專利名稱：多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中藥指紋圖譜是通過色譜或光譜手段對(duì)中藥分析樣品的特征性進(jìn)行表達(dá)的一種有效方式。在相關(guān)藥物研究的指導(dǎo)性文件中已經(jīng)對(duì)中藥注射劑做了相應(yīng)的要求，并已用于中藥注射劑的鑒別。近年來，在中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的實(shí)踐發(fā)展過程中，由于質(zhì)量要求的提高以及有關(guān)新藥研究的發(fā)展，越來越要求對(duì)中藥樣品進(jìn)行全面分析和整體表達(dá)，但是，由于中藥樣品中大量未知成分的存在，針對(duì)性地說明中藥樣品中包含成分和相對(duì)含量有較大的困難，因此在現(xiàn)代研究中，大量運(yùn)用指紋圖譜的方式進(jìn)行樣品特性表達(dá)，同時(shí)在針對(duì)中藥材、飲片、中藥提取物以及中藥制劑的分析中也廣泛地利用了色譜或光譜手段進(jìn)行指紋圖譜的研究。
在眾多色譜指紋圖譜的研究中，主要是運(yùn)用紫外檢測(cè)、蒸發(fā)光檢測(cè)以及質(zhì)譜檢測(cè)方式，其中鑒于實(shí)用目的，紫外檢測(cè)是指紋圖譜測(cè)定的主要檢測(cè)手段，但是比較而言，一般紫外檢測(cè)方式存在以下問題1、檢測(cè)波長(zhǎng)的唯一性，使得對(duì)大量其它非特征吸收的物質(zhì)信息沒有得到較好的表達(dá)；2、圖譜在整體相似度比較的情況下沒有對(duì)其中成分的相對(duì)量進(jìn)行控制；3、在對(duì)指紋峰進(jìn)行考察的過程中，僅僅采取相對(duì)保留值方式進(jìn)行鑒別，沒有建立蘊(yùn)涵特征信息的指紋峰數(shù)據(jù)序列，用于專屬性評(píng)價(jià)；4、在指紋圖譜評(píng)價(jià)方法中，結(jié)果的定性和定量信息沒有結(jié)合使用，判斷結(jié)果針對(duì)性不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種采用定性和定量指標(biāo)相結(jié)合的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，其包括以下步驟(1)將中藥樣品進(jìn)行制備，在色譜預(yù)選流動(dòng)相體系中進(jìn)行粗分，對(duì)其中較強(qiáng)的紫外吸收響應(yīng)進(jìn)行識(shí)別和認(rèn)定，根據(jù)識(shí)別和認(rèn)定的結(jié)果，確定樣品的多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)并跟蹤響應(yīng)，測(cè)定多級(jí)洗脫比例下容量因子和對(duì)應(yīng)流動(dòng)相比例關(guān)系；(2)根據(jù)上述比例關(guān)系，確定在設(shè)定流動(dòng)相體系下的梯度洗脫方法，進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)定，根據(jù)分離情況以及各個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下色譜洗脫行為，進(jìn)行整體優(yōu)化，實(shí)時(shí)調(diào)整梯度洗脫曲線，最終按照跟蹤響應(yīng)的識(shí)別情況和容量因子分布，確定在1小時(shí)～1.5小時(shí)洗脫時(shí)間下的梯度曲線，從而確定該樣品的指紋圖譜測(cè)定方法；(3)對(duì)上述確定的測(cè)定方法進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)，其中包括專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、測(cè)定范圍以及耐用性；(4)對(duì)不少于10批的實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果包括多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的圖譜及數(shù)據(jù)，對(duì)所述數(shù)據(jù)以保留時(shí)間縱向展開，對(duì)每個(gè)波長(zhǎng)下所得相對(duì)峰面積值或峰高值進(jìn)行一致性處理，建立測(cè)定樣品的對(duì)應(yīng)相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)峰面積值或峰高值的指紋圖譜數(shù)據(jù)序列，對(duì)對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行平均或取中位值，形成多個(gè)單波長(zhǎng)下指紋圖譜共有模式序列，然后進(jìn)行多個(gè)波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù)整合，以所有全檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)可響應(yīng)指紋峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