專利名稱：Eb病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法
專利說明EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法 本發(fā)明涉及對鼻咽癌及其他EB病毒相關(guān)疾病進行血清學(xué)診斷的試劑盒及其制備方法，特別是采用特定的EB病毒蛋白作為靶抗原檢測血清中抗體水平的試劑盒以及EB病毒重組多肽制備酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的方法。在我國，幾乎100％四歲以上的人群均已感染了EB病毒，80％以上的健康成人是EB病毒攜帶者。EB病毒攜帶者血清中可以存在一種或2至3種(不是多種，即不是3種以上)低水平的(不是高水平的)抗EB病毒抗體。我國南方，特別是珠江三角洲及香港地區(qū)，是世界上鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，而鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染密切相關(guān)。我國南方及香港地區(qū)也是其他EB病毒相關(guān)疾病，例如鼻腔、鼻竇的NK/T細(xì)胞淋巴瘤、肺的淋巴上皮瘤樣癌和傳染性單核細(xì)胞增多癥等的高發(fā)區(qū)。前兩者患者血清EB病毒抗體譜與鼻咽癌患者的類同，而傳染性單核細(xì)胞增多癥患者血清EB病毒抗體的出現(xiàn)有一定的先后規(guī)律性。
目前常規(guī)地在臨床上應(yīng)用的血清EB病毒抗體的檢測(免疫熒光法或免疫酶標(biāo)法)在一定程度上欠客觀性(憑個人在顯微鏡下計算陽性細(xì)胞的百分率)、指標(biāo)較粗(采用幾何級數(shù)的滴度，例如1∶20，1∶40，1∶80等，尚未采用目前數(shù)碼時代的十分具體的數(shù)字表示)，且對EB病毒感染的特征針對性不強。例如鼻咽癌主要是潛伏感染伴少量溶解性感染，鼻咽癌患者血清中大多具有廣譜的高水平的抗EB病毒抗體，特別是IgA抗體。又例如不能確切地顯示傳染性單核細(xì)胞增多癥患者血清中具特征性的抗體水平(包括p18 VCA IgM、低親和性p18 VCAIgG、p18 VCA IgG和EBNA1 IgG)。
酶聯(lián)免疫吸附法可用于鑒別EB病毒的各種感染狀態(tài)，在血清學(xué)診斷EB病毒相關(guān)疾病時，具有十分潛在的優(yōu)勢。目前雖已有采用酶聯(lián)吸附試制盒血清學(xué)診斷EB病毒相關(guān)疾病的研究報告，但缺乏處理EB病毒抗體水平的一套新方法。如何區(qū)分高、低水平，尚無比較客觀的標(biāo)準(zhǔn)。此外，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法時，如何克服各批號之間的差異和采用同一批號試劑盒每次檢測之間的差異，目前尚無良方。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒，其優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有客觀性和EB病毒抗原的特異性，它提供了定量檢測針對個體EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗體的亞型。這種優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測法做不到的，因為傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測法并不能明確抗原的特異性。而且，新的優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)采用了參考血清，可以糾正每批檢測間的差異，保證了診斷的可靠性。
本發(fā)明選擇血清學(xué)診斷鼻咽癌(或傳染性單核細(xì)胞增多癥)最具臨床診斷價值的EB病毒蛋白(相關(guān)氨基酸序列95％的同源性)為EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截，即PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE以及Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。采用這三種EB病毒蛋白作為靶抗原，用以檢測血清中的抗體水平，并通過在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中對EB病毒蛋白進行克隆、表達和純化，創(chuàng)制出診斷試劑盒，從而使重組EB病毒抗原在以下診斷方面得以應(yīng)用1、EB病毒的原發(fā)性感染；2、確立EB病毒感染的抗體譜和鑒別診斷各種EB病毒感染；3、鑒別傳染性單核細(xì)胞增多癥(Infectious mononucleosis)和傳染性單核細(xì)胞綜合癥(Infectious mononucleosissyndrome)；4、血清學(xué)協(xié)助診斷疑為鼻咽癌；5、早期發(fā)現(xiàn)和評估患鼻咽癌的風(fēng)險度。
這三種蛋白(六種抗體檢測)的試劑盒可以相互互補?？梢詥为毷褂?，也可以組合使用。例如EBNA1-IgA和Zta-IgG的組合檢測大大地提高了血清學(xué)診斷鼻咽癌的可靠性。即絕大多數(shù)鼻咽癌患者既呈EBNA1-IgA陽性，又呈Zta-IgG陽性；少數(shù)鼻咽癌患者即使是EBNA1-IgA陰性，也會呈Zta-IgG陽性。而少數(shù)鼻咽癌患者即使是Zta-IgG陰性，也會呈EBNA1-IgA陽性，兩者有互補作用。
許多臨床上疑有鼻咽癌的人，經(jīng)此組合檢測后，如果EBNA1-IgA和Zta-IgG均為陰性，則90％以上可以有把握地排除是鼻咽癌患者。這對鼻咽癌高發(fā)區(qū)的醫(yī)院和人群來說，無疑貢獻良多。
如何在鼻咽癌高發(fā)區(qū)人群中早期發(fā)現(xiàn)患者，以便早期治療，獲得最佳的預(yù)后？本試劑盒的組合使用，提供了可能性。同時做EBNA1-IgA、EBNA1-IgG和Zta-IgG后顯示三者陽性是高風(fēng)險人群；兩者陽性是中風(fēng)險人群；僅單陽者是低風(fēng)險人群。這對鼻咽癌高發(fā)區(qū)人群早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者，又是一重大貢獻。
組合使用本試劑盒也有助于傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷和判別各種類型的EB病毒感染。
總之，選擇這三種EB病毒蛋白作為試劑盒的靶抗原，不但有單獨使用的價值，更是一個整體性的、具有互補性的設(shè)計和臨床實踐(見下表)，可以組合使用，非其他試劑盒可以比擬，具有創(chuàng)新性，應(yīng)獲得權(quán)利保護。請見下表。
酶聯(lián)免疫吸附法 應(yīng)用于EBNA1-IgA 鼻咽癌的血清學(xué)診斷EBNA1-IgG 鼻咽癌和傳染性單核細(xì)胞增多癥的血清學(xué)診斷Zta-IgA鼻咽癌的血清學(xué)診斷Zta-IgG鼻咽癌的血清學(xué)診斷P18 VCA IgG傳染性單核細(xì)胞增多癥的血清學(xué)診斷P18 VCA IgM傳染性單核細(xì)胞增多癥急性期的血清學(xué)診斷P18 VCA IgG+EBNA1-IgG EB病毒近期感染的血清學(xué)診斷EBNA1-IgA+Zta-IgG 鼻咽癌的血清學(xué)診斷或EBNA1-IgA+Zta-IgAEBNA1-IgA+EBNA1-IgG+Zta-IgG患鼻咽癌的風(fēng)險性評估利用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)克隆、表達和純化的這三種EB病毒蛋白。融合克隆蛋白的大小分別為EBNA-1＝40Kd；BFRF3＝44Kd；BZLF1＝53Kd。
但披覆在檢測板上的抗原，已采用凝血酶(Thrombin)法從融合蛋白中脫離，因此是去除了谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的抗原。這就避開了在抗原抗體反應(yīng)時由谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶所引起的非特異性反應(yīng)。
這三種EB病毒蛋白的特征可以概括如下表EB病毒蛋白分子量(氨基酸數(shù))EB病毒基因核苷酸(相當(dāng)坐標(biāo))EBNA1 40Kd(234) BKRF1 705(109171-109875)Zta 53Kd(245) BZLF1 738(102210-103155)P18VCA44Kd(176) BFRF3 531(61507-62037)[


