專利名稱:可特異結(jié)合的物質(zhì)的測定方法
本發(fā)明涉及依照免疫分析原理檢測可特異結(jié)合的蛋白質(zhì)物質(zhì)的方法，即相互特異結(jié)合的物質(zhì)對的組分之一以固相結(jié)合的形式出現(xiàn);因而還涉及一種適用于該方法的載體材料。
為檢測某種可特異結(jié)合的物質(zhì)，常常使用依據(jù)免疫學(xué)分析原理建立的方法。從而使可相互特異結(jié)合的物質(zhì)對組分之一與對其特異的受體發(fā)生反應(yīng)(其中所說的組分是用已知方法標(biāo)記的)。之后這兩種物質(zhì)的結(jié)合物便可與對結(jié)合物特異的或?qū)Y(jié)合物兩者之一特異的受體反應(yīng)。有許多不同的免疫學(xué)方法。如將受體之一結(jié)合于固相上將是有利的。這樣將比較容易地分離已結(jié)合的或未結(jié)合的反應(yīng)組分。之后為檢測可特異結(jié)合的物質(zhì)，可檢測結(jié)合于固相上的或存在于溶液中的標(biāo)記的反應(yīng)組分的量，而且測得的量是以已知方式與待檢反應(yīng)組分的量相關(guān)的。
在這類免疫學(xué)方法中，所使用的固相通常是在其內(nèi)表面固定了反應(yīng)組分的合成材料制成的試管或微量滴定板，或者是在其外表面固定了反應(yīng)組分的扁球體。這些合成樹脂試管、微量滴定板或小球通常是由相當(dāng)惰性的合成樹脂材料制成的，致使反應(yīng)組分的結(jié)合產(chǎn)生困難。再者，特異性反應(yīng)組分同上述表面的結(jié)合必須以這樣一種方式發(fā)生，即不能喪失對可與它特異結(jié)合的物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合的能力。為此，反應(yīng)性組分同固相的結(jié)合主要是吸附結(jié)合。
因此，有人提出通過一種可導(dǎo)致結(jié)合的偶聯(lián)劑使反應(yīng)組分固定到固相上。必須特別注意的是，反應(yīng)組分同結(jié)合試劑的結(jié)合不能破壞分子的特異反應(yīng)區(qū)域，或者應(yīng)使被結(jié)合的反應(yīng)組分的反應(yīng)部位背離固相而朝向結(jié)合組分。
另外，西德書2533701號(hào)提到，為了達(dá)到更好的結(jié)合，可使有免疫學(xué)活性的各個(gè)蛋白質(zhì)交聯(lián)，之后使之吸附到聚苯乙烯小球上。該參考文獻(xiàn)中給出的另一種可能性是，使惰性蛋白質(zhì)與具有免疫學(xué)特性的蛋白質(zhì)交聯(lián)，以使交聯(lián)的產(chǎn)物具有惰性和活性蛋白質(zhì)的特性，之后再將其吸附于聚苯乙烯小球上。然而，依據(jù)所選用的反應(yīng)條件，這種類型的交聯(lián)可導(dǎo)致非交聯(lián)蛋白質(zhì)的比例變化，以及已變?yōu)椴蝗苄缘牡鞍踪|(zhì)產(chǎn)生不可再生的交聯(lián)。另外，由于交聯(lián)的程度不同，而可得到具有不同結(jié)合性質(zhì)的產(chǎn)物。
歐洲書0，122，209號(hào)中描述了一種相似的方法，而且也存在著同樣的缺點(diǎn)。據(jù)此，所有這些已知方法都是不能令人滿意的，仍不能導(dǎo)致可特異結(jié)合物質(zhì)的最佳吸附，而且很難適用于已包被之固相的可再生制備。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種可再生的、改善可特異結(jié)合物質(zhì)同固相吸附的方法，并提供了適用于這一方法的載體材料。因?yàn)樵S多免疫學(xué)方法都是經(jīng)加入去污劑以避免混濁不清的條件下完成的，所以本發(fā)明的目的還包括將吸附作用改善到這樣一種程度即使在去污劑存在下，也不能將已經(jīng)結(jié)合上去的可特異結(jié)合的物質(zhì)溶解掉。
據(jù)此，按照本發(fā)明，其提供了一種制備結(jié)合于某種不溶性載體材料上的可特異結(jié)合之蛋白質(zhì)物質(zhì)的方法，特別是依據(jù)免疫分析原理用于不均一分析的方法，此方法將分子量約500，000以上，比可特異結(jié)合的物質(zhì)有更大疏水性的可溶性蛋白與可特異結(jié)合的物質(zhì)相偶聯(lián)，然后將反應(yīng)組分和蛋白質(zhì)的結(jié)合物吸附于疏水的固相上。
