末端，使得該半胱氨酸或硫醇僅與第二肽的游離半胱氨酸或硫醇反應(yīng)，形成二硫鍵連接的雙環(huán)肽-肽綴合物。類似的技術(shù)同樣適用于兩種雙環(huán)和雙重特異性大環(huán)化合物的合成/偶聯(lián)，潛在地產(chǎn)生四重特異性分子。此外，可以以相同的方式，使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法，在n-或c-末端或通過側(cè)鏈的偶聯(lián)來完成其它官能團(tuán)或效應(yīng)子基團(tuán)的加入。在一個(gè)實(shí)施例中，以不阻礙任一實(shí)體的活性的方式進(jìn)行偶聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供制備如本文定義的藥物綴合物的方法，其包含方案i、ii或iii中任一項(xiàng)所述的合成路線。藥物組合物根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文定義的肽配體或藥物綴合物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。一般地，本發(fā)明的肽配體將與藥理學(xué)上適當(dāng)?shù)馁x形劑或載體一起以純化的形式使用。典型地，這些賦形劑或載體包括水性或醇/水溶液、乳劑或混懸液，包括生理鹽水和/或緩沖介質(zhì)。腸胃外空白載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉和乳酸林格氏試劑。如果必要，合適的生理學(xué)上可接受的佐劑可以選自增稠劑如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽，以將多肽復(fù)合物保持在混懸液中。靜脈內(nèi)空白載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑和電解質(zhì)補(bǔ)充劑，如基于林格氏右旋糖的那些。還可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(mack(1982)remington'spharmaceuticalsciences，第16版)。本發(fā)明的肽配體可以用作單獨(dú)施用的組合物，或者與其他試劑結(jié)合施用。這些可以包括抗體、抗體片段和各種免疫治療藥物，例如環(huán)孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或順鉑和免疫毒素。藥物組合物可以包括與本發(fā)明的蛋白配體結(jié)合的各種細(xì)胞毒素或其它試劑的“雞尾酒混合物”，或甚至包括具有不同特異性的根據(jù)本發(fā)明選擇的多肽的組合，例如使用不同靶配體選擇的多肽，無論是否在施用之前匯集。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的那些。對(duì)于治療方法，包括但不限于免疫治療法，本發(fā)明的肽配體可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)施用于任何患者。施用可以通過任何適當(dāng)?shù)哪Ｊ?，包括腸胃外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)肺途徑、或者適當(dāng)?shù)赝ㄟ^直接導(dǎo)管輸注。施用的劑量和頻率取決于患者的年齡、性別和狀況，其它藥物的聯(lián)合施用，相反指征和臨床醫(yī)生要考慮的其它參數(shù)。本發(fā)明的肽配體可以被凍干儲(chǔ)存并在使用前重構(gòu)在合適的載體中。已經(jīng)證明這種技術(shù)是有效的，并且可以采用本領(lǐng)域已知的凍干和重構(gòu)技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，凍干和重構(gòu)可導(dǎo)致不同程度的活性損失，并且可能必須向上調(diào)整水平以進(jìn)行補(bǔ)償?？梢允┯煤斜景l(fā)明肽配體或其雞尾酒混合物的組合物用于預(yù)防性和/或治療性治療。在某些治療應(yīng)用中，將完成所選細(xì)胞群體的至少部分抑制、壓制、調(diào)節(jié)、殺死或某些其它可測(cè)量參數(shù)的足夠量定義為“治療有效劑量”。實(shí)現(xiàn)該劑量所需的量將取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)，但通常每千克體重0.005至5.0mg所選擇的肽配體，更常用0.05至2.0mg/kg/劑量的劑量。對(duì)于預(yù)防性應(yīng)用，含有本發(fā)明肽配體或其雞尾酒混合物的組合物也可以以相似或稍低的劑量施用。包含根據(jù)本發(fā)明的肽配體的組合物可以用于在預(yù)防和治療環(huán)境中幫助改變、滅活、殺死或除去哺乳動(dòng)物中的選擇性靶細(xì)胞群體。此外，本文所述的肽配體可以體外(extracorporeally)或體外(invitro)選擇性使用以從細(xì)胞的異質(zhì)集合物中殺死、消耗或以其它方式有效去除靶細(xì)胞群體。來自哺乳動(dòng)物的血液可以與選擇的肽配體體外組合，由此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將不期望的細(xì)胞殺死或以其它方式從血液中除去以返回哺乳動(dòng)物。治療用途本發(fā)明的雙環(huán)肽具有作為膜1型金屬蛋白酶(mt1-mmp，也稱為mmp14)的高親和力結(jié)合劑的特異性用途。mt1-mmp是一種跨膜金屬蛋白酶，其直接通過降解其數(shù)種組分并間接通過活化pro-mmp2在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮主要作用。mt1-mmp對(duì)于腫瘤血管發(fā)生至關(guān)重要(sounni等人(2002)fasebj.16(6),555-564)，并且在多種實(shí)體瘤上過表達(dá)，因此本發(fā)明的mt1-mmp結(jié)合的雙環(huán)肽在靶向治療癌癥，特別是實(shí)體瘤如非小細(xì)胞肺癌中具有特殊用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙環(huán)肽對(duì)人mt1-mmp是特異性的。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙環(huán)肽對(duì)小鼠mt1-mmp是特異性的。在一個(gè)更進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙環(huán)肽對(duì)人和小鼠mt1-mmp是特異性的。在一個(gè)更進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙環(huán)肽對(duì)人、小鼠和狗mt1-mmp是特異性的。根據(jù)本發(fā)明的方法選擇的多肽配體可用于體內(nèi)治療和預(yù)防應(yīng)用、體外和體內(nèi)診斷應(yīng)用、體外試驗(yàn)和試劑應(yīng)用等。具有選擇的特異性水平的配體在其中需要交叉反應(yīng)性的涉及在非人動(dòng)物中進(jìn)行測(cè)試的應(yīng)用中是有用的，或在需要仔細(xì)控制與同系物或旁系同源物的交叉反應(yīng)性的診斷應(yīng)用中是有用的。在一些應(yīng)用中，例如疫苗應(yīng)用，可以利用引發(fā)對(duì)預(yù)定范圍的抗原的免疫應(yīng)答的能力來定制針對(duì)特定疾病和病原體的疫苗。對(duì)于哺乳動(dòng)物施用，優(yōu)選至少90至95％同質(zhì)性的基本上純的肽配體，并且對(duì)于藥物用途，特別是當(dāng)哺乳動(dòng)物是人時(shí)，最優(yōu)選優(yōu)選98至99％或更高同質(zhì)性。一旦按需要被純化(部分或同質(zhì)的)，所選擇的多肽可以在診斷或治療(包括體外)或開發(fā)和進(jìn)行測(cè)試程序、免疫熒光染色等中使用(lefkovite和pernis,(1979和1981)immunologicalmethods,volumesiandii,academicpress,ny)。本發(fā)明的肽配體的效應(yīng)子基團(tuán)和綴合物典型地可用于預(yù)防、抑制或治療癌癥，特別是實(shí)體瘤如非小細(xì)胞肺癌。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供本文定義的肽配體的效應(yīng)子基團(tuán)和藥物綴合物，其用于預(yù)防、抑制或治療癌癥，特別是實(shí)體瘤如非小細(xì)胞肺癌的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防、抑制或治療癌癥，特別是實(shí)體瘤如非小細(xì)胞肺癌的方法，其包括向有需要的患者施用如本文定義的肽配體的效應(yīng)子基團(tuán)和藥物綴合物。可以治療(或抑制)的癌癥(及其良性對(duì)應(yīng)物)的示例包括但不限于上皮起源的腫瘤(各種類型的腺瘤和癌，包括腺癌、鱗狀癌、移行細(xì)胞癌和其它癌)，例如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃腸道癌(包括食管、胃(stomach)(胃部的(gastric))、小腸、結(jié)腸、直腸和肛門)、肝癌(肝細(xì)胞癌)、膽囊和膽道系統(tǒng)癌、外分泌胰腺癌、腎癌、肺癌(例如腺癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、細(xì)支氣管肺泡癌和間皮瘤)、頭頸部癌(例如舌頭、口腔、喉、咽、鼻咽、扁桃體、唾液腺、鼻腔和鼻旁竇癌)、卵巢癌、輸卵管癌、腹膜癌、陰道癌、外陰癌、陰莖癌、子宮頸癌、子宮肌層癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌(例如甲狀腺濾泡癌)、腎上腺癌、前列腺癌、皮膚和附屬物癌(例如黑素瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、角化棘皮瘤、發(fā)育異常痣)；血液學(xué)惡性腫瘤(即白血病、淋巴瘤)和惡變前血液病和邊緣惡性腫瘤的疾病包括血液學(xué)惡性腫瘤和淋巴系統(tǒng)的相關(guān)病癥(例如急性淋巴細(xì)胞白血病[all]、慢性淋巴細(xì)胞性白血病[cll]、b-細(xì)胞淋巴瘤如彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤[dlbcl]、濾泡性淋巴瘤、布基特氏(burkitt’s)淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、t細(xì)胞淋巴瘤和白血病、天然殺傷[nk]細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病、不確定意義的單克隆丙種球蛋白病、漿細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤和移植后淋巴細(xì)胞增生性疾病)，以及血液學(xué)惡性腫瘤和骨髓系相關(guān)病癥(例如急性髓細(xì)胞白血病[aml]、慢性髓細(xì)胞白血病[cml]、慢性骨髓單核細(xì)胞白血病[cmml]、嗜酸細(xì)胞增多綜合征、骨髓增生性疾病如紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥和原發(fā)性骨髓纖維化、骨髓增生綜合征、骨髓增生異常綜合征和早幼粒細(xì)胞性白血病)；間葉細(xì)胞源的腫瘤，例如軟組織、骨和軟骨的肉瘤如骨肉瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因氏肉瘤、滑膜肉瘤、上皮樣肉瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、良性和惡性組織細(xì)胞瘤、和隆突性皮膚纖維肉瘤；中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤(例如星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、室管膜瘤、松果體瘤和神經(jīng)鞘瘤)；內(nèi)分泌腫瘤(例如垂體腫瘤、腎上腺腫瘤、胰島細(xì)胞腫瘤、甲狀旁腺腫瘤、良性腫瘤和甲狀腺髓樣癌)；眼和附屬器腫瘤(例如成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)；生殖細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(例如畸胎瘤、精原細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞瘤、水泡狀胎塊和絨毛癌)；和兒科和胚胎腫瘤(例如成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、維耳姆斯瘤和原始神經(jīng)外胚層腫瘤)；或先天性或其它綜合癥，其使患者易患惡性腫瘤(例如著色性干皮癥)。