專(zhuān)利名稱(chēng):一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本實(shí)用新型涉及一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，屬于免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。該試紙條由PVC底板、樣品墊、涂覆金標(biāo)標(biāo)記群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體（3D2）的金標(biāo)墊、在檢測(cè)線包被有群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體（4D11）和在質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、及吸水墊構(gòu)成。該試紙條操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，全過(guò)程只需5min，不受環(huán)境條件的干擾，特異性好，檢測(cè)靈敏度高，對(duì)水稻白葉枯病菌最低檢測(cè)限為1×104cfu/mL，對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌最低檢測(cè)限為1×105cfu/mL。本實(shí)用新型適用于海關(guān)、糧倉(cāng)、企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)糧食或種子樣本中該病菌的快速檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及了一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的快速檢測(cè)，適用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、進(jìn)出口糧食的快速檢測(cè)與應(yīng)急處理，屬于免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻白葉枯病菌(Xan thomonas oryzae p v.0ryzae)和水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.是黃單胞菌屬水稻黃單胞菌的不同致病變種。水稻白葉枯病是一種世界性病害，以亞洲稻區(qū)發(fā)生為重，水稻細(xì)菌性條斑病的危害僅次于水稻白葉枯病，主要發(fā)生在我國(guó)南部地區(qū)，是國(guó)內(nèi)重要的檢疫性病害。這兩種病害同時(shí)也被許多國(guó)家列為檢疫性有害生物，限制從這兩種病害的的疫區(qū)進(jìn)口水稻種子及稻米。因此，發(fā)展一種靈敏專(zhuān)化、準(zhǔn)確便捷的同時(shí)可從水稻上檢測(cè)這兩種細(xì)菌的檢疫技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)植物檢疫及我國(guó)水稻種子及稻米的出口均有重要意義。
[0003]對(duì)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的檢測(cè)診斷方法包括野外觀察、生理生化鑒定、免疫學(xué)檢測(cè)和鑒定、以及PCR檢測(cè)技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)和生物傳感技術(shù)也被用來(lái)檢測(cè)。但生化檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，且檢測(cè)結(jié)果存在不可靠性。PCR檢測(cè)技術(shù)相比具有很好的靈敏性與準(zhǔn)確性，但由于依賴(lài)于昂貴的儀器和專(zhuān)業(yè)的檢測(cè)人員，不適用于大量產(chǎn)品的快速檢測(cè)。ELISA檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)靈敏度上雖然不如PCR方法，但是具有檢測(cè)快速、批量、便宜的優(yōu)勢(shì)。而膠體金試紙條具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、不需要借助專(zhuān)門(mén)儀器、適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)
[0004]由于水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)帶來(lái)巨大威脅與損失，因此快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法顯得尤為重要。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0005]本實(shí)用新型目的在于提供一種檢測(cè)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，操作簡(jiǎn)單，快速方便，靈敏度高，穩(wěn)定性好，成本低廉。
[0006]本實(shí)用新型適用于海關(guān)、糧倉(cāng)、企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)大量糧食或種子樣本中水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的快速檢測(cè)。
[0007]本實(shí)用新型的技術(shù)方案，一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，包括PVC底板，在PVC底板兩端分別設(shè)有樣品墊和吸水墊；
[0008]在PVC底板中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測(cè)層，在硝酸纖維素膜檢測(cè)層與樣品墊之間設(shè)置有金標(biāo)墊；所述金標(biāo)墊一端與樣品墊相連接疊放，金標(biāo)墊另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測(cè)層上；
[0009]所述硝酸纖維素膜檢測(cè)層上依次設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線。
[0010]所述金標(biāo)墊上包被有金標(biāo)標(biāo)記群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(3D2)；
[0011]所述檢測(cè)線上包被有群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(4D11)；
[0012]所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。
[0013]所述水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，步驟如下:
[0014](I)抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的單克隆抗體的制備
[0015]單克隆抗體是采用水稻白葉枯病菌(NCPPB3002，來(lái)自湖南省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局)菌體經(jīng)過(guò)特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免，I X 18Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，IX 18Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，IX 17 cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測(cè)效價(jià)，分別挑選對(duì)水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體效價(jià)最高的老鼠；第九周進(jìn)行沖刺免疫，I X 17Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB3002菌體/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血后進(jìn)行融合、篩選，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株；
