專利名稱:用于測(cè)定靶物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定分子的方法。更具體地,本發(fā)明涉及一種借助于適體來(lái) 測(cè)定分子的方法。
背景技術(shù):
生物傳感器由能夠識(shí)別分子的材料和檢測(cè)由該材料與靶化學(xué)物質(zhì)之間的相互作 用引起的物理和/或化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換器構(gòu)成。能夠識(shí)別分子的傳統(tǒng)材料為諸如酶、抗體和 受體的蛋白質(zhì)。文獻(xiàn)1 (BUNSEKI KAGAKU Vol. 51,No. 6,(2002)389-396)披露了一種借助于表面細(xì) 胞質(zhì)基因共振(SPR)傳感器來(lái)高速篩選內(nèi)分泌擾亂化學(xué)藥品的方法。這種方法包括將雌激 素響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)的激素響應(yīng)序列DNA(ERE)固定在Sra傳感器芯片上,并向其中加入 純化的雌激素受體α (ER),從而在沒有修飾的情況下實(shí)時(shí)測(cè)量ER與ERE的相互作用。不幸的是,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)由于其化學(xué)和熱不穩(wěn)定性而在壽命上受到限制,并且它們 經(jīng)受了非特性吸附,所以它們不適合于長(zhǎng)期使用。引人注意的是蛋白質(zhì)的代替物為適體,其為核酸序列,該核酸序列對(duì)于從低分子 量化合物至蛋白質(zhì)范圍的抗原引起像抗體一樣的特異性結(jié)合。由于不是蛋白質(zhì),所以適體 在穩(wěn)定性和壽命方面具有優(yōu)勢(shì)。此外,由于其在比較溫和的條件下用于再生的能力、其通過 化學(xué)合成用于經(jīng)濟(jì)上批量生產(chǎn)的潛力、以及其諸如與互補(bǔ)鏈可逆的結(jié)合和解離的核酸的性 能特性,所以期望將其用作生物傳感器。文獻(xiàn)2 (J.Am. Chem. Soc. 128,(2006)3138-3139)披露 了一種電化學(xué)方法,用于觀 察由于當(dāng)利用亞甲藍(lán)修飾適體的末端時(shí)作為靶物質(zhì)的可卡因的存在而在適體的結(jié)構(gòu)中發(fā) 生的變化。
發(fā)明內(nèi)容
不幸地,文獻(xiàn)2 (J. Am. Chem. Soc. 128,(2006) 3138-3139)中披露的方法具有不能 夠區(qū)分由于適體與靶物質(zhì)的結(jié)合而引起其結(jié)構(gòu)變化的適體與由于在其分子中的雙鏈的形 成而引起的結(jié)構(gòu)變化(下文中,稱作自退火)的適體的缺點(diǎn),這導(dǎo)致了與已經(jīng)進(jìn)行了自退火 的適體的量成比例的更高的噪聲水平以及因此導(dǎo)致更高的檢測(cè)極限。鑒于上述想法完成了本發(fā)明,以提供一種借助于適體來(lái)對(duì)靶物質(zhì)(target substance)進(jìn)行高度敏感測(cè)定的方法。根據(jù)本發(fā)明,上述技術(shù)問題是通過用于測(cè)定靶物質(zhì)的方法來(lái)解決的,所述方法包 括使能夠與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的適體、與靶物質(zhì)和具有與適體的至少一部分互補(bǔ)的堿基 序列的核酸鏈競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合;檢測(cè)由適體與核酸鏈的結(jié)合所引起的物理變化和化學(xué)變化中的 至少任一個(gè);并且基于檢測(cè)結(jié)果來(lái)測(cè)定靶物質(zhì)。另外,本發(fā)明所涉及的靶物質(zhì)應(yīng)該在廣義上理解成不僅包括分子,而且還包括離 子。而且,“適體”表示DNA分子或與特定分子特異性結(jié)合的肽。
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根據(jù)本發(fā)明,適體應(yīng)該優(yōu)選為被固定在傳感器的檢測(cè)表面上的適體。在這種情況下,傳感器應(yīng)該優(yōu)選為基于表面細(xì)胞質(zhì)基因共振的原理進(jìn)行檢測(cè)并能 夠檢測(cè)由適體與核酸鏈的結(jié)合引起的介電常數(shù)的變化的傳感器。此外,傳感器應(yīng)該優(yōu)選為 基于石英晶體微量天平的原理進(jìn)行檢測(cè)并能夠檢測(cè)由適體與核酸鏈的結(jié)合引起的質(zhì)量變 化的傳感器。根據(jù)本發(fā)明的方法,適體應(yīng)該優(yōu)選為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop structure)的適 體,并且核酸鏈應(yīng)該優(yōu)選為具有與適體的非莖部互補(bǔ)的堿基序列的核酸鏈。至少具有與適 體的非莖部(non-stem portion)互補(bǔ)的堿基序列,核酸鏈與已經(jīng)進(jìn)行自退火的適體結(jié)合, 并解開適體的自退火。