間為列，各檢測(cè)波長(zhǎng)數(shù)據(jù)為行進(jìn)行序列矩陣化，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)無響應(yīng)的位置以0填充，形成多波長(zhǎng)指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣；(5)對(duì)相同的中藥樣品采取多種制備方式制備或采取多種檢測(cè)方法對(duì)相同樣品進(jìn)行測(cè)定，并分別重復(fù)步驟(4)，將得到的多個(gè)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行差異比較，在此基礎(chǔ)上對(duì)步驟(4)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行層次化；(6)對(duì)指紋圖譜中的主要色譜峰進(jìn)行指紋圖譜定性；(7)對(duì)指紋圖譜中的主要色譜峰進(jìn)行指紋圖譜定量。
上述步驟(6)中，指紋圖譜定性包含三個(gè)推斷層次，即①采用對(duì)照品對(duì)照定性；②采用已知結(jié)構(gòu)對(duì)照物為參照，利用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)中準(zhǔn)分子離子或分子離子和相應(yīng)碎片裂解規(guī)律和液相色譜/二極管陣列檢測(cè)器(LC/DAD)的紫外吸收光譜特征推斷指紋峰蘊(yùn)含成分的結(jié)構(gòu)類型，用于對(duì)指紋峰成分的推測(cè)；③采用LC/MS和LC/DAD信息及保留值標(biāo)識(shí)指紋峰代表的物質(zhì)成分，內(nèi)容包括指紋峰的保留值、實(shí)時(shí)紫外吸收光譜、以及可能的分子量和質(zhì)譜碎片信息用于標(biāo)識(shí)該指紋峰。
上述步驟(7)中，指紋圖譜定量包含三個(gè)層次，①采用對(duì)照品進(jìn)行準(zhǔn)確定量；②以準(zhǔn)確定量指紋峰為參比，將推測(cè)具有相同結(jié)構(gòu)類型的指紋峰與之比較，采用相對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行定量；③采用百分響應(yīng)值的方式，對(duì)用信息標(biāo)識(shí)指紋峰進(jìn)行量化控制。
上述步驟(5)中，層次化是指按照響應(yīng)大小或按照物質(zhì)成分鑒別情況，進(jìn)行數(shù)據(jù)分類，將相似差異變化的數(shù)據(jù)歸并為一類，對(duì)相同類別指紋峰數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，選取其中可定量成分或者基本可定性的穩(wěn)定成分峰為參照，對(duì)類中其它數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)化處理，作為相對(duì)含量或相對(duì)特征比值進(jìn)行指紋數(shù)據(jù)的量化處理結(jié)果，將不同層次量化處理結(jié)果填入數(shù)據(jù)矩陣中，即形成量化指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣。
上述步驟(5)中，多種制備方式包括冷浸法、溫浸法、滲漉法、煎煮法、回流法、加壓浸出、減壓浸出、超聲提取法、微波提取法、超臨界提取法。
上述步驟(4)中，所述多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的圖譜及數(shù)據(jù)是在各檢測(cè)波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定得到或在相同條件不同波長(zhǎng)下分別測(cè)定得到。
通過上述多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜。
上述多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜在質(zhì)量鑒別中的應(yīng)用。
上述多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜在質(zhì)量評(píng)價(jià)分析中的應(yīng)用。
本發(fā)明由于采取以上設(shè)計(jì)，其具有以下優(yōu)點(diǎn)1、由于本發(fā)明采用多波長(zhǎng)檢測(cè)方式，將多個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)得的圖形進(jìn)行組合整理，構(gòu)建了一個(gè)較為完整的反映被測(cè)樣品在各波長(zhǎng)下特征的指紋圖譜，因此可以更充分地表征各種中藥成分特異性信息，并在中藥樣品質(zhì)量鑒別和評(píng)價(jià)分析中，非常方便地對(duì)預(yù)檢驗(yàn)物品進(jìn)行定性的分析比較，并得出較為精確的判斷結(jié)論。