以這種方法固定于固相上的可特異結(jié)合物質(zhì)表現(xiàn)有改善了的附著力。當(dāng)使用去污劑時(shí)這種結(jié)合也是穩(wěn)定的。在制作校正曲線(對于估價(jià)許多免疫學(xué)方法是不可缺少的)時(shí)，依據(jù)本發(fā)明的可特異結(jié)合物質(zhì)的固相結(jié)合給出更陡的校正曲線，使精確度得到提高。
本發(fā)明之方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，它能更為準(zhǔn)確地控制結(jié)合量。因?yàn)檎掣阶饔蔑@著地好于先前已知的方法，所以必須使用的特異性蛋白質(zhì)的量也是較少的。
為了選擇適用于本發(fā)明之方法的可溶性蛋白，必須測定分子量以及疏水性能，與可特異結(jié)合物質(zhì)的相應(yīng)數(shù)值進(jìn)行比較。分子量是依照已知方法測定的。
亦可用常規(guī)方法對可溶性蛋白質(zhì)和可特異結(jié)合物質(zhì)之間的疏水性進(jìn)行比較。例如，適用的方法包括先結(jié)合于帶顏色材料上然后比較熒光吸光率(Biochem，Biophys，Acta，624，13-20/1980);比較疏水層析時(shí)的洗脫行為(Biochem，Biophys.Acta，576;269-279/1979);表面張力(Biochem，Biophys.Acta，670，64-73/1981);以及比較疏水性相互作用層析(HIC)時(shí)的滯留時(shí)間(Angew，Chemic，98，530-548/1986;J.Chromat，296，107-114/1984;Anal，Biochem，137，464-472/1984)。
參考文獻(xiàn)Sep.Sci.Technol，14，305-317/1979中比較了適于本發(fā)明之物質(zhì)的疏水性。例如依據(jù)該方法，下列物質(zhì)按疏水性增加排列α2-巨球蛋白(分子量820，000)、牛血清白蛋白蛋白/人血清白蛋白(分子量約70，000)、卵白蛋白、α2HS-糖蛋白(分子量約49，000)、β1C/β1A-球蛋白、免疫球蛋白(分子量約150，000)和鐵傳遞蛋白(分子量約90，000)。
因此，如果使用免疫球蛋白作為可特異結(jié)合物質(zhì)，則按本發(fā)明的方法在沒有作進(jìn)一步的預(yù)處理時(shí)，人血清白蛋白或α2HS-糖蛋白不適于作可溶性蛋白。
這里不僅須對上述各種蛋白質(zhì)作疏水處理，而且須增加其分子量。在使用鐵傳遞蛋白的情況下，產(chǎn)生足夠的交聯(lián)，以及在使用α2-巨球蛋白的情況下，具足夠的疏水性作用。
不作預(yù)處理亦適于與作為可特異結(jié)合物質(zhì)的免疫球蛋白偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，包括β-脂蛋白(分子量約3.2×105)和α2-脂蛋白(分子量約5-20×106)。
例如，可通過加熱、用酸、變性劑和/或離液序列高的陰離子處理和/或與某種疏水化合物化學(xué)偶聯(lián)來使之產(chǎn)生疏水性質(zhì)。
例如，可通過加熱、用酸、變性劑和/或離液序列高的陰離子處理和/或與雙或多功能蛋白試劑交聯(lián)來增加分子量。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)聚合物分子量達(dá)到500，000或更高時(shí)即完成了處理過程。最好選用分子量為500，000至20×106的蛋白質(zhì)聚合物。
當(dāng)也需要進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，可在交聯(lián)前、交聯(lián)期間或交聯(lián)后，但不是在可特異結(jié)合物質(zhì)的存在下，完成疏水化處理。
通過加熱使蛋白質(zhì)疏水化，所用溫度一般是40至95℃，所用時(shí)間如Biochem，Biophys，Acta，624，13-20/1980中所述，為1分鐘至10小時(shí)。
所用的酸有乙酸、丙酸、乳酸或鹽酸。適用濃度為1至100mM/升，作用時(shí)間為10分鐘到16小時(shí)。
適用的離液序列高的陰離子如硫氰酸鹽、碘化物、氟化物、溴化物、高氯酸鹽和硫酸鹽的陰離子。適用的變性劑包括鹽酸胍和尿素等。所用濃度一般為10mM/升至6M/升。
為衍生疏水化合物，最好選用可溶性脂肪酸、低和高分子量的脂類，以及合成的聚合物如聚乙二醇或聚苯乙烯的可溶性共聚物。依照眾所周知的方法進(jìn)行這一衍生作用。
使用已知的蛋白結(jié)合試劑，通過雙和多功能化合物進(jìn)行交聯(lián)。這些化合物至少含有兩個(gè)可以是相同的或不同的功能基團(tuán)，并可通過這些功能基團(tuán)與蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)反應(yīng)。首選的是在其末端含烷基鏈的化合物，如琥珀酰亞胺、順丁烯二酰亞胺和/或醛基化合物。