[0016](2)群選性單克隆抗體的配對(duì)篩選
[0017]將步驟(I)中純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，確定群選性免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條所需要的抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的群選性抗體；其中3D2為金標(biāo)抗體，4D11為包被抗體；
[0018](3)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備:
[0019]a、空白膠體金的制備:
[0020]采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL 1%朽1檬酸鈉,繼續(xù)加熱15~20min,至呈亮紅色,然后室溫中冷卻，4 C冷減保存；
[0021]b、膠體金標(biāo)記抗體的制備:
[0022]空白膠體金溶液用0.1M K2CO3調(diào)節(jié)pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(2)制備的抗體，每HiL膠體金加入30 μ g抗體3D2，繼續(xù)攪拌30 min,離心，吸取上清，用金標(biāo)抗體保存液(0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液)重旋；
[0023]C、金標(biāo)墊的制備:
[0024]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL標(biāo)記好膠體金的抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(3D2)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6 μ L/cm,37°C烘干過(guò)夜，封袋備用；
[0025]d、包被膜的制備:
[0026]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(4D11)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線；將羊抗鼠IgG抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量均為0.6μ L /cm，37°C烘干過(guò)夜，封袋備用。
[0027]將PVC底板、樣品墊、金標(biāo)墊、涂有檢測(cè)線與質(zhì)控線的硝酸纖維素膜檢測(cè)層、和吸水墊組合，即得產(chǎn)品水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條。
[0028]其適用于海關(guān)、糧倉(cāng)、企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)糧食或種子樣本中水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的快速檢測(cè)，最低檢測(cè)限分別為水稻白葉枯病菌為IXlO4cfu/mL和水稻細(xì)菌性條斑病菌IXlO5 cfu/mL。。
[0029]本實(shí)用新型試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術(shù)，選用水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌群選性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測(cè)樣品中是否含有水稻白葉枯病菌和/或水稻細(xì)菌性條斑病菌。當(dāng)待檢樣品中含有水稻白葉枯病菌和/或水稻細(xì)菌性條斑病菌時(shí),抗原先和膠體金標(biāo)記的群選性抗病菌抗體(3D2)結(jié)合，由于層析作用復(fù)合物沿包被膜向前移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測(cè)線上的群選性抗病菌抗體(4D11)時(shí)，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，在檢測(cè)線上富集，形成紅色沉淀線。
[0030]與其他檢測(cè)方法相比，免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):1、迅速；2、靈敏度高；3、成本低廉；4、安全簡(jiǎn)便。
[0031]本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0032]1.檢測(cè)速度快，全過(guò)程只需要5 min即可，可以試驗(yàn)大批量樣品的快速檢測(cè)；
[0033]2.靈敏度高，最低檢測(cè)限分別為I X 104cfu/mL和I X 105cfu/mL ；
[0034]3.操作簡(jiǎn)便，無(wú)需經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，易于推廣；
[0035]4.不需要儀器，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；
[0036]5.過(guò)程簡(jiǎn)單,直接上樣檢測(cè),樣本量少。

【附圖說(shuō)明】

[0037]圖1本實(shí)用新型水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖正視圖；
[0038]圖2本實(shí)用新型水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖俯視圖；
[0039]附圖標(biāo)記說(shuō)明:1、PVC底板；2、硝酸纖維素膜檢測(cè)層；3、樣品墊；4、金標(biāo)墊；5、檢測(cè)線(T線)；6、質(zhì)控線(C線)；7、吸水墊。
[0040]圖3本實(shí)用新型水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條實(shí)物檢測(cè)示意圖；水稻白葉枯病菌(NCPPB 3002，來(lái)自湖南省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局)
[0041]附圖標(biāo)記說(shuō)明:1、2X106cfu/mL NCPPB 3002 菌體濃度；2、3.3 X 105cfu/mLNCPPB 3002 菌體濃度；3、lX105cfu/mL NCPPB 3002 菌體濃度；4、3.3X 104cfu/mL NCPPB3002菌體濃度；5、lX104cfu/mL NCPPB 3002菌體濃度；6、空白樣。
[0042]圖4本實(shí)用新型水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條實(shí)物檢測(cè)示意圖；水稻細(xì)菌性條斑病菌(NCPI3B 1585，來(lái)自湖南省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局)
[0043]附圖標(biāo)記說(shuō)明:1、1X107cfu/mL NCPPB 1585 菌體濃度；2、I X 106cfu/mL NCPPB1585 菌體濃度；3、5X105cfu/mL NCPPB 1585 菌體濃度；4、I X 105cfu/mL NCPPB 1585 菌體濃度；5、空白樣。

【具體實(shí)施方式】
[0044]實(shí)施例1
[0045]如圖1所示，一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，包括PVC底板1，在PVC底板I兩端分別設(shè)有樣品墊3和吸水墊7 ；
[0046]在PVC底板I中部設(shè)有硝酸纖維素膜檢測(cè)層2，在硝酸纖維素膜檢測(cè)層2與樣品墊3之間設(shè)有金標(biāo)墊4 ;在金標(biāo)墊4 一端與樣品墊3相疊加,金標(biāo)墊4另一端疊加在硝酸纖維素膜檢測(cè)層2上；