]圖1采用ELISA檢測EBNA1-IgA抗體水平時血清的稀釋度。
圖2鼻咽癌患者與健康供血者的BNA1-IgA抗體水平比較。
圖3優(yōu)化體外診斷鼻咽癌的EB病毒ELISA法。
圖4血清中具有高水平廣譜的抗體是鼻咽癌患者的一種特異性的特征。
圖5鼻咽癌診斷和風(fēng)險評估的EB病毒抗體譜。一、EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒，包括有陽性對照血清、對照血清、酶底物、終止反應(yīng)液、稀釋緩沖液、沖洗緩沖液以及EB病毒靶抗原，其中EB病毒蛋白為EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。
試劑盒還包括有相當(dāng)于優(yōu)化臨界光密度值的診斷參考血清。參考血清以靈敏度曲線和特異度曲線交接點的相對光密度值(rOD)為最佳臨界值。
EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒的制備方法，包括重組抗原的制備、純化標(biāo)記、效價滴定、包被板制備、封閉、干燥及包裝、酶標(biāo)抗體濃縮液制備、稀釋液制備、陽性對照制備、正常對照制備、參考血清制備、底物分裝、終止液及濃縮液置備等步驟。
二、EB病毒蛋白在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中的克隆、表達和純化2.1選擇血清學(xué)診斷鼻咽癌(或傳染性單核細(xì)胞增多癥)的EB病毒蛋白最具臨床診斷價值的EB病毒蛋白為EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。因此我們采用這三種EB病毒蛋白作為靶抗原，用以檢測血清中的抗體水平。
2.2三種EB病毒蛋白的制備采用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中克隆、表達和純化這三種EB病毒蛋白。
2.2.1選定這三種EB病毒蛋白在基因庫(V01555，B95-8細(xì)胞株的序列)中的mRNA序列，逆轉(zhuǎn)錄酶將之轉(zhuǎn)為cDNA序列。
2.2.2設(shè)計可以擴增該cDNA序列的引物在引物5’端加BamHI酶切序列(GGATCC)或EcoRI序列(GAATTC)，以便在Bam HI和EcoR1切割后，將之插入物連結(jié)至質(zhì)粒pGEX DNA(4948bp，Amersham Biosciences)。而引物5’端再加TAG，既有利插入，又經(jīng)限制性酶消化后不出現(xiàn)在克隆中。
2.2.3具體的引物設(shè)計、序列擴增過程2.2.3.1關(guān)于EB病毒EBNA1蛋白(又稱BKRF1蛋白)2.2.3.1.1 EBNA-1(BKRF1)引物設(shè)計5’-TACGGA TCCCCT GTA GGG GAA GCC GAT TA-3’BamHI5’-TACGAA TTCTCA CTC CTG CCC TTC CTC CAC-3’EcoRI引物5’端的3個堿基TAC經(jīng)限制性酶消化后不出現(xiàn)在克隆中。
GGATCC為BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC則為EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)。
2.2.3.1.2擴增的EBNA-1編碼序列(cDNA)B95-8細(xì)胞的EBNA1(BKRF1)的核苷酸編碼序列應(yīng)為107950-109875。現(xiàn)在擴增的序列為109171-109875。即無需107950-109170甘氨酸(Gly)重復(fù)區(qū)截取的EBNA-1編碼序列。所克隆的編碼DNA序列與B95-8細(xì)胞的完全一致，共705堿基。
以下劃線表示。
107950→a tgtctgacga ggggccaggt acaggacctg gaaatggcct aggagagaag108061 aaccatggac gaggacgggg aagaggacga ggacgaggag gcggaagacc aggagccccg108121 ggcggctcag gatcagggcc aagacataga gatggtgtcc ggagacccca aaaacgtcca108001 ggagacacat ctggaccaga aggctccggc ggcagtggac ctcaaagaag agggggtgat
108061 aaccatggac gaggacgggg aagaggacga ggacgaggag gcggaagacc aggagccccg108121 ggcggctcag gatcagggcc aagacataga gatggtgtcc ggagacccca aaaacgtcca108181 agttgcattg gctgcaaagg gacccacggt ggaacaggag caggagcagg agcgggaggg108241 gcaggagcag gaggggcagg agcaggagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggaggg108301 gcaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga108361 ggggcaggag gggcaggagc aggaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca108421 ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca108481 ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga108541 gcaggaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg108601 gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca108661 ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg108721 gcaggagggg caggagcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggaggg108781 gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagg ggcaggagca108841 ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg gcaggagggg caggagcagg aggaggggca108901 ggagcaggag gggcaggagc aggaggtgga ggccggggtc gaggaggcag tggaggccgg108961 ggtcgaggag gtagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgccg gggtagagga109021 cgtgaaagag ccaggggggg aagtcgtgaa agagccaggg ggagaggtcg tggacgtgga109081 gaaaagaggc ccaggagtcc cagtagtcag tcatcatcat ccgggtctcc accgcgcagg109171↓109141 ccccctccag gtagaaggcc atttttccaccctgtagggg aagccgatta ttttgaatac109201caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc109261cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc actggacccc ggggtcaggg tgatgggggc109321aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa109381tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact109441accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt109501tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct attccacaat gtcgtcttac accattgagt109561cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc109621attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat109681gcgattaagg accttgttat gacaaagccc gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg109741tgcagctttg acgatggagt agatttgcct ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct109801gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag109861gaagggcagg agtga←109875*>為終止密碼子2.2.3.1.3所翻譯形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)除109873-109875的tga為終止密碼子外，實際翻譯到234個氨基酸，以下劃線表示。