2、本發(fā)明由于將多個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)得的指紋峰數(shù)據(jù)進(jìn)行了一致性和分層處理，并整合成共有模式的數(shù)據(jù)矩陣，因此可以將中藥成分中的主要成分進(jìn)行量化，加強(qiáng)了指紋圖譜對(duì)中藥品種及其質(zhì)量的表達(dá)能力和規(guī)范程度，使得在中藥樣品質(zhì)量鑒別和評(píng)價(jià)分析中，不但可以得到被檢驗(yàn)物品定性的分析結(jié)果，而且還可以非常方便地得到具有針對(duì)性的定量判斷。3、本發(fā)明由于提供了一整套規(guī)范的定性與定量相結(jié)合的多波長(zhǎng)色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，因此當(dāng)使用本方法得到的中藥色譜指紋圖譜進(jìn)行中藥成分鑒定、分析和評(píng)價(jià)時(shí)，不但方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，而且易于掌握和應(yīng)用。本發(fā)明可以廣泛用于中藥材、飲片、提取物、中藥制劑以及保健品、食品等含有多類化學(xué)成分的復(fù)雜體系，通過構(gòu)建多波長(zhǎng)色譜指紋圖譜進(jìn)行定性和定量分析，達(dá)到鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制的目的。


圖1是梔子藥材全波長(zhǎng)掃描圖譜圖2a～c是梔子藥材分別在240、330和440nm波長(zhǎng)下的指紋圖譜圖3是梔子藥材多波長(zhǎng)組合的指紋圖譜(組合圖譜)圖4a～c是梔子藥材多波長(zhǎng)HPLC定性定量分析對(duì)照品圖譜圖5a～f是栽培(a)和野生(b)梔子藥材的多波長(zhǎng)指紋圖譜對(duì)比圖6是清開靈注射液全波長(zhǎng)掃描圖譜圖7a～c是清開靈注射液中主要成分黃芩苷、梔子苷和綠原酸的紫外吸收光譜8a～c是清開靈注射液分別在240、280和330nm波長(zhǎng)下的指紋圖譜圖9a～c是清開靈注射液中三種主要成分對(duì)照品HPLC色譜10是清開靈注射液按保留值分類結(jié)果圖11a～d是不同廠家清開靈注射液采用本指紋圖譜方法進(jìn)行質(zhì)控前相似度比較圖12a～d是不同廠家清開靈注射液采用本指紋圖譜方法進(jìn)行質(zhì)控后相似度比較具體實(shí)施方式
本發(fā)明多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟1、將中藥樣品進(jìn)行制備，在色譜預(yù)選流動(dòng)相體系中進(jìn)行粗分，對(duì)其中較強(qiáng)的紫外吸收響應(yīng)進(jìn)行識(shí)別和認(rèn)定，根據(jù)識(shí)別和認(rèn)定的結(jié)果，確定樣品的多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)并跟蹤響應(yīng)，測(cè)定多級(jí)洗脫比例下容量因子和對(duì)應(yīng)流動(dòng)相比例關(guān)系；2、根據(jù)上述比例關(guān)系，確定在設(shè)定流動(dòng)相體系下的梯度洗脫方法，進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)定，根據(jù)分離情況以及各個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下色譜洗脫行為，進(jìn)行整體優(yōu)化，實(shí)時(shí)調(diào)整梯度洗脫曲線，最終按照跟蹤響應(yīng)的識(shí)別情況和容量因子分布，確定在1小時(shí)～1.5小時(shí)洗脫時(shí)間下的梯度曲線，從而確定該樣品的指紋圖譜測(cè)定方法；3、對(duì)上述確定的測(cè)定方法進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)，其中包括專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、測(cè)定范圍以及耐用性；4、對(duì)不少于10批的實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，采用各檢測(cè)波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定或在相同條件不同波長(zhǎng)下分別測(cè)定的方式進(jìn)行測(cè)定，得到的測(cè)定結(jié)果包括多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的圖譜及數(shù)據(jù)，對(duì)所述數(shù)據(jù)以保留時(shí)間縱向展開，對(duì)每個(gè)波長(zhǎng)下所得相對(duì)峰面積值或峰高值進(jìn)行一致性處理，即將數(shù)據(jù)相對(duì)化，一般可采用相對(duì)峰面積值或峰高值，并通過可定量的物質(zhì)成分峰作為定點(diǎn)指標(biāo)，進(jìn)行保留時(shí)間的相對(duì)化處理，匹配相應(yīng)測(cè)定批次的數(shù)據(jù)，識(shí)別共有指紋峰，建立測(cè)定樣品