專(zhuān)利名稱(chēng)：多肽的定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽的定量分析。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及用于確定選定的多肽在樣品中的實(shí)際量的方法和材料。本方法包括以相應(yīng)于特定的水解產(chǎn)物的外源多肽為參照，來(lái)測(cè)量從選定的多肽中釋放出的特定的水解產(chǎn)物的量。
背景技術(shù)：
多肽在生物系統(tǒng)中具有重要的作用。例如，多肽可以作為催化生物反應(yīng)的酶，作為多種分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或載體，作為分子間和分子內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的受體，作為激素，以及作為細(xì)胞、組織和器官的結(jié)構(gòu)元件。
確定特定的多肽的量在研究中(例如在藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)中)和臨床中(例如用于醫(yī)療診斷和監(jiān)測(cè)治療效果)通常都是重要的。特定的多肽通常通過(guò)例如親和的方法來(lái)定量，包括免疫分析、質(zhì)譜和高效液相色譜。放射性同位素、穩(wěn)定的同位素、熒光和化學(xué)發(fā)光試劑可以與這些方法結(jié)合使用來(lái)對(duì)多肽定量。酶可以通過(guò)對(duì)其催化活性進(jìn)行生物化學(xué)分析來(lái)定量。
傳統(tǒng)的方法在測(cè)量樣品中特定的多肽的實(shí)際量而不是相對(duì)量的能力方面有所局限。這個(gè)缺點(diǎn)使得其難以對(duì)由于例如疾病或藥物治療的影響而引起的蛋白水平的變化作出評(píng)估。對(duì)特定的多肽在復(fù)雜混合物或水不溶性環(huán)境(例如細(xì)胞膜)中的實(shí)際量進(jìn)行定量，已經(jīng)被證明是特別困難的。因此，本發(fā)明的方法避免了許多與不溶性蛋白相關(guān)的問(wèn)題，這是因?yàn)榭梢赃x擇一個(gè)可溶性的蛋白水解片段來(lái)定量地代表完整的蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明的特征在于測(cè)定樣品中選定的多肽的實(shí)際量的方法和材料。該方法包括以相應(yīng)于特定的水解產(chǎn)物的外源多肽為參照，來(lái)測(cè)量從選定的多肽中釋放出的特定的水解產(chǎn)物的量。公開(kāi)的方法和材料與傳統(tǒng)的多肽定量方法相比提供了許多優(yōu)點(diǎn)?？梢砸砸环N容易制備的參照多肽為對(duì)照測(cè)定選定的多肽的實(shí)際量而不是相對(duì)量。參照多肽對(duì)應(yīng)于被測(cè)量的特定水解產(chǎn)物，因此消除了與參照的和測(cè)量的水解產(chǎn)物的不同行為有關(guān)的誤差。膜結(jié)合蛋白的測(cè)定可以通過(guò)將一種特定的水解產(chǎn)物釋放到溶液中(例如通過(guò)對(duì)選定的多肽中溶液可進(jìn)入的位點(diǎn)進(jìn)行靶向水解)來(lái)簡(jiǎn)化。本發(fā)明的方法和材料可以用于對(duì)甚至是在復(fù)雜樣品和水不溶性環(huán)境中的一種或多種選定的多肽進(jìn)行定量。
本發(fā)明的特征在于測(cè)定樣品中一種或多種選定的多肽的實(shí)際量的方法。這種特征方法包括1)用至少一種水解試劑從每個(gè)選定的多肽上釋放出至少一種特定的水解產(chǎn)物；以及2)通過(guò)與確定量的相應(yīng)的外源多肽進(jìn)行比較來(lái)確定每種特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量。每種特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量與它從其上釋放出來(lái)的選定的多肽的實(shí)際量直接相關(guān)。
在某些實(shí)施方案中，樣品含有一種選定的多肽。在其它的實(shí)施方案中，樣品含有2到5種選定的多肽。在另一些實(shí)施方案中，樣品含有6到10種選定的多肽。
在某些實(shí)施方案中，從選定的多肽上可以釋放出一種特定的水解產(chǎn)物。在其它的實(shí)施方案中，從選定的多肽上可以釋放出2到5種特定的水解產(chǎn)物。
在某些實(shí)施方案中，在特定的水解產(chǎn)物和選定的多肽的量之間有1∶1的直接關(guān)系。
在某些實(shí)施方案中，選定的多肽是膜多肽。在某些實(shí)施方案中，選定的多肽是神經(jīng)受體。
在某些實(shí)施方案中，確定量的相應(yīng)的外源多肽在釋放步驟前被加入到樣品中。
在某些實(shí)施方案中，水解試劑是一種酶(例如胰蛋白酶、Lys-C內(nèi)切蛋白酶、Arg-C內(nèi)切蛋白酶和Glu-C內(nèi)切蛋白酶)。在其它的實(shí)施方案中，水解試劑是一種化學(xué)試劑(例如溴化氰)。
在某些實(shí)施方案中，抗體被用于測(cè)量水解產(chǎn)物的量。在其它的實(shí)施方案中，串聯(lián)的或高階質(zhì)譜被用于測(cè)量水解產(chǎn)物的量。
在某些實(shí)施方案中，這種特征方法還包括1)在從選定的多肽上釋放出水解產(chǎn)物之前在樣品中先加入一種確定量的回收多肽；以及2)在從選定多肽上釋放出水解產(chǎn)物后測(cè)量回收多肽的實(shí)際量。在這些實(shí)施方案中，回收多肽相應(yīng)的特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量被調(diào)整到能夠反映出在樣品中加入回收多肽后發(fā)生的回收多肽的損失。