另外,在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“非莖部”表示排除了莖環(huán)結(jié)構(gòu)從而形成互補(bǔ)鏈的 適體的部分,并且其表示具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀部和沒有形成互補(bǔ)鏈的膨脹部。此外,根據(jù)本發(fā)明的方法,核酸鏈應(yīng)該優(yōu)選為具有與適體非互補(bǔ)的堿基序列的核 酸鏈,或者適體和核酸鏈中的至少任一種應(yīng)該優(yōu)選為具有取代基從而增強(qiáng)由適體與核酸鏈 的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種。以這種方式構(gòu)造的互補(bǔ)鏈產(chǎn)生了期望 的效果,即,核酸鏈與適體的結(jié)合引起用于更高的檢測(cè)敏感度的顯著的物理變化和化學(xué)變 化。另外,核酸鏈可以為被固定在傳感器的檢測(cè)表面上的核酸鏈。在這種情況下,傳感器以傳感器檢測(cè)由核酸鏈與適體的結(jié)合引起的介電常數(shù)變化 的方式基于表面細(xì)胞質(zhì)基因共振的原理來(lái)進(jìn)行檢測(cè)??商鎿Q地,傳感器以傳感器檢測(cè)由核 酸鏈與適體的結(jié)合引起的質(zhì)量變化的方式基于石英振蕩器微量天平的原理來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。最后,本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)的的方法,所述方法包括以下步 驟在檢測(cè)表面上固定能夠與靶物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的適體;通過適體與樣品中的靶物質(zhì) 和具有與適體的至少一部分互補(bǔ)的堿基序列的核酸鏈的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)檢測(cè)由適體與核酸 鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種;通過適體與規(guī)定量的靶物質(zhì)和規(guī)定 量的核酸鏈的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,檢測(cè)由適體與核酸鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至 少任一種,從而知道靶物質(zhì)的量與檢測(cè)結(jié)果之間的關(guān)系;以及估算樣品中靶物質(zhì)的量。
圖1是示出了關(guān)于本發(fā)明的方法的示意圖。圖2是示出了用于關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實(shí)施方式的流程圖。圖3是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實(shí)施方式中的第一步驟的示意圖。圖4是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實(shí)施方式中的第二步驟的示意圖。圖5是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實(shí)施方式中的第三步驟的示意圖。圖6是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實(shí)施方式中的第四步驟的示意圖。圖7是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法中所使用的優(yōu)選核酸鏈的一個(gè)實(shí)例的示意圖。圖8是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法中所使用的優(yōu)選核酸鏈的另一個(gè)實(shí)例的示意 圖。圖9是示出了用于關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實(shí)施方式的流程圖。圖10是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實(shí)施方式中的第一步驟的示意