以通常方式使可溶性蛋白與雙或多功能化合物一起反應(yīng)，以使蛋白質(zhì)與雙或多功能化合物交聯(lián)。
為進(jìn)行疏水化和/或交聯(lián)，最好使用分子量為10，000至700，000的蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選的是牛血清白蛋白、脂酶和γ免疫球蛋白。
然后以已知方法將欲被結(jié)合的可特異結(jié)合物質(zhì)與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。如可使用Ishikawa(J.Immunoassay，4，209-327/1983)所描述的偶聯(lián)方法?？贵w、抗體片段、抗原及半抗原等蛋白質(zhì)均可用作可特異結(jié)合物質(zhì)。
然后將所得到的可特異結(jié)合之蛋白質(zhì)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合物吸附于用作固相的合成樹脂表面。同固相的吸附結(jié)合是通過強(qiáng)和弱交換作用、疏水力、偶極-偶極及離子-偶極相互作用達(dá)到的。可使用表面張力比疏水性可溶蛋白質(zhì)表面張力小的載體材料作為疏水固相，即其比蛋白質(zhì)有更大的疏水性。最好使用表面張力＜40erg/cm2的載體材料。特別優(yōu)選的有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚四氟乙烯(Teflon)、聚酰胺、苯乙烯和丙烯腈的共聚物、玻璃和纖維素產(chǎn)品。它們可以以任何要求的形式存在，如薄膜、平板、粉末、顆?；蚶w維絮狀物，最好是得自纖維素/纖維素酯纖維和聚合物纖維的纖維絮狀物。
疏水的蛋白質(zhì)表現(xiàn)有特別好的吸附結(jié)合能力。由于疏水化處理，可能使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)橋鍵打開，從而使蛋白質(zhì)的疏水部分到達(dá)表面并比親水部分更好地附著于疏水的合成樹脂的表面，親水部分往往出現(xiàn)于非疏水化蛋白質(zhì)表面上。
可依據(jù)本發(fā)明的方法來檢測可特異結(jié)合的物質(zhì)。對于一對物質(zhì)對，它的反應(yīng)組分以結(jié)合于固相上的形式存在，這種可以使用的物質(zhì)對包括抗原-抗體、半抗原-抗體及其他能相互特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，特別是抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)或抗生物素蛋白和生物素構(gòu)成的系統(tǒng)。
在使蛋白質(zhì)與可特異結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物吸附于疏水固相上之前，亦可以用物理或化學(xué)方法對固相進(jìn)行預(yù)處理。例如，可以將合成樹脂表面預(yù)溶脹或用某些其他已知方法活化之。
依據(jù)本發(fā)明用于固相免疫分析的載體材料，其特征在于它包含一疏水固相，其上吸附有某種分子量約500，000以上的蛋白質(zhì)，而該蛋白質(zhì)能結(jié)合可特異結(jié)合的物質(zhì)。
因?yàn)檫@種載體材料對可特異結(jié)合物質(zhì)的吸附能力很好而且在去污劑存在下亦不會(huì)解吸附，故特別適用于固相免疫分析。
載體材料可以是試管、微量滴定板或小球等形式的，其上復(fù)蓋一種交聯(lián)蛋白，后者可與可特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合。
由交聯(lián)蛋白與可特異結(jié)合物質(zhì)組成的結(jié)合物被吸附于固體基質(zhì)上。優(yōu)選的蛋白質(zhì)為已經(jīng)按所述方法交聯(lián)的牛血清白蛋白、脂酶或γ免疫球蛋白。
依據(jù)本發(fā)明，提供了具有好的附著力和長時(shí)間保持穩(wěn)定的方法及載體材料，將可特異結(jié)合物質(zhì)固定于疏水固相上。從而可使吸附效果得以改善，以至加入去污劑也不會(huì)使該物質(zhì)解吸附，而且本發(fā)明的方法簡便易行。