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGG
AGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE2.2.3.2關(guān)于EB病毒Zta(BamH1Ztransactivator)或ZEBRA(BamHIZ Epstein-BarrReplicationActivator)蛋白或BZLF1蛋白2.2.3.2.1 Zta(BZLF1)引物設(shè)計5’-TACGGA TCCATG ATG GAC CCA AAC TCG AC-3’BamHI5’-TACGAA TTCTTA GAA ATT TAA GAG ATC CTC-3’EcoRI引物5’端的3個堿基TAC經(jīng)限制性酶消化后不出現(xiàn)在克隆中。
GGATCC為BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC則為EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restrictionsite)。
2.2.3.2.2擴增的Zta編碼序列(cDNA)B95-8細(xì)胞的Zta(BZLF1)的核苷酸編碼序列應(yīng)為102210-102338，102423-102530，102655-103155三段拼接而成。以下劃線表示。所克隆的編碼DNA序列與B95-8細(xì)胞的三段拼接而成的序列完全一致，共738堿基。以下劃線表示。
102210↓102181 tgaagcaggc gtggtttcaa taacgggagt tagaaattta agagatcctc gtgtaaaaca102241tctggtgtcc gggggataat ggagtcaaca tccaggcttg ggcacatctg cttcaacagg102301aggcgcagcc tgtcattttc agatgatttg gcagcagcca cctgcggaca aaaatcaggc↑102338102361 gtttagatgg ggcatttatg tttgggacgc tagccgcctg ggcattcgtg ttagtatata102423↓102421 ctgacctcac ggtagtgctg cagcagttgc ttaaacttgg cccggcattt tctggaagcc102481acccgattct tgtatcgctt tatttctagt tcagaatcgc attcctccagctgcgagcaa↑102530102541 gggaatgcgt tactacaagt ggtgcctagt cagttgaaac aagccccacc atccgctgcc102655↓102601 gcccctccat gagccccacc gtccgctgcc gcccctcctt gagcccctcc ttaccgattc102661tggctgttgt ggtttccgtg tgcgtcgtgc cggggcagcc actggtgcag gctgtggaac102721accaatgtct gctagctgtt gtccttggtt agccccgggg caagcaaaca ccactgctgc102781tgctgtttga acagtagaat tgtctccagg ttgaggtgct tctcccccgg cttggttagt102841ctgttgattc tgggttatgt cggagactgg gaacagctga ggtgctgcat aagcttgata102901agcattctca ggagcaggct gaggggcaga aaaccacgac ccagtcggag cggttgaaac102961atgataggca gttagctggc cttgtggcag aggctctggc agcaccggcc acagcacaca103021aggcaaagga gcttgcgatg gccctcccag gtcctgatag actctggtag cttggtcaaa103081agcttgtaca aaaggcacct ggtatgggtc aggtgtaaat tttacatctt cagaagtcga103141gtttgggtcc atcatcttca gcaaagatag caaaggtggc cggcaaggtg caatgtttag↑103155三段拼接而成的序列如下*>為終止密碼子t tagaaattta agagatcctc gtgtaaaacatctggtgtcc gggggataat ggagtcaaca tccaggcttg ggcacatctg cttcaacaggaggcgcagcc tgtcattttc agatgatttg gcagcagcgacctcac ggtagtgctg cagcagttgc ttaaacttgg cccggcattt tctggaagccacccgattct tgtatcgctt tatttctagt tcagaatcgc attcctccagcgattc
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MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF2.2.3.3關(guān)于EB病毒VCA-p18蛋白(又稱BFRF3蛋白)，即18kd的VCA蛋白2.2.3.3.1 VCA-p18(BFRF3)引物設(shè)計5’-TACGGA TCCATG GCA CGC CGG CTG CCC AAG-3’BamHI5’-TACGAA TTCCTA CTG TTT CTT ACG TG-3’EcoRI引物5’端的3個堿基TAC經(jīng)限制性酶消化后不出現(xiàn)在克隆中。
GGATCC為BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC則為EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restrictionsite)。
2.2.3.3.2擴增的BFRF3編碼序列(cDNA)B95-8細(xì)胞的BFRF3的核苷酸編碼序列應(yīng)為61507-62037。
所克隆的編碼DNA序列與B95-8細(xì)胞的完全一致，共531堿基。以下劃線表示。
61507↓61501 cgcgttatgg cacgccggct gcccaagccc accctccagg ggaggctgga ggcggatttt61561ccagacagtc ccctgcttcc taaatttcaa gagctgaacc agaataatct ccccaatgat61621gtttttcggg aggctcaaag aagttacctg gtatttctga catcccagtt ctgctacgaa61681gagtacgtgc agaggacttt tggggtgcct cggcgccaac gcgccataga caagaggcag61741agagccagtg tggctggggc tggtgctcat gcacaccttg gcgggtcatc cgccaccccc61801gtccagcagg ctcaggccgc cgcatccgct gggaccgggg ccttggcatc atcagcgccg61861tccacggccg tagcccagtc cgcgaccccc tctgtttctt catctattag cagcctccgg61921gccgcgactt cgggggcgac tgccgccgcc tccgccgccg cagccgtcga taccgggtca61981ggtggcgggg gacaacccca cgacaccgcc ccacgcgggg cacgtaagaa acagtagagg↑6203761507→atgg cacgccggct