4圖。圖11是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實(shí)施方式中的第二步驟的示意 圖。圖12是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實(shí)施方式中的第三步驟的示意 圖。圖13是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實(shí)施方式中的第四步驟的示意 圖。圖14是示出了用于關(guān)于本發(fā)明的方法的第三優(yōu)選實(shí)施方式的示意圖。圖15是示出了適體細(xì)胞(在本發(fā)明實(shí)施例中所使用的)與參考細(xì)胞之間的sra 角位移的差異的曲線圖。圖16是示出了其中繪制在每個(gè)膽酸甲酯濃度(在本發(fā)明的實(shí)施例中)下的峰位 移值與空白的峰位移值之間的差異的曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面為參照附圖給出的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的描述。應(yīng)當(dāng)注意,實(shí)施方式僅為 典型實(shí)例,不應(yīng)該理解為限制本發(fā)明的范圍。圖1是示出了用于測(cè)定根據(jù)本發(fā)明的靶物質(zhì)的方法的示意圖?!癟”表示靶物質(zhì), “A”表示與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的適體,并且“N”表示具有與適體A的至少一部分互補(bǔ)的堿基 序列的核酸鏈。根據(jù)本發(fā)明的方法期望通過使與靶物質(zhì)T特異性結(jié)合的適體A與靶物質(zhì)T和具有 與適體A的至少一部分互補(bǔ)的堿基序列的核酸鏈N進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)測(cè)定靶物質(zhì)T (參見 圖1 (1))。在這種狀態(tài)下,適體A與核酸鏈N的結(jié)合至少引起物理變化和化學(xué)變化中的任一 種被檢測(cè)到(參見圖1(2))。檢測(cè)的結(jié)果被用于測(cè)定靶物質(zhì)T。由適體A與核酸鏈N結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種的檢測(cè)提供了即 使在例如靶物質(zhì)T為低分子量(當(dāng)與適體A結(jié)合時(shí),不會(huì)引起可以以充分高的靈敏度被檢 測(cè)的物理變化和化學(xué)變化中的任一種)的情況下也允許靶物質(zhì)T的檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。另外,上述程序排除了由適體A的自退火所產(chǎn)生的影響。這導(dǎo)致由于經(jīng)受了自退 火的適體A所引起的噪聲的降低。下面逐步描述適合于根據(jù)本發(fā)明的方法的第一實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)注意,圖2是示出 了用于關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實(shí)施方式的流程圖,并且圖3至圖6是示出了在關(guān)于 本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方式中的每一步驟的示意圖。另外,這些圖中示出了傳感器的檢 測(cè)表面1和接頭11。 第一步驟為將規(guī)定量的適體A弓I入到檢測(cè)表面1上。適體A具有用于固定在檢測(cè) 表面1上的末端官能團(tuán)。固定在檢測(cè)表面1上是通過經(jīng)由接頭11的連接來(lái)發(fā)生的(參見 用于第一步驟的圖3)。下一步驟為將包含靶物質(zhì)T和核酸鏈N的樣品引入至其上固定了適體A的檢測(cè)表 面1。通過兩者與適體A的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,由適體A與核酸鏈N的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué) 變化中的至少任一種被檢測(cè)到(參見用于第二步驟的圖4)。通過以以下方式制備的校準(zhǔn)曲線來(lái)估算樣品中的靶物質(zhì)T的量。其上固定了適體A的檢測(cè)表面1被設(shè)置有規(guī)定量的靶物質(zhì)T和規(guī)定量的核酸鏈N,使得它們與適體A競(jìng)爭(zhēng)性 結(jié)合。在這種條件下,適體A與核酸鏈的結(jié)合引起其中的至少任一種被檢測(cè)的物理變化和 化學(xué)變化。通過將核酸鏈N的量保持恒定并改變靶物質(zhì)T的量來(lái)重復(fù)用于檢測(cè)的該程序, 使得檢測(cè)結(jié)果與所引入的靶物質(zhì)T的量相關(guān)。因此,獲得了校準(zhǔn)曲線(參見用于第三步驟 的圖5)。在上面所提及的第三步驟中所獲得的關(guān)系允許通過在上述第二步驟中的檢測(cè)結(jié) 果來(lái)估算樣品中靶物質(zhì)T的量(參見用于第四步驟的圖6)。下面為本發(fā)明的第一實(shí)施方式的詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明的方法并不具體限定于用于由適體A與核酸鏈N的結(jié)合所引起的物理 變化和化學(xué)變化中的至少任一種的檢測(cè)的目的。物理變化的典型實(shí)例包括介電常數(shù)和質(zhì)量 的變化。化學(xué)變化的典型實(shí)例包括適體A的結(jié)構(gòu)變化和適體A的分子內(nèi)部鍵的鍵強(qiáng)度的變 化。