的對(duì)應(yīng)相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)峰面積值或峰高值的指紋圖譜數(shù)據(jù)序列，對(duì)對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行平均或取中位值，形成多個(gè)單波長(zhǎng)下指紋圖譜共有模式序列，然后進(jìn)行多個(gè)波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù)整合，以所有全檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)可響應(yīng)指紋峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間為列，各檢測(cè)波長(zhǎng)數(shù)據(jù)為行進(jìn)行序列矩陣化，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)無響應(yīng)的位置以0填充，形成多波長(zhǎng)指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣；5、對(duì)相同的中藥樣品采取冷浸法、溫浸法、滲漉法、煎煮法、回流法、加壓浸出、減壓浸出、超聲提取法、微波提取法、超臨界提取法中的一種或多種制備方法對(duì)相同樣品進(jìn)行制備后，分別重復(fù)步驟4；或者采取紫外檢測(cè)法、蒸發(fā)光檢測(cè)法、質(zhì)譜檢測(cè)法中的一種或多種檢測(cè)方法對(duì)相同樣品進(jìn)行測(cè)定，分別重復(fù)步驟4。將得到的多個(gè)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行差異比較，在此基礎(chǔ)上對(duì)步驟4所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行層次化。層次化是指按照響應(yīng)大小或按照物質(zhì)成分鑒別情況，進(jìn)行數(shù)據(jù)分類，將相似差異變化的數(shù)據(jù)歸并為一類，對(duì)相同類別指紋峰數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，選取其中可定量成分或者基本可定性的穩(wěn)定成分峰為參照，對(duì)類中其它數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)化處理，作為相對(duì)含量或相對(duì)特征比值進(jìn)行指紋數(shù)據(jù)的量化處理結(jié)果，將不同層次量化處理結(jié)果填入數(shù)據(jù)矩陣中，即形成量化指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣。
6、對(duì)指紋圖譜中的主要色譜峰進(jìn)行指紋圖譜定性，定性可以包含三個(gè)推斷層次(1)采用對(duì)照品對(duì)照定性；(2)采用已知結(jié)構(gòu)對(duì)照物為參照，利用LC/MS中準(zhǔn)分子離子或分子離子和相應(yīng)碎片裂解規(guī)律和LC/DAD紫外吸收光譜特征推斷指紋峰蘊(yùn)含成分的結(jié)構(gòu)類型，用于對(duì)指紋峰成分的推測(cè)；(3)采用LC/MS和LC/DAD信息及保留值標(biāo)識(shí)指紋峰代表的物質(zhì)成分，內(nèi)容包括指紋峰的保留值、實(shí)時(shí)紫外吸收光譜、以及可能的分子量和質(zhì)譜碎片信息用于標(biāo)識(shí)該指紋峰。
7、對(duì)指紋圖譜中的主要色譜峰進(jìn)行指紋圖譜定量，定量可以包含三個(gè)層次，(1)采用對(duì)照品進(jìn)行準(zhǔn)確定量；(2)以準(zhǔn)確定量指紋峰為參比，將推測(cè)具有相同結(jié)構(gòu)類型的指紋峰與之比較；(3)采用相對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行定量，采用百分響應(yīng)值的方式，對(duì)用信息標(biāo)識(shí)指紋峰進(jìn)行量化控制。
經(jīng)上述構(gòu)建方式得到的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜，可以對(duì)未知供試樣品進(jìn)行測(cè)定，利用上述矩陣進(jìn)行樣品的相似度判別和成分差異比較，從而實(shí)現(xiàn)定性定量相結(jié)合的質(zhì)量鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)分析。
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述。
實(shí)施例一1、梔子藥材多波長(zhǎng)指紋圖譜的構(gòu)建(a)實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1100型高效液相色譜儀(DAD二極管陣列檢測(cè)器)，Phenomenex Luna C18色譜柱(250×4.6mm，5μm)。