下列實(shí)施例中將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，附圖可供參考，其中圖1是使用非交聯(lián)的Fab＜TSH＞(曲線1)、交聯(lián)的Fab＜TSH＞(曲線2)、Fab＜TSH＞/β-Gal的結(jié)合物(曲線3)及Fab＜TSH＞/熱處理牛血清白蛋白(thermo-BSA)的結(jié)合物(曲線4)在Luran試管中檢測TSH(促甲狀腺激素)的校正曲線;
圖2是使用固相化的抗生蛋白鏈菌素和生物素化的AK＜TSH＞;非交聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素(曲線1)、交聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素(曲線2)、抗生蛋白鏈菌素/β-gal結(jié)合物(曲線3)、抗生蛋白鏈菌素/BSA結(jié)合物(曲線4)、抗生蛋白鏈菌素(曲線5)和抗生蛋白鏈菌素/熱處理-BSA結(jié)合物(曲線6)檢測TSH的校正曲線;在曲線1-5的情況下，固相是Luran試管，而在曲線6的例子中，固相是聚苯乙烯試管。
圖3是T3檢測試驗(yàn)的校正曲線;
圖4是檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的校正曲線。
實(shí)施例1抗TSH單克隆抗體之Fab片段在聚苯乙烯試管上的結(jié)合a)Fab片段(Fab＜TSH＞)的制備按Galfre和Millstein(Meth.in Enzymology，73/1981)所述的方法制得單克隆抗體(MAB＜TSH＞)。為進(jìn)一步純化，將腹水液用硫酸銨沉淀并過一次DEAE纖維素柱。
然后按已述及的方法(Biochem.J.，73，119-126/1959)進(jìn)行木瓜蛋白酶水解。依照Meth.in Enzymology，73，418-459/1981中所述的方法，在萄聚糖G100柱上凝膠過濾并在DEAE纖維素柱上進(jìn)行離子交換層析以自未消化的IgG分子和Fc片段中分離所形成的Fab片段。
b)未加蛋白質(zhì)(對照)條件下Fab片段的交聯(lián)。
將50mg Fab片段溶解于2ml 0.05M/升磷酸鉀緩沖液(PH7.5)中，并向其中加入0.4ml溶于二噁烷中(7.4mg/ml)的辛二酸二琥珀酰亞胺酯(制造商Pierce)，同時(shí)進(jìn)行攪拌。于25℃保溫2小時(shí)后，加入0.2ml濃度為0.1M/升的鹽酸賴氨酸中止反應(yīng)。用0.2ml磷酸鉀緩沖液(見上述)稀釋反應(yīng)混合物并離心。將上清液過Ultrogel AcA 202柱(LKB，Grafelfing，西德)除鹽，得到含45mg蛋白質(zhì)的11.3ml洗脫產(chǎn)物。取該制劑的一部分上Superose-6柱(Deutsche pharmacia GmbH)進(jìn)行層析分離，用0.05M/升的磷酸鉀緩沖液(PH7.0)以0.5ml/分的流速洗脫，并收集分子量約500，000至5×106的部分留作下一步使用。
c)Fab片段與未處理的γ-球蛋白交聯(lián)(對照)。
將Fab片段與小牛γ球蛋白(Serva，Heidelberg，西德)以1∶1的重量比混合。按b)中所述方法完成交聯(lián)。
d)Fab片段結(jié)合于預(yù)交聯(lián)的γ球蛋白上(依照本發(fā)明)將1.25g γ球蛋白(溶于10ml濃度為0.05M/升的磷酸鉀緩沖液(PH7.8)中，并在Sorvall冷凍離心機(jī)中以5000r.p.m.離心10分鐘。向該溶液中加入1.75ml辛二酸二琥珀酰亞胺酯，之后用2.5ml水稀釋之。于25℃攪拌4小時(shí)后，向其中加入10ml濃度為0.1M/升的賴氨酸，并將pH調(diào)到6.8，然后離心。在制備凝膠過濾柱(TSK3000，LKB Grafelfing，西德)上分離上清液，超濾濃縮并于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>將50mg這一交聯(lián)的γ球蛋白溶解在5ml濃度為0.05M/升的磷酸鉀緩沖液中，并加入固體碳酸鈉將pH值調(diào)到9.5。然后向其中加入50mg N-乙酰同型半胱氨酸硫羥丙酮(Serva，Heidelberg，西德)并于25℃攪拌5小時(shí)，同時(shí)通入氮?dú)?。繼之將該部分材料在0.1M/升磷酸鉀(pH7.0)、0.001M/升氯化鎂及0.05M/升氯化鈉組成的緩沖液中過Ultragel AcA 202柱除鹽。
于25℃用0.002ml溶于二甲基亞砜的順丁烯二酰亞胺基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Boehringer Mannheim GmbH)(33mg/ml)將依照a)所制備的Fab片段(即10mg溶于1ml濃度為0.01M/升的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中)活化2小時(shí)，然后離心并過AcA202柱脫鹽。