根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選借助于具有在其檢測(cè)表面1上所固定的適體A并允許物理變化 和化學(xué)變化中的任一種作為適體A與核酸鏈N結(jié)合的結(jié)果發(fā)生的傳感器來(lái)檢測(cè)由適體A與 核酸鏈N結(jié)合所引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種。用于檢測(cè)的手段(方式)并不限 制于該實(shí)施方式中所使用的手段。因?yàn)椴恍枰ㄟ^諸如染料的不穩(wěn)定標(biāo)記物來(lái)修飾適體A 和核酸鏈N,所以上述的方式是期望的。也因?yàn)槠湓试S重復(fù)檢測(cè),只要檢測(cè)表面1被再生即 可,所以是期望的。如上所述,傳感器被用于檢測(cè)由適體A與核酸鏈N的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué) 變化中的任一種。這種傳感器不被具體限定,只要其能夠檢測(cè)由所固定的適體A與核酸鏈 N的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種。其典型實(shí)例包括基于表面細(xì)胞質(zhì)基因共 振(下文中,簡(jiǎn)稱為SPR)原理的傳感器以及基于石英晶體微量天平(下文中,簡(jiǎn)稱為QCM) 原理的傳感器。基于SI^R原理的檢測(cè)憑借當(dāng)適體A(被固定在檢測(cè)表面1上)與核酸鏈N結(jié)合時(shí)發(fā) 生的介電常數(shù)的變化。具體而言,當(dāng)適體A(被固定在檢測(cè)表面1上)與核酸鏈N結(jié)合時(shí), 介電常數(shù)變化,并且這種介電常數(shù)的變化以由于表面細(xì)胞質(zhì)基因共振所引起的反射光的強(qiáng) 度的衰減峰角度的變化的方式被觀察到。因此,基于sra原理的檢測(cè)依賴于由適體A與核 酸鏈N的結(jié)合導(dǎo)致的介電常數(shù)的變化量來(lái)改變靈敏度?;赒CM的原理的檢測(cè)憑借當(dāng)適體A (被固定在檢測(cè)表面1上)與核酸鏈N結(jié)合 時(shí)發(fā)生的質(zhì)量的變化。具體而言,當(dāng)適體A (被固定在檢測(cè)表面1上)與核酸鏈N結(jié)合時(shí), 質(zhì)量變化,并且這種質(zhì)量的變化以由于石英振蕩器的壓電效應(yīng)所引起的共振頻率的變化的 方式被觀察到。因此,基于QCM原理的檢測(cè)依賴于由適體A與核酸鏈N的結(jié)合導(dǎo)致的質(zhì)量 的變化量來(lái)改變靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定的靶物質(zhì)T沒有特別限定。例如,它包括蛋白質(zhì)、核酸、激 素、環(huán)境激素以及藥物。在這些實(shí)例中,優(yōu)選的是低分子量化合物形式的激素、環(huán)境激素以 及藥物。由于在借助于諸如SI^R傳感器和QCM傳感器的生物傳感器的直接檢測(cè)中介電常數(shù) 或質(zhì)量的變化較小,所以常常不能高靈敏度地測(cè)定具有低分子量的激素、環(huán)境激素以及藥 物。即使在這種情況下,也可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法以高靈敏度來(lái)檢測(cè)諸如激素、環(huán)境激 素以及藥物的低分子量化合物。
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在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的適體A是與靶物質(zhì)T特異性結(jié)合的分子(諸如核 酸)。其沒有具體限定,只要其與靶物質(zhì)T特異性結(jié)合即可。它包括DNA適體、RNA適體、肽 適體、PNA (肽核酸)等。根據(jù)本發(fā)明的方法被設(shè)計(jì)成檢測(cè)由適體A與核酸鏈N的結(jié)合所導(dǎo)致的物理變化和 化學(xué)變化中的任一種;因此,它可以減小由于自退火的適體A所引起的噪聲。這允許在本發(fā) 明的方法中的檢測(cè)靈敏度的改善,而沒有由于適體A的量的增加而引起噪聲增加。根據(jù)本發(fā)明的方法,適體A以任意方式被固定在檢測(cè)表面1上,而沒有具體的限 定。存在如下列出的幾種固定方式。通過由修飾適體A的末端基團(tuán)的抗生物素蛋白與修飾 檢測(cè)表面1的生物素之間的反應(yīng)引起的抗生物素蛋白_生物素連接的固定。通過由適體A 的胺化末端基團(tuán)與修飾檢測(cè)表面1的羧酸之間的反應(yīng)引起的酰胺基連接的固定。通過由 適體A的硫醇化末端基團(tuán)與構(gòu)成檢測(cè)表面1的貴金屬之間的反應(yīng)引起的硫醇金屬連接的固 定。通過由用于修飾適體A的末端基團(tuán)的蛋白質(zhì)與由容易吸附蛋白質(zhì)的材料制成的檢測(cè)表 面1之間的反應(yīng)引起的蛋白質(zhì)物理吸附的固定。本發(fā)明的方法對(duì)適體A的量沒有任何限定,適體A的量可以根據(jù)所要測(cè)定的靶物 質(zhì)τ的種類和濃度而適當(dāng)?shù)卮_定。被固定在檢測(cè)表面1上的適體A的量沒有具體限定。