本文引用術(shù)語“預(yù)防”涉及在誘導(dǎo)疾病之前施用保護(hù)性組合物?！耙种啤笔侵冈谡T導(dǎo)事件之后但在臨床出現(xiàn)疾病之前施用組合物。“治療”涉及在疾病癥狀明顯后施用保護(hù)性組合物。可用于篩選肽配體在保護(hù)或治療疾病中的有效性的動(dòng)物模型系統(tǒng)是可用的。通過本發(fā)明促進(jìn)了動(dòng)物模型系統(tǒng)的使用，本發(fā)明允許開發(fā)可與人和動(dòng)物靶標(biāo)交叉反應(yīng)的多肽配體，以允許使用動(dòng)物模型。下面參照以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例材料和方法噬菌體選擇如heinis等人(2009),natchembiol5(7),502-507、wo2009/098450、wo2013/050615和wo2013/050616中所述，產(chǎn)生6x6雙環(huán)噬菌體文庫。使用所述6x6噬菌體文庫針對(duì)生物素化的人mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合域進(jìn)行噬菌體展示選擇。蛋白質(zhì)表達(dá)使用pexpr-iba42(iba)表達(dá)載體，將mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白樣重復(fù)序列(也稱為mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域)，來自人類基因的殘基cys319-gly511在hek293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，作為分泌型n末端his6標(biāo)記的可溶性蛋白。表達(dá)后，通過鎳-nta親和層析法純化蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行凝膠過濾，并通過sds-page檢測(cè)純度。還通過熒光熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，在存在/不存在血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合雙環(huán)的情況下，監(jiān)測(cè)批次間的變化性。肽合成基于fmoc化學(xué)法進(jìn)行肽合成，使用由peptideinstruments制造的symphony肽合成儀和multisyntech制造的syroii合成儀。采用標(biāo)準(zhǔn)的fmoc-氨基酸(sigma，merck)，其具有以下側(cè)鏈保護(hù)基：arg(pbf)、asn(trt)、asp(otbu)、cys(trt)、giu(otbu)、gln(trt)、his(trt)、lys(boc)、ser(tbu)、thr(tbu)、trp(boc)、和tyr(tbu)(sigma)。偶聯(lián)劑為hctu(pepceuticals)，采用二異丙基乙基胺(dipea，sigma)作為堿，并用dmf中20％的哌啶(agtc)實(shí)現(xiàn)脫保護(hù)。使用0.37mmol/grfmoc-rink酰胺am樹脂(agtc)進(jìn)行合成，使用四倍過量的fmoc-氨基酸，并且堿相對(duì)于氨基酸四倍過量。將氨基酸以0.2m溶解于dmso中，hctu以0.4m溶解于dmf中，dipea以1.6m溶解于n-甲基吡咯烷酮(alfaaesar)中。條件使得偶聯(lián)反應(yīng)物包含在dmf中20至50％的dmso中，這在固相合成期間減少聚集和缺失并提高產(chǎn)率。偶聯(lián)時(shí)間一般為30分鐘，并且脫保護(hù)時(shí)間為2×5分鐘。將fmoc-n-甲基甘氨酸(fmoc-sar-oh，merck)偶聯(lián)1小時(shí)，并且隨后的殘基的脫保護(hù)和偶聯(lián)時(shí)間分別為20分鐘和1小時(shí)。合成后，用二氯甲烷洗滌樹脂并干燥。使用10ml95:2.5:2.5:2.5v/v/v/wtfa/h2o/ipr3sih/二硫蘇糖醇，進(jìn)行從載體上的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的裂解3小時(shí)。裂解后，通過過濾除去用過的樹脂，并將濾液加入至35ml已經(jīng)于-80℃冷卻的乙醚中。將肽球狀物離心，棄去乙醚上清液，并將肽球狀物用冷乙醚洗滌兩次以上。然后，將肽重新溶解于5-10ml的乙腈-水中并凍干。取出少量樣品用于通過質(zhì)譜(maldi-tof，voyagerde來自appliedbiosystems)分析粗產(chǎn)物的純度。凍干后，將肽粉末吸收于補(bǔ)充有0.5ml1m的二硫蘇糖醇的10ml6m胍鹽酸鹽的水溶液中，并加載于c8luna制備型hplc柱(phenomenex)上。用0.1％的七氟丁酸酸化溶劑(h2o，乙腈)。使用gilson制備型hplc系統(tǒng)，梯度為15分鐘內(nèi)30-70％乙腈，流速為15-20ml/min。合并含有純線性肽材料(通過maldi鑒定)的級(jí)分，并用1,3,5-三(溴甲基)苯(tbmb，sigma)修飾。為此，將線性肽用h2o稀釋至～35ml，加入～500μl100mmtbmb的乙腈溶液，并用5ml1mnh4hco3的水溶液引發(fā)反應(yīng)。反應(yīng)在室溫進(jìn)行～30-60分鐘，并且一旦反應(yīng)完成(用maldi判斷)即可凍干。凍干后，如上所述純化修飾的肽，同時(shí)用geminic18柱(phenomenex)替換lunac8，并將酸變?yōu)?.1％三氟乙酸。合并含有正確tmb修飾材料的級(jí)分，凍干，置于-20℃保存。除非另有說明，所有的氨基酸均使用l-構(gòu)型。在固相肽合成期間，使用受保護(hù)的前體dota(tbu)3(tci，cas137076-54-1)將dota偶聯(lián)至肽鏈上。使用如上所述的一般方法將非天然氨基酸合并入肽序列。本文中采用的非天然氨基酸前體列表總結(jié)在下表中：用于藥代動(dòng)力學(xué)研究的肽從0.1％tfa水溶液中凍干，得到化合物的tfa鹽或游離酸。使用17-69-07-n219作為前體雙環(huán)肽合成bdc使用17-69-07-n219作為前體肽，合成兩種雙環(huán)藥物綴合物(bdc)。將活化的vcmmae或二硫化物-dm1構(gòu)建體(溶解在dmso中)在水性條件(100磷酸鈉ph8)中以1.4×過量直接與17-69-07-n219綴合(參見方案i和ii)。濃度為9mg/ml肽或更高濃度。反應(yīng)后進(jìn)行l(wèi)c/ms，并在3.5小時(shí)后判斷為完成。然后使用c18半制備柱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)反相純化。分離純度大于95％的級(jí)分并凍干。這些材料不含有可測(cè)量的游離毒素。對(duì)于體外和體內(nèi)研究，將凍干粉末吸收為濃縮的dmso儲(chǔ)存液(100mg/ml)，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中稀釋以供進(jìn)一步使用。使用17-69-07-n241作為前體雙環(huán)肽合成bdc對(duì)于bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的合成，使用二硫化物美登木素生物堿類的以下n-羥基琥珀酰亞胺酯(nhs酯)：其中r1、r2、r3、r4、m和n分別如本文之前對(duì)于bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的式(v)a、(v)b、(v)c、(v)d的化合物的定義。bt17bdc-18進(jìn)一步通過如下文和方案iii所述的可替代路線合成。這里，通過將17-69-07-n241與spp(n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯)在dmso中反應(yīng)合成17-69-07-n277。于室溫，17-69-07-n241的濃度為10mm或更高，具有1.3倍過量的spp和20倍過量的二異丙基乙基胺。1小時(shí)后，通過lcms判斷反應(yīng)完成。如上所述通過反相進(jìn)行純化。將適當(dāng)?shù)募?jí)分凍干。在氮?dú)鈱酉拢谑覝兀?7-69-07-n277在半水性條件(補(bǔ)充有2mmedta的50％二甲基乙酰胺和50％100mm乙酸鈉ph5.0)中與1.15當(dāng)量dm1(作為游離硫醇)進(jìn)行二硫鍵交換21小時(shí)。反應(yīng)中17-69-07-n277的濃度為10mm或更高。然后使用c18半制備柱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)反相純化。分離純度大于95％的級(jí)分并凍干。材料不含有可測(cè)量的游離毒素。對(duì)于體外和體內(nèi)研究，如上所述將凍干粉末溶解于水性制劑中，或直接吸收于適當(dāng)?shù)木彌_液中。雙環(huán)結(jié)合物對(duì)mt1-mmp的解離速率常數(shù)測(cè)定直接結(jié)合熒光偏振(各向異性)試驗(yàn)直接結(jié)合熒光偏振或各向異性試驗(yàn)通過用其結(jié)合配對(duì)體(本文為mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域)滴定恒定濃度的熒光示蹤劑(本文為待研究的熒光雙環(huán)肽)進(jìn)行。隨著滴定過程中結(jié)合配對(duì)體的濃度增加，極化信號(hào)與結(jié)合和未結(jié)合材料的份數(shù)成比例變化。這允許定量地確定解離速率(kd)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以使用標(biāo)準(zhǔn)配體結(jié)合方程擬合。典型地，示蹤劑的理想濃度遠(yuǎn)低于示蹤劑的kd：滴定劑對(duì)，并且所選擇的濃度通常為～1nm或更小。滴定劑(結(jié)合配對(duì)體)濃度從0.1nm變化至典型的5μm。選擇該范圍使得可以觀察到熒光偏振的最大變化。采用的緩沖液是在0.01％吐溫存在下的磷酸鹽緩沖鹽水。實(shí)驗(yàn)在黑色384孔低結(jié)合/低體積板(corning3820)中進(jìn)行，并且使用bmgpherastarfs平板讀數(shù)器測(cè)量熒光偏振信號(hào)。本文中提及的熒光示蹤劑是已經(jīng)使用5,6-羧基熒光素?zé)晒馑鼗?fluoresceinated)的雙環(huán)肽。可以在肽的n末端氨基上進(jìn)行熒光素化，所述肽通過肌氨酸間隔子(通常為sar5)與雙環(huán)核心序列分隔。這可以在fmoc固相合成期間或如果n末端氨基是肽獨(dú)有的，在合成后(用tbmb環(huán)化后和純化后)進(jìn)行。熒光素化還可以在c末端進(jìn)行，通常在作為第一個(gè)c末端殘基引入的賴氨酸上進(jìn)行，然后通過肌氨酸間隔子(通常為sar6)與雙環(huán)核心序列分隔。