gcccaagccc accctccagg ggaggctgga ggcggattttccagacagtc ccctgcttcc taaatttcaa gagctgaacc agaataatct ccccaatgatgtttttcggg aggctcaaag aagttacctg gtatttctga catcccagtt ctgctacgaagagtacgtgc agaggacttt tggggtgcct cggcgccaac gcgccataga caagaggcagagagccagtg tggctggggc tggtgctcat gcacaccttg gcgggtcatc cgccacccccgtccagcagg ctcaggccgc cgcatccgct gggaccgggg ccttggcatc atcagcgccgtccacggccg tagcccagtc cgcgaccccc tctgtttctt catctattag cagcctccgggccgcgactt cgggggcgac tgccgccgcc tccgccgccg cagccgtcga taccgggtcaggtggcgggg gacaacccca cgacaccgcc ccacgcgggg cacgtaagaa acagtag←62037*>為終止密碼子2.2.3.3.3所翻譯形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)除62035-620370的tag為終止密碼子外，實際翻譯到176個氨基酸，以下劃線表示。
MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQA
QAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ總結(jié)關(guān)于EB病毒EBNA1蛋白、Zta蛋白、和VCA-p18蛋白的基因片段、基因庫序列大小、擴增克隆序列大小和表達多肽的氨基酸數(shù)如下。
表1EB病毒蛋白EBNA1 Zta VCA-p18基因片段 BKRF1 BZLF BFRF3基同庫序列大小1926bp738bp531bp擴增克隆序列大小 705bp 738bp531bp表達多肽的氨基酸數(shù)234aa 245aa176aa2.3將PCR擴增子與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因克隆到Eco Rl/Bam HI消化的原核細(xì)胞表達pGEX2T質(zhì)粒載體(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上系在一起。采用氯化鈣技術(shù)將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌。加乳糖類似物異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)到了重組質(zhì)粒的大腸桿菌數(shù)小時，然后收獲細(xì)菌并以去垢triton(一系列有機的非離子型表面活化劑的商品名)X-100和超聲波裂解細(xì)菌。細(xì)菌裂解產(chǎn)物經(jīng)離心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽瓊脂糖4B經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-谷胱甘肽親和色譜儀純化。純度達94.0％以上。融合克隆蛋白的大小為EBNA-1＝40Kd；BFRF3＝44Kd；BZLF1＝53Kd。具體步驟如下。
2.3.1.cDNA的擴增2.3.1.1 RNA的制備。
2.3.1.1.1根據(jù)Rnaid Plus試劑盒(BIO 101)說明書的要求從培養(yǎng)細(xì)胞中分離RNA。
采用RNaid Plus試劑盒從懸浮的細(xì)胞中抽提RNA。培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗一次，然后每106細(xì)胞加1ml quanidine thiocyanate溶解液，并與vortex混合。再加等容積酸性酚(acid phenol)，并混合。加lmlchloroform isoamyl alcohol(BDH)至溶液中，再次混合。溶解產(chǎn)物在冰塊上孵15min后，在4℃下旋轉(zhuǎn)10,000xg 20min。將上層轉(zhuǎn)移至一新管，再用1/2容積的chloroform isoamyl alcohol(BDH)旋轉(zhuǎn)2min。將上層再轉(zhuǎn)移至一新管。加入15ul RNAMATRIX，并在室溫下孵育5min，孵育中偶加混合，使RNA吸附。RNA/RNAMATRIX復(fù)合物在10,000xg下1min形成小球，在500μl RNA洗液中洗兩次。小球再次懸浮在30-100μl Diethpyrocarbonate(DEPC，Sigma)處理過的水中。RNA在55℃下洗提5min，并適合于光譜分析。
2.3.1.1.2.采用RT PCR擴增RNA轉(zhuǎn)錄物。
2.3.1.2在Bam HI和EcoR1切割后，將插入物連結(jié)至質(zhì)粒pGEX DNA(4948bp，Amersham Biosciences)。
2.3.2將連結(jié)產(chǎn)物轉(zhuǎn)至XL1反應(yīng)潛能細(xì)胞。
2.3.3采用摘取個別克隆法使質(zhì)粒小孔化。
2.3.4小孔化DNA的限制性酶切。
2.3.5從pGEX重組物中篩選融合蛋白表達。
2.3.6 SDS PAGE分析。
2.3.7采用抗谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗體做Western blot。
2.3.8大量純化融合蛋白。
2.3.9如果需要的話用凝血酶將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶除去。
3.所選三類EB病毒抗原的特點所選三類EB病毒抗原的ELISA法對測定EB病毒抗體既敏感、特異、又客觀。
表2 EB病毒抗原的ELISA法對測定EB病毒抗體既敏感、特異、又客觀血清號 EB病毒感染狀態(tài) VCAIgG VCAIgA ZtaIgG ZtaIgA EBNA1 EBNA1IgG IgAN11 未感染嬰兒 ＜200未測定 未測定 未測定 ＜1k未測定N31 傳染性單核細(xì) ＞3k ＜100＜200＜20 ＜1k＜100胞增多癥患者MIN 健康EB病毒 ＞3k ＜100＜200＜20 3k 陰性攜帶者PG495 取自鼻咽癌 ＞3k 1.6k ＞3k 100 ＞6k800患者血清庫PA196 取自鼻咽癌 ＞3k ＞1.6k ＞3k 400 ＞6k＞800患者血清庫臨界值＝所測血清的平均光密度值/血清空白的平均光密度值＝S/N＝3為了檢測Zta IgA，開始的血清稀釋度是1∶20；為了檢測p18 VCAIgA和EBNA1 IgA，開始的血清稀釋度是1∶100；為了檢測p18 VCAIgG和Zta IgG，開始的血清稀釋度是1∶200；為了檢測EBNA1 IgG，開始的血清稀釋度是1∶1000。滴度＝高于臨界值的最大血清稀釋度。
從表2可知(1)取自1例從未感染過EB病毒的嬰兒血清(N11)，沒有檢測到VGA IgG；而在一例傳染性單核細(xì)胞增多癥患者急性感染期所取的血清樣本中(N31)，VCA IgG抗體很早就產(chǎn)生了?？梢詾榱丝陀^地作抗體的定量。
(2)在急性時期的傳染性單核細(xì)胞增多癥患者血清樣本中(N31)無EBNA1 IgG抗體。在產(chǎn)生VCA IgG抗體8個月或更長時期后才產(chǎn)生EBNA1 IgG(Chan KH等)。
(3)因此，同時出現(xiàn)VCA IgG和EBNA1 IgG是過去感染EB病毒的指標(biāo)。
(4)與健康攜帶者相對比，鼻咽癌患者血清中具有廣譜的抗EB病毒抗體。
(5)EBNA1 IgG的抗體水平高于其他的抗體水平。這說明，EBNA1是EB病毒感染，特別是鼻咽癌患者的一種重要抗原。這也是與EBNA1是寄生在腫瘤細(xì)胞中的EB病毒所表達的主要抗原相一致的。
(6)總之，上述結(jié)果顯示，酶聯(lián)免疫吸附法可用于鑒別EB病毒的各種感染狀態(tài)。
(7)所以，針對EB病毒特異性抗原而創(chuàng)建的酶聯(lián)免疫吸附法，在血清學(xué)診斷EB病毒相關(guān)疾病時，確實具有十分潛在優(yōu)勢的可用性。
4.優(yōu)化血清學(xué)診斷鼻咽癌的ELISA法
(1)創(chuàng)建了以靈敏度和特異度曲線的交界點為臨界光密度值由于鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗體水平與健康攜帶者血清中抗EB病毒抗體水平有相互重疊，不會具有能回答“陽”或“陰”的絕對標(biāo)準(zhǔn)(見附圖2)，我們所創(chuàng)建的以靈敏度和特異度曲線的交界點為臨界光密度值(見附圖3)的方法，區(qū)分“高”和“低”，就能客觀地反映鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗體的特征。