將這些片段與γ球蛋白合并(蛋白質(zhì)重量比為1∶1)，并于25℃、pH7.0條件下保溫1小時(shí)。然后于4℃，以蛋白濃度為2.5mg/ml對除鹽水透析過夜。
該結(jié)合物可直接用來吸附于固相上。
e.與熱處理的BSA偶聯(lián)的Fab片段的制備(根據(jù)本發(fā)明)。
熱處理的BSA(牛血清白蛋白)的制備于溫和攪拌下將1gBSA-Ⅰ溶解于100ml濃度為50mM/升的磷酸鉀(pH7.0)中，加熱到70℃，并在這一溫度保持4小時(shí)。將溶液冷卻、過濾并在一超濾器(排阻極限30，000道爾頓)中調(diào)到濃度為50mg/ml。然后對30倍體積的雙蒸水透析并凍干。產(chǎn)品的分子量約為700，000。
在與Fab片段偶聯(lián)前，先活化熱處理過的BSA。為此目的，將68mg熱處理的BSA溶解于2ml濃度為0.1M/升的磷酸鉀(pH7.8)中，并與3.8mgS-乙酰巰基琥珀酸酐(SAMSA)的溶液緩慢混合。反應(yīng)3小時(shí)后，對2升濃度為50mM/升的磷酸鉀溶液(pH6.5)透析。將該熱處理的BSA于25℃及pH7.0條件下與按照d)所述方法活化的Fab片段(重量比為1∶1)保溫1小時(shí)，然后于4℃并以2.5mg/ml的蛋白濃度對除鹽水透析過夜。該產(chǎn)品可直接用于包被。
f)與β-半乳糖苷酶偶聯(lián)的Fab片段的制備(依據(jù)本發(fā)明)。
按照J(rèn).Immunology，4，209-327/1983中所述的方法，將按d)所述方法活化的Fab片段與β-半乳糖苷酶的SH基偶聯(lián)。所用的β半乳糖苷酶的分子量為500，000至2×106。作另一實(shí)驗(yàn)時(shí)，則使用交聯(lián)的β-半乳糖苷酶(分子量約5×106)。
g)用Fab片段或其結(jié)合物裝填聚苯乙烯試管將50mg Fab片段或結(jié)合物的凍干品溶解于10ml雙蒸水中。取1ml該溶液加入1000ml裝填緩沖液(含5.25g/升磷酸二氫鈉和1g/升疊氮鈉)中稀釋，并于常溫下攪拌30分鐘。
將各個(gè)聚苯乙烯或Luran(制造商為BASF)試管均加入1.5ml溶液并保存過夜(約22小時(shí))。然后將試管完全排空并完成下述的功能試驗(yàn)。
h)通過TSH檢測進(jìn)行功能試驗(yàn)將按照g)所述方法裝填的聚苯乙烯和Luran試管用于類似TSH-Enzymun試驗(yàn)的TSH檢測試劑(Boehringer Mannheim GmbH，序號(hào)736，082)，并按照試驗(yàn)程序測出校正曲線。由此得到如下列表1及附圖1中所示的測定值。
可以看出(由圖1)，沒有加蛋白時(shí)，被固定的Fab片段只給出很平坦的校正曲線(曲線1和2)。如與分子量低于500，000且疏水性低的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，則校正曲線(曲線3)稍為陡些，但仍不能得到令人滿意的結(jié)果。另一方面，對使用按本發(fā)明的方法制備的結(jié)合物，則可得到足夠陡的校正曲線(曲線4)。
表1各種Fab〔TSH〕結(jié)合物的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值
＊在吸附情況下蛋白質(zhì)的總量每管1.5ml，5ug蛋白質(zhì)/ml;
＊＊Tp〔分鐘〕，參見實(shí)施例3;
1測定曲線的最低值(應(yīng)盡可能地低);
2測定曲線的最高值(應(yīng)盡可能地高)。
實(shí)施例2抗生蛋白鏈菌素的固定a)交聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素的制備按與實(shí)施例1b相似的方法交聯(lián)抗生蛋白鏈菌素(制造商Boehringer Mannheim GimbH)。
b)與BSA或β-半乳糖苷酶結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素的制備按與實(shí)施例1f相似的方法完成與未交聯(lián)的BSA或β-半乳糖苷酶結(jié)合。
