專利名稱：具有分離固體能力的測試片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適于檢測血液中的被檢物質(zhì)的測試片，其主要屬于生物材料的化學(xué)分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在檢測生物樣品，如血，尿或腦脊髓液中包含的任何一種成分時(shí)，通常需要一系列的分析過程，如樣品液的吸收，擴(kuò)散，反應(yīng)，檢測等。特別是，在使用含血細(xì)胞和血漿的血液(在下文中，有時(shí)也稱其為“全血”)試驗(yàn)中，所要檢測的是血漿中的葡萄糖，并將其作為被檢物質(zhì)而量化，但血細(xì)胞可對測量結(jié)果產(chǎn)生各種影響，并傾向于引起誤差。由于這個(gè)原因，在使用全血的血液試驗(yàn)中，我們希望能夠?qū)⒀?xì)胞和血漿分離?，F(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)行了很多分離全血中的血細(xì)胞和血漿，并檢測所分離血漿中的被檢物質(zhì)的試驗(yàn)。
如上所述，已知有一種測試儀，其原理是利用血細(xì)胞和血漿之間比重的差異，通過離心分離血細(xì)胞。然而，這種測試儀需要離心機(jī)，從而使得用來檢測被檢物質(zhì)的裝置變得復(fù)雜了，且較大的規(guī)模和所用的試劑也使其變得更加復(fù)雜，這是我們所不希望的。
另一方面，如上所述，已知有一種測試片，其可分離全血中的血細(xì)胞，并通過使用著色試劑與被檢物質(zhì)顯色來檢測血漿中的被檢物質(zhì)。該測試片優(yōu)于上述測試儀，其原因在于它可通過用全血點(diǎn)樣來檢測被檢物質(zhì)。
已知有這樣一種多層測試片，在其光透底層上覆蓋有多孔結(jié)構(gòu)的血細(xì)胞分離層，該血細(xì)胞分離層是由不對稱膜，玻璃濾光器，或用有機(jī)聚合物固定的聚合物顆粒組成的，光透底層上還覆蓋有含著色試劑的試劑層，所述著色試劑可與被檢物質(zhì)顯色(例如，JP49-53888 A，JP55-90859A，等)，且由有機(jī)粘合劑固定的聚合物顆粒組成的，顆粒間具有適宜空隙并形成含著色試劑的試劑層的測試片可分離血細(xì)胞，展開血漿，并檢測被檢物質(zhì)(例如，JP57-160063A，等)。
然而，在上述多層測試片中，全血傾向于在血細(xì)胞分離層上展開，且血細(xì)胞和血漿的分離主要是利用它們各自的重量在垂直方向上分離，從而在血細(xì)胞分離層的頂部形成血細(xì)胞層。因此，當(dāng)通過測量透射光來量化被檢物質(zhì)時(shí)，如果被檢物質(zhì)通過著色試劑顯色，那么上述血細(xì)胞層會(huì)擋住測量光，從而無法測量透射光。
另外，還可根據(jù)被檢物質(zhì)將氧供給于其上，檢測并測量被檢物質(zhì)。在這種情況下，上述測試片傾向于在血細(xì)胞分離層上形成血細(xì)胞層，從而導(dǎo)致對氧較差的滲透性；為了供給氧，還需提供一種氧供給工具，如在試劑層和底層之間提供一種氧滲透膜。給上述層壓型測試片提供氧供給工具，如氧滲透膜是比較困難的，且成為制造測試片時(shí)成本增加的原因。
在上述層壓型測試片中，全血傾向于在血細(xì)胞分離層上展開，且所述分離主要發(fā)生在垂直方向上，因此為了在試劑層中充分展開被檢物質(zhì)，需將足量的血液點(diǎn)樣到血細(xì)胞分離層中，從而使得在進(jìn)行單次測量時(shí)，需要較大量的樣品。
在上述多層測試片中，血液分離層是通過用有機(jī)聚合物固定聚合物顆粒而形成的，所述有機(jī)聚合物傾向于吸水且膨脹，血細(xì)胞分離層中的顆粒間的空隙太小，以致于血漿難以展開，進(jìn)而不能在試劑層中展開足量的血漿。