在某些實(shí)施方案中，這種特征方法還包括1)在從選定的多肽上釋放出水解產(chǎn)物之前在樣品中先加入一種確定量的合成的可水解多肽；2)用水解試劑從合成的可水解多肽上釋放出至少2種不同標(biāo)記的多肽；以及3)測(cè)量每種不同標(biāo)記的水解產(chǎn)物的實(shí)際量。在這些實(shí)施方案中，特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量被調(diào)整到能夠反映出水解的不完全性。在某些這樣的實(shí)施方案中，一種不同標(biāo)記的多肽對(duì)應(yīng)于特定的水解產(chǎn)物，而特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量被調(diào)整到能夠反映出在樣品中加入可水解多肽后發(fā)生的相應(yīng)的不同標(biāo)記的多肽的損失。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從下面的發(fā)明詳述和權(quán)利要求中變得明顯。
除非有特別的定義，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通專(zhuān)業(yè)人員所通常理解的含義。所有本文提到的著作、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其它參考文獻(xiàn)以其全文引為參考。在有沖突的情況下，以本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)、包括定義為準(zhǔn)。所公開(kāi)的材料、方法和實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的而沒(méi)有限制的目的。專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到與本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以被用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
附圖描述

圖1顯示了合成的多肽TETSQVAPA(SEQ ID NO1)的MS和MS/MS譜圖。
圖2顯示了實(shí)驗(yàn)的和標(biāo)準(zhǔn)樣品的LC/MS/MS離子色譜圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于確定樣品中選定多肽的實(shí)際量的方法和材料。本發(fā)明至少部分是基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即人們可以通過(guò)從選定的多肽上釋放出特定的水解產(chǎn)物，然后以相應(yīng)于特定的水解產(chǎn)物的外源多肽為參照，來(lái)測(cè)量這種特定的水解產(chǎn)物的量，從而確定樣品中選定多肽的實(shí)際量。不受理論的束縛，本測(cè)定方法是可能實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)樵谶x定的多肽和被測(cè)量的釋放多肽之間有1∶1的摩爾關(guān)系。此外，特定的水解產(chǎn)物和相應(yīng)的外源多肽在測(cè)量過(guò)程中有同樣的行為，因此消除了由于測(cè)量樣本和參照樣本的不同行為而可能引起的潛在誤差。
提供的方法和材料可以被用于測(cè)定樣品中單個(gè)選定多肽的實(shí)際量，也可以被用于測(cè)定樣品中多個(gè)選定多肽的實(shí)際量?？梢詼y(cè)量一種以上的特定水解產(chǎn)物以便增加靈敏度和/或檢查準(zhǔn)確性。
此處公開(kāi)的方法可直接適用于分子生物學(xué)、蛋白化學(xué)和臨床化學(xué)中的許多現(xiàn)有的研究需要。此處公開(kāi)的方法可以以比現(xiàn)有方法所能提供的更高的靈敏度、動(dòng)力學(xué)范圍、精確度和速度為多種不同的多肽提供絕對(duì)的定量。由于本發(fā)明的方法需要的分析循環(huán)時(shí)間相對(duì)較短，因此可以在例如應(yīng)激或急性藥劑發(fā)作后的許多時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)地測(cè)量特定的一組蛋白的水平，從而更清楚地闡明調(diào)節(jié)途徑。此外，由于本發(fā)明方法比現(xiàn)有可用的方法允許更短的分析循環(huán)時(shí)間，本發(fā)明的方法適合于高通量實(shí)驗(yàn)。
選定的多肽和樣品選定的多肽可以是任何多肽(即兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸被肽鍵連接起來(lái))，而樣品可以是任何含有多肽的樣品。適合的樣品包括細(xì)胞樣品、組織樣品、體液和環(huán)境樣品。樣品可以來(lái)自動(dòng)物(例如人類(lèi))，并可以包括動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官。樣品可以來(lái)自植物，并可以包括植物細(xì)胞、組織或器官。樣品也可以來(lái)自真菌、細(xì)菌和病毒。樣品也可以來(lái)自環(huán)境(例如土壤、水和空氣樣品)。多肽可以來(lái)自動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒。多肽可以是膜結(jié)合的(即跨過(guò)脂雙層或吸附在脂雙層的表面)。膜結(jié)合的多肽可以與例如細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞器膜和病毒衣殼結(jié)合。多肽可以在細(xì)胞質(zhì)中或細(xì)胞器中。多肽可以在細(xì)胞外，被發(fā)現(xiàn)在間隙中或體液中(例如血漿和脊髓液)。多肽可以是生物催化劑，多種分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或載體，細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的受體，激素以及細(xì)胞、組織和器官的結(jié)構(gòu)元件。某些多肽是腫瘤標(biāo)記。