c)與熱處理的BSA偶聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素的制備抗生蛋白鏈菌素的活化將60mg抗生蛋白鏈菌素溶解于6ml磷酸鉀(50mM/升)/氯化鈉(100mM/升)(pH7.0)中并于4℃儲(chǔ)存。將6.16mg順丁烯二酰亞胺基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯溶解于620ul二噁烷中并于攪拌下加到抗生蛋白鏈菌素溶液中。于4℃反應(yīng)2小時(shí)后，于4℃對1升磷酸鉀(50mM/升)/氯化鈉(100mM/升)(pH5)透析兩次。
抗生蛋白鏈菌素和熱處理的BSA的結(jié)合物的制備將66mg抗生蛋白鏈菌素溶解于10ml磷酸鉀(50mM/升)(pH5.0)和氯化鈉(100mM/升)中，并向其中加入溶于5ml磷酸鉀(50mM/升)/氯化鈉(100mM/升)(pH6.5)中的活化的熱處理過的BSA-SAMBA(依照實(shí)施例1e制備)?；旌虾螅蚱渲屑尤?0ml羥胺(1M/升)(pH7.0)，以終止反應(yīng)。3小時(shí)后，通過凝膠層析
(Superose 6，50mM/升磷酸鉀/100mM/升氯化鈉;pH7.5)純化反應(yīng)產(chǎn)物。由此得到分子量為1至5×106的結(jié)合物。
d)用抗生蛋白鏈菌素裝填聚苯乙烯和Luran試管按實(shí)施例1g)中所述的方法進(jìn)行裝填。
e)通過TSH檢測來測定標(biāo)準(zhǔn)值將依照d)裝填的試管用于TSH Enzymun試劑(4倍結(jié)合物活性)。但不同于已述的方法是使用生物素化的MAB＜TSH＞代替固定化的抗體。該生物素化的MAB是根據(jù)J.A.C.S.，100，3585-3590/1978中所述的方法制備的。用于該試驗(yàn)的抗體濃度為每個(gè)試管加400ng，并加有其他試劑。
圖2中顯示了試驗(yàn)結(jié)果。由圖中可以看出，隨著分子量增加和疏水性增加，校正曲線的斜率增加，并因而使可達(dá)到的準(zhǔn)確度增加。
實(shí)施例3用依照本發(fā)明的方法裝填的試管進(jìn)行T3試驗(yàn)。為此目的。在一已用與熱處理的BSA偶聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素包被的試管中，將200ul樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液與500ul用POD標(biāo)記的抗T3多克隆抗體結(jié)合物一起預(yù)保溫。5分鐘后，將按已知方法生物素化的聚合的T3400ug加在500ul緩沖液中保溫30分鐘。作為緩沖液，使用了含0.20%BSA和0.04%8-苯胺基-1-萘磺酸(ANA)的pH8.65的磷酸氫鈉溶液。保溫后洗三次，然后向其中加入1mlABTs底物溶液。繼續(xù)保溫30分鐘，用光度計(jì)測定405nm消光率。所得測定值以圖3所示的曲線給出。
實(shí)施例4用依照本發(fā)明的方法制備的試管進(jìn)行HBSAg試驗(yàn)。為此目的，在依據(jù)實(shí)施例1g)包被的試管中同時(shí)溶解400ng抗HBs抗原的生物素化的單克隆抗體及50mU用POD抗記的同一抗體，并向其中加入1ml如實(shí)施例3中所述的同種組分。以及200ul標(biāo)準(zhǔn)溶液。所加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液，一方面是純化的HBsAg ay亞型，另一方面是純化的HBsAg ad亞型。然后在常溫下保溫4小時(shí)。將試管洗三次后，向其中加入1mlABTS底物溶液。20分鐘后，終止反應(yīng)并在光度計(jì)中測定405nm處的消光率。測定值可由圖4看出，其中連續(xù)的曲線給出HBsAg ad亞型的數(shù)值;不連續(xù)的曲線給出HBsAg ay亞型的值。
實(shí)施例5比較按本發(fā)明方法包被的試管與按已知方法包被的試管的溶除作用。為此目的，一方面用1.5ml抗生蛋白鏈菌素-熱處理的BSA溶液(4ug/ml，于40mM磷酸氫鈉緩沖液(pH7.4)中)裝填試管(20℃，18至24小時(shí))。吸出試管內(nèi)容物，于20℃用1.8ml含0.9%氰化鈉和0.3%BSA的2%蔗糖溶液進(jìn)行后處理30分鐘。然后于20℃和40%相對濕度下將試管干燥24小時(shí)。這些試管就可以用以進(jìn)行這一試驗(yàn)了。另外，按已知方法用抗生蛋白鏈菌素裝填試管。在有去污劑作用的情況下，試驗(yàn)這些試管的溶除引為。下列表2中給出了所得結(jié)果
按照普通技術(shù)人員已知的方法檢測百分溶除，如用125Ⅰ標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素和抗生蛋白鏈菌素-熱處理的BSA，或用酶學(xué)檢測法。
