專利名稱：保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于保健食品功能檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
1956年英國D.Harman提出了衰老的自由基學(xué)說，1957年發(fā)表了第一篇研究報(bào)告，闡述用含0.5％～1％自由基清除劑的飼料喂養(yǎng)小鼠可延長壽命。所謂自由基，是指帶有未成對(duì)電子的分子、原子、或離子。由于未成對(duì)電子總是有成雙成對(duì)的趨向，因此自由基很容易發(fā)生失去或得到電子的反應(yīng)而顯示出活潑的化學(xué)性質(zhì)。羥自由基(·OH)是目前所知各種自由基中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種。它可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，使細(xì)胞壞死或突變。
近年來，隨著抗衰老、抗氧化研究的不斷深入，利用中草藥，保健食品清除羥自由基的研究逐步開展起來。2002年，李會(huì)軍等用生物化學(xué)發(fā)光法測(cè)定金銀花類中藥提取物清除自由基的作用；李貴榮以紫外和可見分光光度法試驗(yàn)觀察野菊花多糖對(duì)模型中產(chǎn)生的O-2·和·OH的影響；靳菊情等應(yīng)用Fonten反應(yīng)測(cè)定銀杏葉多糖對(duì)·OH的清除作用；許申鴻等用化學(xué)發(fā)光法對(duì)三株口服液，昂立一號(hào)等五種保健品清除自由基作用做了測(cè)定。先宏對(duì)很多中藥抗氧化、清除自由基作用做了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)很多黃酮類，酚類，皂苷類，多糖類中草藥或天然植物均有較好的清除自由基作用。
但目前保健食品清除羥自由基的實(shí)驗(yàn)主要是體外實(shí)驗(yàn)，即在試管中產(chǎn)生羥自由基，加入受試物后觀察羥自由基含量的變化。羥自由基在生物體內(nèi)濃度低，壽命短，因而檢測(cè)困難。而體內(nèi)測(cè)定羥自由基方法目前則是通過測(cè)定MDA、脂褐質(zhì)等自由基攻擊產(chǎn)物間接評(píng)價(jià)體內(nèi)自由基水平。缺少一種通過直接測(cè)定體內(nèi)羥自由基，評(píng)價(jià)抗氧化保健食品的功能檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述不足，本發(fā)明提供一種迅速準(zhǔn)確的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，其步驟如下一、用所述保健食品喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50天；二、給所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用尾靜脈注射水楊酸鈉反應(yīng)一段時(shí)間；三、選用所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織，用高效液相色譜儀和紫外檢測(cè)器分離，檢測(cè)由水楊酸捕獲羥自由基后產(chǎn)生的2，5-DHBA含量。
在所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法中，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為10月齡以上昆明種小鼠。
在所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法中，給所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射水楊酸鈉5-90分鐘后，取出所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織。
在所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法中，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織為肝臟、腦或心臟。
在所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法中，所述水楊酸鈉的濃度為60mg/ml，以小鼠體重的0.5％作為水楊酸鈉注射量進(jìn)行注射。
受試物(保健食品)經(jīng)口服喂養(yǎng)＞10月齡小鼠50天后，采用尾靜脈注射法注射水楊酸鈉(小鼠體重的0.5％，水楊酸鈉濃度60mg/ml)，反應(yīng)60分鐘后處死動(dòng)物，取肝組織經(jīng)高效液相色譜儀和紫外檢測(cè)器分離、檢測(cè)由水楊酸捕獲羥自由基后產(chǎn)生的2，5-DHBA，將結(jié)果與對(duì)照組比較，由此判定該受試物是否具有清除體內(nèi)羥自由基的功能。


圖1為2，5-DHBA隨自由基捕獲時(shí)間變化曲線圖。
具體實(shí)施例方式
1.實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種雌性小鼠，11月齡。
實(shí)驗(yàn)用小鼠購自軍科院動(dòng)物所，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物均在SPF級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)。
1.2儀器美國Beckman SystemGOLD高效液相色譜儀406色譜泵，166紫外檢測(cè)器，色譜處理系統(tǒng)SYSTEM-GOLD；高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；AR2130電子天平，奧旁斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；KQ-100型超聲波清洗器，昆山是超聲儀器有限公司。組織勻漿器1.3試劑甲醇-色譜純2，5-二羥基苯甲酸(以下簡稱2，5-DHBA)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司抗壞血酸(維生素C，Vc)、國產(chǎn)分析純水楊酸鈉、高氯酸、檸檬酸、無水乙酸鈉均為國產(chǎn)分析純。