在本發(fā)明的方法中所使用的核酸鏈N具有與適體A的至少一部分互補(bǔ)的堿基序 列,使得核酸鏈N與適體A結(jié)合,從而引起物理變化和化學(xué)變化,為了靶物質(zhì)T的測(cè)定而測(cè) 量物理變化和化學(xué)變化中的任一種。核酸鏈N沒有具體限定與適體A互補(bǔ)的堿基序列的堿基的數(shù)目?;パa(bǔ)堿基序列的 堿基數(shù)目的變化導(dǎo)致適體A與核酸鏈N之間的雙鏈鍵的平衡常數(shù)的變化。由此可以調(diào)整靈 敏度。核酸鏈N沒有特別限于與適體A互補(bǔ)的堿基序列。如果適體A具有莖環(huán)結(jié)構(gòu),則 核酸鏈N應(yīng)當(dāng)優(yōu)選具有與適體A的非莖部的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列,使其從自退火適體 A的非莖部分開始與適體A有效地結(jié)合。這導(dǎo)致靈敏度的改善。換句話說,存在這樣的情況,其中,自退火的適體A(其具有莖環(huán)結(jié)構(gòu))并不與靶物 質(zhì)T結(jié)合,因此,對(duì)檢測(cè)沒有貢獻(xiàn)。類似于此的適體A在檢測(cè)時(shí)引起噪聲。在這種情況下, 具有與適體A的非莖部的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸鏈N解開具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的自退火 適體A的自退火,從而有助于檢測(cè)。此外,它也減少了自退火的適體A,從而降低了噪聲并改 善了檢測(cè)靈敏度(參見圖8)。在核酸鏈N具有與適體A的非莖部的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的情況下,與適體A 的非莖部的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的堿基數(shù)目沒有特別限制;然而,期望的數(shù)目不小于 4。這種條件對(duì)于核酸鏈N與適體A的非莖部的有效結(jié)合是必須的。另外,當(dāng)其與靶物質(zhì)T結(jié)合時(shí),核酸鏈N應(yīng)該優(yōu)選具有與靶物質(zhì)T作用最強(qiáng)的堿基 序列(在適體A的堿基序列中)的部分互補(bǔ)的堿基序列。與靶物質(zhì)T結(jié)合的適體A的堿基 序列的所述部分在與靶物質(zhì)T結(jié)合時(shí)變得穩(wěn)定。因此,具有與所述部分互補(bǔ)的堿基序列的 核酸鏈N容易與還沒有與靶物質(zhì)T結(jié)合的適體A結(jié)合(參見圖7 (1)),但很難與已經(jīng)與靶物 質(zhì)T結(jié)合的適體A結(jié)合(參見圖7(2))。在核酸鏈N具有與結(jié)合了靶物質(zhì)T的適體A的堿基序列部分互補(bǔ)的堿基序列的情 況下,與結(jié)合了靶物質(zhì)T的適體A的部分互補(bǔ)的堿基序列的堿基數(shù)目沒有特別限制。
另外,在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的核酸鏈N沒有具體限定,只要其具有與適 體A的至少一部分互補(bǔ)的堿基序列即可。然而,其優(yōu)選為具有與適體A非互補(bǔ)的堿基序列 的核酸鏈N。當(dāng)其與適體A結(jié)合時(shí),具有與適體A非互補(bǔ)的堿基序列的核酸鏈N引起介電常 數(shù)和質(zhì)量的較大變化。這導(dǎo)致靈敏度的改善。此外,對(duì)于當(dāng)與適體A結(jié)合時(shí)為了改善靈敏度而引起介電常數(shù)和質(zhì)量的較大變化 的核酸鏈而言,可以通過增大當(dāng)適體A與核酸鏈N結(jié)合時(shí)發(fā)生的物理變化和化學(xué)變化中的 至少任一種的取代基來(lái)修飾適體A和核酸鏈N中的至少任一種。這種取代基沒有具體限定, 而是可以根據(jù)用于檢測(cè)的手段而適當(dāng)?shù)剡x擇。例如,在適體A被固定在基于SPR的原理執(zhí) 行檢測(cè)的傳感器的表面上的情況下,核酸鏈可以具有通過介電材料修飾的末端基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的方法在核酸鏈N的量方面沒有特別限定,核酸鏈N的量可以根據(jù)適 體A和核酸鏈N的結(jié)構(gòu)以及所要引入的靶物質(zhì)T的量適當(dāng)?shù)卮_定。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法讓適體A與靶物質(zhì)T和核酸鏈N競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合時(shí),對(duì)引入靶物 質(zhì)T和核酸鏈N的順序沒有施加具體限定。例如,可以同時(shí)引入靶物質(zhì)T和核酸鏈N。而 且,當(dāng)借助于傳感器檢測(cè)由適體A與核酸鏈N的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少 任一種時(shí),靶物質(zhì)T可以在核酸鏈N之前被引入,使得在適體A與核酸鏈N的結(jié)合達(dá)到平衡 之前可以快速獲得信號(hào)。