就百分溶除的酶學(xué)檢測法來說，是將已包被的試管與50mM/升磷酸鉀緩沖液(pH7.0)保溫，在緩沖液中加有表Ⅱ中所示的去污劑并于表Ⅱ所述的條件下完成試驗(yàn)。
然后在常溫下保溫1小時(shí)，用上述緩沖液洗滌并于常溫下與生物素POD(200mU/mlPOD活性)的結(jié)合物保溫1小時(shí)，洗滌后向其中加2mlABTs
溶液(見實(shí)施例7)。底物反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)后，測定405nm處消光率，通過標(biāo)準(zhǔn)校正曲線由消光率數(shù)值確定抗生蛋白鏈菌素和抗生蛋白-熱處理BSA的百分溶除。
實(shí)施例6用疏水相互作用層析法(HIC)檢測蛋白的疏水性用液相層析儀(Hewlett Packard 10%LUSI)研究各種化合物的疏水性。預(yù)層析柱是BioRad Biogel TSK-phenyl-5PW柱(長5mm×內(nèi)徑4.6mm)。層析柱BioRad-Biogel TSK-phenyl-5PW(長7.5mm×內(nèi)徑7.5mm，10um，1000A)。所用檢測儀器是Hitachi F1000熒光計(jì)。洗脫液/梯度(見表3)。
a)0.01M/升磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)中含1.5M/升硫酸銨。
b)0.01M/升磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)。
表3A% B% t/分鐘100 0 0100 0 50 100 流速30-0.5分鐘0 100 5100 0 5100 0 5工作溫度冷室+7℃樣品制備使用未稀釋的樣品。樣品體積為10ul。
以濃度為0.2至1.4mg/ml將被研究的化合物溶解于10mM/升磷酸鉀緩沖液(pH6.8)中。
下列表4總結(jié)了各種蛋白質(zhì)和可特異結(jié)合的物質(zhì)的滯留時(shí)間。滯留時(shí)間越長，則疏水性越大。
表4蛋白質(zhì) 滯留時(shí)間tp(分鐘)Fab TSH 41.5BSA 23.2γ-球蛋白 32.0β-半乳糖苷酶 39.6交聯(lián)的β半乳糖苷酶 40.2抗生蛋白鏈菌素 38.3熱處理的BSA(實(shí)施例1e) 未能洗脫γ-球蛋白，交聯(lián)的 未能洗脫(實(shí)施例1a)在這些條件下不能洗脫的蛋白質(zhì)是特別適用的并優(yōu)先被采用，而特別優(yōu)選的是熱處理的BSA。
實(shí)施例7處理的BSA-抗生蛋白鏈菌素在玻璃纖維絮狀物上的吸附將玻璃纖維絮狀物(6×6mm)，其吸附體積約30ul，用濃度為30ug/ml的熱處理的BSA-抗生蛋白鏈菌素(依照實(shí)施例2c制備的)(在50nm/升磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中)沉浸，并于50℃循環(huán)干燥器中干燥。
為測定生物素結(jié)合能力，用30ul含過氧化物酶(POD)和生物素之結(jié)合物的試劑(POD活性為50mU/ml，生物素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5、10、20、30、40、50、100、200、1000ng/ml生物素)沉浸硝酸纖維素印跡條并保溫2分鐘。然后用含2%O-Tween-20的過量的50mM/升磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗一次，繼之將100mM/升檸檬酸鹽緩沖液(pH4.4)、3.2mM/升過硼酸鹽、1.9M/升ABTA
(2，2′-連氮基-二〔3-乙基-苯并噻唑啉磺酸(6)〕-二銨鹽引入2mlABTS溶液中并攪拌15分鐘。底物反應(yīng)1小時(shí)后，測定405nm處的消光率，并由測得數(shù)值通過半最大標(biāo)記滴數(shù)(semimaximum signal drop)確定生物素結(jié)合能力。
權(quán)利要求
1.制備結(jié)合于不溶性載體材料之可特異結(jié)合的蛋白質(zhì)物質(zhì)的方法，特別是用于根據(jù)免疫學(xué)原理進(jìn)行異質(zhì)性分析的方法，其中將分子量大于500，000、比可特異結(jié)合的物質(zhì)有更大疏水性的可溶性蛋白質(zhì)與可特異結(jié)合的物質(zhì)相偶聯(lián)，然后使反應(yīng)組分與蛋白質(zhì)的結(jié)合物吸附于疏水固相上。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所用的可溶性蛋白的分子量為500，000至20×106。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中可溶性蛋白是由分子量為10，000至70，000的蛋白質(zhì)將分子量增加到大約500，000至20×106制得的。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求