實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸超純水紅景天苷(紅景天粗提物)2.水楊酸捕獲法測(cè)定小鼠體內(nèi)羥自由基含量的基本原理水楊酸鹽(SAL，salicylate)可作為·OH的捕獲劑，水楊酸與·OH反應(yīng)速度極快5×109-10×1010M-1S-1；水楊酸不是生物體的內(nèi)源性物質(zhì)，其代謝產(chǎn)物不易被機(jī)體進(jìn)一步代謝。由于水楊酸(2-羥基苯甲酸，2-HBA)無毒，其羥化產(chǎn)物DHBA(二羥基苯甲酸)便于分析。水楊酸在體內(nèi)代謝過程中，主要與·OH生成2，3-和2，5-DHBA兩種產(chǎn)物，體內(nèi)2，5-DHBA的生成量隨水楊酸劑量的增加而增加。由于個(gè)體差異，水楊酸的分布和濃度可能會(huì)在不同個(gè)體間有所差異，從而造成個(gè)體間DHBA的絕對(duì)生成量差異較大，因此要用DHBA/水楊酸的比例表示體內(nèi)·OH的含量。由于2，5-DHBA生成量較大，反應(yīng)比較靈敏，因此選取2，5-DHBA作為檢測(cè)對(duì)象，且用2，5-DHBA與水楊酸的比例來表示體內(nèi)羥自由基的含量(以下定義為Q，即Q＝2，5-DHBA/水楊酸，比例為色譜的峰面積比)。
3實(shí)驗(yàn)方法
3.1小鼠體內(nèi)羥自由基的測(cè)定以尾靜脈注射和腹腔注射兩種方式對(duì)小鼠注射水楊酸鈉(60mg/ml，反應(yīng)不同時(shí)間后用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速置于冰盤上取出待測(cè)組織，稱重后以1∶3(w/v)加0.1mol/L的高氯酸后用組織勻漿器在冰水浴中勻漿3min，以終止酶系反應(yīng)且除去雜蛋白。得到的勻漿液立即離心(4℃，10000r/m，15min)，上清經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾后準(zhǔn)備HPLC分析。
取上述前處理過的勻漿液上清進(jìn)行HPLC分析色譜柱為C18(反向碳-18)色譜柱(150mm×4.6mm ID，5μm)，柱溫為室溫。流動(dòng)相為0.2mol/L檸檬酸∶0.2mol/L乙酸鈉∶甲醇＝2∶2∶1(v/v)，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長305nm，每次進(jìn)樣量為20μl。
標(biāo)準(zhǔn)品的配置精確稱取2，5-DHBA標(biāo)準(zhǔn)品3mg，定容至50ml，用0.2mol/L檸檬酸∶0.2mol/L乙酸鈉(v/v)溶液溶解，配成60μg/ml(6.0×10-10g/μl)的標(biāo)準(zhǔn)品，置-20℃冰箱避光保存。
以2，5-DHBA標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)色譜結(jié)果用GOLD軟件對(duì)樣品出峰時(shí)間和峰面積進(jìn)行分析，最后用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。
3.2水楊酸鈉給藥方式的選擇11月齡小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，每組5只。以小鼠體重的0.5％作為水楊酸鈉(60mg/ml)注射量進(jìn)行注射一組用腹腔注射法注射水楊酸鈉，而另一組用尾靜脈注射法注射。注射后60min處死小鼠取肝組織，稱重后以1∶3(w/v)加0.1mol/L的高氯酸后用組織勻漿器在冰水浴中勻漿3min，以終止酶系反應(yīng)且除去雜蛋白。得到的勻漿液立即離心(4℃，10000r/m，15分鐘)，上清經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾后準(zhǔn)備HPLC分析。
取上述前處理過的勻漿液上清進(jìn)行HPLC分析色譜柱為C18(反向碳-18)色譜柱(150mm×4.6mm ID，5μm)，柱溫為室溫。流動(dòng)相為0.2mol/L檸檬酸∶0.2mol/L乙酸鈉∶甲醇＝2∶2∶1(v/v)，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長305nm，每次進(jìn)樣量為20μl。
標(biāo)準(zhǔn)品的配置精確稱取2，5-DHBA標(biāo)準(zhǔn)品3mg，定容至50ml，用0.2mol/L檸檬酸∶0.2mol/L乙酸鈉(v/v)溶液溶解，配成60μg/ml(6.0×10-10g/μl)的標(biāo)準(zhǔn)品，置-20℃冰箱避光保存。
以2，5-DHBA標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)色譜結(jié)果用GOLD軟件對(duì)樣品出峰時(shí)間和峰面積進(jìn)行分析，最后用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。
3.3水楊酸捕獲時(shí)間的選擇11月齡小鼠25只，隨機(jī)分為5組，每組5只。以小鼠體重的0.5％作為水楊酸鈉(60mg/ml)注射量進(jìn)行尾靜脈注射。然后按照分組號(hào)，分別于注射水楊酸鈉后5分鐘，15分鐘，35分鐘，60分鐘，90分鐘的不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取肝組織，作為對(duì)水楊酸捕獲時(shí)間的觀察。