(b)梔子果實(shí)粉碎后，過40目篩，加入適量甲醇浸泡1小時(shí)，超聲處理20分鐘，放冷，3000rpm離心10分鐘后，取上清液過濾即得。
(c)色譜條件流動(dòng)相為甲醇和水，流速0.8ml/min，柱溫35℃，采用線性梯度洗脫。
(d)根據(jù)DAD檢測(cè)器在200～600nm全波長(zhǎng)掃描圖(如圖1所示)，為了使各組分達(dá)到吸收強(qiáng)、干擾小的目的，選擇在240nm測(cè)定環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)(如圖2-a所示)，330nm測(cè)定綠原酸(如圖2-b所示)，440nm測(cè)定藏紅花素類物質(zhì)(如圖2-c所示)，獲得三個(gè)波長(zhǎng)下梔子的單獨(dú)指紋圖譜；將此三個(gè)波長(zhǎng)下單獨(dú)的指紋圖譜有機(jī)地組合在一起就構(gòu)成梔子的組合指紋圖譜(如圖3所示)，圖中不同成分的譜圖分別采用優(yōu)化后的不同檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)得，其分別是1、梔子酸；2、異梔子苷；4、京尼平龍膽二糖苷；8、梔子苷；7、綠原酸；14、藏紅花素1；16、藏紅花素2；18、藏紅花素3；19、藏紅花酸。
(e)采用對(duì)照品對(duì)樣品物質(zhì)成分進(jìn)行定性，如圖4a～c所示，是梔子藥材的多波長(zhǎng)HPLC定量分析對(duì)照品圖譜，給出了梔子中9種成分的定性鑒定結(jié)果1、梔子酸；2、異梔子苷；3、京尼平龍膽二糖苷；4、梔子苷；5、綠原酸；6、藏紅花素1；7、藏紅花素2；8、藏紅花素3；9、藏紅花酸，對(duì)其相似物及無對(duì)照品的成分采取在線掃描圖譜的一致性分析結(jié)合LC/MS進(jìn)行定性。
(f)采用對(duì)照品外標(biāo)法對(duì)樣品物質(zhì)成分進(jìn)行定量測(cè)定，在多波長(zhǎng)HPLC指紋圖譜中(如圖4a～c所示)，采用對(duì)照品定量測(cè)定梔子藥材中9種成分，采用相對(duì)峰面積對(duì)其相似物及無對(duì)照品的成分進(jìn)行定量測(cè)定，其測(cè)量結(jié)果如表1所示
表1 梔子多波長(zhǎng)指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣數(shù)據(jù)表峰面積相對(duì)保留時(shí)間240nm 330nm 440nm3.851 0 0 170612.0642554908 0 014.037909293 0 014.7840 146862 015.691506727 0 017.6855684359 0 018.315805815 1188839 288520.1390 361535 020.587262739220 022.933558051 0 023.0720 94150 023.413403608 0 023.4350 80959 030.0800 114335 030.5280 0 862131.0400 138811 031.4770 0 472231.6590 231528 031.8612974654 2652173 032.4160 508344 032.427120161 0 032.4480 0 418932.747756831 1450702 032.7680 0 1445033.28 362344 482370 033.7920 0 411233.824297857 436311 034.4210 0 859834.432848036 2333891 035.68 129105 0 035.883156509 189857 036.0530 0 489136.1920 0 215637.493638054887652378834328339.1047243344 0 039.8082541040 0 046.7630 1598107 047.765829225 903816 048.3730 227272 049.7490 1791878 0(g)將量化指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣(如表1所示)，用于進(jìn)行樣品的相似度判別與評(píng)價(jià)。
2、梔子藥材多波長(zhǎng)指紋圖譜的應(yīng)用如圖5a～f所示，是栽培的梔子藥材(a)(如圖5-a、c、e所示)和野生梔子藥材(b)(如圖5-b、d、f所示)的多波長(zhǎng)指紋圖譜對(duì)比，本指紋圖譜方法能夠明確表征兩者之間的異同。結(jié)果表明野生梔子中的梔子苷及藏紅花素類成分含量普遍略高于栽培品的含量，表明栽培品質(zhì)量低于野生品種。
實(shí)施例二1、清開靈多波長(zhǎng)指紋圖譜的構(gòu)建(a)采用島津LC-2010A型高效液相色譜儀(帶有SPD-M10 A型二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣裝置)，Kromasil C18色譜分析柱(250×4.6mm，5μm)。
(b)清開靈注射液用0.45μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣。
(c)色譜條件流動(dòng)相為A相0.3％甲酸水溶液，B相甲醇，柱溫30℃；流速1.0ml/min，采用線性梯度洗脫。