樣品制備液根據(jù)所測(cè)定的選定多肽和特定的水解產(chǎn)物的位置和生物物理性質(zhì)測(cè)定。樣品在釋放出特定的水解產(chǎn)物之前可以對(duì)選定的多肽進(jìn)行富集。組織或細(xì)胞樣品在用水解試劑處理前可以被勻漿或保持完整，這依賴(lài)于被測(cè)量的選定多肽和特定水解產(chǎn)物的細(xì)胞定位。膜結(jié)合的多肽例如受體，一般來(lái)說(shuō)與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白操作不同。在用水解試劑處理之前可以通過(guò)例如離心來(lái)分離細(xì)胞膜，從而富集膜結(jié)合的多肽。在樣品制備過(guò)程中，在用水解試劑處理之前可以分離細(xì)胞質(zhì)，從而富集細(xì)胞質(zhì)中的多肽。
在某些實(shí)施方案中，樣品在用水解試劑處理之前被可溶解。樣品多肽可以根據(jù)樣品的本性溶解在多種介質(zhì)中。例如，粗膜制備物可以溶解在含有6M尿素、還原試劑和烷基化試劑的緩沖的去污劑中。樣品在用水解試劑處理之前可以被脫脂(例如在95％的乙醇和己烷或丙酮中)。樣品在用水解試劑處理之前可以被溶解和脫脂(例如在95％的乙醇和己烷或丙酮中)。在某些情況下，特別是當(dāng)特定水解產(chǎn)物可以在溶液中獲得時(shí)，樣品可以不需要溶解或脫脂就進(jìn)行消化?？梢栽谌芤褐蝎@得的特定水解產(chǎn)物包括例如從細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外、細(xì)胞間隙、體液和某些環(huán)境多肽上釋放的水解產(chǎn)物，以及從膜結(jié)合多肽上釋放到溶液中的水解產(chǎn)物。
特定水解產(chǎn)物和水解反應(yīng)可以通過(guò)一種或多種水解試劑的處理將特定水解產(chǎn)物從選定的多肽上釋放出來(lái)。這種處理可以通過(guò)體外或原位的水解反應(yīng)來(lái)完成，其中在含有多肽的樣品中加入了一種或多種水解試劑。水解試劑在多肽的特定的氨基酸之間水解肽鍵，從而釋放出特定的水解多肽。水解試劑可以單獨(dú)使用，也可以組合使用以便從選定多肽上釋放出特定水解產(chǎn)物。某些水解試劑是酶，例如Arg-C內(nèi)切蛋白酶、Glu-C內(nèi)切蛋白酶、Lys-C內(nèi)切蛋白酶和胰蛋白酶。這些特定的內(nèi)切蛋白酶從商業(yè)化的生產(chǎn)商購(gòu)買(mǎi)到，具有嚴(yán)格的特異性，使它們成為用于蛋白定量的理想的水解工具。其它有用的水解試劑是是化學(xué)試劑，例如溴化氰。
用一種水解試劑從具有已知氨基酸序列的選定多肽上釋放出的特定水解產(chǎn)物的身份是可能預(yù)測(cè)的。這樣的預(yù)測(cè)通常被稱(chēng)為“虛擬消化”。容易獲得的計(jì)算機(jī)程序可以便利地進(jìn)行選定多肽的虛擬消化。大鼠的嘌呤能受體P2X3(GenBank Accession No.CAA62594)的虛擬的胰蛋白酶消化顯示在表1中。特定水解產(chǎn)物的終點(diǎn)相對(duì)于天然蛋白中的氨基酸位置在“從”和“到”欄中指明。
表1


一般來(lái)說(shuō)，選擇具有5到100個(gè)(例如5-10、10-20、20-40、60-80和80-100個(gè))氨基酸的特定水解產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。
一般來(lái)說(shuō)，選擇可能被釋放并進(jìn)入溶液中的特定水解產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行測(cè)定。水解和測(cè)定的可達(dá)性可以在例如選定多肽的已知的或預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行評(píng)估。此外，具有相對(duì)親水的氨基酸序列的特定水解產(chǎn)物特別適合于測(cè)定。特定水解產(chǎn)物的疏水性/親水性可以使用計(jì)算機(jī)軟件、或者在已知的氨基酸疏水性指數(shù)的基礎(chǔ)上手動(dòng)地進(jìn)行估計(jì)。
一般來(lái)說(shuō)，選擇具有較低的翻譯后修飾的可能性的特定水解產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。用于翻譯后修飾的氨基酸序列的決定簇是熟知的(參見(jiàn)Han和Martinage，1992，Int J Biochem.，2419-28)，缺乏這樣的序列決定簇的特定水解產(chǎn)物可以通過(guò)手工檢查容易地鑒別。
水解反應(yīng)的條件依賴(lài)于使用的水解試劑。樣品多肽可以在含有水解試劑釋放特定水解產(chǎn)物所需的任何分子(例如ATP或Mg++)的緩沖液中稀釋。用蛋白水解酶處理一般在較高的溫度(例如37℃)進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)或以上。
特定的水解產(chǎn)物可以通過(guò)例如凝膠過(guò)濾、反相色譜(例如高效液相色譜和快效液相色譜)、固相抽提、離子交換色譜、親和色譜和免疫親和分離，以及這些技術(shù)的不同組合，從水解反應(yīng)中獲得。用于免疫親和分離的抗體可以使用相應(yīng)于特定水解產(chǎn)物的外源肽來(lái)制備。
多肽的測(cè)量和定量特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，特定水解產(chǎn)物的量使用質(zhì)譜(例如串聯(lián)的質(zhì)譜或更高階的質(zhì)譜(例如MSN))測(cè)量。在其它的實(shí)施方案中，特定水解產(chǎn)物的量通過(guò)親和分析例如免疫分析(例如ELISA或RIA)來(lái)測(cè)量。免疫分析可以是競(jìng)爭(zhēng)性的，也可以是非競(jìng)爭(zhēng)性的。對(duì)于使用RIA的測(cè)量，一般使用外源的多肽作為示蹤劑，一般用放射性同位素例如3H、14C或125I進(jìn)行標(biāo)記。在另外的實(shí)施方案中，特定水解產(chǎn)物的量通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量包括對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行可檢測(cè)的標(biāo)記(例如通過(guò)與熒光、化學(xué)發(fā)光或放射性分子結(jié)合)。例如，特定水解產(chǎn)物可以用穩(wěn)定的同位素例如2H、15N、13C或18O進(jìn)行標(biāo)記以便利用質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)量。
特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量的確定以相應(yīng)的外源多肽作為參照。測(cè)量確定量的相應(yīng)外源多肽，然后產(chǎn)生將獲得的信號(hào)與多肽量相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)樣品通過(guò)同樣的方法進(jìn)行測(cè)量，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將測(cè)量的信號(hào)轉(zhuǎn)換成實(shí)際的多肽量。選定多肽的實(shí)際量可以被測(cè)量，這部分是因?yàn)橄鄳?yīng)的外源多肽在測(cè)量中與特定水解產(chǎn)物有同樣的行為，因而消除了與特定水解產(chǎn)物和外源多肽的不同行為有關(guān)的潛在誤差。在本文中使用的化合物(例如特定水解產(chǎn)物或選定多肽)的“實(shí)際”量是指樣品中化合物的絕對(duì)量。化合物的“實(shí)際”量可以通過(guò)使用例如質(zhì)譜進(jìn)行直接測(cè)量而獲得，也可以通過(guò)與使用確定量的相應(yīng)化合物所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較而獲得。這樣的相應(yīng)化合物對(duì)于樣品來(lái)說(shuō)一般是外源的(即來(lái)自或產(chǎn)生于細(xì)胞、組織或器官之外)?；衔锏摹皩?shí)際”或“絕對(duì)”量與化合物的“相對(duì)”量不同，后者中測(cè)定的化合物的量是基于或依賴(lài)于(即相對(duì)于)不相應(yīng)于被測(cè)量的化合物的化合物(“不相應(yīng)”的化合物)的量。對(duì)于本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然適當(dāng)?shù)牟幌鄳?yīng)的化合物應(yīng)該與被測(cè)量的化合物是同樣類(lèi)型的化合物(例如，如果測(cè)量多肽，不相應(yīng)的化合物也應(yīng)該是多肽)。
本發(fā)明的方法允許測(cè)定選定的多肽的實(shí)際量，因?yàn)樵诙嚯暮蛷钠洚a(chǎn)生的獨(dú)特的水解產(chǎn)物之間有1∶1的摩爾比率。為了使1∶1的比率得到保證，需要水解試劑的完全水解。本發(fā)明還提供了在水解不完全的情況下(下面討論)測(cè)定選定多肽的實(shí)際量的方法。本發(fā)明的方法特別適合于獲得例如不能容易或有效地純化的多肽的實(shí)際量。這樣的多肽包括但不限于膜多肽(例如受體如G蛋白偶聯(lián)受體和神經(jīng)受體)?？梢哉J(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的方法可以用于在正常實(shí)驗(yàn)誤差的范圍內(nèi)測(cè)定特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量以及隨后的選定多肽的實(shí)際量。
在使用質(zhì)譜定量分析選定多肽的應(yīng)用中，相應(yīng)的外源多肽一般與特定水解產(chǎn)物在組成上一致。在此所用的組成一致的多肽包括同樣的氨基酸，但是可以有不同的一級(jí)序列。在使用抗體定量分析選定多肽的應(yīng)用中，相應(yīng)的外源多肽與結(jié)合從選定多肽水解產(chǎn)生的特定水解產(chǎn)物的抗體具有特異性免疫反應(yīng)性。特異性免疫反應(yīng)多肽是一個(gè)抗體制備物能夠與其結(jié)合并顯示出稀釋線(xiàn)性(即對(duì)一系列抗原稀釋度有成比例的反應(yīng)性)的多肽。抗體制備物不應(yīng)該表現(xiàn)出與選定多肽及其片段以外的其它多肽的交叉反應(yīng)性。抗體制備物的特異性免疫反應(yīng)性可以針對(duì)多肽中任意組的氨基酸(例如抗原決定簇)。與一種生物的多肽特異性反應(yīng)的抗體制備物可以與另一種生物結(jié)構(gòu)相似的多肽具有特異性免疫反應(yīng)性。例如，與大鼠的多肽特異性反應(yīng)的抗體制備物可以與人類(lèi)的多肽具有特異性免疫反應(yīng)性。具有免疫反應(yīng)性的相應(yīng)的外源多肽應(yīng)該與特定水解產(chǎn)物一致。對(duì)于本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)，顯然用于定量選定多肽的免疫分析中使用的抗體制備物需要過(guò)量，以便100％的特定水解產(chǎn)物可以被檢測(cè)到。