3.4實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物組織的選擇11月齡小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。以小鼠體重的0.5％作為水楊酸鈉(60mg/ml)注射量進(jìn)行尾靜脈注射，反應(yīng)60分鐘后用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速置于冰盤上取出組織，根據(jù)分組不同，分別取出肝臟，腦和心臟三種組織。稱重后以1∶3(w/v)加0.1mol/L的高氯酸后用組織勻漿器在冰水浴中勻漿3分鐘，以終止酶系反應(yīng)且除去雜蛋白。得到的勻漿液立即離心(4℃，10000r/m，15min)，上清經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾后準(zhǔn)備HPLC分析。
取上述前處理過的勻漿液上清進(jìn)行HPLC分析色譜柱為C18(反向碳-18)色譜柱(150mm×4.6mm ID，5μm)，柱溫為室溫。流動(dòng)相為0.2mol/L檸檬酸∶0.2mol/L乙酸鈉∶甲醇＝2∶2∶1(v/v)，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長305nm，每次進(jìn)樣量為20μl。
標(biāo)準(zhǔn)品的配置精確稱取2，5-DHBA標(biāo)準(zhǔn)品3mg，定容至50ml，用0.2mol/L檸檬酸∶0.2mol/L乙酸鈉(v/v)溶液溶解，配成60μg/ml(6.0×10-10g/μl)的標(biāo)準(zhǔn)品，置-20℃冰箱避光保存。
以2，5-DHBA標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)色譜結(jié)果用GOLD軟件對(duì)樣品出峰時(shí)間和峰面積進(jìn)行分析，最后用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。
3.5方法實(shí)用性的檢測(cè)采用上述實(shí)驗(yàn)探索的最佳實(shí)驗(yàn)條件，用維生素C(VC)溶液和具有抗氧化功能的紅景天提取物(紅景天苷)為受試物。
將11月齡小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只其中一組以VC作為受試物(簡稱VC組，維生素C濃度300mg/100ml水溶液)，一組以紅景天苷作為受試物(以下簡稱紅景天組，紅景天苷濃度30mg/100ml水溶液)，還有一組灌胃白水作為對(duì)照組(簡稱白水組)。灌胃量為每日一次，每次每只動(dòng)物0.4ml。所有動(dòng)物在SPF級(jí)動(dòng)物房中喂養(yǎng)50天。
實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射水楊酸鈉，待反應(yīng)60分鐘后殺死取肝組織，加高氯酸勻漿后離心，上清過濾后進(jìn)行HPLC分析，用GOLD系統(tǒng)計(jì)算峰面積，最后用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
4.結(jié)果與討論4.1水楊酸給藥方式的選擇實(shí)驗(yàn)選取腹腔注射和尾靜脈注射兩種方式作為水楊酸鈉的給藥方式，從色譜結(jié)果來看，采用相同注射量，相同反應(yīng)時(shí)間的統(tǒng)一條件時(shí)，尾靜脈注射組小鼠肝臟中檢測(cè)到的2，5-DHBA/水楊酸值較大，原因是腹腔注射和尾靜脈注射進(jìn)入到肝組織途徑不同而造成的差異，尾靜脈注射水楊酸通過血液循環(huán)能更快的到達(dá)肝臟。因此，為了能更容易反映出保健食品清除自由基的效果，以及考慮到節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和用藥量，實(shí)驗(yàn)選取尾靜脈注射作為水楊酸鈉的給藥方式。
4.2水楊酸捕獲時(shí)間的選擇實(shí)驗(yàn)選取了5分鐘，15分鐘，35分鐘，60分鐘，90分鐘的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取肝組織，作為對(duì)水楊酸捕獲時(shí)間的觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)從5min開始到35min 2，5-DHBA/SA的比例一直上升，60min左右最大，而90min的結(jié)果略有下降(如圖1)。由此說明60min左右基本為水楊酸捕獲羥自由基產(chǎn)生衍生物2，5-DHBA的平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)之所以選擇60min作為水楊酸的捕獲時(shí)間，是因?yàn)?0min以前的時(shí)間沒有到達(dá)水楊酸捕獲羥自由基的最大值，捕獲反應(yīng)還在進(jìn)行，而60min以后雖然捕獲量達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，但衍生物2，5-DHBA及過量水楊酸可能會(huì)有微量被機(jī)體代謝掉，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此本著節(jié)約時(shí)間及保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，最終選取60min作為水楊酸的捕獲時(shí)間。
4.3實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物組織的選擇實(shí)驗(yàn)選取了小鼠肝臟，腦和血液三個(gè)組織做討論但發(fā)現(xiàn)腦組織中2，5-DHBA/水楊酸值較低(6.967±0.594)；而心臟結(jié)果比腦組織略有上升(7.823±0.834)肝臟所得結(jié)果是三種組織中最高的(10.272±0.967)；這是因?yàn)楦闻K是機(jī)體代謝的終止場所，相對(duì)來講各種產(chǎn)物含量均比較高，實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。因此為了保證實(shí)驗(yàn)的靈敏性和顯著性，選取肝臟作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物組織。心臟和腦也完全可以作為評(píng)價(jià)2，5-DHBA/水楊酸的實(shí)驗(yàn)組織。