(d)經(jīng)過DAD檢測(cè)器在200～600nm全波長(zhǎng)掃描(如圖6所示)，掃描結(jié)果(溶劑甲醇)表明梔子苷在238nm處有最大吸收；黃芩苷在280nm處有最大吸收；綠原酸在329nm處有最大吸收。圖7a～c是清開靈注射液中主要成分黃芩苷、梔子苷和綠原酸的紫外吸收光譜圖，圖中1、梔子苷，2、黃芩苷，3、綠原酸，溶劑為甲醇。為了使各組分達(dá)到吸收強(qiáng)、干擾小的目的，最終選擇在238nm測(cè)定梔子苷(如圖8-a所示)，280nm測(cè)定黃芩苷(如圖8-b所示)，330nm測(cè)定綠原酸(如圖8-c所示)，同時(shí)獲得三個(gè)波長(zhǎng)下的指紋圖譜，圖中1、梔子苷，2、黃芩苷，3、綠原酸。
(e)采用對(duì)照品對(duì)樣品物質(zhì)成分進(jìn)行定性，對(duì)其相似物及無對(duì)照品的成分采取在線LC/UV結(jié)合LC/MS進(jìn)行定性(如圖9a～c所示)，圖中是清開靈注射劑中三種主要成分1、梔子苷，2、黃芩苷，3綠原酸的定性。
(f)采用對(duì)照品外標(biāo)法對(duì)樣品物質(zhì)成分進(jìn)行定量測(cè)定、采用相對(duì)峰面積對(duì)其相似物及無對(duì)照品的成分進(jìn)行定量測(cè)定。
(g)將清開靈指紋峰按保留值分類(如圖10所示)，分類結(jié)果采用量化指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)行樣品的相似度判別與評(píng)價(jià)。共有模式數(shù)據(jù)矩陣數(shù)據(jù)如表2所示
表2 清開靈多波長(zhǎng)指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣數(shù)據(jù)峰面積相對(duì)保留時(shí)間238nm 280nm 330nm4.768 453610 0 04.779 0 389856 322106.293 0 882817 07.893 0 340205 010.2720 536179 011.2430 107203 011.659844011 0 011.6690 2023175013.1950 427316 013.205557140 0 014.101926108 324157 015.467669109 595233 018.347384221 0 018.3890 0 10389120.459898142 0 020.4690 449928 021.1411998911 0 021.3331357095 0 021.3760 2935551022.027554408 0 023.6910 163450 54004528.3630 0 42680129.067775892 0 029.7280 0 42885230.9330 0 31303232.3955410397 0 042.24 0 0 15211742.5280 0 21511243.3711015044 2445299332882144.928479956 0 046.3040 276533 17297649.4931.09E+080 049.5040 0 1.15E+0851.3920 0 16786252.1710 0 33287752.9710 334864 053.6111010591 2181996053.6210 0 119240854.7313135701 7076680322607275.3284676526 625855 02、清開靈多波長(zhǎng)指紋圖譜的應(yīng)用如圖11a～d所示，是不同廠家清開靈注射液采用本發(fā)明的指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)控前與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行相似度比較。各廠產(chǎn)品的指紋圖譜基本反映出產(chǎn)品的原有狀況，各廠家之間指紋圖譜差異較大，相似度分別為0.958、0.780、0.650。
如圖12a～d所示，是不同廠家清開靈注射液采用本發(fā)明的指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)控后相似度比較。經(jīng)過指紋圖譜指導(dǎo)下進(jìn)行工藝改進(jìn)，各廠家產(chǎn)品間指紋圖譜趨于一致，相似度分別為0.974、0.941、0.925。
從以上說明可以看出，由本發(fā)明方法得到的多波長(zhǎng)指紋圖譜能夠有效、全面、綜合地反映中藥產(chǎn)品的質(zhì)量變異，可以有效地進(jìn)行從藥材、半成品到最終產(chǎn)品全過程的質(zhì)量控制，使不同廠家能夠生產(chǎn)出統(tǒng)一的、穩(wěn)定的、相同質(zhì)量的并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，其包括以下步驟(1)將中藥樣品進(jìn)行制備，在色譜預(yù)選流動(dòng)相體系中進(jìn)行粗分，對(duì)其中較強(qiáng)的紫外吸收響應(yīng)進(jìn)行識(shí)別和認(rèn)定，根據(jù)識(shí)別和認(rèn)定的結(jié)果，確定樣品的多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)并跟蹤響應(yīng)，測(cè)定多級(jí)洗脫比例下容量因子和對(duì)應(yīng)流動(dòng)相比例關(guān)系；(2)根據(jù)上述比例關(guān)系，確定在設(shè)定流動(dòng)相體系下的梯度洗脫方法，進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)定，根據(jù)分離情況以及各個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下色譜洗脫行為，進(jìn)行整體優(yōu)化，實(shí)時(shí)調(diào)整梯度洗脫曲線，最終按照跟蹤響應(yīng)的識(shí)別情況和容量因子分布，確定在1小時(shí)～1.5小時(shí)洗脫時(shí)間下的梯度曲線，從而確定該樣品的指紋圖譜測(cè)定方法；(3)對(duì)上述確定的測(cè)定方法進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)，其中包括專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、測(cè)定范圍以及耐用性；(4)對(duì)不少于10批的實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果包括多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的圖譜及數(shù)據(jù)，對(duì)所述數(shù)據(jù)以保留時(shí)間縱向展開，對(duì)每個(gè)波長(zhǎng)下所得相對(duì)峰面積值或峰高值進(jìn)行一致性處理，建立測(cè)定樣品的對(duì)應(yīng)相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)峰面積值或峰高值的指紋圖譜數(shù)據(jù)序列，對(duì)對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行平均或取中位值，形成多個(gè)單波長(zhǎng)下指紋圖譜共有模式序列，然后進(jìn)行多個(gè)波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù)整合，以所有全檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)可響應(yīng)指紋峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間為列，各檢測(cè)波長(zhǎng)數(shù)據(jù)為行進(jìn)行序列矩陣化，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)無響應(yīng)的位置以0填充，形成多波長(zhǎng)指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣；(5)對(duì)相同的中藥樣品采取多種制備方式制備或采取多種檢測(cè)方法對(duì)相同樣品進(jìn)行測(cè)定，并分別重復(fù)步驟(4)，將得到的多個(gè)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行差異比較，在此基礎(chǔ)上對(duì)步驟(4)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行層次化；(6)對(duì)指紋圖譜中的主要色譜峰進(jìn)行指紋圖譜定性；(7)對(duì)指紋圖譜中的主要色譜峰進(jìn)行指紋圖譜定量。
2.如權(quán)利要求1所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(6)中，所述指紋圖譜定性包含三個(gè)推斷層次，即①采用對(duì)照品對(duì)照定性；②采用已知結(jié)構(gòu)對(duì)照物為參照，利用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用中準(zhǔn)分子離子或分子離子和相應(yīng)碎片裂解規(guī)律和液相色譜/二極管陣列檢測(cè)器的紫外吸收光譜特征推斷指紋峰蘊(yùn)含成分的結(jié)構(gòu)類型，用于對(duì)指紋峰成分的推測(cè)；③采用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜/二極管陣列檢測(cè)器信息及保留值標(biāo)識(shí)指紋峰代表的物質(zhì)成分，內(nèi)容包括指紋峰的保留值、實(shí)時(shí)紫外吸收光譜、以及可能的分子量和質(zhì)譜碎片信息用于標(biāo)識(shí)該指紋峰。
3.如權(quán)利要求1所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(7)中，所述指紋圖譜定量包含三個(gè)層次，①采用對(duì)照品進(jìn)行準(zhǔn)確定量；②以準(zhǔn)確定量指紋峰為參比，將推測(cè)具有相同結(jié)構(gòu)類型的指紋峰與之比較，采用相對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行定量；③采用百分響應(yīng)值的方式，對(duì)用信息標(biāo)識(shí)指紋峰進(jìn)行量化控制。