之任一項(xiàng)的方法，其中于偶聯(lián)前，將蛋白質(zhì)與雙或多功能蛋白試劑交聯(lián)，直至達(dá)到所要求的分子量。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求
之任一項(xiàng)的方法，其中使用了經(jīng)疏水化處理的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中，于偶聯(lián)前，經(jīng)加熱、用酸、變性劑或離液序列高的陰離子處理和/或與疏水化合物化學(xué)偶聯(lián)，使蛋白質(zhì)成為疏水性的。
7.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中辛二酸二琥珀酰亞胺酯被用作雙功能化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求
3至7中任一項(xiàng)的方法，其中所用蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白、脂酶和/或免疫γ球蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1的制備與不溶性載體材料結(jié)合之可特異結(jié)合的蛋白質(zhì)物質(zhì)的方法，基本上是如說明書中所描述和舉例說明的。
10.依照權(quán)利要求
1至9中任一項(xiàng)的方法制備的與不溶性載體材料結(jié)合的可特異結(jié)合的蛋白質(zhì)物質(zhì)。
11.依照權(quán)利要求
1至9中任何一項(xiàng)的方法制備的用于固相免疫檢測的載體材料，其中載體材料構(gòu)成了吸附于分子量約500，000以上的疏水蛋白質(zhì)與可特異結(jié)合的蛋白質(zhì)物質(zhì)所成結(jié)合物上的疏水固相。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的載體材料，其中疏水固相由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚四氟乙烯或苯乙烯與丙烯腈的共聚物構(gòu)成。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11或12的載體材料，其中蛋白質(zhì)是疏水化處理的牛血清白蛋白(熱處理的BSA)、疏水化處理的脂酶或疏水化處理的免疫γ球蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求
11至13中任一項(xiàng)的載體材料，其中可特異結(jié)合的物質(zhì)是抗原或抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求
11至13任一項(xiàng)的載體材料，其中可特異結(jié)合的物質(zhì)是抗生蛋白的鏈菌素或抗生物素蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求
11至15中任一項(xiàng)的載體材料，其中載體是玻璃纖維絮狀物或由纖維素-/纖維素酯纖維和多聚物纖維制成的纖維絮狀物。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種制備結(jié)合于不溶性載體材料的可特異結(jié)合之蛋白質(zhì)物質(zhì)的方法，特別是依據(jù)免疫試驗(yàn)原理用于異質(zhì)性分析方法中，其中包括將分子量大于500,000左右、疏水性大于可特異結(jié)合物質(zhì)的可溶性蛋白質(zhì)與可特異結(jié)合的物質(zhì)偶聯(lián)，然后使反應(yīng)組分和蛋白質(zhì)的結(jié)合物吸附于疏水的固相上。還提供了適用于該方法的載體材料，其中它構(gòu)成了吸附于上述結(jié)合物上的疏水固相。
文檔編號(hào)G01N33/74GK87107982SQ87107982
公開日1988年6月15日 申請日期1987年11月25日
發(fā)明者威爾海姆·蒂施爾, 約瑟夫·梅爾, 羅爾夫·迪格 申請人:伯倫格·曼海姆有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan