專(zhuān)利名稱：Sars早期診斷方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SARS的早期診斷方法及試劑盒。具體地，本發(fā)明使用人工合成的源自SARS病毒M蛋白的多肽，以及該多肽免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體(單抗、多抗)，結(jié)合酶聯(lián)免疫和其他方法檢測(cè)人血清樣品中的早期抗SARS抗體IgM或IgG，或直接檢測(cè)血清樣品中SARS病原體。
背景技術(shù)：
非典型肺炎即嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的病原體最近已經(jīng)確認(rèn)，是一種冠狀病毒。該病毒是一種正鏈RNA病毒，基因組為單鏈RNA，含有Poly(A)，總長(zhǎng)接近30kb。病毒表面有約20nm左右的棒狀結(jié)構(gòu)，呈皇冠狀。該病原體具有很強(qiáng)的感染性和傳染性，病毒在患者體內(nèi)經(jīng)過(guò)早期復(fù)制過(guò)程后，在肺部引發(fā)大規(guī)模炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺部組織損傷。由于臨床缺少有效的治療藥物，所以現(xiàn)階段將感染病人迅速隔離治療是最有效的防治手段。
目前已經(jīng)發(fā)展并使用的診斷方法包括1.RT-PCR檢查病毒。能及時(shí)檢查帶毒者，當(dāng)痊愈后，顯陰性。但受到儀器設(shè)備的限制，易產(chǎn)生較多的假陰性和假陽(yáng)性而導(dǎo)致漏診或誤診。
2.通過(guò)臨床癥狀綜合評(píng)價(jià)診斷。這種方法在疾病的早期，因癥狀不明顯，而無(wú)法準(zhǔn)確的診斷。在疾病的晚期，雖然可以準(zhǔn)確診斷，但延誤了對(duì)疾病進(jìn)行有效的治療。
3.血清免疫檢查病毒抗體(熒光免疫法或ELISA)?？贵w產(chǎn)生需要在發(fā)病后至少14天，因此，這種方法不能做早期診斷。但是從免疫學(xué)角度來(lái)說(shuō)，機(jī)體產(chǎn)生病原體特異性抗體IgM較早，選擇合適的抗原與之結(jié)合也可以用作診斷參考。
目前正在使用的大多數(shù)是前三方法，這些方法在臨床使用過(guò)程中，不能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的判斷與區(qū)分患者與疑似病例。
4.抗原檢測(cè)(ELISA)。通過(guò)制備病原體特異性的抗體(單抗與多抗)檢測(cè)病人血液或組織中病原體，該方法準(zhǔn)確率高，操作簡(jiǎn)便，適合臨床推廣。但目前缺少病原體的特異性抗體。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的更加有效的早期診斷SARS的方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是提供一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高的SARS檢測(cè)方法和試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種源自SARS病毒的多肽，其氨基酸序列為SEQID NO1或2。這些SARS特異性多肽可特異性地與抗SARS病毒的抗體結(jié)合。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種多肽偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián)物由多肽、交聯(lián)劑、和BSA構(gòu)成，其中所述的多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO1或2，所述的交聯(lián)劑選自戊二醛或EDAC。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種抗體，所述抗體特異性地與本發(fā)明的SARS特異性多肽結(jié)合。
在一優(yōu)選例中，所述的抗體是單克隆抗體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測(cè)試劑盒，它含有本發(fā)明的SARS特異性多肽、多肽偶聯(lián)物、抗本發(fā)明多肽的抗體、或其組合。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種體外檢測(cè)樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法，包括步驟(a)將樣品與選自下組的物質(zhì)接觸本發(fā)明的SARS特異性多肽、多肽偶聯(lián)物、抗本發(fā)明多肽的抗體、或其組合；(b)檢測(cè)是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體。
在一優(yōu)選例中，所述的樣品為血清樣品或痰液。
在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)是氨基酸序列為SEQ ID NO1或2的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)是單克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)的檢測(cè)方法是熒光檢測(cè)法。


圖1顯示了在SARS病毒感染后，IgG和IgM抗體的產(chǎn)生情況。
圖2顯示了對(duì)SARS病毒S蛋白的結(jié)構(gòu)分析。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)對(duì)SARS病毒潛在抗原蛋白的序列分析，找到了具有很強(qiáng)抗原性的氨基酸序列，通過(guò)合成多肽合成這些潛在抗原靶位，再由這些多肽免疫獲得的抗體，研制出一種通過(guò)檢測(cè)SARS病毒或抗SARS病毒抗體，進(jìn)行臨床早期SARS診斷的酶聯(lián)免疫方法和試劑盒。本發(fā)明可顯著提高診斷效率，并且簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高。
參見(jiàn)圖1。已有的研究表明病毒在人體內(nèi)十天左右達(dá)到復(fù)制高峰，而SARS-IgM抗體在發(fā)病10～14天時(shí)出現(xiàn)并很快達(dá)到高峰，60天時(shí)約有1/3的患者仍可檢測(cè)到IgM抗體，大部分患者中該抗體基本消失。IgG抗體亦可在10-14天時(shí)檢測(cè)到，60天時(shí)達(dá)到高峰，90天時(shí)仍維持在高水平。所以采用抗體檢測(cè)病原體可以在病人感染后最短時(shí)間內(nèi)作出有效診斷；采用IgM檢測(cè)可以在感染后一個(gè)星期左右作出診斷；而檢測(cè)病人體內(nèi)IgG則最不理想。
為了獲得檢測(cè)SARS病毒所需的相關(guān)抗原與抗體，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)SARS病毒基因組的分析與比對(duì)，結(jié)合最近與以往文獻(xiàn)資料，對(duì)SARS的潛在抗原蛋白進(jìn)行分析。
通過(guò)與冠狀病毒的分析與比對(duì)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合，隨即與細(xì)胞膜發(fā)生融合，病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞。病毒的生活周期完全在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，不需細(xì)胞核參與。SARS病毒本身編碼兩大類(lèi)蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白(a)結(jié)構(gòu)蛋白主要包括結(jié)合在病毒膜表面的S(棒狀結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成成分)，M蛋白，以及與RNA結(jié)合構(gòu)成螺旋狀核衣殼樣結(jié)構(gòu)的N蛋白。
(b)非結(jié)構(gòu)蛋白則是病毒RNA復(fù)制密切相關(guān)的聚合酶。
在病毒表達(dá)的眾多蛋白之中，S、M蛋白構(gòu)成了病毒最外層的結(jié)構(gòu)，S蛋白是一種十分重要的結(jié)構(gòu)蛋白，眾多的冠狀病毒在這一部分差異很大，這可能和它針對(duì)不同的靶細(xì)胞有關(guān)。
參見(jiàn)圖2。S蛋白分為S1，S2兩部分，其中通過(guò)序列分析表明，S1區(qū)包括1-668；S2區(qū)669-1162。S1蛋白它主要與靶細(xì)胞受體結(jié)合有關(guān)；S2蛋白則介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合。由于S蛋白對(duì)于病毒感染的重要性，因此很可能在其中篩選出能夠用于治療的中和性抗體；而且已知的冠狀病毒中和性抗體都是作用于S蛋白區(qū)。
因此，本發(fā)明選擇SARS的Spike蛋白(S蛋白)作為抗原靶位的主要研究對(duì)象，同時(shí)考慮到M，N蛋白也有潛在的抗原性，適當(dāng)?shù)倪x擇部分抗原決定表位，從臨床的角度來(lái)說(shuō)，這些部位產(chǎn)生的抗體對(duì)于疾病的早期診斷可能有些意義。
確定靶蛋白后，本發(fā)明使用多種抗原性分析軟件和網(wǎng)站對(duì)蛋白完整序列，綜合考慮氨基酸序列的親水性(高親水性)和多級(jí)結(jié)構(gòu)(多為α-螺旋，β-折疊)，優(yōu)先考察那些存在于膜表面部分，剔除包含在膜內(nèi)的部分，這樣從M蛋白序列中挑選了部分多肽序列(表1)。
如本文所用，“本發(fā)明多肽”或“SARS特異性多肽”指氨基酸序列如表1所示的多肽。
本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。
本發(fā)明多肽可以直接用于檢測(cè)抗SARS的抗體，也可用于與BSA等分子量的蛋白偶聯(lián)，從而形成多肽偶聯(lián)物。通常，所述的偶聯(lián)物由多肽、交聯(lián)劑、和BSA構(gòu)成，其中所述的交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛(當(dāng)與本發(fā)明多肽的N-端偶聯(lián)時(shí))、EDAC(當(dāng)與本發(fā)明多肽的C-端偶聯(lián)時(shí))。
本發(fā)明的偶聯(lián)物可用于免疫兔、鼠等動(dòng)物，從而獲得抗本發(fā)明多肽的抗體(“本發(fā)明抗體”)。本發(fā)明抗體包括特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于SARS病毒、基因產(chǎn)物或片段。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段(如Fab′或(Fab)2片段)、抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體、人源化抗體等。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。對(duì)于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本發(fā)明的多肽、偶聯(lián)物和抗體都可用檢測(cè)樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體，從而作為早期檢測(cè)SARS的有效指標(biāo)之一。
除了用于檢測(cè)，本發(fā)明的SARS特異性多肽還可在體內(nèi)與病毒競(jìng)爭(zhēng)受體，阻止病毒與膜融合，抑制病毒感染正常細(xì)胞。此外，本發(fā)明的多肽和偶聯(lián)物還可用于制備治療性的藥物組合物或預(yù)防性的疫苗組合物。
因此，另一方面，本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明多肽、偶聯(lián)物或其組合物；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。本發(fā)明的組合物可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。以本發(fā)明多肽計(jì)，其用量例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)因?yàn)楸景l(fā)明的SARS特異性多肽、多肽偶聯(lián)物與抗SARS病毒抗體的親和力高，本發(fā)明抗體與SARS病毒的親和力高，因此，本發(fā)明的檢測(cè)方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高。
(b)本發(fā)明的SARS特異性多肽還可在體內(nèi)與病毒競(jìng)爭(zhēng)受體，阻止病毒與膜融合，抑制病毒感染正常細(xì)胞，所以本發(fā)明具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1多肽的人工合成按表1所示的氨基酸序列，在多肽合成儀上用合成多肽。合成后經(jīng)質(zhì)譜法驗(yàn)證，證明合成的多肽與設(shè)計(jì)相符。
表1本發(fā)明多肽的氨基酸序列

實(shí)施例2抗原多肽的與載體的連接(偶聯(lián)物的制備)對(duì)于實(shí)施例1合成的各多肽，先用PBS溶解(對(duì)某些不溶的多肽，可以先用半量PBS溶解，若不溶則用1M NaOH調(diào)節(jié)PH使之全溶)，取0.5ml多肽(濃度分別為0.5mg/ml、1mg/ml)與15mg BSA(1.5ml)混勻，然后加入交聯(lián)劑(針對(duì)交聯(lián)方向的不同，選擇不同的交聯(lián)劑，N-端交聯(lián)加入戊二醛，C-端加入EDAC)，混合后于室溫反應(yīng)5小時(shí)，避光不斷搖晃；交聯(lián)結(jié)束后，放入透析袋中，對(duì)PBS 4℃透析過(guò)夜；量體積，以BSA計(jì)算濃度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3抗原多肽免疫動(dòng)物制備抗體取實(shí)施例2制備的偶聯(lián)物約0.5ml(偶聯(lián)物含量分別為0.1mg、0.5mg)，加入PBS 1.5ml后與CFA(完全弗氏佐劑)混合，在三通管中反復(fù)推打，直至感覺(jué)費(fèi)力，放置3-5分鐘后，無(wú)兩相分離即可。
將經(jīng)過(guò)佐劑乳化處理的抗原免疫兔子和小鼠；每只兔子注射抗原3ml左右，小鼠則注射0.8ml/只。分別皮下注射動(dòng)物兩足墊、頸部、背部多點(diǎn)注射(每點(diǎn)0.2ml)。
初次免疫三周后，取同樣劑量多肽抗原、PBS，混合2ml IFA(不完全弗氏佐劑)，乳化后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，注射劑量不變。
三周后對(duì)動(dòng)物取血，收集抗血清。使用BSA包被的層析柱，清除針對(duì)BSA的抗體。
挑選抗體滴度較高的抗原多肽，制備單克隆抗體。
實(shí)施例4檢測(cè)應(yīng)用(1)抗原多肽檢測(cè)病人血清樣品使用經(jīng)過(guò)處理的實(shí)施例1制備的抗原多肽包被，與病人血清混合反應(yīng)，結(jié)果本發(fā)明的抗原肽段可以識(shí)別病人血清中早期針對(duì)SARS的特異性抗體，并與之結(jié)合，洗滌后加入HRP酶連二抗反應(yīng)；最后加入顯色底物，進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽可特異性地與抗SARS病毒的抗體結(jié)合。
(2)抗體(單抗與多抗)檢測(cè)病原體對(duì)于實(shí)施例3獲得的獲得的抗體(多抗和單抗)，用ELISA法與病人血清反應(yīng)，檢測(cè)病人組織液、血液中的病毒結(jié)合，對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果表明，本發(fā)明的多抗和單抗可特異性地與SARS病毒結(jié)合。
實(shí)施例5免疫印跡實(shí)驗(yàn)在本實(shí)施例中，所用抗體分別為免疫前血清，M1-抗血清和M2-抗血清(免疫兔后的血清中抗體，未純化)。
免疫印跡實(shí)驗(yàn)流程如下1.SDS-PAGE樣品SARS病毒感染的細(xì)胞裂解液上樣量100ul上層膠3.5％，下層膠7％，上層膠100V 1小時(shí)，下層膠200V 15小時(shí)2.轉(zhuǎn)膜電流1.0mA/cm2，2小時(shí)3.封閉5％脫脂奶粉封閉6小時(shí)4.雜交一抗，1∶100稀釋在TBS-Tween中，4度雜交過(guò)夜二抗(goat-anti-rabbit-HRP，購(gòu)自Santa Cruze公司)1∶4000稀釋?zhuān)s交1小時(shí)顯色ECL-Plus(購(gòu)自Amersham公司)
結(jié)果表明，抗M1和M2抗體特異性地與SARS病毒的M蛋白結(jié)合。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>SARS早期診斷方法及試劑盒<130>033040<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>PRT<213>非典病毒(SARS virus)<400>1Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu Glu Gln1 5 10 15Trp Asn Leu Val20<210>2<211>22<212>PRT<213>非典病毒(SARS virus)<400>2Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp Ile1 5 10 15Lys Asp Leu Pro Lys Glu20
權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于，其氨基酸序列為SEQ ID NO1或2。
2.一種多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述的偶聯(lián)物由多肽、交聯(lián)劑、和BSA構(gòu)成，其中所述的多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO1或2，所述的交聯(lián)劑選自戊二醛或EDAC。
3.一種抗體，其特征在于，所述的抗體特異性地與權(quán)利要求1所述的多肽結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的抗體，其特征在于，所述的抗體是單克隆抗體。
5.一種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2所述的多肽偶聯(lián)物、權(quán)利要求3所述的抗體、或其組合。
6.一種體外檢測(cè)樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法，其特征在于，包括步驟(a)將樣品與選自下組的物質(zhì)接觸權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2所述的多肽偶聯(lián)物、權(quán)利要求3所述的抗體、或其組合；(b)檢測(cè)是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的樣品為血清或痰液。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的物質(zhì)是氨基酸序列為SEQID NO1或2的多肽。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的物質(zhì)是權(quán)利要求3所述的抗體，且所述抗體是單克隆抗體。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(b)的檢測(cè)方法是熒光檢測(cè)法。
全文摘要
本發(fā)明涉及SARS的早期診斷方法及試劑盒。具體地，本發(fā)明使用人工合成的源自SARS病毒M蛋白的多肽作為抗原，以及該多肽免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體(單抗、多抗)，結(jié)合酶聯(lián)免疫和其他方法檢測(cè)人血清樣品中的早期抗SARS抗體IgM或IgG，或直接檢測(cè)血清樣品中SARS病原體。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1552730SQ0312883
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日
發(fā)明者孫兵, 吳家睿, 裴鋼, 李亦學(xué), 石鐵流, 楊瑞馥, 何有裕, 施木德, 呂偉, 季永鏞, 孫 兵 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院