回收多肽和水解對(duì)照回收多肽可以被用來(lái)校正在樣品制備、水解和/或定量分析過(guò)程中可能發(fā)生的特定水解產(chǎn)物的任何損失?；厥斩嚯氖且环N相應(yīng)于特定水解產(chǎn)物的標(biāo)記的外源多肽。在使用時(shí)，回收多肽可以以確定的量直接加到樣品中作為內(nèi)標(biāo)?；厥斩嚯牡募尤朐试S對(duì)在將其加入到樣品中之時(shí)一直到回收多肽被測(cè)量時(shí)為止的期間可能發(fā)生的損失進(jìn)行校正。因此，為了校正在樣品制備、水解和定量分析過(guò)程中發(fā)生的所有損失，可以在開(kāi)始樣品制備之前在樣品中加入確定量的回收多肽，然后在測(cè)量相應(yīng)的特定水解產(chǎn)物的量時(shí)測(cè)量回收多肽的量?；厥斩嚯牡膿p失(因此也是相應(yīng)的特定水解產(chǎn)物的損失)可以通過(guò)將樣品制備后存在的回收多肽的量與加入到樣品中的確定的量進(jìn)行比較而確定。然后可以將特定水解產(chǎn)物的測(cè)定量調(diào)整到反映出回收多肽的損失。
回收多肽可以與被測(cè)量的特定水解產(chǎn)物一致。在使用質(zhì)譜定量分析選定多肽的應(yīng)用中，回收多肽一般與被測(cè)定的特定水解產(chǎn)物一致。在使用抗體定量分析選定多肽的應(yīng)用中，回收多肽一般與結(jié)合被測(cè)定的特定水解產(chǎn)物的抗體具有特異性免疫反應(yīng)性。
回收多肽可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行標(biāo)記。例如，回收多肽可以用穩(wěn)定的同位素例如2H、15N、13C和18O進(jìn)行標(biāo)記以便用質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)量?；厥斩嚯目梢允褂胾H、14C或125I進(jìn)行標(biāo)記以便用免疫分析進(jìn)行測(cè)量?；厥斩嚯倪€可以用熒光或化學(xué)發(fā)光分子進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)回收多肽被加入到含有標(biāo)記的特定水解產(chǎn)物的樣品中時(shí)，標(biāo)記的特定水解產(chǎn)物和相應(yīng)的回收多肽的標(biāo)記一般來(lái)說(shuō)是不同的。當(dāng)使用放射性免疫分析測(cè)量特定水解產(chǎn)物時(shí)，在回收多肽中的放射活性的量一般來(lái)說(shuō)是足夠低的，以便不干擾特定水解產(chǎn)物的測(cè)量。
為了證實(shí)特定水解產(chǎn)物與起始的選定多肽之間有1∶1的摩爾關(guān)系，應(yīng)該證實(shí)水解反應(yīng)的完全性。多種方法可以被用來(lái)證實(shí)水解反應(yīng)的完全性。例如，一種監(jiān)測(cè)已知的多肽(例如選定多肽)轉(zhuǎn)化為水解產(chǎn)物的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)可以被用來(lái)估計(jì)特定的水解試劑將選定多肽完全轉(zhuǎn)化為水解產(chǎn)物所需要的時(shí)間。
另一種證實(shí)選定多肽的完全水解的方法包括設(shè)計(jì)和制備具有一個(gè)可水解位點(diǎn)(例如，如果使用胰蛋白酶作為水解試劑，為賴(lài)氨酸)的不同標(biāo)記的合成的可水解肽。在可水解位點(diǎn)的N-端的一種或多種氨基酸和可水解位點(diǎn)的C-端的一種或多種氨基酸用不同的同位素標(biāo)記。例如N-端的氨基酸可以用14C標(biāo)記，而可水解位點(diǎn)的C-端的氨基酸可以用3H標(biāo)記。帶有不同標(biāo)記的可水解多肽在水解反應(yīng)前被加入到樣品中，既可以直接加到含有選定多肽的樣品中，也可以加入到平行樣品中。同位素的量可以使用雙通道的液閃計(jì)數(shù)器定量，一種同位素對(duì)另一種同位素的比率是水解反應(yīng)完全性的一種度量單位。
如果帶有不同標(biāo)記的可水解多肽直接被加入到含有選定多肽的樣品中，它被加入的量應(yīng)該不干擾特定水解產(chǎn)物的測(cè)量。如果可水解的肽被直接加入到含有選定多肽的樣品中，它應(yīng)該使用與任何標(biāo)記的特定水解產(chǎn)物(例如通過(guò)MS/MS測(cè)量的水解產(chǎn)物)不同的標(biāo)記。
在合成的可水解多肽的可水解位點(diǎn)一側(cè)或兩側(cè)的氨基酸可以相應(yīng)于特定的水解產(chǎn)物。如果在可水解位點(diǎn)任何一側(cè)的氨基酸對(duì)應(yīng)于被測(cè)量的特定水解產(chǎn)物，這些氨基酸可以用作回收多肽來(lái)說(shuō)明特定水解產(chǎn)物的任何損失。
多個(gè)水解產(chǎn)物的測(cè)量對(duì)于任何特定的樣品，可以測(cè)量多個(gè)不同的特定水解產(chǎn)物。通過(guò)測(cè)量從一個(gè)特定的選定多肽上釋放出的多個(gè)特定水解產(chǎn)物，人們可以增加這個(gè)特定的選定多肽定量分析的靈敏度和/或證實(shí)其準(zhǔn)確性。通過(guò)測(cè)量從不同選定多肽上釋放的特定水解產(chǎn)物，人們可以對(duì)一個(gè)特定樣品中的多個(gè)選定多肽進(jìn)行定量。每個(gè)特定水解產(chǎn)物可以以相應(yīng)的外源多肽作為參照進(jìn)行測(cè)量，并且回收多肽可以被用來(lái)說(shuō)明任何或所有被測(cè)量的特定水解產(chǎn)物的損失。