4.如權(quán)利要求1所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(5)中，所述層次化是指按照響應(yīng)大小或按照物質(zhì)成分鑒別情況，進(jìn)行數(shù)據(jù)分類，將相似差異變化的數(shù)據(jù)歸并為一類，對(duì)相同類別指紋峰數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，選取其中可定量成分或者基本可定性的穩(wěn)定成分峰為參照，對(duì)類中其它數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)化處理，作為相對(duì)含量或相對(duì)特征比值進(jìn)行指紋數(shù)據(jù)的量化處理結(jié)果，將不同層次量化處理結(jié)果填入數(shù)據(jù)矩陣中，即形成量化指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣。
5.如權(quán)利要求1所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(5)中，所述多種制備方式包括冷浸法、溫浸法、滲漉法、煎煮法、回流法、加壓浸出、減壓浸出、超聲提取法、微波提取法、超臨界提取法。
6.如權(quán)利要求1所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(4)中，所述一致性處理是指采用相對(duì)峰面積值或峰高值，進(jìn)行保留時(shí)間的相對(duì)化處理，匹配相應(yīng)測(cè)定批次的數(shù)據(jù)，并通過可定量的物質(zhì)成分峰作為定點(diǎn)指標(biāo)，識(shí)別共有指紋峰。
7.如權(quán)利要求1所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(4)中，所述多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的圖譜及數(shù)據(jù)是在各檢測(cè)波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定得到或在相同條件不同波長(zhǎng)下分別測(cè)定得到。
8.一種通過權(quán)利要求1所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜。
9.如權(quán)利要求8所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜在質(zhì)量鑒別中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求8所述的多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜在質(zhì)量評(píng)價(jià)分析中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多波長(zhǎng)中藥色譜指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該方法通過色譜條件和紫外響應(yīng)的考察與優(yōu)化，確定在1～1.5小時(shí)洗脫時(shí)間下的梯度曲線和多個(gè)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)用于指紋圖譜測(cè)定并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；采用相對(duì)響應(yīng)值和可定量峰作為定點(diǎn)指標(biāo)進(jìn)行相對(duì)化處理和矩陣化，建立量化多波長(zhǎng)指紋圖譜共有模式數(shù)據(jù)矩陣；對(duì)未知樣品利用該矩陣進(jìn)行相似度判別和成分差異比較，實(shí)現(xiàn)定性定量相結(jié)合的質(zhì)量鑒別和評(píng)價(jià)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是不僅能從色譜的整體特征把握中藥的品種和質(zhì)量情況，而且通過多波長(zhǎng)選取和指紋峰定性鑒定，能夠更好表征中藥的成分特異性，通過定量處理將主要成分量化，加強(qiáng)了指紋圖譜對(duì)中藥品種及其質(zhì)量的表達(dá)能力和規(guī)范程度。采用本發(fā)明方法構(gòu)建的中藥色譜指紋圖譜，可以廣泛地應(yīng)用于中藥質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N30/02GK1544935SQ20031010386
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月14日
發(fā)明者羅國(guó)安, 楊學(xué)東, 曹進(jìn), 王義明, 胡震 申請(qǐng)人:清華大學(xué)