(2)創(chuàng)建了根據(jù)鼻咽癌患者組和健康成人組的滴度曲線確定檢測血清的稀釋度(見圖1)。
表3優(yōu)化血清學(xué)診斷鼻咽癌的ELISA法VCA IgG VCA IgA Zta-IgG Zta IgA EBNA1EBNA1IgG IgA抗免疫球蛋白，稀釋度 zG，50k zA，2k zG，50k zA，2k zG，50k zA，2k血清稀釋*[n＝81C，74NRC]100 200 20 2000 100臨界光密度值1.250.83 1 10.62靈敏度 65％86％ 83％72％ 83％特異度 65％86％ 83％72％ 83％*根據(jù)74例鼻咽癌患者和81例對照組的數(shù)據(jù)而得z抗免疫球蛋白購自Zymed，zG表示Zymed IgG，zA表示Zymed IgA(3)為了診斷標(biāo)準(zhǔn)的判定，在試劑盒中提供一支相當(dāng)于優(yōu)化臨界光密度值的診斷參考血清。這就使使用同一批號的試劑盒分批檢測樣本時，可以糾正每一批檢測所應(yīng)用的區(qū)分高、低水平的相對光密度值，得出更精確可靠的數(shù)據(jù)。
(4)由于鼻咽癌患者血清中大多具有廣譜的高水平的抗EB病毒抗體，特別是IgA抗體的特征(見圖4)，我們創(chuàng)建了兩步檢測法，即首先使用EBNA IgA，如屬“高”水平則再進行第二步，使用Zta IgG以診斷，或同時使同Zta-IgG和EBNA IgG以篩選(見附圖5)。
總之，新的優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有客觀性和EB病毒抗原的特異性，它提供了定量撿測針對個體EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗體的亞型。這種優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測法做不到的，因為傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測法并不能明確抗原的特異性。而且，新的優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)采用了參考血清，可以糾正每批檢測間的差異，保證了診斷的可靠性。
5.重組EB病毒抗原在診斷方面的應(yīng)用5.1 EB病毒的原發(fā)性感染5.1.1免疫熒光顯示存在VCA抗體；由于延遲的EBNA抗體轉(zhuǎn)陽，所以采用抗補體免疫熒光顯示無EBNA抗體。
5.1.2 EBV IgM陽性。
5.1.3低親和性VCAIgG抗體這里要強調(diào)的是采用熒光免疫(IF)檢測低親和性VCA IgG不敏感，而采用ELISA則較敏感；采用熒光免疫(IF)檢測VCA IgM不敏感，而采用ELISA較敏感。
為了測定低親和性VCA IgG抗體，將一系列血清樣本在平行的徽板上起作用。一個板孔以4M尿素處理30min，而另一個板孔則不經(jīng)處理。當(dāng)尿素處理引起抗體水平下降4倍或4倍以上時，則顯示低親和性VCA IgG抗體存在。
5.2確立EB病毒感染的抗體譜和鑒別診斷各種EB病毒感染表4 EB病毒各種感染狀態(tài)的抗體譜1 2 3 4 5VCA IgGEBNA IgGVCA IgM低親和性感染狀態(tài) VCA IgG DNA例數(shù)原發(fā)性感染陽性 陰性陽性 陽性 30陽性 陰性陽性 陰性 1陽性 陰性陰性 陽性 15小計 37 46近期感染陽性 陰性陰性 陰性0 12小計 0 12過去感染陽性 陽性陰性 陰性 14陽性 陽性陽性 陰性 1小計 1 15未感染 陰性 陰性陰性 陰性0 8合計 38 69表5各種EB病毒感染狀態(tài)的鑒別診斷酶聯(lián)免疫吸附法免疫熒光法PCR法EB病毒感染狀態(tài) VCAIgG陽性和EBNAIgG陰性低親和性p18 VCA IgGVCA IgMEB病毒DNA急性原發(fā)性感染(n＝46) 100％ 97.8％ 67.4％ 80.4％近期感染(n＝12)100％ 0 0 0過去感染(n＝15)0* 0 0.7％ 0.7％未感染(n＝8) 0**0 0 0*所有過去感染過EB病毒的人，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測VCA IgG和EBNA1 IgG，均呈陽性。
**所有過去未感染過EB病毒的人，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測VCA IgG和EBNA1 IgG，均呈陰性。
由此可見，由于EBNA IgG要在感染后一段時間血清抗體才轉(zhuǎn)陽，采用傳統(tǒng)的免疫熒光法不能鑒別急性原發(fā)性感染和近期感染；而采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清低親和性p18 VCA IgG和VCAIgM，則大多數(shù)急性原發(fā)性感染患者(低親和性p18 VCA IgG為97.8％，VCA IgM為67.4％)可呈陽性。即，采用酶聯(lián)免疫吸附法可鑒別急性原發(fā)性感染和近期感染。
5.3鑒別傳染性單核細(xì)胞增多癥(Infectious mononucleosis)和傳染性單核細(xì)胞綜合癥(Infectious mononucleosis syndrome)5.3.1除癥狀、白細(xì)胞升高(12000-18000)、外周血涂片見不典型CD4T淋巴細(xì)胞、異嗜抗羊紅細(xì)胞抗體(heteophil anti-sheepred blood cell antibodies)、涂片EBERs原位雜交等外。
5.3.2首先出現(xiàn)傳染性單核細(xì)胞增多癥的急性表指，即p18 VCA IgM和低親和性VCA IgG，然后是VCA IgG，8個月后才出現(xiàn)EBNA1 IgG。因此未感染EB病毒VCA陰性、EBNA1為陰性。
傳染性單核細(xì)胞增多癥VCA陽性、EBNA1陰性。
健康攜帶者VCA陽性、EBNA1陽性。
VCA陰性、EBNA1為陰性，為未感染EB病毒。
因此，采用ELISA法檢測EBNA1 IgG陽性和p18 VCA IgM陽性則為傳染性單核細(xì)胞增多癥；而傳染性單核細(xì)胞綜合癥則否。
5.4血清學(xué)協(xié)助診斷疑為鼻咽癌5.4.1鼻咽癌患者血清EB病毒抗體水平特征及血清學(xué)檢測的應(yīng)用范圍表6鼻咽癌患者血清EB病毒抗體水平特征及血清學(xué)檢測的應(yīng)用范圍鼻咽癌患者血清EB病毒抗體水平特征 血清學(xué)檢測的應(yīng)用范圍廣譜的血清EB病毒抗休，特別是IgA的升高1.血清學(xué)診斷鼻咽癌2.人群普查以早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌高拷貝量的血清/血漿中EB病毒DNA 1.預(yù)測治療的療效5.4.2免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附法的單獨使用在香港瑪麗醫(yī)院218例連續(xù)檢測的血清樣本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤樣癌、23例其他癌和140例其他疾病)作了如下分析。
表7免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附法單獨使用的比較檢測方法 鼻咽癌 對照組 舊性預(yù)測陰性預(yù)測實用性真陽性/假陰性假陽性/真陰性免疫熒光VCA IgA51/4 65/98 44％96％排除和(預(yù)測)EA IgA 40/155/158 89％91％預(yù)測酶聯(lián)免疫吸附EBNA1 IgA 46/9 22/141 68％94％(排除)和預(yù)測Zta IgG41/1428/135 59％91％EBV DNA31/243/160 91％87％預(yù)測陽性預(yù)測＝真陽性/真陽性+假陽性×100％＝A/(A+C)×100％陰性預(yù)測＝真陰性/假陰性+真陰性×100％＝D/(B+D)×100％5.4.3免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附法的聯(lián)合使用的比較在香港瑪麗醫(yī)院218例連續(xù)檢測的血清樣本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤樣癌、23例其他癌和140例其他疾病)同樣作了如下分析。