在下面的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，這并不對(duì)權(quán)利要求中描述的本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實(shí)施例實(shí)施例1人P2X3的ELISA定量本實(shí)施例描述了一種膜結(jié)合的嘌呤能受體人P2X3的定量。以相應(yīng)的合成多肽為參照，測(cè)量了從人P2X3羧基端釋放的水解產(chǎn)物。該水解產(chǎn)物的氨基酸序列為QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO2)。相應(yīng)的合成多肽具有大鼠P2X3的氨基酸序列VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ IDNO3)。合成的多肽被用來(lái)產(chǎn)生與合成多肽和水解產(chǎn)物具有特異性免疫反應(yīng)性的抗體?？贵w也通過(guò)免疫組化和Western印跡進(jìn)行證實(shí)，以表明對(duì)選定多肽的特異性反應(yīng)性。
樣品和水解反應(yīng)含有P2X3的制備物從表達(dá)人P2X3的Hex細(xì)胞轉(zhuǎn)染子制備。簡(jiǎn)單地說(shuō)，含有P2X3的Hex細(xì)胞被懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，超聲，在-70℃冷凍。冷凍的細(xì)胞懸浮液在冰浴中融化，超聲，然后在4℃ 100000xg離心1小時(shí)。沉淀重新懸浮在PBS中。細(xì)胞懸浮液被超聲，在4℃ 100000xg離心1小時(shí)。沉淀重懸浮在膜溶解緩沖液(6M尿素，2mM二硫蘇糖醇(DTT)，1％Chaps，0.05M Tris(pH8.0))中，以便在膜制備液中的蛋白濃度在每100μl大約1.0到1.5mg之間。通過(guò)Pierce BCA方法測(cè)定蛋白表明在樣品中存在大約8mg的總膜蛋白。Western印跡證實(shí)了在膜制備液中存在P2X3。膜制備液在-70℃冷凍。
在用水解試劑胰蛋白酶處理之前，將細(xì)胞懸浮液融化，超聲，在室溫保溫15分鐘，并在5ml Wheaton管中用50mM Tris(pH7.6)和1mMMgCl2稀釋7倍。通過(guò)在每mg蛋白中加入10μg胰蛋白酶(測(cè)序級(jí)，Promega，Madison，WI)起始水解反應(yīng)。水解反應(yīng)在37℃搖動(dòng)保溫24小時(shí)。為了保證完全的消化，平行地用胰蛋白酶消化細(xì)胞色素C，消化的進(jìn)程通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)。水解反應(yīng)用100％TFA酸化到大約pH1-2，得到的沉淀在高速離心機(jī)中通過(guò)10000rpm離心除去。
水解反應(yīng)分兩次上樣到先用10ml甲醇再用10ml 0.1％TFA洗滌過(guò)的C18 Sep-Pak(Waters Corp.)柱。用1ml 0.1％TFA和8％乙腈沖洗Sep-Pak柱。水解產(chǎn)物用1ml 0.1％TFA和48％乙腈洗脫到預(yù)先稱(chēng)重的12×75mm管中。洗脫液在氮?dú)庵懈稍锏酱蠹s200μl。將管稱(chēng)重，通過(guò)參照管的干重將樣品體積用水調(diào)整到300μl，取200μl試樣用1％BSA-PBS稀釋5倍，并調(diào)整pH到7.2-7.4，用于ELISA。HPLC分析證實(shí)多肽包括水解產(chǎn)物得到了接近完全的回收。
ELISA測(cè)量和定量參比曲線(xiàn)如下產(chǎn)生。將兩份50μl含有0.078到2.5μg/ml合成多肽的BSA-PBS的樣品吸取到封閉、清洗和印跡過(guò)的96孔Nunc Polysorb板的孔中，每個(gè)孔預(yù)先用0.25μg合成的多肽包被。在每個(gè)孔中加入補(bǔ)充有胰蛋白酶抑制劑(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的抗體(稀釋20000倍)50μl?？贵w通過(guò)用與牛甲狀腺球蛋白偶聯(lián)的合成的大鼠P2X3多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ IDNO3)注射兔而獲得，并通過(guò)免疫組化和Western印跡證實(shí)了其與人P2X3水解產(chǎn)物QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO2)和合成多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO3)具有特異性反應(yīng)性。在4℃保溫24-48小時(shí)后，板被洗滌4次，倒置在印跡紙上。在每個(gè)孔中加入100μl與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的驢抗兔抗體(稀釋50000倍)，在室溫保溫45分鐘后，板被洗滌4次，并倒置在印跡紙上。在每個(gè)孔中加入100μl HRP底物顯色試劑(500μl 0.48％TMB溶液+10ml含有0.0024M H2O2的0.1M檸檬酸緩沖液(pH4.25))，保溫直到藍(lán)色完全顯現(xiàn)。在每個(gè)孔中加入100μl 2.0N H2SO4，測(cè)定在450nm的吸光度。以A450作為VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO3)的量為函數(shù)作圖得到的參比曲線(xiàn)表明最小的可檢測(cè)劑量是大約1pmol。實(shí)驗(yàn)樣品的分析表明當(dāng)用于QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO2)水解產(chǎn)物時(shí)分析為線(xiàn)性。
ELISA分析被用來(lái)測(cè)量存在于實(shí)驗(yàn)的胰蛋白酶消化樣品中的水解產(chǎn)物的量。實(shí)驗(yàn)的ELISA測(cè)量與參比曲線(xiàn)進(jìn)行比較，從而確定了存在于胰蛋白酶消化樣品中的QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO2)的量。參見(jiàn)表2。
表2

為了得到P2X3定量檢測(cè)的量，測(cè)量的水解產(chǎn)物的量被調(diào)整以校正在樣品制備、消化和加工過(guò)程中發(fā)生的損失。作為損失的對(duì)照，合成多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO3)進(jìn)行了平行的樣品制備、消化和加工步驟。合成多肽的回收率被確定為67％。表3顯示了在上述實(shí)驗(yàn)和重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的含有P2X3的Hex細(xì)胞中存在的P2X3的量。
表3

實(shí)施例2視紫紅質(zhì)的LC/MS/MS定量本實(shí)施例說(shuō)明了對(duì)一種跨膜G-蛋白偶聯(lián)受體視紫紅質(zhì)的定量。從視紫質(zhì)的羧基末端釋放的水解產(chǎn)物以相同的合成多肽作為參照進(jìn)行測(cè)定。水解產(chǎn)物和相應(yīng)的外源多肽的氨基酸序列如下TETSQVAPA(SEQ ID NO1)。
樣品和水解反應(yīng)含視紫紅質(zhì)的制備物從牛的視桿細(xì)胞外節(jié)(ROS)制備，參考Nemis和Dratz的方法(1982，Methods Enzymol.，81116-23，Packer主編，Academic Press，New York)。含有13μg/μl或者315pmol/μl視紫紅質(zhì)的ROS制備物稀釋13倍，取20μl樣品加入微量離心管中。每一個(gè)被定量的樣品含有485pmol視紫紅質(zhì)。在某些樣品中補(bǔ)充了480pmol合成多肽(即12μl 40pmol/μl的儲(chǔ)備液)。對(duì)照樣品含有緩沖液和480pmol合成多肽。
在用水解試劑胰蛋白酶處理之前，樣品用50mM Tris緩沖液(pH8.0)+1mM CaCl2將體積調(diào)整到200μl。水解反應(yīng)液為含有5μl 1μg/μl的胰蛋白酶儲(chǔ)液的樣品，于37℃保溫過(guò)夜。在水解反應(yīng)中加入純的TFA到濃度為1％進(jìn)行酸化，然后于20000xg離心30分鐘以沉淀剩余的ROS。水解反應(yīng)液使用SpeedVac真空離心濃縮至體積為大約40μl。取10μl樣品用于LC/MS/MS的分析。
LC/MS/MS的測(cè)定與定量通過(guò)在幾種濃度下(即0.500pmol/μl，1pmol/μl，和40pmol/μl)使用LC/MS/MS對(duì)合成多肽TETSQVAPA(SEQID NO1)進(jìn)行測(cè)定，產(chǎn)生了一個(gè)符合線(xiàn)性的、1倍加權(quán)的參考曲線(xiàn)。參考曲線(xiàn)使用了多個(gè)監(jiān)測(cè)的反應(yīng)(即測(cè)定了來(lái)自帶單或雙電荷的合成多肽離子的多個(gè)子離子所對(duì)應(yīng)的峰面積)來(lái)獲得。圖1顯示了合成多肽TETSQVAPA(SEQ ID NO1)的MS和MS/MS譜圖。上圖表示MS譜圖，箭頭指示的峰尖代表了與在m/z903Da所示的多肽的單電荷[M+H]+1離子相關(guān)的質(zhì)量。下圖顯示了來(lái)自多肽[M+H]+1離子的碰撞誘導(dǎo)解離的MS/MS譜圖。用于LC/MS/MS定量的子離子位于m/z 717、646和187。參考曲線(xiàn)表明LC/MS/MS方法的檢測(cè)極限大約為0.5pmol，線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍大約為1至2000pmol。
使用LC/MS/MS方法，測(cè)定了在實(shí)驗(yàn)性胰蛋白酶消化的含有ROS、ROS+合成多肽和緩沖液+合成多肽的樣品中TETSQVAPA(SEQID NO1)多肽的量。圖2顯示實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)樣品的LC/MS/MS離子譜圖。峰的面積代表從HPLC柱上洗脫下的多肽離子數(shù)。峰面積數(shù)用于線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的計(jì)算和未知濃度的確定。實(shí)驗(yàn)的LC/MS/MS測(cè)定值與參考曲線(xiàn)進(jìn)行比較，以確定存在于胰蛋白酶消化的含有ROS、ROS+合成多肽和緩沖液+合成多肽的樣品中TETSQVAPA(SEQ ID NO1)的量。參見(jiàn)表4。
表4

在ROS樣品中測(cè)量的TETSQVAPA(SEQ ID NO1)多肽的量被調(diào)整，以便說(shuō)明補(bǔ)充的合成TETSQVAPA(SEQ ID NO1)多肽的存在，并且根據(jù)回收率加以調(diào)整。含有緩沖液和合成的TETSQVAPA(SEQ IDNO1)多肽的樣品，為水解和測(cè)量后存在于補(bǔ)充有TETSQVAPA(SEQ IDNO1)多肽的ROS樣品中的合成多肽的量提供了一個(gè)指示，并且為T(mén)ETSQVAPA(SEQ ID NO1)多肽的回收率提供了指示。假定從緩沖液樣品和ROS樣品中合成多肽的回收率是相同的。
對(duì)于補(bǔ)充有合成多肽的ROS樣品421.6pmol-234.9pmol＝186.7pmol，186.7pmol x(1/0.49)＝381pmol。視紫紅質(zhì)測(cè)定值與已知存在于樣品中的視紫紅質(zhì)的量完全符合(即381pmol是485pmol的78.6％)。水解產(chǎn)物測(cè)定值與在未補(bǔ)充的ROS樣品中測(cè)量的TETSQVAPA(SEQ ID NO1)水解產(chǎn)物的量完全符合(即186.7pmol對(duì)161.7pmol)。因此，從緩沖液樣品和ROS樣品中合成多肽的回收率是相同的這個(gè)假設(shè)很可能是有效的。