下面為本發(fā)明的第二實(shí)施方式的逐步描述。它排除了與第一實(shí)施方式中相同的項(xiàng) 目,而是僅提及與第一實(shí)施方式中不同的項(xiàng)目。應(yīng)當(dāng)注意,圖9為用于關(guān)于本發(fā)明的方法的 第二優(yōu)選實(shí)施方式的流程圖,并且圖10至圖13是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施 方式中的每個(gè)步驟的示意圖。另外,在這些圖中示出了傳感器的檢測(cè)表面2和接頭21。第一步驟為將規(guī)定量的核酸鏈N固定在檢測(cè)表面2上。核酸鏈N具有用于在檢測(cè) 表面2上固定的末端官能團(tuán)。在檢測(cè)表面2上的固定通過接頭21的連接來(lái)進(jìn)行(參見用 于第一步驟的圖10)。接下來(lái)的步驟為將包含靶物質(zhì)T和適體A的樣品引入其上已經(jīng)固定了核酸鏈N的 檢測(cè)表面2。通過核酸鏈N和靶物質(zhì)T與適體A的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,由核酸鏈N與適體A的結(jié)合 引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種被檢測(cè)到(參見用于第二步驟的圖11)。通過以下面方式制作的校準(zhǔn)曲線來(lái)估算樣品中靶物質(zhì)T的量。其上固定有核酸鏈 N的檢測(cè)表面2設(shè)置有規(guī)定量的適體A和規(guī)定量的靶物質(zhì)T,使得它們與核酸鏈N競(jìng)爭(zhēng)性結(jié) 合。在這種條件下,核酸鏈N與適體A的結(jié)合引起物理變化和化學(xué)變化,檢測(cè)至少任一種變 化。通過將適體A的量保持恒定,并且改變靶物質(zhì)T的量來(lái)重復(fù)這種用于檢測(cè)的程序,使得 檢測(cè)的結(jié)果與所引入的靶物質(zhì)T的量相關(guān)。因此,獲得了校準(zhǔn)曲線(參見用于第三步驟的 圖 12)。在上面所提及的第三步驟中所獲得的關(guān)系允許通過在上述第二步驟中的檢測(cè)結(jié) 果來(lái)估算樣品中靶物質(zhì)τ的量(參見用于第四步驟的圖13)。下面為本發(fā)明第二實(shí)施方式的詳細(xì)描述。根據(jù)該實(shí)施方式,核酸鏈N被固定在傳感器的檢測(cè)表面2上,并且核酸鏈N與適體 A結(jié)合,從而引起物理變化和化學(xué)變化,其中的至少任一種通過傳感器檢測(cè)。因?yàn)椴恍枰?過諸如染料的不穩(wěn)定標(biāo)記物來(lái)修飾適體A和核酸鏈N,所以期望以這種方式的檢測(cè)。也因?yàn)?其允許重復(fù)測(cè)量,只要檢測(cè)表面2被再生即可,所以其也是期望的。
如上所述,傳感器被用于檢測(cè)由核酸鏈N與適體A的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué) 變化中的任一種。這種傳感器沒有具體限定,只要其能夠檢測(cè)由核酸鏈N與適體A的結(jié)合 引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種。它的典型實(shí)例包括基于Sra原理和QCM原理的傳 感器?;赟ra原理的檢測(cè)借助于當(dāng)核酸鏈N(被固定在檢測(cè)表面2上)與適體A結(jié)合 時(shí)發(fā)生的介電常數(shù)的變化。具體而言,當(dāng)核酸鏈N(被固定在檢測(cè)表面2上)與適體A結(jié)合 時(shí),介電常數(shù)變化,并且這種介電常數(shù)的變化以由于表面細(xì)胞質(zhì)基因共振所引起的反射光 的強(qiáng)度的衰減峰角度的變化的方式被觀察到。因此,基于SPR的原理的檢測(cè)依賴于由核酸 鏈N與適體A的結(jié)合導(dǎo)致的介電常數(shù)的變化量來(lái)改變靈敏度。基于QCM的原理的檢測(cè)借助于當(dāng)核酸鏈N(被固定在檢測(cè)表面2上)與適體A結(jié)合 時(shí)發(fā)生的質(zhì)量的變化。具體而言,當(dāng)核酸鏈N(被固定在檢測(cè)表面2上)與適體A結(jié)合時(shí), 質(zhì)量變化,并且這種質(zhì)量的變化以由于石英振蕩器的壓電效應(yīng)所引起的共振頻率的變化的 方式被觀察到。因此,基于QCM原理的檢測(cè)依賴于由核酸鏈N與適體A的結(jié)合導(dǎo)致的質(zhì)量 的變化量來(lái)改變靈敏度。核酸鏈N以任意方式被固定在檢測(cè)表面2上,而沒有具體的限定。存在如下列出 的幾種固定方式。通過由修飾核酸鏈N的末端基團(tuán)的抗生物素蛋白與修飾檢測(cè)表面2的生 物素之間的反應(yīng)引起的抗生物素蛋白-生物素連接的固定。通過由核酸鏈N的胺化末端基 團(tuán)與修飾檢測(cè)表面2的羧酸之間的反應(yīng)引起的酰胺基連接的固定。通過由核酸鏈N的硫醇 化末端基團(tuán)與構(gòu)成檢測(cè)表面2的貴金屬之間的反應(yīng)引起的硫醇金屬連接的固定。