因此，n末端示蹤劑可以具有描述為fluo-gly-sar5-a(bicyclecoresequence)和(bicyclecoresequence)-a-sar6-k(fluo)用于c末端熒光素化構(gòu)建體的分子格式。實(shí)施例中使用的熒光示蹤劑是a-(17-69)-a-sar6-k(fluo)、a-(17-69-07)-a-sar6-k(fluo)、和a-(17-69-12)-a-sar6-k(fluo)。由于17-69熒光肽的酸性性質(zhì)，其典型地以濃縮的dmso儲(chǔ)備液制備，由此在100mmtrisph8緩沖液中制備稀釋液。使用熒光偏振(各向異性)的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)由于其對(duì)mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域(pex)的高親和力，17-69-07和17-69-12的熒光素化衍生物(分別表示為17-69-07-n040和17-69-12-n005)可用于競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)(使用fp進(jìn)行檢測(cè))。本文中，用游離的、非熒光素化雙環(huán)肽滴定pex與熒光pex結(jié)合示蹤劑的預(yù)先形成的復(fù)合物。由于預(yù)期所有基于17-69的肽在相同的位點(diǎn)結(jié)合，所以滴定劑將從pex置換熒光示蹤劑?？梢远康販y(cè)量復(fù)合物的解離，并確定競(jìng)爭(zhēng)者(滴定劑)對(duì)靶蛋白的kd。競(jìng)爭(zhēng)方法的優(yōu)點(diǎn)是可以準(zhǔn)確和快速地確定非熒光素化雙環(huán)肽的親和力。示蹤劑的濃度通常為kd或以下(本文中為1nm)，并且結(jié)合蛋白(本文中為mt1-mmp的血紅素結(jié)合蛋白)為15倍過量，使得結(jié)合了>90％的示蹤劑。隨后，滴定非熒光競(jìng)爭(zhēng)劑雙環(huán)肽(通常僅僅是雙環(huán)核心序列)，使得其從靶蛋白置換熒光示蹤劑。測(cè)量示蹤劑的置換并與熒光偏振的下降相關(guān)聯(lián)。熒光偏振的降低與非熒光滴定劑結(jié)合的靶蛋白的份數(shù)成比例，因此是測(cè)量滴定劑對(duì)靶蛋白的親和力。原始數(shù)據(jù)適合于描述熒光示蹤劑、滴定劑和結(jié)合蛋白之間平衡的三次方程的解析解。擬合需要熒光示蹤劑對(duì)靶蛋白的親和力的值，其可以通過直接結(jié)合fp實(shí)驗(yàn)單獨(dú)確定(參見前面的部分)。使用sigmaplot12.0進(jìn)行曲線擬合，并使用zhi-xinwang(febsletters360(1995)111-114)描述的方程式的改編版本。血漿穩(wěn)定性分析方法1：開發(fā)了采用質(zhì)譜檢測(cè)(maldi-tof，voyagerde，appliedbiosystems)母體質(zhì)量以及其血漿-蛋白酶誘導(dǎo)的片段的快速血漿穩(wěn)定性分析測(cè)定。通過評(píng)估片段的性質(zhì)，可以確定優(yōu)選的裂解位點(diǎn)。本文中，將1-1.5mm肽儲(chǔ)備液(dmso中)直接稀釋到小鼠/大鼠/人血漿(sera實(shí)驗(yàn)室，使用檸檬酸鹽作為抗凝血?jiǎng)?中，得到最終濃度為50μm肽，并且于37℃孵育長達(dá)48小時(shí)。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)取5μl樣品，并在-80℃冷凍。用于分析，將樣品除霜，與25μl的3:3:1乙腈:甲醇:水混合，并于13k離心5分鐘。吸出5μl含肽的上清液，并與在乙腈:h2o的1:1混合物中的30mm碳酸氫銨混合。然后將其中1μl點(diǎn)在maldi板上，干燥，并將matrix(α-氰基肉桂酸，sigma，制備成含有0.1％三氟乙酸的1:1乙腈:水中的飽和溶液)層鋪在樣品(1μl)上，干燥，并使用malditof分析。應(yīng)當(dāng)注意，這是一種定性試驗(yàn)用于檢測(cè)不同雙環(huán)肽序列之間血漿穩(wěn)定性的對(duì)比變化，并且作為確定優(yōu)選的裂解位點(diǎn)的優(yōu)異工具起作用。方法2：為了定量獲得雙環(huán)肽的血漿穩(wěn)定性，將肽儲(chǔ)備液(dmso中200μm)與血漿(人或小鼠)混合，使得最終濃度為10μm。長達(dá)8小時(shí)定期取出40μl樣品，并在-80℃冷凍。在lc-ms分析之前，將樣品除霜，并與3體積(本文中為120μl)1:1乙腈/meoh水混合。將乳狀混懸液以13000rpm離心30分鐘，并使用watersxevotq-d儀器定量含肽的上清液的雙重/三重帶電荷物質(zhì)和其ms/ms片段，同時(shí)使用同一肽的血漿提取標(biāo)準(zhǔn)曲線作為參考。血漿中降解的半衰期用于評(píng)估分子的對(duì)比穩(wěn)定性。17-69-07在小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)，代謝物鑒定17-69-07-n004的藥代動(dòng)力學(xué)使用雙環(huán)肽17-69-04-n004獲得小鼠藥代動(dòng)力學(xué)，其作為1.19mg/ml溶液的5ml/kg推注，以單次靜脈注射5.925mg/kg劑量給予一組12只雄性cd1小鼠。從100μl23.7mg/mldmso儲(chǔ)備液中制備配制的溶液，所述儲(chǔ)備液在給藥之前立即用1.9ml磷酸鹽緩沖鹽水稀釋，得到由ph7.4的pbs中的5％dmso組成的空白載體。經(jīng)終端麻醉下的心臟穿刺，于給藥后0.08、0.5、1、2和4小時(shí)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從兩只動(dòng)物取血樣，并轉(zhuǎn)移到edta管中進(jìn)行血漿生成。血漿樣品立即冷凍在-20℃。用于分析，將樣品快速解凍，并用3體積的提取溶劑(2:9:9的10mm碳酸氫銨，ph8、乙腈和甲醇的混合物，含有分析內(nèi)標(biāo))處理50μl等分試樣。通過離心除去沉淀的蛋白，并通過lc-ms/ms分析上清液。樣品的定量參考在對(duì)照小鼠血漿中制備的校準(zhǔn)線。使用summitresearchservices的軟件包pksolutions2.0，通過非房室分析測(cè)定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。術(shù)語的定義：cmax：最大測(cè)量濃度；tmax：測(cè)量到最大濃度的時(shí)間；auc0-t：從0分鐘到最后的可量化數(shù)據(jù)點(diǎn)的血漿藥物濃度/時(shí)間曲線下面積；和auc0-∞：從0分鐘基于終末半衰期外推到超出最終數(shù)據(jù)點(diǎn)的血漿藥物濃度/時(shí)間曲線下的面積。小鼠血漿中雙環(huán)肽代謝物的鑒定可以使用三種血漿樣品(0.5、1和2小時(shí))分析17-69-07-n004的潛在小鼠體內(nèi)代謝物。通過hplc-ms和帶有l(wèi)tqorbitrapxl質(zhì)譜儀的hplc-ms/ms進(jìn)行分析。在血液循環(huán)中尋找肽代謝物的方法是計(jì)算假定代謝物的精確質(zhì)量(10ppm窗)(加入1或2滴水(+18，+36)分別用于環(huán)1和/或環(huán)2的裂解；然后從環(huán)1和/或環(huán)2丟失單個(gè)氨基酸或丟失氨基酸的延伸)。其次，通過與空白小鼠血漿比較總離子色譜圖進(jìn)行手動(dòng)搜索。bt17bdc-1和bt17bdc-9在ht-1080異種移植小鼠中的功效用bdc或空白載體(pbs)處理攜帶皮下ht-1080異種移植腫瘤的balb/c裸鼠。給予bdc每周3次持續(xù)2周，當(dāng)腫瘤測(cè)量約150-200mm3時(shí)開始給藥。監(jiān)測(cè)小鼠，每周記錄3次腫瘤體積和體重的測(cè)量值。實(shí)施例1：使用mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域鑒定具有高親和力的雙環(huán)肽采用先前建立的生成雙環(huán)肽噬菌體文庫的方法，對(duì)人mt1-mmp的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行選擇。采用連續(xù)降低濃度的靶標(biāo)從天然文庫進(jìn)行三輪選擇后，對(duì)輸出進(jìn)行測(cè)序。雙環(huán)肽17-69(cknrgfgcedfydic)(seqidno：16)被鑒定為最豐富的序列輸出之一，并且通過α篩選(alphascreen)驗(yàn)證了與靶標(biāo)的定性結(jié)合。產(chǎn)生了三個(gè)小噬菌體文庫，提供17-69序列的3個(gè)部分的全序列覆蓋。對(duì)這三個(gè)文庫進(jìn)行兩輪針對(duì)血紅素結(jié)合蛋白的選擇。有趣的是，最有希望的序列輸出是5×6雙環(huán)肽，而起始文庫是6×6格式。由于雙環(huán)肽對(duì)靶蛋白的較高親和力，可能選擇較短的環(huán)長度。更短的環(huán)長度是由于在構(gòu)建噬菌體文庫期間合并入的不正確合成的引物導(dǎo)致的。主要序列輸出是肽17-69-07，其具有序列cynefgcedfydic(seqidno：2)。基于觀察到5×6格式顯示最有成效，并且需要5×6結(jié)合物之間的區(qū)別，產(chǎn)生另外兩個(gè)文庫來測(cè)試產(chǎn)生雙環(huán)肽17-69-02、17-69-03、17-69-04和17-69-12的第一個(gè)環(huán)的有意截?cái)?。這些包含在圖8中公開的序列中。某些殘基的傾向是明顯的，盡管結(jié)合試驗(yàn)不能區(qū)分最佳結(jié)合物之間的區(qū)別因?yàn)樗鼈円呀?jīng)達(dá)到測(cè)試上限。使用α篩選測(cè)試最常發(fā)生的序列的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合，其中所有信號(hào)高于原始17-69序列(參見表1)：表1：使用本發(fā)明的雙環(huán)肽的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合測(cè)試由于所有基于17-69的親和力成熟克隆產(chǎn)生接近測(cè)試上限的信號(hào)，表1所示的圖不允許明確鑒定最佳克隆。因此，一些肽被合成為熒光素化衍生物(17-69、17-69-07和17-69-12)，并用于直接結(jié)合熒光偏振(fp)實(shí)驗(yàn)。本文中，熒光素通過連接子(通常為sar6)與雙環(huán)序列分隔，位于核心序列的n或c末端(表2)。表2：直接結(jié)合熒光偏振(fp)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果17-69-07和17-69-12的熒光素化衍生物(表示為17-69-07-n040和17-69-12-n005)分別顯示出0.52和3.1nm解離速率的強(qiáng)結(jié)合。它們比原來非成熟的17-69序列(17-69-n004)顯著改善。似乎包含5×6格式的序列在親和力成熟文庫的情況下誘導(dǎo)高親和力。由于它們對(duì)mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域(pex)的高親和力，17-69-07和17-69-12的熒光素化衍生物(表示為17-69-07-n040和17-69-12-n005)用于隨后的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)(使用fp進(jìn)行檢測(cè))。本文中，用游離的、非熒光素化雙環(huán)肽滴定pex與熒光pex結(jié)合示蹤劑的預(yù)形成復(fù)合物。由于預(yù)期所有基于17-69的肽(含有保守的第二環(huán)基序cedfydic；seqidno：17)在相同的位點(diǎn)結(jié)合，所以滴定劑將從pex置換熒光示蹤劑?？梢远繙y(cè)定復(fù)合物的離解，并確定競(jìng)爭(zhēng)者(滴定劑)的kd。競(jìng)爭(zhēng)方法的優(yōu)點(diǎn)是可以準(zhǔn)確和快速地確定非熒光素化雙環(huán)肽的親和力。在這種情況下，重要的是要驗(yàn)證17-69-07和17-69-12核心序列對(duì)pex的高親和力負(fù)全部責(zé)任。因此，肽被合成為具有n和c末端丙氨酸的變體，從而密切地模擬噬菌體顆粒上表達(dá)的序列，但缺少與熒光素化構(gòu)建體一起使用的sar5/6分子間隔子。通過競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)確定的親和力與用熒光素化衍生物獲得的親和力幾乎相同，明確地證明核心雙環(huán)序列負(fù)責(zé)與pex的高親和力結(jié)合(表3)。此外，熒光素化構(gòu)建體顯示分子間隔子和效應(yīng)子基團(tuán)(本文中作為-a-sar6-k(熒光素))的c-末端連接是可以耐受的。表3：直接結(jié)合熒光偏振(fp)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果實(shí)施例2：17-69-07核心序列的蛋白水解穩(wěn)定性17-69-07的小鼠血漿穩(wěn)定性對(duì)于人類的治療應(yīng)用和對(duì)于動(dòng)物物種的臨床前評(píng)估，先導(dǎo)雙環(huán)肽在靜脈內(nèi)施用后在循環(huán)中足夠穩(wěn)定是相關(guān)的。需要足夠的穩(wěn)定性，使得足夠水平的雙環(huán)肽可以與其靶標(biāo)結(jié)合并發(fā)揮其生物學(xué)功能。臨床前模型通常采用如小鼠、大鼠、兔和食蟹猴等物種。首先，使用本文如上所述的方法(方法2)，在小鼠血漿的存在下，評(píng)估雙環(huán)肽17-69-07-n219的穩(wěn)定性。雙環(huán)核心序列保留17-69-07序列的原始天然蛋白原性氨基酸，并且還包含用于與效應(yīng)子基團(tuán)綴合的n末端分子間隔子(序列：g-sar10-acynefgcedfydic；seqidno：20)。盡管存在分子間隔子，但保留了17-69-07-n219對(duì)pex的親和力(kd＝0.82nm)。該化合物在離體小鼠血漿中顯示出適度的穩(wěn)定性，半衰期為6小時(shí)(參見圖1)。鑒定17-69-07的離體/體內(nèi)蛋白水解切割位點(diǎn)為了了解小鼠血漿中17-69-07-n219降解的化學(xué)性質(zhì)，使用maldi-tof分析樣品的任何潛在的降解產(chǎn)物。質(zhì)譜顯示可能的酪氨酸損失，這意味著開環(huán)(水解)和環(huán)1中tyr1和/或環(huán)2中tyr9中的去除。使用最小雙環(huán)肽17-69-07-n004(ac-cynefgcedfydic(seqidno：2)，其構(gòu)成17-69-07的最小核心雙環(huán)肽)進(jìn)行小鼠藥代動(dòng)力學(xué)(pk)研究以確定體內(nèi)循環(huán)的清除率和消除率。進(jìn)一步分析所得血液樣品，并分析血漿樣品中17-69-07-n004的任何潛在的蛋白水解降解產(chǎn)物。pk圖示于圖2。表4:17-69-07-n004的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)nc：由于有限的數(shù)據(jù)而未計(jì)算表4顯示肽的消除半衰期為14分鐘，并且以20.7ml/min/kg清除。清除率大于在小鼠中觀察到的腎小球?yàn)V過率(qi等人,americanjournalofphysiology-renalphysiology(2004)vol.286no.3,f590-f596中總結(jié))，表明肽被另外的方式，例如由血漿和內(nèi)皮蛋白酶驅(qū)動(dòng)的蛋白水解清除。為了解決體內(nèi)蛋白水解是否明顯有助于清除，使用lc-ms/ms技術(shù)，使在t＝0.5、1和2小時(shí)采集的血漿樣品經(jīng)歷雙環(huán)片段的靶向分析。可以鑒定多種蛋白水解代謝物，并且具有最強(qiáng)信號(hào)的片段在下面降序列出：ac-ciynefgciiedfydiciii(seqidno：2)：環(huán)1中切除yne；環(huán)1中切除ynef(seqidno：21)；環(huán)1中切除ynefg(seqidno：22)(去除全部環(huán))；環(huán)1和/或2中切除y；環(huán)2中切除yd；環(huán)2中切除fyd；環(huán)2中切除ydi；和環(huán)2中切除edfydi(seqidno：23)(去除全部環(huán))。前三種代謝物以中等信號(hào)水平存在，而剩余的片段只能以痕量檢測(cè)。總之，離體和體內(nèi)代謝物顯示集中于tyr1/9處或附近的初始裂解，隨后連續(xù)除去附近的殘基。這最終導(dǎo)致完整的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的去除。17-69-07序列的蛋白水解穩(wěn)定性和效力增強(qiáng)穩(wěn)定肽序列免于蛋白水解降解的方法很多(論述參見gentilucci等人,curr.pharmaceuticaldesign,(2010),16,3185-203，和nestor等人,curr.medicinalchem(2009),16,4399-418)，和wo2009/098450、wo2013/050615和wo2013/050616)。簡(jiǎn)言之，它們包括對(duì)蛋白酶提供識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸的取代，切割位點(diǎn)處的氨基酸骨架的改變(即n-甲基化，偽肽鍵等)，鄰近的鍵的空間位阻(即β-取代的氨基酸)，和包含d-對(duì)映體氨基酸。這些修飾(即n-甲基化，d-氨基酸)中的一些可以保護(hù)/屏蔽蛋白水解切割位點(diǎn)免于水解，即使它們位于遠(yuǎn)離切割位點(diǎn)的兩個(gè)殘基。盡管保護(hù)序列免受蛋白水解攻擊是相對(duì)直接，但合并入不會(huì)顯著改變對(duì)于靶蛋白的效力(和特異性)的穩(wěn)定的變化更具挑戰(zhàn)性。從前面部分顯示的17-69-07的離體/體內(nèi)蛋白水解降解數(shù)據(jù)可以看出，tyr1/9和鄰近的殘基是穩(wěn)定雙環(huán)肽的潛在位點(diǎn)。評(píng)估肽的成功穩(wěn)定化的定量方法是通過增加其在小鼠和人血漿中的半衰期。首先，產(chǎn)生17-69-07的11個(gè)衍生物，其中每個(gè)位置被丙氨酸替代(稱為“丙氨酸掃描”)。這種類型的信息對(duì)某些殘基的能量貢獻(xiàn)和作用提出建議，并可能除去蛋白水解識(shí)別位點(diǎn)。表5：丙氨酸掃描結(jié)果17-69-07-n004是野生型，含有封端的n末端(n末端乙?；Q為“ac”)的未修飾的肽。一些ala取代被良好耐受，特別是在序列中的第1、3、4、10和11位。由于這些殘基的側(cè)鏈對(duì)于與靶標(biāo)的高親和力結(jié)合不是必需的，所以在這些特定序列位置的式(i)的化合物被廣泛地定義。這使得殘基1(tyr1)的取代是非常有吸引力的可能性，因?yàn)樗梢匀コ鞍姿庾R(shí)別位點(diǎn)之一。用ala5取代gly5是有意義的，因?yàn)榛瘜W(xué)變化較小(加入甲基)，但產(chǎn)生顯著降低的效力。gly5可能采用在普通拉氏圖(ramachandronchart)外的不尋常的phi/psi角度，這些角度可能是由d-氨基酸誘導(dǎo)。另外的益處是鄰近該位點(diǎn)的肽鍵的穩(wěn)定化。為此，進(jìn)行部分d-丙氨酸掃描以評(píng)估它們是否在效力維持方面是耐受的：由于它們的蛋白水解穩(wěn)定作用，在序列中包含d-氨基酸是非常需要的。表6：用d-丙氨酸取代第一環(huán)中的殘基的作用d-ala1代替tyr1以比野生型少10倍的親和力結(jié)合。然而，令人感興趣的是蛋白水解識(shí)別位點(diǎn)tyr1被去除并被穩(wěn)定的氨基酸替代，卻不引起效力的重大損失。值得注意的是，用d-ala5取代gly5是良好耐受的，因?yàn)榕c野生型相比的親和力保持不變。在此情況下，d-arg5也被耐受(并且可能因此除了d-pro之外的所有d-氨基酸，參見表6)，如果物理化學(xué)性質(zhì)在分子的進(jìn)一步開發(fā)期間需要改變，則這可能是有意義的(表7)。表7：在5位取代殘基的作用肽編碼分子描述kd(nm)17-69-07-n004ac-(17-69-07)(野生型)2.47±0.2517-69-07-n018ac-(17-69-07)ala5>500017-69-07-n058ac-(17-69-07)d-ala52.37±0.8617-69-07-n120ac-(17-69-07)d-arg54.24±1.48接下來，由于噬菌體選擇輸出顯示對(duì)序列的4位處的疏水性和芳香族氨基酸的一定偏好，合成了一系列衍生物，其中合并入選擇的芳香族氨基酸，包括天然酪氨酸和色氨酸(表8)。表8：在4位取代殘基的作用肽編碼分子描述kd(nm)17-69-07-n004ac-(17-69-07)(野生型)2.47±0.2517-69-07-n057ac-(17-69-07)tyr41.78±0.4517-69-44-n002ac-(17-69-07)trp40.75±0.2317-69-07-n067ac-(17-69-07)1nal40.36±0.1217-69-07-n068ac-(17-69-07)2nal40.7±0.1917-69-07-n065ac-(17-69-07)chg4>500017-69-07-n071ac-(17-69-07)phg462817-69-07-n072ac-(17-69-07)tbugly4>500017-69-07-n137ac-(17-69-07)3,4-dcphe41.85±2.4517-69-07-n139ac-(17-69-07)cha436217-69-07-n140ac-(17-69-07)hphe443.31nal：1-萘基丙氨酸；2nal：2-萘基丙氨酸；chg：環(huán)己基甘氨酸；phg：苯基甘氨酸；tbugly：叔丁基甘氨酸；3,4-dcphe4：3,4-二氯苯丙氨酸；cha：環(huán)己基丙氨酸；和hphe：高苯丙氨酸。與野生型相比，4位處的數(shù)個(gè)取代增加親和力，這些包括酪氨酸、色氨酸、1和2-萘基丙氨酸(1/2nal)和3,4-二氯苯丙酸(3,4-dcphe)。最有效的取代是1-萘基丙氨酸，其增強(qiáng)7倍親和力。為了提高分子的穩(wěn)定性，檢查了17-69-07環(huán)2中的某些殘基。這些包括殘基9，其含有潛在的tyr9識(shí)別位點(diǎn)。殘基11也是有吸引力的，因?yàn)樗试S取代(表5)并與tyr9識(shí)別位點(diǎn)相鄰。表9：耐受的氨基酸取代的總結(jié)肽編碼分子描述kd(nm)17-69-07-n004ac-(17-69-07)(野生型)2.47±0.2517-69-07-n130ac-(17-69-07)4brphe92.45±1.0817-69-07-n182ac-(17-69-07)5fphe913.117-69-07-n100ac-(17-69-07)tbugly111.56±1.14感興趣的是4-溴苯丙氨酸(4brphe)，其改變tyr9蛋白水解識(shí)別位點(diǎn)，和叔丁基甘氨酸(tbugly)，其略微增強(qiáng)親和力和重要地，其通過空間位阻強(qiáng)烈保護(hù)鄰近氨基酸骨架不被蛋白水解。17-69-07的多位點(diǎn)取代實(shí)現(xiàn)總體蛋白水解保護(hù)前面的部分公開了允許包含蛋白水解穩(wěn)定和/或親和力增強(qiáng)的氨基酸的17-69-07序列中的多個(gè)位置。為了在單個(gè)分子中組合這些修飾，合成了一個(gè)分子，其中合并入tyr1→d-ala1、phe4→1萘基丙氨酸4、gly5→d-ala5、tyr9→4brphe9和ile11→tbugly11取代。值得注意的是，所有的修飾是一致耐受的，并且效力優(yōu)于野生型分子的效力(表10和11)。表10：特異性多取代的結(jié)果預(yù)期在分子的進(jìn)一步開發(fā)期間將效應(yīng)子基團(tuán)連接至這樣的雙環(huán)肽上，用n末端肌氨酸分子間隔子(10個(gè)連續(xù)的sar，表示為sar10)產(chǎn)生各版本，所述間隔子用n末端甘氨酸起始和用c末端丙氨酸終止。為了本實(shí)驗(yàn)的目的，將n末端gly用乙?；舛?，以除去正電荷。表11：g-sar10-a加入后的對(duì)比數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)表明，分子間隔子(如所示與n末端連接)和雙環(huán)核心序列內(nèi)的氨基酸取代均被良好地耐受，因?yàn)樾ЯΡ槐Ａ艋蚋纳?。?2顯示了表11所示分子的非乙?；?非)穩(wěn)定化衍生物。在小鼠和人血漿中定量評(píng)估其穩(wěn)定性，以證明與非穩(wěn)定化的17-69-07-n219相比有改善(圖1)。表12：用于血漿穩(wěn)定性評(píng)估所選擇的分子，相關(guān)的效力圖3a顯示與原始的非穩(wěn)定的野生型分子17-69-07-n219相比，五取代和四取代分子17-69-07-n244和17-69-07-n231分別的小鼠血漿穩(wěn)定性。于37℃，肽在小鼠血漿中的半衰期為>>20小時(shí)，而非增強(qiáng)型野生型分子為6小時(shí)。圖3b顯示與原始的非穩(wěn)定的野生型分子17-69-07-n219相比，五取代和四取代分子17-69-07-n244和17-69-07-n231分別的人血漿穩(wěn)定性。于37℃，肽在小鼠血漿中的半衰期為>>20小時(shí)，而非增強(qiáng)型野生型分子為6小時(shí)?？傊?7-69-07雙環(huán)核心序列(tyr1→d-ala1、phe4→1萘基丙氨酸4、gly5→d-ala5、tyr9→4brphe9和ile11→tbugly11)中多達(dá)5個(gè)位置的靶向取代產(chǎn)生具有增強(qiáng)的效力和顯著改善血漿穩(wěn)定性的優(yōu)異分子。穩(wěn)定的17-69-07衍生物(17-69-07-n241)的選擇性通過fp競(jìng)爭(zhēng)測(cè)試了穩(wěn)定的、含有衍生物17-69-07-n241的分子間隔子對(duì)于來源于其它物種的mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的親和力。數(shù)據(jù)總結(jié)在表13中：表13：17-69-07和衍生物的物種交叉反應(yīng)性人/食蟹猴(kd,nm)狗(kd,nm)小鼠(kd,nm)17-69-07-n2190.820.9nd17-69-07-n2411.211.40.6317-69-07的非穩(wěn)定和穩(wěn)定的衍生物均是完全交叉反應(yīng)的。針對(duì)相關(guān)的人金屬蛋白酶測(cè)試17-69-07-n241的n末端熒光素化衍生物(稱為17-69-07-n258，序列為：熒光素-(bala)-sar10-a-(17-69-07)d-ala11nal4d-ala5tbugly11)。數(shù)據(jù)證明17-69-07核心序列和這種穩(wěn)定的變體對(duì)于mt1-mmp是獨(dú)特的選擇性(表14)。表14：17-69-07和衍生物對(duì)于相關(guān)金屬蛋白酶的選擇性實(shí)施例3：與螯合劑綴合的17-69-07的蛋白水解穩(wěn)定變體的體內(nèi)分析與金屬螯合劑連接的肽在診斷和治療中具有多種應(yīng)用。某些成像或治療放射性同位素可以“負(fù)載”到螯合劑上，而肽將所述同位素?cái)y帶到靶標(biāo)。以這種方式，可以使用例如pet和spect掃描儀來可視化腫瘤特異性抗原。對(duì)于靶向放射治療，將治療性放射性核素(如90y和177lu)加載到螯合劑-肽上，并通過結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原選擇性地?cái)y帶到腫瘤中。在那里，他們通過發(fā)射的高能量輻射發(fā)揮其抗腫瘤活性。螯合物連接的17-69-07雙環(huán)肽的合成合成了五種衍生物，其中金屬螯合劑dota(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸)與17-69-07雙環(huán)肽的n-末端丙氨酸連接。表15：分子和結(jié)構(gòu)的總結(jié)17-69-07-n144是17-69-07的野生型序列，其中dota直接連接到用作一個(gè)氨基酸間隔子的n-末端丙氨酸。該分子保持對(duì)mt1-mmp的完全效力。為了證明在負(fù)載治療/成像放射性核素時(shí)保留效力，用天然(冷)175镥負(fù)載螯合劑作為安全取代物。保留效力。完全穩(wěn)定的變體，17-69-07-n248也在dota綴合物的情況中保留效力。制備對(duì)照分子17-69-07-n246，其為17-69-07-n144的完全d-氨基酸等價(jià)物。該分子對(duì)蛋白水解降解完全耐受，因?yàn)榕cd氨基酸相鄰的酰胺鍵被保護(hù)免受蛋白酶水解，并且其沒有對(duì)mt1-mmp的任何活性。重要的是，該肽保留了完全相同的序列和化學(xué)成分。177lu負(fù)載的17-69-07-n144在ht1080異種移植小鼠中的生物分布將ht-1080細(xì)胞(已知豐富表達(dá)mt1-mmp)皮下接種至雄性6周齡balb/cnu/nu小鼠的右側(cè)軀干中。使腫瘤生長約1周。使用標(biāo)準(zhǔn)絡(luò)合技術(shù)，用1mbq的γ-和β-發(fā)射體177lu負(fù)載150皮摩爾的17-69-07-n144肽。每個(gè)荷瘤小鼠，然后注射150皮摩爾負(fù)載的17-69-07-n144(相當(dāng)于17μg/kg)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)3只動(dòng)物進(jìn)行安樂處死，各種器官和腫瘤切除并稱重，隨后確定每克腫瘤/器官組織的γ輻射計(jì)數(shù)。得到的圖給出了肽在體內(nèi)小鼠中的定位的定量指征。特別地，ht1080腫瘤中的選擇性積累表明體內(nèi)mt1-mmp結(jié)合。圖4總結(jié)了生物分布數(shù)據(jù)。值得注意的是，雙環(huán)肽對(duì)于腫瘤是特異性的，并且似乎持續(xù)長達(dá)24小時(shí)，盡管預(yù)測(cè)的循環(huán)半衰期為14分鐘。這可能表明攝入腫瘤細(xì)胞。在腎臟中顯著的定位是可見的，并且這可能是由于腎臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體瞬時(shí)結(jié)合肽。所有其他器官未顯示對(duì)分子的顯著吸收。值得注意的是，小鼠血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域與人類配對(duì)物具有完全同源性，表明如果小鼠pex在其它地方表達(dá)，則會(huì)觀察到相應(yīng)的信號(hào)。為了評(píng)估異種移植模型中的腫瘤攝取是否是選擇性的并且由于pex結(jié)合，使用肽17-69-07-n246進(jìn)行另外的研究，該肽是17-69-07-n144的d-氨基酸配對(duì)物(圖5)。比較生物分布模式與用活性雙環(huán)肽17-69-07-n144獲得的生物分布模式，顯然mt1-mmp非結(jié)合17-69-07-n246雙環(huán)肽不靶向腫瘤，證實(shí)了17-69-07-n144的腫瘤信號(hào)由體內(nèi)mt1-mmp靶標(biāo)結(jié)合驅(qū)動(dòng)。最后，為了評(píng)估17-69-07序列的蛋白水解穩(wěn)定對(duì)生物分布的影響，在相同的生物分布研究中采用雙環(huán)肽17-69-07-n248(dota-a-(17-69-07)d-ala11nal4d-ala54brphe9tbugly11)(圖6)。令人驚奇的是，與17-69-07-n144相比，肽的增強(qiáng)的蛋白水解穩(wěn)定性在任何給定時(shí)間點(diǎn)導(dǎo)致腫瘤攝取的整體倍增，例證與原始的、非穩(wěn)定化17-69-07序列相比分子的優(yōu)異性質(zhì)。預(yù)期這種效果可以產(chǎn)生有利的治療指數(shù)，無論是使用本實(shí)施例中描述的綴合物的放射性核素靶向治療，還是使用毒素-綴合的雙環(huán)肽(實(shí)施例4)的情況中的放射性核素靶向治療。實(shí)施例4：非穩(wěn)定化雙環(huán)肽與細(xì)胞毒素的綴合對(duì)于靶向癌癥治療，高度有效的細(xì)胞毒性藥物通過可裂解的連接子連接到靶向?qū)嶓w(本文中為雙環(huán)肽)，其結(jié)合腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)。由于其內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)部的能力，選擇過表達(dá)腫瘤相關(guān)的細(xì)胞表面蛋白靶標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞毒性劑-綴合的靶向?qū)嶓w與腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面蛋白結(jié)合時(shí)，整個(gè)分子復(fù)合體內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)部。在從全身循環(huán)過渡到不同的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境之后，細(xì)胞毒素藥物通過細(xì)胞內(nèi)條件從靶向?qū)嶓w裂解，然后裂解的藥物通過細(xì)胞周期停止和其后的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)靶向細(xì)胞死亡，而發(fā)揮其抗腫瘤活性。雙環(huán)肽17-69-07-n219(參見實(shí)施例2和3)由在n-末端側(cè)連接至gly-sar10-ala分子間隔子(g-sar10-a-(17-69-07),其中完整序列描述是g-sar10-a-cynefgcedfydic；seqidno：20)的野生型雙環(huán)核心序列組成。(17-69-07)的該衍生物在0.8nm的kd保持對(duì)mt1-mmp的完全效力(表12)。分子間隔子的n末端側(cè)的游離的、獨(dú)特的氨基被理想地放置以與效應(yīng)子基團(tuán)如高效細(xì)胞毒性物質(zhì)綴合。采用在n末端gly的綴合位點(diǎn)和雙環(huán)核心序列上之間的sar10連接子施加長的分子間距離，以保證與具有顯著分子大小的效應(yīng)子基團(tuán)的綴合后的靶標(biāo)結(jié)合效力的完全保留。只要保持雙環(huán)核心序列對(duì)靶蛋白的效力，可以隨意選擇較短的分子間隔子。為了用靶向mt1-mmp的雙環(huán)肽藥物綴合物(稱為bdc)產(chǎn)生概念數(shù)據(jù)的證明，制備了17-69-07-n219的兩種綴合物，其使用微管聚合抑制毒素dm1(美登素，也稱為n2'-去乙?；?n2'-(3-巰基-1-氧代丙基)-美登素)或mmae(單甲基奧里斯他汀e，也稱為(s)-n-((3r,4s,5s)-1-((s)-2-((1r,2r)-3-(((1s,2r)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-n,3-二甲基-2-((s)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺基)丁酰胺)。mmae綴合物稱為bt17bdc-1，并通過包含自我犧牲的對(duì)氨基芐基-羰基(pabc)基團(tuán)的纈氨酸-瓜氨酸(val-cit)連接子與17-69-07-n219前體分隔。val-cit連接子通過在細(xì)胞內(nèi)溶酶體中遇見的富含組織蛋白酶b的環(huán)境選擇性地裂解(水解)，并且在水解后，pabc犧牲釋放作為活性毒性物質(zhì)的mmae。val-cit-pabc連接子在循環(huán)中是穩(wěn)定的，并且因此僅在細(xì)胞內(nèi)化時(shí)釋放毒素。綴合物的結(jié)構(gòu)以及制備bt17bdc-1的合成方案如方案i所示：方案ibt17bdc-1的結(jié)構(gòu)反應(yīng)方案：用于制備bdc17bdc-1的合成策略：將完全純化的、tmb環(huán)化的17-69-07-n219雙環(huán)前體與戊二?；?纈氨酸-瓜氨酸-對(duì)氨基芐基羰基-mmae(通?？s寫為vc-mmae或val-cit-pabc-mmae)的琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，得到綴合物bdc17bdc-1。17-69-07-n219的dm1綴合物稱為bt17bdc-9，并通過二硫鍵與17-69-07-n219前體分隔，所述二硫鍵可以通過在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中遇到的還原環(huán)境而被裂解。據(jù)信還原通過細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)存在～10mm濃度的谷胱甘肽。相比之下，血液循環(huán)中谷胱甘肽和游離還原劑的濃度要低得多(<10μm)；因此毒素主要在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中釋放，在此其可以展現(xiàn)其細(xì)胞殺傷活性。綴合物的結(jié)構(gòu)以及制備bt17bdc-9的合成方案如方案ii所示：方案iibt17bdc-9的結(jié)構(gòu)反應(yīng)方案：用于制備bdc17bdc-9的合成策略：將含有游離的、n末端胺的完全純化的、tmb環(huán)化的17-69-07-n219雙環(huán)前體與二硫化物-dm1的琥珀酰亞胺酯(結(jié)構(gòu)如所示)反應(yīng)，得到綴合物bdc17bdc-9。因此，bdc17bdc-1和bdc17bdc-9中的毒素的釋放在機(jī)械上是不同的，即前者通過細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解條件，后者通過細(xì)胞內(nèi)的還原條件。兩種bdc用于體外細(xì)胞毒性研究，并在細(xì)胞培養(yǎng)物如ht1080上顯示低的納摩爾/皮摩爾效力(數(shù)據(jù)未顯示)。在體內(nèi)小鼠異種移植模型(攜帶ht1080腫瘤)中，與空白載體對(duì)照相比，兩種bdc在注射后9天后引起腫瘤體積的顯著降低。劑量方案如圖7(箭頭)所示。通過觸診判斷，對(duì)于兩個(gè)bdc在第14天完全清除腫瘤(圖7)。值得注意的是，bdc17bdc-1和bdc17bdc-9的動(dòng)物體重大部分是穩(wěn)定的，表明能夠足以用于治療目的治療窗口。實(shí)施例5：蛋白水解穩(wěn)定的雙環(huán)肽與細(xì)胞毒性劑的綴合含有1位的d-丙氨酸、4位的d-丙氨酸、5位的d-丙氨酸和11位的α-叔丁基甘氨酸修飾的，具有或不具有9位4-溴苯丙氨酸的雙環(huán)核心序列17-69-07，可以增強(qiáng)離體血漿和體內(nèi)的蛋白水解穩(wěn)定性(實(shí)施例2、3)。在雙環(huán)藥物綴合物的情況下，由于降低的全身清除率和在蛋白水解侵襲性腫瘤微環(huán)境中更大的穩(wěn)定性，更穩(wěn)定的雙環(huán)核心序列可能導(dǎo)致更大的腫瘤暴露。兩者均可以產(chǎn)生增加的mt1-mmp驅(qū)動(dòng)的bdc向細(xì)胞內(nèi)吸收，導(dǎo)致治療效果的提高。穩(wěn)定的雙環(huán)肽17-69-07-n241被設(shè)計(jì)為具有與非穩(wěn)定化的17-69-07-n219(在實(shí)施例3和4中描述)整體相似的分子布局。其具有以下序列：(b-ala)-sar10-ac(d-ala)ne(1nal)(d-ala)cedfyd(tbugly)c(seqidno：5)其如前那樣與tbmb環(huán)化。選擇n-末端β-丙氨酸而不是如先前在17-69-07-n219中使用的甘氨酸，以便在與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)酯偶聯(lián)期間，具體地在本實(shí)施例中與細(xì)胞毒性劑的nhs酯偶聯(lián)(方案i、ii)期間最小化二酮哌嗪副產(chǎn)物形成(purdie等人(1973),j.chem.soc.,perkintrans.2,1845)。如在17-69-07-n219中一樣保留肌氨酸十聚體間隔子，以確保雙環(huán)肽與mt1-mmp的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合的完全保留?；趯?shí)施例4中所描述的小鼠異種移植模型中的功效和耐受性，選擇美登素毒素類與17-69-07-n241綴合，并再次選擇二硫鍵可裂解連接子。制備了四種bdc(本文之前稱為bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20)，其中毒素和17-69-07-n241都是不變的，而二硫鍵對(duì)還原/裂解的敏感性通過調(diào)節(jié)鄰近硫原子的阻礙程度來改變。綴合物的合成路線如方案ii所述，其中17-69-07-n219被17-69-07-n241替換。對(duì)于bt17bdc-18，另外的合成路線涉及產(chǎn)生吡啶基-二硫化物雙環(huán)前體(稱為17-69-07-n277)，其與dm1反應(yīng)以形成全綴合物。合成路線描述于方案iii中。方案iiibt17bdc-18的結(jié)構(gòu)反應(yīng)方案用于制備bdc17bdc-18的合成策略：將含有游離的、n末端胺的完全純化的、tmb環(huán)化的17-69-07-n241雙環(huán)前體與spp(n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯))，得到中間體17-69-07-n277。然后將其與作為游離巰基dm1反應(yīng)，得到所需的綴合物bt17bdc-18。bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的體外表征評(píng)估四種bdc的數(shù)種體外參數(shù)，例如對(duì)人類mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的效力的保留，離體小鼠、大鼠和人血漿中的穩(wěn)定性，以及對(duì)還原劑如二硫蘇糖醇的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)總結(jié)在下表16中：表16：bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的體外性質(zhì)其中n/a：不適用(notapplicable)，其中n＝重復(fù)次數(shù)a：使用17-69-07-n040作為示蹤劑，通過熒光偏振競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)確定b：使用定量lc-ms測(cè)定。血漿中孵育時(shí)間長達(dá)24小時(shí)，含有4μmbdc。c：來自kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717。請(qǐng)注意，這些值涉及本文中描述的包含二硫鍵連接子的抗體藥物綴合物d：通過定量lc-ms測(cè)定。請(qǐng)注意，這些值涉及本文中描述的含有二硫鍵連接子的雙環(huán)藥物綴合物。方法從kellogg等(2011)bioconjugatechemistry,22,717修改。e：在fp競(jìng)爭(zhēng)中使用17-69-07-n004作為示蹤劑f：在fp競(jìng)爭(zhēng)中使用17-69-07-n040作為示蹤劑所有分子構(gòu)建體保留其對(duì)血紅素結(jié)合蛋白靶標(biāo)的親和力(第二列)。數(shù)據(jù)表明，血漿穩(wěn)定性取決于二硫鍵的性質(zhì)(如由對(duì)于還原的敏感性所調(diào)節(jié))，而不是雙環(huán)肽的性質(zhì)，因?yàn)樗衎dc均含有相同的雙環(huán)肽(17-69-07-n241)，其在來自三種測(cè)試物種的血漿中是穩(wěn)定的。此外，bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20顯示出足夠治療用途的人血漿中的穩(wěn)定性，因?yàn)槿祟愔性摲肿哟笮〉碾牡念A(yù)期腎臟過濾驅(qū)動(dòng)清除具有預(yù)估2至4小時(shí)的半衰期，其比人血漿中bdc的降解半衰期(>14小時(shí)bt17bdc-18/19/20，參見表16)快幾倍。因此，預(yù)期bdc的大部分將在腎臟中清除，只有一部分在循環(huán)中降解，使得這些bdc可能適合于治療目的。bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的體內(nèi)功效使用人肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系ebc-1，測(cè)試含有穩(wěn)定的雙環(huán)核心序列的所有bdc在體內(nèi)小鼠異種移植模型中的功效。bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19在9天內(nèi)有效并清除腫瘤(圖9、10和11)。bt17bdc-17顯示出良好的功效，但在高劑量下有一些重量減輕。bt17bdc-20雖然基于恒重而被耐受，但是不是有效的，并且僅導(dǎo)致腫瘤大小的邊緣減少(圖12)。取腫瘤體積隨著時(shí)間的曲線下面積(auc)和bdc，并對(duì)于相應(yīng)劑量組作圖(圖13)。由此，可以確定獲得50％腫瘤auc降低(ed50)的有效劑量，其總結(jié)在表17中。表17：bt17bdc-9、bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20獲得50％腫瘤auc降低的有效劑量bdcbt17bdc-9bt17bdc-17bt17bdc-18bt17bdc-19bt17bdc-20ed50a2.1±1.1b1.3±0.6b2.1±0.8b3.1±1.6b22±13baed50±95％置信限b單位為mg/kg，攜帶ebc-1腫瘤的小鼠因此，bt17bdc-9、bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19基于功效是用于靶向癌癥治療的合適分子，并且bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19在有效劑量下具有良好的耐受性。序列表<110>拜斯科醫(yī)療有限公司<120>對(duì)mt1-mmp特異性的雙環(huán)肽配體<130>bic-c-p1803pct<150>gb1419237.1<151>2014-10-29<150>gb1515245.7<151>2015-08-27<160>23<170>patentinversion3.5<210>1<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>xaa可以為任何天然存在的氨基酸<220><221>xaa<222>(3)..(3)<223>xaa代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基或選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基<220><221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>xaa可以為任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(12)..(13)<223>xaa可以為任何天然存在的氨基酸<400>1cysxaaxaaxaaxaaglycysgluaspphetyrxaaxaacys1510<210>2<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>2cystyrasnglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>3<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(1)..(1)<223>xaa為βala<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為sar10<400>3xaaxaaalacystyrasnglupheglycysgluaspphetyraspile151015cys<210>4<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為d-ala<400>4cysxaaasnglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>5<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(1)..(1)<223>xaa為βala<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為sar10<220><221>xaa<222>(5)..(5)<223>xaa為d-ala<220><221>xaa<222>(8)..(8)<223>xaa為nal<220><221>xaa<222>(9)..(9)<223>xaa為d-ala<220><221>xaa<222>(16)..(16)<223>xaa為tbugly<400>5xaaxaaalacysxaaasngluxaaxaacysgluaspphetyraspxaa151015cys<210>6<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為y、m、f或v<220><221>xaa<222>(3)..(3)<223>xaa代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基或選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基<220><221>xaa<222>(4)..(4)<223>xaa代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基或選自d或e的極性、帶負(fù)電荷的氨基酸殘基<220><221>xaa<222>(5)..(5)<223>xaa代表選自f、w和y的非極性芳香族氨基酸殘基<220><221>xaa<222>(12)..(12)<223>xaa代表選自d或e的極性、帶負(fù)電荷的氨基酸殘基<220><221>xaa<222>(13)..(13)<223>xaa代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基<400>6cysxaaxaaxaaxaaglycysgluaspphetyrxaaxaacys1510<210>7<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為y、m、f或v<220><221>xaa<222>(3)..(3)<223>xaa為n或g<220><221>xaa<222>(4)..(4)<223>xaa為e或q<400>7cysxaaxaaxaapheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>8<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為y、m或f<220><221>xaa<222>(3)..(3)<223>xaa為n或g<220><221>xaa<222>(4)..(4)<223>xaa為e或q<400>8cysxaaxaaxaapheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>9<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為y或m<220><221>xaa<222>(4)..(4)<223>xaa為e或q<400>9cysxaaasnxaapheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>10<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>10cysmetasnglnpheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>11<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>11cyspheglyglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>12<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>12cysvalasnglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>13<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>13cyspheasnglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>14<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>14cystyrasnglutyrglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>15<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>15cystyrasnglutrpglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>16<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>16cyslysasnargglypheglycysgluaspphetyraspilecys151015<210>17<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>17cysgluaspphetyraspilecys15<210>18<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>18alacystyrasnglupheglycysgluaspphetyraspilecysala151015<210>19<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>19alacysmetasnglnpheglycysgluaspphetyraspilecysala151015<210>20<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為sar10<400>20glyxaaalacystyrasnglupheglycysgluaspphetyraspile151015cys<210>21<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>21tyrasngluphe1<210>22<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>22tyrasngluphegly15<210>23<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>23gluaspphetyraspile15權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種對(duì)mt1-mmp特異性的肽配體，其包含多肽和分子骨架，所述多肽含有至少三個(gè)半胱氨酸殘基，并被至少兩個(gè)環(huán)序列分隔；所述分子骨架與所述多肽的半胱氨酸殘基形成共價(jià)鍵，使得在所述分子骨架上形成至少兩個(gè)多肽環(huán)，其中所述肽配體包含式(i)的氨基酸序列：-ci-x1-u/o2-x3-x4-g5-cii-e6-d7-f8-y9-x10-x11-ciii-(seqidno:1)(i)或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中：ci、cii和ciii分別代表第一、第二和第三半胱氨酸殘基；x代表任何氨基酸殘基；u代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基；和o代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽配體，其中x1選自任何一種以下氨基酸：y、m、f或v，如y、m或f，特別是y或m，更特別是y。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的肽配體，其中u/o2選自u(píng)，如n，或o，如g。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的肽配體，其中x3選自u(píng)或z，其中u表示選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基，并且z代表選自d或e的極性、帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，特別地3位的u選自q或3位的z選自e。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的肽配體，其中x4選自j，其中j代表選自f、w和y的非極性芳香族氨基酸殘基。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的肽配體，其中x10選自z，其中z代表選自d或e的極性、帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，如d。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的肽配體，其中x11選自o，其中o代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基，如i。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的肽配體，其中式(i)的化合物為式(ia)的化合物：-ci-y/m/f/v-u/o-u/z-j-g-cii-e-d-f-y-z-o-ciii-(seqidno：6)(ia)；其中，u、o、j和z如本文之前所定義；或?yàn)槭?ib)的化合物：-ci-y/m/f/v-n/g-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：7)(ib)；或?yàn)槭?ic)的化合物：-ci-y/m/f-n/g-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：8)(ic)；或?yàn)槭?id)的化合物：-ci-y/m-n-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：9)(id)；或?yàn)槭?ie)的化合物：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)(ie)。