其它實(shí)施方案可以理解，當(dāng)本發(fā)明已經(jīng)與其詳細(xì)的描述結(jié)合起來(lái)得以說(shuō)明時(shí)，上述描述的目的是為了說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制，本發(fā)明的范圍由附加的權(quán)利要求的范圍界定。本發(fā)明其它的方面、優(yōu)點(diǎn)和修飾在下列的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定一種或多種選定多肽在樣品中的實(shí)際量的方法，所述方法包括用至少一種水解試劑從每個(gè)所述一種或多種選定多肽中釋放出至少一種特定水解產(chǎn)物；以及通過(guò)與確定量的相應(yīng)的外源多肽進(jìn)行比較，確定每個(gè)所述至少一種特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量，其中每個(gè)所述至少一種特定水解產(chǎn)物的實(shí)際量與它從其中釋放出的選定多肽的實(shí)際量直接相關(guān)。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中所述樣品含有一種選定多肽。
3.權(quán)利要求2中的方法，其中從所述選定多肽釋放出一種特定水解產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1中的方法，其中所述特定水解產(chǎn)物和所述選定多肽之間的所述直接關(guān)系是1∶1。
5.權(quán)利要求3中的方法，其中所述特定水解產(chǎn)物和所述選定多肽之間的所述直接關(guān)系是1∶1。
6.權(quán)利要求1中的方法，其中所述確定量的所述相應(yīng)的外源多肽在所述釋放步驟之前加到所述樣品中。
7.權(quán)利要求2中的方法，其中從所述選定多肽中釋放出2到5種特定的水解產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求1中的方法，其中所述樣品含有2到5種選定多肽。
9.權(quán)利要求8中的方法，其中從每個(gè)所述選定多肽上釋放出一種特定水解產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求8中的方法，其中從每個(gè)所述選定多肽上釋放出2到5種特定水解產(chǎn)物。
11.權(quán)利要求1中的方法，其中所述樣品含有6到10種選定多肽。
12.權(quán)利要求11中的方法，其中從每個(gè)所述選定多肽上釋放出一種特定水解產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求11中的方法，其中從每個(gè)所述選定多肽上釋放出2到5種特定水解產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種所述水解試劑是酶。
15.權(quán)利要求14中的方法，其中所述酶選自胰蛋白酶、Lys-C內(nèi)切蛋白酶、Arg-C內(nèi)切蛋白酶和Glu-C內(nèi)切蛋白酶。
16.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種所述水解試劑是化學(xué)試劑。
17.權(quán)利要求16中的方法，其中所述化學(xué)試劑是溴化氰。
18.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種所述選定多肽是膜多肽。
19.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種所述選定多肽是神經(jīng)受體。
20.權(quán)利要求1中的方法，其中所述測(cè)定步驟包含使用抗體測(cè)量至少一種所述水解產(chǎn)物的實(shí)際量。
21.權(quán)利要求1中的方法，其中所述測(cè)定步驟包含使用串聯(lián)質(zhì)譜或更高階的質(zhì)譜測(cè)量至少一種所述水解產(chǎn)物的實(shí)際量。
22.權(quán)利要求1中的方法，進(jìn)一步包括在所述釋放步驟前向所述樣品中加入確定量的回收多肽；以及在所述釋放步驟后測(cè)量所述回收多肽的實(shí)際量，其中所述測(cè)定步驟包括對(duì)所述回收多肽與之相應(yīng)的所述特定水解產(chǎn)物之一的量進(jìn)行調(diào)整，以反映在所述添加步驟后發(fā)生的所述回收多肽的損失。
23.權(quán)利要求1中的方法，進(jìn)一步包括在所述釋放步驟前向所述樣品中加入確定量的合成的可水解多肽；用所述水解試劑從所述合成的可水解多肽上釋放出至少兩種不同標(biāo)記的多肽；以及測(cè)量每種所述不同標(biāo)記的多肽的實(shí)際量，其中所述測(cè)定步驟包括對(duì)每種所述特定水解產(chǎn)物的量進(jìn)行調(diào)整，以反映由所述水解試劑水解的不完全性。
24.權(quán)利要求23中的方法，其中一種所述不同標(biāo)記的多肽對(duì)應(yīng)于至少一種所述特定水解產(chǎn)物，以及其中所述測(cè)定步驟包括對(duì)所述至少一種特定水解產(chǎn)物的量進(jìn)行調(diào)整，以反映在所述添加步驟后發(fā)生的所述相應(yīng)的不同標(biāo)記的多肽的損失。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)定從選定的多肽釋放的水解產(chǎn)物的量以及利用對(duì)應(yīng)于水解產(chǎn)物的外原多肽作為標(biāo)準(zhǔn)用于測(cè)定選定的多肽在樣品中的實(shí)際量的方法和材料。這些方法和材料可用于例如定量分析一種或多種選定的多肽在復(fù)雜樣品中的實(shí)際量。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1623000SQ02823947
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2002年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月29日
發(fā)明者戴維·R·巴爾尼奇, 阿諾德·W·林德?tīng)?申請(qǐng)人:塞莫費(fèi)尼根股份有限公司