通過由修 飾核酸鏈N的末端基團(tuán)的蛋白質(zhì)與由容易吸附蛋白質(zhì)的材料制成的檢測(cè)表面之間的反應(yīng) 引起的蛋白質(zhì)物理吸附的固定。本發(fā)明的方法對(duì)適體A的量沒有任何限制,適體A的量可以根據(jù)待測(cè)定的靶物質(zhì) T的種類和濃度而適當(dāng)?shù)卮_定。可以通過改變適體A的濃度來(lái)改變用于靶物質(zhì)T的動(dòng)態(tài)范圍。此外,對(duì)于當(dāng)與核酸鏈結(jié)合時(shí)為了改善靈敏度而引起介電常數(shù)和質(zhì)量的較大變化 的適體A而言,可以通過增大當(dāng)適體A與核酸鏈N結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的物理變化和化學(xué)變化中的 任一種的取代基來(lái)修飾適體A和核酸鏈N中的至少任一種。這種取代基沒有具體限定,而 是可以根據(jù)用于檢測(cè)的手段而適當(dāng)?shù)剡x擇。例如,在核酸鏈ν被固定在基于sra原理進(jìn)行 檢測(cè)的傳感器的表面上的情況下,適體A可以具有通過介電材料所修飾的末端基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的方法的核酸鏈N(被固定在傳感器的檢測(cè)表面2上)的量沒有特別 限定,核酸鏈N的量可以根據(jù)適體A和核酸鏈N的結(jié)構(gòu)以及待引入的靶物質(zhì)T的量而適當(dāng) 地確定。根據(jù)該實(shí)施方式,對(duì)將靶物質(zhì)T和適體A引入到檢測(cè)表面2上的順序沒有特別的 限制。例如,可以同時(shí)引入靶物質(zhì)T和適體A。也可以優(yōu)先使靶物質(zhì)T與適體A反應(yīng),然后 將反應(yīng)產(chǎn)物引入到核酸鏈N中,使得以在靶物質(zhì)T與適體A之間已經(jīng)達(dá)到反應(yīng)平衡的這種 狀態(tài)來(lái)完成檢測(cè)。這樣可高靈敏度地測(cè)定靶物質(zhì)T。下面為本發(fā)明的第三實(shí)施方式的描述。它排除了與第一和第二實(shí)施方式中相同的 項(xiàng)目,而是僅提及與第一和第二實(shí)施方式中不同的項(xiàng)目。圖14為用于第三實(shí)施方式的示意 圖,其中,“F”表示熒光染料,并且“Q”表示猝滅熒光染料Q的猝滅劑。
根據(jù)該實(shí)施方式,適體A與核酸鏈N結(jié)合,從而引起物理變化和化學(xué)變化,借助于 熒光染料F和猝滅熒光染料F的猝滅劑Q (兩者均修飾適體A的堿基序列)檢測(cè)物理變化 和化學(xué)變化中的至少任一種。當(dāng)適體A被連接至靶物質(zhì)T或處于自退火狀態(tài)下時(shí),熒光染 料F和猝滅劑Q以它們彼此接近的這種方式來(lái)修飾適體A,但是當(dāng)適體A與核酸鏈N連接 時(shí),以它們彼此遠(yuǎn)離的這種方式來(lái)修飾適體A(參見圖14)。當(dāng)適體A被連接至靶物質(zhì)T或處于自退火狀態(tài)時(shí),熒光染料F與猝滅劑Q接近,并 且通過猝滅劑Q來(lái)猝滅熒光染料F,使得沒有觀察到熒光(參見圖14(1))。相反,當(dāng)適體A被連接至核酸鏈N時(shí),熒光染料F遠(yuǎn)離猝滅劑Q,并且熒光染料沒有 被猝滅劑Q猝滅,使得觀察到熒光(參見圖14(2))。因此,根據(jù)該實(shí)施方式的方法,由適體A與核酸鏈N的結(jié)合引起的結(jié)構(gòu)上的變化可 以以修飾適體A的熒光染料F的熒光強(qiáng)度的變化的方式被觀察到。關(guān)于本發(fā)明的方法提供了即使在其為低分子量從而不允許對(duì)由適體A與靶物質(zhì)T 的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種進(jìn)行靈敏檢測(cè)的情況下,也可以以高靈敏度 來(lái)測(cè)定靶物質(zhì)T的優(yōu)勢(shì)。另外,上述方法免于由適體A的自退火所產(chǎn)生的效應(yīng),因此能夠降低由于自退火 的適體A所引起的噪聲。此外,上述方法允許根據(jù)核酸鏈N與適體A的平衡狀態(tài)以及核酸鏈N、靶物質(zhì)T和 適體A的平衡狀態(tài)來(lái)計(jì)算適體A與靶物質(zhì)T的平衡常數(shù)。此外,如果靶物質(zhì)T的量變化,其中適體A的量保持不變,則可以容易地測(cè)量靶物 質(zhì)T與適體A的親和力。因此,例如,關(guān)于本發(fā)明的方法可以容易地被用于藥物的篩選。將參照下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述發(fā)明,下面的實(shí)施例不應(yīng)該被理解為限制本發(fā) 明的范圍。<實(shí)驗(yàn)條件>參考物質(zhì)為膽酸甲酯,并且適體為被制備用于膽酸的適體。通過用于結(jié)合檢測(cè)表 面的生物素修飾5’ -端。表1示出了適體和參考DNA的堿基序列。[表 1]
權(quán)利要求
