專利名稱：一種實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及教學(xué)用實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，具體說是一種適合醫(yī)學(xué)院校生物化學(xué)專業(yè)和綜合院校生物學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)用的人工血清。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)用得最多的標(biāo)本是血清，而血清標(biāo)本來源困難。血庫血清一般用于臨床病人，資源珍貴，難以求購，且價(jià)格昂貴；采集動(dòng)物血清或因消耗量大、所需動(dòng)物較多或因測定值與人體血清相差甚遠(yuǎn)而不宜采用。因此，實(shí)驗(yàn)多采用醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)殘剩血清，但又難以保證供應(yīng)，并且臨床檢驗(yàn)血清來自于各種各樣的病人，由于學(xué)生實(shí)驗(yàn)技術(shù)尚不熟練，在實(shí)驗(yàn)過程中極易造成實(shí)驗(yàn)室污染和學(xué)生感染。目前尚無理想的血清標(biāo)本用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、可以人工配制、無污染的血清，以滿足一些生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)需要。
糖、脂肪、蛋白質(zhì)(酶)、離子不僅是人體構(gòu)筑成分，也是重要的生物能源物質(zhì)，尤其是酶在人體代謝中發(fā)揮著重要作用，在某些病變時(shí)其含量變化常常能在血清中反應(yīng)出來。因此每個(gè)醫(yī)學(xué)院校的學(xué)生都必需熟悉和掌握其代謝規(guī)律，了解和熟練其檢測方法。在醫(yī)學(xué)生物化學(xué)中測定四類的實(shí)驗(yàn)占了相當(dāng)比重，為此我們制備的血清以該四類作為主要指標(biāo)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，以牛肉蛋白胨為基液，分別加入人體血清組成成分如葡萄糖(G)、甘油三酯(TG)、膽固醇(Chol)、丙氨酸氨基移換酶(ALT)、K+、Na+、Cl-、尿素(Urea)和維生素B1(VitB1)等各項(xiàng)待測成分，制成所需待測濃度的單一成分或混合成分的人工血清，其中，牛肉蛋白胨在人工血清中的含量為0.5～2g/dL。
測定蛋白濃度的單一成分人工血清的組成為100ml生理鹽水中含有1.0～2.0g牛肉蛋白胨。
測定血糖(G)濃度的單一成分人工血清的組成為100ml濃度為0.5～2g/dL的牛肉蛋白胨中含有40～300mg的葡萄糖。
測定血脂濃度的單一成分人工血清為100ml人工血清中含有0.5～2g的牛肉蛋白胨和5ml濃度分別為6～60mg/ml甘油三酯(TG)和10～80mg/ml膽固醇(Chol)的異丙醇溶液。
測定鈉離子(Na+)和氯離子(Cl-)濃度的單一成分人工血清的組成為100ml濃度為0.5～2g/dL的牛肉蛋白胨中含有550～869mg的氯化鈉。
測定丙氨酸氨基移換酶(ALT)濃度的單一成分人工血清由下述方法制得取動(dòng)物肝臟0.1～1.0g，用勻漿器加少許0.1molPH7.4磷酸緩沖溶液(PBS)研磨成肝勻漿，再用PBS稀釋至5～10ml，2500rpm離心8分鐘，取0.1～8ml上清液，經(jīng)測定，加入0.1mol PH7.4的PBS稀釋至待測ALT濃度，最后加入牛肉蛋白胨，使牛肉蛋白胨的濃度為0.5～2g/dL，制得測定ALT濃度的人工血清。
測定尿素(Urea)濃度的單一成分人工血清的組成為100ml濃度為0.5～2g/dL的牛肉蛋白胨中含有12～84mg的Urea。
測定維生素B1(VitB1)的單一成分人工血清的組成為100ml濃度為0.5～2g/dL的牛肉蛋白胨中含有0.05～1g的鹽酸硫胺素。
所述混合成分的人工血清由下述方法制得用異丙醇溶解TG和Chol，使TG和Chol的濃度分別為6～60mg/ml和10～80mg/ml，取上述溶液5ml，用0.1mol PH7.4PBS稀釋至40～70ml，加入0.5～2g牛肉蛋白胨、40～300mg的葡萄糖及肝勻漿液，肝勻漿液的加入量使血清中ALT的濃度在1～40單位，最后用0.1mol PH7.4PBS稀釋至100ml。
所述混合成分的人工血清，由下述方法制得用濃度為0.525～2.1g/dL的牛肉蛋白胨溶液溶解550～807mg NaCl、1～60mg KCl和40～300mg葡萄糖，加入5ml含有濃度分別為6～60mg/ml甘油三酯和10～80mg/ml膽固醇的異丙醇溶液，再加入上述蛋白胨溶液至終容積100ml。
如制備正常值或低于正常值范圍的測定離子用人工血清，不能與含鈉、鉀離子多的緩沖溶液制備的ALT一起制成混合血清，如制備鈉、鉀離子濃度高的血清，需經(jīng)過嚴(yán)格計(jì)算后制備。或者用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液等制備混合血清，如用異丙醇溶解甘油三酯和膽固醇，使甘油三酯和膽固醇的濃度分別為6～60mg/ml和10～80mg/ml，取上述溶液5ml，用0.1mol Tris緩沖溶液稀釋至40～70ml，加入0.5～2g牛肉蛋白胨和肝勻漿液，肝勻漿液的加入量使血清中ALT的濃度在1～40單位，再加入40～300mg的葡萄糖、550～807mg NaCl和1～60mg KCl，最后用0.1mol Tris緩沖溶液定容至100ml。
由于人體血清構(gòu)成成分較多，且每一成分的含量因正?；虍惓６煌?，甚至因人而異，故本發(fā)明僅以制備蛋白、G、TG、Chol、ALT、K+、Na+、Cl-、Urea和Vit B1實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清為例，除此之外，尚可應(yīng)用本發(fā)明的方法制備其它任意需要成分及濃度的人工血清，如半乳糖、蔗糖、丙酮酸等糖類及其代謝物，谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶等酶類，Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、P等離子類，維生素A、E(Vit E)等維生素類，以及膽紅素、肌酐、尿素代謝產(chǎn)物等。
本發(fā)明由牛肉蛋白胨及其濃度決定人工血清的外觀與蛋白含量。正常血清的外觀澄清、淡黃、具有一定粘度，0.5～2g/dL濃度的牛肉蛋白胨溶液從外觀上也呈現(xiàn)澄清、淡黃、有一定粘度的特點(diǎn)，與人體血清相似，故被選作人工血清的基液。
本發(fā)明應(yīng)用動(dòng)物肝臟制備ALT血清，尚可應(yīng)用動(dòng)物的腎臟、心臟等制備。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明解決了實(shí)驗(yàn)教學(xué)血清來源困難的問題。所提供的實(shí)驗(yàn)教學(xué)人工血清的制備方法，簡單、易行，可以根據(jù)需要，制備任意需要值的人工血清，從根本上解決了實(shí)驗(yàn)教學(xué)血清來源困難的問題，滿足了生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要。本發(fā)明所制備的實(shí)驗(yàn)教學(xué)人工血清，其原料潔凈、無病原菌，故在使用過程中不會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室污染。本發(fā)明以牛肉蛋白胨為基液，應(yīng)用動(dòng)物肝臟制備ALT血清，應(yīng)用一至數(shù)種化學(xué)試劑、生物制劑制備所需要的血清，成本低，隨用隨取，標(biāo)本新鮮，從而節(jié)省了大量的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和人力物力。


圖1為人工血清蛋白測定曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 測定蛋白濃度單一成分血清的制備(基液)分別稱取0.5、1.0、2.0、4.0g牛肉蛋白胨(本發(fā)明采用北京紅星生物化學(xué)制品廠生產(chǎn)的牛肉蛋白胨，其值相應(yīng)產(chǎn)生，其他廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品也可以應(yīng)用，各值應(yīng)進(jìn)一步測定后確定)溶于100ml生理鹽水中，制成不同蛋白濃度的單一成分的人工血清。
實(shí)施例2 測定ALT濃度單一成分血清的制備將小白鼠脫頸椎處死，立即剖腹取出肝臟，稱取0.7g，用玻璃勻漿器加少許0.1molPH7.4PBS研磨成勻漿，再用PBS稀釋至10ml，2500rpm離心8分鐘，取上清液0.6ml，加PBS至10ml，經(jīng)測定稀釋濃度為23單位，最后加入蛋白胨，使牛肉蛋白胨的濃度為1.0g/dL。
本實(shí)施例采用小白鼠肝臟是因?yàn)樾“资笠椎?，成本低，隨用隨取，標(biāo)本新鮮，尚可使用其它動(dòng)物的肝臟。
實(shí)施例3 測定血糖用單一成分血清的制備精稱100mg葡萄糖(購于化學(xué)試劑商店，國產(chǎn)試劑，分析純)溶于100ml濃度為1g/dL的蛋白胨溶液中。
實(shí)施例4 測定血脂用單一成分血清的制備用異丙醇溶解TG、Chol(均購于化學(xué)試劑商店，國產(chǎn)試劑，分析純)，并配制濃度為17.71mg/ml TG、37.89mg/ml Cho l的貯存液，取5ml貯存液加到95ml濃度為1g/dL蛋白胨溶液中，迅速混勻。
實(shí)施例5 測定K+濃度的血清的制備精稱12mg氯化鉀(KCl)(購于化學(xué)試劑商店，國產(chǎn)試劑，分析純)，溶于100ml濃度為1g/dL的蛋白胨溶液中。
實(shí)施例6 測定鈉、氯離子(Na+、Cl-)濃度的單一成分血清的制備精稱620mg氯化鈉(NaCl)(購于化學(xué)試劑商店，國產(chǎn)試劑，分析純)，溶于100ml 1g/dL蛋白胨溶液中。
實(shí)施例7 測定urea濃度血清的制備取5ml 100mmol/L Urea貯存液(Urea購于化學(xué)試劑商店，國產(chǎn)試劑，分析純)，用濃度為0.525～2.1g/dL的牛肉蛋白胨溶液稀釋至100ml。
實(shí)施例8 測定維生素B1血清的制備稱取0.2g鹽酸硫胺素(購于化學(xué)試劑商店，國產(chǎn)試劑，分析純)，溶于100ml濃度為1g/dL的蛋白胨溶液中。
實(shí)施例9 混合成分血清的制備混合血清1取5ml含有濃度分別為17.71mg/ml TG和37.89mg/ml Chol的異丙醇溶液，用0.1molPH7.4的PBS稀釋至40ml，加入1g牛肉蛋白胨及100mg G及小白鼠肝勻漿液，經(jīng)測定調(diào)整肝勻漿液的用量，使血清中ALT的濃度為23單位，最后用PBS稀釋至100ml并混勻。
混合血清2用濃度為1g/dL的牛肉蛋白胨溶液溶解100mg G、12mg KCl、620mgNaCl和5ml含有濃度分別為17.71mg/ml TG和37.89mg/ml Chol的異丙醇溶液，終容積為100ml。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.外觀濃度從0.5g/dL至2g/dL的蛋白胨溶液均為均勻、澄清、淡黃色和有一定粘度，只是顏色逐漸加深。制成單一成分標(biāo)本后，ALT、G、離子、Urea、Vit B1仍同濃度為1g/dL蛋白胨溶液的外觀，血脂標(biāo)本色澤略深，但仍似血清的外觀。
2.單一成分血清測定結(jié)果人工血清蛋白測定的光密度(OD)值見表1，以O(shè)D為縱座標(biāo)，以加樣量為橫座標(biāo)，繪制的測定曲線見圖1。
表1 人工血清蛋白測定結(jié)果(OD)

由圖1可以看出，隨著蛋白胨濃度增大、加樣量增加，OD值也在增加，0.5～2g/dL濃度曲線均為直線，適合教學(xué)用；4g/dL濃度難以成直線，不宜采用。正常血清蛋白含量為6～8g/dL，我們在實(shí)驗(yàn)中常常采用1∶5～1∶10稀釋血清進(jìn)行測定，從濃度上看符合1～2g/dL蛋白胨濃度，因此，可選用1～2g/dL蛋白胨濃度做工作濃度。