表8免疫熒光法聯(lián)合使用在血清學(xué)診斷鼻咽癌方面的比較鼻咽癌組 健康成人對照組舊性預(yù)測陰性預(yù)測真陽性 假陰性假陽性 真陰性VCAIgA陽性+EAIgA陽性 40 155 158 88.9％VCAIgA陽性+EAIgA陰性 11 4464 9914.7％VCAIgA陰性+EAIgA陽性 0 550 163VCAIgA陰性+EAIgA陰性 51 4 89 94 95.9％陽性預(yù)測＝真陽性/(真陽性+假陽性)×100％＝TP/(TP+FP)40/(40+5)＝88.9％11/(11+64)＝14.7％陰性預(yù)測＝真陰性/(假陰性+真陰性)×100％＝TN/(TN+FN)94/(94+4)＝95.9％值得指出的是，無論是鼻咽癌患者或健康成人，EA IgA陽性者中沒有一例呈VCA IgA陰性，這是因為所采用的B95-8細(xì)胞所產(chǎn)生的“VCA”中既有溶解晚期的抗原，又包含了溶解早期的抗原。所以，在免疫熒光法中所采用的VCA IgA的抗原特異性與EA IgA的抗原特異性相互重疊了。也就是說，雖然聯(lián)合使用了兩種免疫熒光法，卻不能達到“1+1＝2”的作用，即互補作用不強。而且，VCA IgA和EAIgA雙陰性98中，4例為假陰性，假陰性率達4.1％(4/4+94)，并不能在臨床上起到有效的排除診斷鼻咽癌的作用。以下所述酶聯(lián)免疫吸附法的聯(lián)合使用卻可以克服這一缺點。
5.4.4先做酶聯(lián)免疫吸附法的EBNA1 IgA，再做免疫熒光VCA IgA
表9酶聯(lián)免疫吸附法的免疫熒光VCA IgA酶聯(lián)免疫吸附法的EBNA1 IgAEBNA1 IgA 和免疫熒光VCA IgA聯(lián)合靈敏度89％86％ 88％特異度78％91％ 95％表10酶聯(lián)免疫吸附法聯(lián)合使用的比較鼻咽癌組 健康成人對照組舊性預(yù)測陰性預(yù)測真陽性 假陰性假陽性 真陰性EBNA1 IgA陽性+ZtaIgG陽性 33 225 158 86.8％EBNA1 IgA陽性+ZtaIgG陰性 13 4217 146 43.3％EBNA1 IgA陰性+ZtaIgG陽性 8 4725 138 24.2％EBNA1 IgA陰性+ZtaIgG陰性 54 1 47 116 99.1％陽性預(yù)測＝真陽性/(真陽性+假陽性)×100％＝TP/(TP+FP)33/(33+5)＝88.8％13/(13+17)＝43.3％8/(8+25)＝陰性預(yù)測＝真陰性/(假陰性+真陰性)×100％＝TN/(TN+FN)116/(1+116)＝比較后可知，酶聯(lián)免疫吸附法聯(lián)合使用(EBNA1 IgA+Zta IgG)的陰性預(yù)測值(99.1％)大大高于免疫熒光法聯(lián)合使用(VCA IgA+EAIgA)，即臨床上聯(lián)合使用EBNA IgA和Zta IgG時，如果是雙陰性，則排除鼻咽癌診斷的可靠性達99.1％。兩種酶聯(lián)免疫吸附法聯(lián)合檢測在血清學(xué)診斷鼻咽癌時具有很強的互補作用。
5.4.5采用免疫熒光和采用酶聯(lián)免疫吸附血清學(xué)診斷鼻咽癌之間的關(guān)聯(lián)表11采用免疫熒光和采用酶聯(lián)免疫吸附血清學(xué)診斷鼻咽癌之間的關(guān)聯(lián)免疫熒光血清學(xué)診斷酶聯(lián)免疫吸附血清學(xué)診斷百分率相互吻合 100例 64.5％旗鼓相當(dāng) 51例 32.9％相互不吻合4例 2.6％總計 155例5.4.6酶聯(lián)免疫吸附聯(lián)合應(yīng)用的血清學(xué)診斷鼻咽癌的預(yù)測和排除表12例數(shù)EBNA1Zta IgG 預(yù)測評論IgA33 高 高 陽性，87％ 恒定地符合鼻咽癌30 高 低 陽性，43％ 中度地符合鼻咽癌33 低 高 陽性，24％ 臨界地符合鼻咽癌117 低 低 陰性，99％ 恒定地不符合鼻咽癌5.5早期發(fā)現(xiàn)和評估患鼻咽癌的風(fēng)險度聯(lián)合應(yīng)用EBNA1 IgA、EBNA1 IgG和Zta IgG顯示優(yōu)勢比大大增高。
表13聯(lián)合應(yīng)用EBNA1 IgA、EBNA1 IgG和Zta IgG顯示優(yōu)勢比大大增高EB病毒抗體譜觀察到的％(期待的％)EBNA1 IgAEBNA1 IgGZta IgG鼻咽癌(n＝121)健康成人(n＝332)優(yōu)勢比低 低 低 0.83(0.54)59.3(59.17) 0.009低 低 高 5.79(2.01)14.8(14.79) 0.13低 高 低 1.65(2.61)8.73(9.63) 0.28高 低 低 3.31(3.03)10.2(9.63) 0.31低 高 高 6.61(9.84)3.01(2.41) 3.98高 低 高 6.61(11.42) 1.51(2.41) 4.50高 高 低 15.7(14.82) 1.51(1.57) 9.54高 高 高 59.5(55.73) 0.9(0.39) 137.9總數(shù) 100 100 1.0r＝0.990 r＝0.999
兩個層次的篩查第一層次EBNAIgA第二層次Zta IgG+EBNA IgG表14早期發(fā)現(xiàn)和評估患鼻咽癌的風(fēng)險度的兩個層次的篩查/1 000EBNA1 IgAEBNA1 IgG Zta IgG風(fēng)險度水平相對風(fēng)險度隨訪4 高 高 高 高138 疑為鼻咽癌16高 高 低 中9 宜監(jiān)護的風(fēng)險度24高 低 高 中4 宜監(jiān)護的風(fēng)險度96高 低 低 低0.3 微風(fēng)險度860 低 未做 未做低0.2 不必在意在1000人中140人(14.0％，140/1000)認(rèn)為具有患鼻咽癌的風(fēng)險度。在這140人中4人(2.86％，4/140)認(rèn)為具有高風(fēng)險度；40人(28.57％，40/140)認(rèn)為具有中等風(fēng)險度；96人(68.57％，96/140)認(rèn)為具有微風(fēng)險度。860人EBNA1 IgA低，未進一步做Zta-IgG和EBNA1 IgG，認(rèn)為無風(fēng)險度。
另香港某私人機構(gòu)篩查了香港居民2000人，發(fā)現(xiàn)6例具有高風(fēng)險度的人，其中1人證實為鼻咽癌忠患者，經(jīng)治療后5年無復(fù)發(fā)；所有其他人均未患鼻咽癌。
5.6協(xié)助診斷Burkitt淋巴瘤應(yīng)用Zta IgGl.
EBV-1.ST25EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法序列表(SEQUENCE LISTING)<110>香港神農(nóng)有限公司(Sinoclone Limited)<120>EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法<130>EBV Serological Diagnositic Kits<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>705<212>DNA<213>Epstein-Barr Virus<400>1cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct 60gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc 120actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag 180catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct 240ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg 300ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct 360attccacaat gtcgtcttac accattgagt cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc 420ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa 480actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat gcgattaagg accttgttat gacaaagccc 540gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg tgcagctttg acgatggagt agatttgcct 600ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga 660gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag gaagggcagg agtga 705<210>2<211>234<212>PRT<213>Epstein-Barr Virus<400>2Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro1 5 10 15Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala20 25 30Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp35 40 45Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys His Arg Gly Gln50 55 60Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala65 70 75 80Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp85 90 95