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的肽配體，其中式(i)的肽包含選自以下的序列：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)；-ci-m-n-q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-12)(seqidno：10)；-ci-f-g-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-02)(seqidno：11)；-ci-v-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-03)(seqidno：12)；-ci-f-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-04)(seqidno：13)；-ci-y-n-e-y-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07-n057)(seqidno：14)；和-ci-y-n-e-w-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-44-n002)(seqidno：15)；如：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)；和-ci-m-n-q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-12)(seqidno：10)；特別是：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的肽配體，其包括一個(gè)或多個(gè)選自以下的修飾：n-末端修飾和/或c-末端修飾；用一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(例如用一個(gè)或多個(gè)等排或等電子氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)極性氨基酸殘基；用其它非天然的等排或等電子氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸殘基)；加入間隔子基團(tuán)；用一個(gè)或多個(gè)d-氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)l-氨基酸殘基；雙環(huán)肽配體中一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵的n-烷基化；用替代鍵替換一個(gè)或多個(gè)肽鍵；肽骨架長度修飾；用另一個(gè)化學(xué)基團(tuán)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的α-碳上的氫，和用合適的胺、硫醇、羧酸和酚反應(yīng)性試劑合成后生物正交修飾氨基酸如半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸和酪氨酸。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肽配體，其中所述修飾包含使用合適的氨基反應(yīng)性化學(xué)的n-末端修飾，和/或使用合適的羧基反應(yīng)性化學(xué)的c-末端修飾。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的肽配體，其中所述n-末端修飾包含加入有助于效應(yīng)子基團(tuán)綴合和保持雙環(huán)肽對(duì)其靶標(biāo)的效力的分子間隔子基團(tuán)，例如ala、g-sar10-a或bala-sar10-a基團(tuán)。13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的肽配體，其中所述n-末端修飾和/或c-末端修飾包含加入細(xì)胞毒性劑。14.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述的肽配體，其包含在1位和/或9位氨基酸處的修飾。15.根據(jù)權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)所述的肽配體，其包含用一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的肽配體，其中所述非天然氨基酸殘基取代于4位并且選自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸和高苯丙氨酸，如1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯丙氨酸；特別是1-萘基丙氨酸。17.根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的肽配體，其中所述非天然氨基酸殘基取代于9位和/或11位并且選自：對(duì)于9位為4-溴苯丙氨酸或五氟-苯丙氨酸和/或?qū)τ?1位為叔丁基甘氨酸。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的肽配體，其中所述非天然氨基酸殘基，如存在于9位的那些，選自：4-溴苯丙氨酸。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的肽配體，其中所述非天然氨基酸殘基，如存在于11位的那些，選自：叔丁基甘氨酸。20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的肽配體，其包含多個(gè)修飾，例如2、3、4或5個(gè)或更多個(gè)以下修飾，特別是所有以下5個(gè)修飾：1位和/或5位的d-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸，9位的4-溴苯丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。21.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肽配體，其中將1位的氨基酸殘基取代為d-氨基酸，例如d-丙氨酸。22.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肽配體，其中將5位的氨基酸殘基取代為d-氨基酸，例如d-丙氨酸或d-精氨酸。23.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的肽配體，其中所述藥學(xué)上可接受的鹽選自游離酸或鈉、鉀、鈣、銨鹽。24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的肽配體，其為人、小鼠和狗的mt1-mmp血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的高親和力結(jié)合劑。25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的肽配體，其對(duì)于mt1-mmp是選擇性的，但不與mmp-1、mmp-2、mmp-15和mmp-16交叉反應(yīng)。26.一種藥物綴合物，其包含與一種或多種效應(yīng)子和/或官能團(tuán)綴合的根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的肽配體。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物綴合物，其中所述效應(yīng)子和/或官能團(tuán)包含細(xì)胞毒性劑或金屬絡(luò)合劑。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物綴合物，其中所述細(xì)胞毒性劑通過可裂解鍵如二硫鍵或蛋白酶敏感鍵與雙環(huán)肽連接。29.根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的藥物綴合物，其中所述細(xì)胞毒性劑選自具有以下結(jié)構(gòu)的dm1：或具有以下結(jié)構(gòu)的mmae：30.根據(jù)權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)所述的藥物綴合物，其為具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：31.根據(jù)權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)所述的藥物綴合物，其為具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：32.根據(jù)權(quán)利要求27至權(quán)利要求28所述的藥物綴合物，其中所述細(xì)胞毒性劑為美登素并選自式(ii)的化合物：其中n代表選自1至10的整數(shù)；和r1和r2獨(dú)立地代表氫、c1-6烷基或碳環(huán)基或雜環(huán)基，如氫或甲基。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物綴合物，其中：n代表1，并且r1和r2均代表氫(即美登素衍生物dm1)；或n代表2，r1代表氫且r2代表甲基(即美登素衍生物dm3)；或n代表2，并且r1和r2均代表甲基(即美登素衍生物dm4)。34.根據(jù)權(quán)利要求26至33所述的藥物綴合物，其中綴合物的雙環(huán)肽組分具有式(iii)所示的結(jié)構(gòu)：其中m代表選自0至10的整數(shù)，和r3和r4獨(dú)立地代表氫、c1-6烷基或碳環(huán)基或雜環(huán)基，如氫或甲基。35.根據(jù)權(quán)利要求27至34所述的藥物綴合物，其中通過式(v)定義的連接子將細(xì)胞毒性劑與雙環(huán)肽連接：其中r1、r2、r3和r4代表氫、c1-6烷基或碳環(huán)基或雜環(huán)基，如氫或甲基；毒素指任何合適的細(xì)胞毒性劑；雙環(huán)代表根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的肽配體；n代表選自1至10的整數(shù)；和m代表選自0至10的整數(shù)。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥物綴合物，其中化合物(iv)的毒素為美登素，并且綴合物包含式(v)的化合物：其中r1、r2、r3和r4代表氫、c1-6烷基或碳環(huán)基或雜環(huán)基；雙環(huán)代表根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的肽配體；n代表選自1至10的整數(shù)；和m代表選自0至10的整數(shù)。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的藥物綴合物，其中：n代表1并且r1、r2、r3和r4各自代表氫，即式(v)a的化合物：n代表1，r1代表甲基，并且r2、r3和r4各自代表氫，即式(v)b的化合物：n代表2，r1和r2均代表氫，并且r3和r4均代表甲基，即式(v)c的化合物：n代表2，r1和r3均代表甲基，并且r2和r4均代表氫，即式(v)d的化合物：38.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27所述的藥物綴合物，其選自：bt17bdc-9：bt17bdc-17：bt17bdc-18：bt17bdc-19：和bt17bdc-20：如bt17bdc-9、bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19，特別是bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19。39.一種制備根據(jù)權(quán)利要求38所述的藥物綴合物的方法，其包括如方案i、ii、iii中任一項(xiàng)所描述的合成路徑。40.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的肽配體或根據(jù)權(quán)利要求26至38中任一項(xiàng)所述的藥物綴合物，和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。41.根據(jù)權(quán)利要求26至38中任一項(xiàng)所述的藥物綴合物，其用于預(yù)防、抑制或治療癌癥，特別是實(shí)體瘤如非小細(xì)胞肺癌的用途。當(dāng)前第1頁12