[0047]在硝酸纖維素膜檢測(cè)層2上按先后順序設(shè)有檢測(cè)線T線5和質(zhì)控線C線6。
[0048]所述金標(biāo)墊4上包被有金標(biāo)標(biāo)記群性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體3D2 ;所述檢測(cè)線T線5上包被有群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體4D11 ;所述質(zhì)控線6上包被有羊抗鼠IgG。
[0049]實(shí)施例2
[0050]所述水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其步驟是:
[0051](I)群選性的單克隆抗體的制備
[0052]采用水稻白葉枯病菌(NCPPB 3002，來(lái)自湖南省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局)菌體經(jīng)過(guò)特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免,IX 18Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，I X 18Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，I X 17 cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測(cè)效價(jià)，分別挑選對(duì)水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體效價(jià)最高的老鼠；第九周進(jìn)行沖刺免疫，I X 17Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血后進(jìn)行融合、篩選，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株。
[0053](2)群選性單克隆抗體的配對(duì)篩選
[0054]將純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，確定免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條所需要的抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的群選性抗病菌抗體；其中3D2為金標(biāo)抗體，4D11為包被抗體；
[0055](3)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備:
[0056]a.空白膠體金的制備:
[0057]采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL 1%朽1檬酸鈉,繼續(xù)加熱15~20min,至呈亮紅色,然后室溫中冷卻，4 C冷減保存；
[0058]b.膠體金標(biāo)記抗體的制備:
[0059]空白膠體金溶液用0.1M K2CO3調(diào)節(jié)pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(2)制備的抗體，每mL膠體金加入30 μ g抗體(3D2),繼續(xù)攪拌30 min,離心,吸取上清,用金標(biāo)抗體保存液(0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液)重旋；
[0060]c.金標(biāo)墊的制備:
[0061]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL標(biāo)記好膠體金的群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(3D2)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6 μ L/cm, 37 °C烘干過(guò)夜，封袋備用；
[0062]d.包被膜的制備:
[0063]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(4D11)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線；將羊抗鼠IgG抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量均為0.6μ L /cm，37°C烘干過(guò)夜，封袋備用。
[0064]將PVC底板、樣品墊、金標(biāo)墊、涂有檢測(cè)線與質(zhì)控線硝的酸纖維素膜檢測(cè)層、和吸水墊組合，即得產(chǎn)品水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條。
[0065]本實(shí)用新型試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術(shù)，選用水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌群選性特異性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測(cè)樣品中是否含有水稻白葉枯病菌和/或水稻細(xì)菌性條斑病菌。當(dāng)待檢樣品中含有水稻白葉枯病菌和/或水稻細(xì)菌性條斑病菌時(shí)，抗原先和膠體金標(biāo)記的群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(3D2)結(jié)合，由于層析作用復(fù)合物沿包被膜向前移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測(cè)線上的群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(4D11)時(shí)，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，在檢測(cè)線上富集，形成紅色沉淀線。
[0066]檢測(cè)時(shí)按如下步驟處理檢測(cè)樣品:取1g種子，先用蒸餾水沖洗以除去殘片和表面污染雜菌，后放入0.001%吐溫-磷酸緩沖液中低溫(5°C ~ 15°C)浸泡4 h ~ 6 h，用均質(zhì)器打碎，制備樣品提取液。提取液于22°C ~ 25°C環(huán)境中放置4 h ~ 6 h，旋窩混勻懸浮液5min,進(jìn)行檢測(cè)。
[0067]檢測(cè)時(shí)如樣品為陰性，則試紙條只有質(zhì)控線C線顯色(圖3中6號(hào)，圖4中5號(hào))；如果樣品為陽(yáng)性，及水稻白葉枯病菌濃度大于IX 104cfu/mL和/或水稻細(xì)菌性條斑病菌濃度大于I X 105cfu/mL,則試紙條質(zhì)控線C線，檢測(cè)線T線均顯色。如果試紙條C線不顯色，則說(shuō)明試紙條質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于:在PVC底板(I)兩端分別設(shè)有樣品墊(3)和吸水墊(7)； 在PVC底板(I)中部設(shè)有包含檢測(cè)線(5)和質(zhì)控線(6)的硝酸纖維素膜檢測(cè)層(2)，在硝酸纖維素膜檢測(cè)層(2 )上依次設(shè)有包被有群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體4D11的檢測(cè)線(5)和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線(6)； 在硝酸纖維素膜檢測(cè)層(2)與樣品墊(3)之間設(shè)有包被有金標(biāo)標(biāo)記群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體3D2的金標(biāo)墊(4);金標(biāo)墊(4)一端與樣品墊(3)相疊加，金標(biāo)墊(4)另一端疊放在硝酸纖維素膜檢測(cè)層(2)上。
【文檔編號(hào)】G01N33-558GK204287191SQ201420718740
【發(fā)明者】徐麗廣, 孔德昭, 胥傳來(lái), 匡華, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 [申請(qǐng)人]江南大學(xué)