在JP57-160063A中公開的測試片中，顆粒間適當(dāng)?shù)目障妒窃趯又行纬傻模@樣由于毛細(xì)管作用，血漿不僅在垂直方向上展開，而且還在水平方向上展開，這對于進(jìn)行上述透射光的測量而言是有利的。然而，因?yàn)橄裆鲜龆鄬訙y試片那樣，血細(xì)胞傾向于在試劑層上擴(kuò)散，因此在測量透射光時(shí)仍然存在下列問題，如與血細(xì)胞層形成有關(guān)的氧滲透性的降低，及血細(xì)胞層對光的遮擋。且，在這些測試片中，當(dāng)血漿在層中展開時(shí)，染料和其它通過與著色試劑反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)也進(jìn)一步展開，從而造成被檢物質(zhì)濃度分布的偏差。
且，因?yàn)樗鰷y試片是通過用粘合劑固定聚合物顆粒而產(chǎn)生的，這樣可在顆粒間形成適當(dāng)?shù)目障叮虼怂鼈兊漠a(chǎn)生比較復(fù)雜且困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在考慮到上述因素的情況下進(jìn)行的，本發(fā)明的目的是提供一種可通過測量透射光來測量被檢物質(zhì)的測試片，其具有較好的氧滲透性，且能更精確地測量被檢物質(zhì)。
本發(fā)明具有下列可達(dá)到目的的組成部分。
就是說，本發(fā)明提供一種具有分離含固體和液體的樣品中的固體，從而檢測包含在液體中的被檢物質(zhì)能力的測試片，其具有多孔結(jié)構(gòu)的試劑層及支持所述試劑層的底層，其中所述多孔結(jié)構(gòu)的試劑層含有顆粒，無機(jī)凝膠，和與被檢物質(zhì)發(fā)生可檢測反應(yīng)的試劑，其中所述顆粒與所述無機(jī)凝膠彼此粘合，使顆粒之間形成空隙，從而捕獲固體。
在本發(fā)明中，優(yōu)選所述樣品是含血細(xì)胞和血漿的血液(全血)，所述底層的表面具有親水區(qū)域，且該親水區(qū)域支持所述試劑層。
在本發(fā)明中，優(yōu)選所述顆粒的粒徑為0.5-10μm，顆粒的終濃度為1-30重量％，且形成無機(jī)凝膠的無機(jī)膠凝劑的終濃度為0.1-3重量％。
在本發(fā)明中，優(yōu)選所述試劑是一種可通過與被檢物質(zhì)反應(yīng)而引起光學(xué)變化的試劑，且所述底層是由透光物質(zhì)制成的。
本發(fā)明的測試片具有試劑層，和支持該試劑層的底層。
所述試劑層具有多孔結(jié)構(gòu)，其含有顆粒，無機(jī)凝膠，和與被檢物質(zhì)產(chǎn)生可檢測反應(yīng)的試劑。在所述試劑層中，所述顆粒與所述無機(jī)凝膠彼此粘合，使顆粒之間形成空隙，從而捕獲固體。
而所述顆?？梢允侨魏我环N顆粒，只要它們能捕獲顆粒間空隙中的固體，在上述粒徑范圍內(nèi)具有較窄粒徑分布的那些顆粒在分離固體時(shí)是優(yōu)選的。且，可使用具有較寬粒徑分布的顆?；蚴褂镁哂邢鄬^大粒徑的顆粒，優(yōu)選使用具有10μm或更小粒徑的顆粒形成顆粒間的適宜空隙。
顆粒的適宜粒徑可根據(jù)在顆粒間的空隙中捕獲的固體(例如，上述血細(xì)胞等)的大小而改變?？墒褂昧郊s為30μm，優(yōu)選0.5-10μm，更優(yōu)選3-8μm的顆粒。如果與上述范圍相比，所述顆粒的粒徑太小，則可能液體的展開不能流暢地進(jìn)行，而如果與上述范圍相比，所述顆粒的粒徑太大，則不能充分捕獲固體。
雖然試劑層中顆粒的適宜含量可根據(jù)所期望的液體展開距離或試劑層的適宜厚度而改變，但優(yōu)選1-30重量％的終濃度。如果與上述范圍相比，顆粒的含量太小，則試劑層的厚度可能不夠，而如果與上述范圍相比，顆粒的含量太大，則試劑層的厚度會(huì)比所希望的還大。
優(yōu)選上述顆粒具有盡可能接近球形的形狀，以便在顆粒間形成良好的空隙。在本發(fā)明中，可使用任何種類的顆粒，只要它們能滿足上述條件。這種顆粒的例子是，例如，無機(jī)顆粒，包括玻璃珠，聚合顆粒如膠乳珠等。在這些之中，更優(yōu)選使用聚合顆粒，這是因?yàn)樵谏a(chǎn)時(shí)，易于控制其粒徑，顆粒形狀及粒徑分布。購買工業(yè)品即可得到這種聚合顆粒。也可通過常規(guī)方法，如懸浮聚合法或乳液聚合法生產(chǎn)它們。