EBV-1.ST25Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn100 105 110Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro115 120 125Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro130 135 140Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln145 150 155 160Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val165 170 175Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn Ile Arg Val Thr Val Cys Ser180 185 190Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro Trp Phe Pro Pro Met Val Glu195 200 205Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly210 215 220Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln Glu225 230<210>3<211>531<212>DNA<213>Epstein-Barr Virus<400>3atggcacgcc ggctgcccaa gcccaccctc caggggaggc tggaggcgga ttttccagac 60agtcccctgc ttcctaaatt tcaagagctg aaccagaata atctccccaa tgatgttttt120cgggaggctc aaagaagtta cctggtattt ctgacatccc agttctgcta cgaagagtac180gtgcagagga cttttggggt gcctcggcgc caacgcgcca tagacaagag gcagagagcc240agtgtggctg gggctggtgc tcatgcacac cttggcgggt catccgccac ccccgtccag300caggctcagg ccgccgcatc cgctgggacc ggggccttgg catcatcagc gccgtccacg360gccgtagccc agtccgcgac cccctctgtt tcttcatcta ttagcagcct ccgggccgcg420acttcggggg cgactgccgc cgcctccgcc gccgcagccg tcgataccgg gtcaggtggc480gggggacaac cccacgacac cgccccacgc ggggcacgta agaaacagta g 531<210>4<211>176<212>PRT<213>Epstein-Barr Virus<400>4Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala1 5 10 15Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln20 25 30
EBV-1.ST25Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu35 40 45Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr50 55 60Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala65 70 75 80Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala85 90 95Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala100 105 110Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro115 120 125Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala130 135 140Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly145 150 155 160Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln165 170 175<210>5<211>738<212>DNA<213>Epstein-Barr Virus<400>5atgatggacc caaactcgac ttctgaagat gtaaaattta cacctgaccc ataccaggtg 60ccttttgtac aagcttttga ccaagctacc agagtctatc aggacctggg agggccatcg120caagctcctt tgccttgtgt gctgtggccg gtgctgccag agcctctgcc acaaggccag180ctaactgcct atcatgtttc aaccgctccg actgggtcgt ggttttctgc ccctcagcct240gctcctgaga atgcttatca agcttatgca gcacctcagc tgttcccagt ctccgacata300acccagaatc aacagactaa ccaagccggg ggagaagcac ctcaacctgg agacaattct360actgttcaaa cagcagcagc agtggtgttt gcttgccccg gggctaacca aggacaacag420ctagcagaca ttggtgttcc acagcctgca ccagtggctg ccccggcacg acgcacacgg480aaaccacaac agccagaatc gttggaggaa tgcgattctg aactagaaat aaagcgatac540aagaatcggg tggcttccag aaaatgccgg gccaagttta agcaactgct gcagcactac600cgtgaggtgg ctgctgccaa atcatctgaa aatgacaggc tgcgcctcct gttgaagcag660atgtgcccaa gcctggatgt tgactccatt atcccccgga caccagatgt tttacacgag720gatctcttaa atttctaa 738<210>6<211>245<212>PRT<213>Epstein-Barr Virus