人工血清G、TG、Chol、ALT、K+、Na+、Cl-、VitB1、Urea測定結(jié)果見表2，將第3天、5天和14天測定結(jié)果分別與第1天測定結(jié)果進(jìn)行比較，用隨機(jī)取組統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法分析，ALT第14天F＝4.65，P＜0.05，有顯著性差異，其它各成分測定結(jié)果均無顯著性差異(P＞0.05)。
表2單一成分人工血清不同時(shí)間測定結(jié)果

*P＜0.053.混合標(biāo)本實(shí)驗(yàn)所需各成分測定結(jié)果見表3仍然用第3天、5天和14天測定結(jié)果分別與第1天測定結(jié)果進(jìn)行比較，人工血清G、TG、Chol、K+、Na+、Cl-測定結(jié)果均無顯著性差異(P＞0.05)，ALT第5天和第14天測定結(jié)果均有顯著性差異F＝11.91，P＜0.05，而第3天無顯著性差異(P＞0.05)。
表3混合成分人工血清不同時(shí)間測定結(jié)果

*P＜0.05單一成分血清用于測定單項(xiàng)指標(biāo)以及觀察基液(蛋白胨及其雜質(zhì))是否對實(shí)驗(yàn)成分產(chǎn)生影響，混合標(biāo)本用于測定多個(gè)成分，同時(shí)觀察成分與成分之間、成分與溶劑之間是否會(huì)相互影響。G、Urea、VitB1測定值無論是單一成分血清還是混合成分血清都與第一天(即制備濃度)相差不大，說明時(shí)間及各種因素對其影響較小，人工血清可以使用。TG測定值從時(shí)間上看第3、5、14天與第一天相比均無顯著性差異，從濃度上看均高于制備濃度，經(jīng)對照實(shí)驗(yàn)證明是蛋白胨所致。由于TG正常值為0.56-1.70mmol/L，人工血清仍在正常值范圍內(nèi)，且可控制，所以該血清可以用于生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)。Chol測定，從時(shí)間上無顯著性差異，從測定值上看符合制備濃度，條件穩(wěn)定，適合生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)使用。ALT的酶活性隨著時(shí)間延長在逐漸降低，混合標(biāo)本在第5、14天時(shí)與第一天相比有顯著性差異，單一成分標(biāo)本只在第14天時(shí)才有顯著性差異，ALT正常值為5-25卡門單位，從表2、3可以看出，盡管在第5、14天時(shí)ALT值在降低，但仍在正常值低線以上，不影響學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果。并且從以往的實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，時(shí)間再延長ALT活性降低的速度也大大減慢，至半年左右仍在血清正常范圍內(nèi)，可以應(yīng)用于學(xué)生教學(xué)實(shí)驗(yàn)。
測定方法參考中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司編《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第二版 南京東南大學(xué)出版社1997.05。其中外觀測定采用目測法；蛋白濃度測定采用雙縮脲法；G測定采用鄰甲苯胺法；TG測定采用異丙醇抽提乙酰丙酮法；Chol測定采用異丙醇抽提高鐵-硫酸顯色法(修改的LRC法)；ALT測定采用比色法；K+、Na+測定采用火焰光度法；Cl-測定采用硫氰酸汞比色法；Urea測定采用二乙酰一肟顯色法；維生素B1測定采用熒光法(定性實(shí)驗(yàn))。在混合標(biāo)本測定中，血脂、G、ALT測定采用混合標(biāo)本1，離子測定采用混合標(biāo)本2。