上述無機(jī)凝膠與上述顆粒彼此粘合，使試劑層具有多孔結(jié)構(gòu)。因?yàn)榕c有機(jī)凝膠相比，通常無機(jī)凝膠吸水時(shí)幾乎不膨脹，因此當(dāng)通過測量透射光而測量被檢物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞長度(試劑層的厚度)更有可能保持穩(wěn)定，且在液體展開的過程中，試劑層中顆粒間的空隙更可能保持穩(wěn)定。
此外，因?yàn)橥ǔＳ糜谛纬蔁o機(jī)凝膠的無機(jī)膠凝劑傾向于吸附具有極性取代基的化合物，染料等，它們傾向于吸附上述試劑和試劑與被檢物質(zhì)間的反應(yīng)產(chǎn)物(染料等)，因此在檢測被檢物質(zhì)時(shí)，濃度分布的偏差幾乎不會(huì)發(fā)生。
此外，如果所述無機(jī)凝膠是一種具有觸變性的凝膠，則在形成無機(jī)溶膠時(shí)，流動(dòng)性非常好，且可通過持續(xù)蒸餾(膠凝)而使之變硬。因此，在上述底層上形成試劑層時(shí)，這些是適宜的。且，由于加水而變透明的無機(jī)凝膠適于通過光學(xué)變化來檢測被檢物質(zhì)。
上述試劑層中無機(jī)膠凝劑的適宜含量可根據(jù)所用顆粒的量和所用無機(jī)膠凝劑的性質(zhì)(膠凝能力等)而改變，優(yōu)選終濃度為0.1-3重量％。與上述范圍相比，如果無機(jī)膠凝劑的含量太小，那么顆粒之間不能充分粘合，則不能形成試劑層。與上述范圍相比，如果無機(jī)膠凝劑的含量太大，那么過量的無機(jī)膠凝劑填充在顆粒間的空隙中，對液體的展開產(chǎn)生不利的影響。
通常所用的無機(jī)膠凝劑是，例如，Laponite系列(由Nippon SilicaIndustrial Co.，Ltd.生產(chǎn))，Lucentite SWN，和SWF(由Co-op ChemicalCo.，Ltd.生產(chǎn))，Thixopy W(由Kyowa Chemical Co.，Ltd.生產(chǎn))，SmectonSA，和Kunipia(由Kunimine Industries Co.，Ltd.生產(chǎn))，Multigen(由Hojun Kogyo Co.，Ltd.生產(chǎn))等。
上述試劑可在各種化合物中找到，如染料前體，其形成光學(xué)可檢測的物質(zhì)，如染料和熒光染料，電化學(xué)可檢測的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的氧化形式或還原形式，或通過氧化-還原反應(yīng)，酸-堿反應(yīng)，縮合反應(yīng)，絡(luò)合物形成反應(yīng)等形成絡(luò)合物的化合物。
首先，詳細(xì)解釋形成光學(xué)可檢測物質(zhì)的試劑。
可使用上述染料前體，優(yōu)選具有共軛鍵系，如芳香環(huán)的化合物。例如，通過偶合劑間的氧化縮合形成醌染料的試劑有4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮(在下文中，縮寫為“4-AA”)，和一種氫供體；形成氧化著色染料，如鄰-二甲基聯(lián)苯胺和聯(lián)苯胺的染料前體；被氧化而形成顏色的染料前體，如染料的隱色體形式；被氧化而形成熒光物質(zhì)的試劑；發(fā)光材料，如化學(xué)發(fā)光材料；被還原而形成染料的試劑，如四唑(鎓)鹽；由于pH改變而形成偶氮染料的重氮鹽；用于產(chǎn)生熒光物質(zhì)的試劑；與酶形成染料或熒光物質(zhì)的酶底物；形成絡(luò)合物且顯色或變色的化合物等。