EBV-1.ST25<400>6Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp1 5 10 15Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val20 25 30Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu35 40 45Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr50 55 60His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro65 70 75 80Ala Pro Glu Ash Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro85 90 95Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu100 105 110Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val115 120 125Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile130 135 140Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg145 150 155 160Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu165 170 175Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys180 185 190Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser195 200 205Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser210 215 220Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu225 230 235 240Asp Leu Leu Asn Phe24權(quán)利要求
1.一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒，包括有陽性對照血清、陰性對照血清、酶底物、終止反應(yīng)液、稀釋緩沖液、沖洗緩沖液以及EB病毒靶抗原，其特征在于EB病毒抗原蛋白為EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所選擇的EBNA1氨基酸序列與以下序列有95％的同源性MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESTVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE其中最具特征性的為后一截，即PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所選擇的Zta氨基酸序列與以下序列有95％的同源性MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所選擇的VCA-p18氨基酸序列與以下序列有95％的同源性MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于它還包括有相當(dāng)于優(yōu)化臨界光密度值的診斷參考血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于參考血清以靈敏度曲線和特異度曲線交接點的相對光密度值(rOD)為最佳臨界值。
7.EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒的制備方法，包括重組抗原的制備、純化標(biāo)記、效價滴定、包被板制備、封閉、干燥及包裝、酶標(biāo)抗體濃縮液制備、稀釋液制備、陽性對照制備、正常對照制備、底物分裝、終止液及濃縮液置備等步驟，其特征在于它還包括參考血清的制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒的制備方法，其特征在于以靈敏度曲線和特異度曲線交接點的相對光密度值(rOD)為最佳臨界值制備參考血清。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒的制備方法，其特征在于EB病毒蛋白重組抗原的制備為A、選定EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截，即PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE以及Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)這三種EB病毒蛋白在基因庫(V01555，B95-8細(xì)胞株的序列)中的mRNA序列，逆轉(zhuǎn)錄酶將之轉(zhuǎn)為cDNA序列；B、設(shè)計可以擴增該cDNA序列的引物、序列擴增；C、將PCR擴增子與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因克隆到Eco R1/Bam HI消化的原核細(xì)胞表達pGEX2T質(zhì)粒載體上，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌，誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)到了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，然后收獲并裂解細(xì)菌，細(xì)菌裂解產(chǎn)物經(jīng)離心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽瓊脂糖4B經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-谷胱甘肽親和色譜儀純化。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒的制備方法，其特征在于EBNA-1(BKRF1)引物設(shè)計為5’-TACGGA TCCCCT GTA GGG GAA GCC GAT TA-3’BamHI5’-TACGAA TTCTCA CTC CTG CCC TTC CTC CAC-3’EcoRI
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒的制備方法，其特征在于Zta(BZLF1)引物設(shè)計為5’-TACGGA TCCATG ATG GAC CCA AAC TCG AC-3’BamHI5’-TACGAA TTCTTA GAA ATT TAA GAG ATC CTC-3’EcoRI
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒的制備方法，其特征在于VCA-p18(BFRF3)引物設(shè)計為5’-TACGGA TCCATG GCA CGC CGG CTG CCC AAG-3’BamHI5’-TACGAA TTCCTA CTG TTT CTT ACG TG-3’EcoRI
13.EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白單獨或聯(lián)合應(yīng)用于鼻咽癌的血清學(xué)診斷。
14.EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白聯(lián)合應(yīng)用于鼻咽癌的血清學(xué)診斷。
15.VCA-p18蛋白在傳染性單核細(xì)胞增多癥的血清學(xué)診斷上的應(yīng)用。
16.EBNA1(BKRF1)蛋白和VCA-p18蛋白在EB病毒近期感染的血清學(xué)診斷上的聯(lián)合應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用特定的EB病毒蛋白作為靶抗原檢測血清中抗體水平的試劑盒以及EB病毒重組多肽制備酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的方法。選擇血清學(xué)診斷鼻咽癌(或傳染性單核細(xì)胞增多癥)最具臨床診斷價值的EB病毒蛋白EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA－p18蛋白作為靶抗原，用以檢測血清中的抗體水平，并通過在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中對EB病毒蛋白進行克隆、表達和純化，創(chuàng)制出診斷試劑盒，從而使重組EB病毒抗原在EB病毒的原發(fā)性感染、確立EB病毒感染的抗體譜和鑒別診斷各種EB病毒感染、鑒別傳染性單核細(xì)胞增多癥和傳染性單核細(xì)胞綜合癥、協(xié)助診斷疑為鼻咽癌、早期發(fā)現(xiàn)和評估患鼻咽癌的風(fēng)險度等診斷方面得以應(yīng)用。
文檔編號G01N33/569GK1584593SQ0315428
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月20日
發(fā)明者吳文翰, 陳泓霖, 陳國雄, 吳子柏 申請人:香港神農(nóng)有限公司