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于以牛肉蛋白胨為基液，分別加入人體血清組成成分如葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、丙氨酸氨基移換酶、維生素B1、尿素和鉀、鈉、氯離子各項(xiàng)待測成分，制成所需待測濃度的單一成分或混合成分的人工血清，其中，牛肉蛋白胨在人工血清中的含量為0.5～2g/dL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于測定蛋白濃度的單一成分人工血清的組成為100ml生理鹽水中含有1.0～2.0g牛肉蛋白胨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于測定血糖濃度的單一成分人工血清的組成為100ml濃度為0.5～2g/dL的牛肉蛋白胨中含有40～300mg的葡萄糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于測定血脂濃度的單一成分人工血清為100ml人工血清中含有0.5～2g的牛肉蛋白胨和5ml濃度分別為6～60mg/ml甘油三酯和10～80mg/ml膽固醇的異丙醇溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于測定Na+和Cl-濃度的單一成分人工血清的組成為100ml濃度為0.5～2g/dL的牛肉蛋白胨中含有550～869mg的氯化鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于測定丙氨酸氨基移換酶濃度的單一成分人工血清由下述方法制得取動(dòng)物肝臟0.1～1.0g，用勻漿器加少許0.1mol PH7.4磷酸緩沖溶液研磨成肝勻漿，再用磷酸緩沖溶液稀釋至5～10ml，2500rpm離心8分鐘，取0.1～8ml上清液，經(jīng)測定，加入0.1mol PH7.4的磷酸緩沖溶液至待測丙氨酸氨基移換酶濃度，最后加入牛肉蛋白胨，使牛肉蛋白胨的濃度為0.5～2g/dL，制得測定丙氨酸氨基移換酶濃度的人工血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于測定尿素濃度的單一成分人工血清的組成為100ml濃度為0.5～2g/dL的牛肉蛋白胨中含有12～84mg的尿素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于測定維生素B1的單一成分人工血清的組成為100ml濃度為0.5～2g/dL的牛肉蛋白胨中含有0.05～1g的鹽酸硫胺素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于所述混合成分的人工血清由下述方法制得用異丙醇溶解甘油三酯和膽固醇，使甘油三酯和膽固醇的濃度分別為6～60mg/ml和10～80mg/ml，取上述溶液5ml，用0.1mol PH7.4磷酸緩沖溶液稀釋至40～70ml，加入0.5～2g牛肉蛋白胨、40～300mg的葡萄糖及肝勻漿液，肝勻漿液的加入量使血清中丙氨酸氨基移換酶的濃度在1～40單位，最后用0.1mol PH7.4磷酸緩沖溶液稀釋至100ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，其特征在于所述混合成分的人工血清由下述方法制得用濃度為0.525～2.1g/dL的牛肉蛋白胨溶液溶解550～807mg NaCl、1～60mg KCl和40～300mg葡萄糖，加入5ml含有濃度分別為6～60mg/ml甘油三酯和10～80mg/ml膽固醇的異丙醇溶液，再加入上述蛋白胨溶液至終容積100ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及教學(xué)用實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，具體說是一種適合醫(yī)學(xué)院校生物化學(xué)專業(yè)和綜合院校生物學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)用人工血清，本發(fā)明是以牛肉蛋白胨為基液，加入人體血清組成成分的各項(xiàng)待測成分，制成所需待測濃度的單一成分或混合成分的人工血清，其中，牛肉蛋白胨在人工血清中的含量為0.5～2g/dL；本發(fā)明以制備蛋白、G、TG、Chol、ALT、K
文檔編號G01N33/48GK1786682SQ20041008292
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者張志芬, 韓維田, 鄒黎明, 伊德林, 姜淑華 申請人:張志芬