一種用于測(cè)定靶物質(zhì)的方法,所述方法包括使得能夠與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的適體與所述靶物質(zhì)和具有與所述適體的至少一部分互補(bǔ)的堿基序列的核酸鏈進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,檢測(cè)由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少一種,以及基于檢測(cè)結(jié)果來(lái)測(cè)定所述靶物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述適體為固定在傳感器的檢測(cè)表面上的適體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中,所述傳感器為基于表面細(xì)胞質(zhì)基因共振原理來(lái) 執(zhí)行檢測(cè)并且能夠檢測(cè)由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的介電常數(shù)的變化的傳感器。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中,所述傳感器為基于石英晶體微量天平原理來(lái)執(zhí) 行檢測(cè)并且能夠檢測(cè)由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的質(zhì)量變化的傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述適體具有莖環(huán)結(jié)構(gòu),并且所述核酸鏈至少具 有與所述適體的非莖部互補(bǔ)的堿基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述核酸鏈具有與所述適體非互補(bǔ)的堿基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述適體和所述核酸鏈中的至少一種由取代基 修飾,所述取代基使由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一 種增加。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述核酸鏈被固定在傳感器的檢測(cè)表面上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其中,所述傳感器基于表面細(xì)胞質(zhì)基因共振的原理以 這樣的方式來(lái)進(jìn)行檢測(cè)所述傳感器檢測(cè)由所述核酸鏈與所述適體的結(jié)合引起的介電常數(shù) 的變化。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其中,所述傳感器基于石英振蕩器微量天平的原理 以這樣的方式來(lái)進(jìn)行檢測(cè)所述傳感器檢測(cè)由所述核酸鏈與所述適體的結(jié)合引起的質(zhì)量變 化。
11.一種用于測(cè)定樣品中的靶物質(zhì)的方法,所述方法包括以下步驟在檢測(cè)表面上固 定能夠與所述靶物質(zhì)特異性結(jié)合的適體;利用所述適體與在所述樣品中的所述靶物質(zhì)和具 有與所述適體的至少一部分互補(bǔ)的堿基序列的核酸鏈競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,檢測(cè)由所述適體與所述 核酸鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種;通過所述適體與規(guī)定量的所述 靶物質(zhì)和規(guī)定量的所述核酸鏈的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,檢測(cè)由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的 物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種,從而了解所述靶物質(zhì)的量與檢測(cè)結(jié)果之間的關(guān)系; 估算所述樣品中的所述靶物質(zhì)的量。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種借助于適體來(lái)高度靈敏度地定量靶物質(zhì)的方法。具體公開了一種用于定量靶物質(zhì)的方法,該方法包括以下步驟在靶物質(zhì)和核酸鏈彼此競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的條件下,使得能夠特異性結(jié)合所述靶物質(zhì)的適體與具有與所述適體的至少一部分互補(bǔ)的堿基序列的所述核酸鏈結(jié)合,檢測(cè)由所述結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少一種;以及基于檢測(cè)結(jié)果來(lái)定量所述靶物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101946011SQ20098010508
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者原田智子, 渡部祐己 申請(qǐng)人:索尼公司