各組織中2，5-DHBA/水楊酸值

4.4方法可行性的驗(yàn)證維生素C作為天然的自由基清除劑，可以直接或間接消除自由基，從而可保護(hù)生物膜完整性，改善機(jī)體工作能力，推遲或減輕疲勞發(fā)生，加快疲勞恢復(fù)，提高機(jī)體內(nèi)氧的利用等，對(duì)提高有氧運(yùn)動(dòng)能力具有一定的作用。最近許多研究證明維生素C不但與維生素E、谷胱甘肽協(xié)同作用凈化自由基，維生素C本身也可參與自由基的清除。
大量研究證明，紅景天的藥理學(xué)活性十分突出，具有抗氧化，抗缺氧，抗輻射等不良刺激，調(diào)節(jié)免疫，抗疲勞，增強(qiáng)記憶，抗病毒及抗腫瘤等多種功能。因此采用這兩種抗氧化功效成分可以對(duì)上述實(shí)驗(yàn)方法可行性進(jìn)行驗(yàn)證。
11月齡小鼠，按照受試物不同分為三組，每組10只。根據(jù)色譜分析，最終得到2，5-DHBA和水楊酸的峰面積，以下是各組Q值(2，5-DHBA/水楊酸)的值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(即X±SD)。用SPSS軟件做方差分析和T檢驗(yàn)，得到兩種受試物組與白水對(duì)照組統(tǒng)計(jì)結(jié)果白水組，VC組和紅景天組的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

**1Vc組和白水組有顯著性差異(P＜0.05)**2紅景天組和白水組有顯著性差異(P＜0.05)4.5結(jié)論由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，用受試物灌胃喂養(yǎng)的11月齡小鼠，灌胃受試物50天后，采用尾靜脈注射法注射水楊酸鈉，反應(yīng)60min后處死取肝組織經(jīng)HPLC和紫外檢測(cè)器分離、檢測(cè)，這一方法能夠靈敏地將保健食品清除羥自由基的功能反映出來。通過抗氧化功效成分維生素C和紅景天苷的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了方法的可行性。
權(quán)利要求
1.一種保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，其步驟如下一、用所述保健食品喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50天；二、給所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射水楊酸鈉反應(yīng)一段時(shí)間后；三、選用所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織，用高效液相色譜儀和紫外檢測(cè)器分離，檢測(cè)由水楊酸捕獲羥自由基后產(chǎn)生的2，5-DHBA含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為10月齡以上昆明種小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，給所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射水楊酸鈉5-90分鐘后，取出所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，給所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射水楊酸鈉60分鐘后，取出所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織為肝臟、腦或心臟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，所述水楊酸鈉的濃度為60mg/ml，以小鼠體重的0.5％作為水楊酸鈉注射量進(jìn)行注射。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，步驟2采用尾靜脈注射。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種保健食品清除羥自由基作用的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)沒有通過直接測(cè)定體內(nèi)自由基評(píng)價(jià)抗氧化保健食品的方法的問題。其步驟如下用所述保健食品喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50天；給所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射水楊酸鈉反應(yīng)一段時(shí)間后；選用所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織，用高效液相色譜儀和紫外線檢測(cè)器分離，檢測(cè)由水楊酸捕獲羥自由基后產(chǎn)生的2，5－DHBA含量。受試物(保健食品)經(jīng)口服喂養(yǎng)＞11月齡小鼠50天后，采用尾靜脈注射法注射水楊酸鈉(小鼠體重的0.5％，水楊酸鈉濃度60mg/ml)，反應(yīng)60min后處死動(dòng)物，取肝組織經(jīng)高效液相色譜儀和紫外檢測(cè)器分離、檢測(cè)由水楊酸捕獲羥自由基后產(chǎn)生的2，5－DHBA，將結(jié)果與對(duì)照組比較，由此判定該受試物是否具有清除體內(nèi)羥自由基的功能。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1588042SQ20041006272
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月8日
發(fā)明者文鏡 申請(qǐng)人:北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測(cè)中心