上述氫供體是一種化合物，如苯酚，其可在氧化劑共存的條件下，通過與4-AA或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮縮合而產(chǎn)生醌染料。氫供體的具體例子包括二氯酚；鄰-甲氧基苯酚；1，2，3-三羥基苯；二甲基苯胺；N-乙基-N-磺丙基-間-茴香胺；N-乙基-N-磺丙基苯胺；N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺；N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺；N-乙基-N-磺丙基-間-甲苯胺；N-乙基-N-(2-羥-3-磺丙基)-間-茴香胺；N-乙基-N-(2-羥-3-磺丙基)苯胺；N-乙基-N-(2-羥-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺；N-(2-羥-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺；N-乙基-N-(2-羥-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺；N-乙基-N-(2-羥-3-磺丙基)-間-甲苯胺；N-(3-磺丙基)苯胺等。
上述鄰-二甲基聯(lián)苯胺和聯(lián)苯胺的例子包括鄰-二甲基聯(lián)苯胺；聯(lián)二茴香胺；3，3’-二氨基聯(lián)苯胺；3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺；N-(3-磺丙基)-3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺等。
上述隱色體形式是一種無色的染料前體，其可被氧化而變成染料并顯色。通過氧化隱色體形式而產(chǎn)生的染料的例子包括2，6-二氯-4-[(4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)己二烯-1-酮；2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)己二烯-1-酮；7-(二乙氨基)-3-亞氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪鹽；3-(二乙氨基)-7-氨基-5-苯基吩嗪鎓(phenazinium)鹽；3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪(phenothiazin)-5-鎓鹽；1-羥-5-甲基吩嗪鎓(phenazinium)鹽；7-羥-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物等。
隱色體形式的例子包括4，4’-亞芐基雙(N，N-二甲基苯胺)；4，4’-雙[N-乙基-N-(3-磺丙基氨基)-2，6-二甲苯基]甲烷；1-(乙氨基硫代羰基)-2-(3，5-二甲氧基-4-羥苯基)-4，5-雙(4-二乙氨基苯基)咪唑；4，4’-雙(二甲氨基)二苯胺；N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯胺鹽；10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪鹽等。
被氧化而顯色的染料前體的其它例子包括4-甲氧基苯酚；4-乙氧基苯酚；2-乙氧基苯酚；1-(2-羥-5-甲氧苯基)ethanone；2-羥-5-甲氧基苯甲酸；2-羥-5-甲氧基苯甲醛；甲基2-羥-5-甲氧基苯甲酸鹽；4-甲氧基-2-硝基苯酚；2-氯-4-甲氧基苯酚；4-羥-3-甲氧基苯甲醛；4-羥-3-甲氧基苯甲酸等。
染料前體的其它例子包括3-(4-羥苯基)-2-丙烯酸；2-羥苯基乙酸；3-羥苯基乙酸；4-羥苯基乙酸；3-羥基苯甲酸；4-羥基苯甲酸；2-氨基苯甲酸；3-氨基苯甲酸；4-氨基苯甲酸；3，4-二氨基苯甲酸；3，5-二氨基苯甲酸；4-氨基-2-氯苯甲酸；4-氨基-3-甲基苯甲酸；4-氨基-3-甲氧基苯甲酸；4-氨基鄰苯二甲酸等。
此外，染料前體的例子包括2，4-二氨基-6-羥嘧啶；4，5-二氨基-6-羥嘧啶；4-氨基-2，6-二羥嘧啶；6-羥基-2，4，5-三氨嘧啶；4，5-二氨基-2，6-二羥嘧啶；4-氨基-6-羥基-2-甲基嘧啶；4-氨基-6-羥基-2-甲氧基嘧啶等。
上述被氧化而形成熒光物質(zhì)的試劑的例子包括4-羥苯基乙酸；(4-羥-3-甲氧苯基)乙酸；3-(4-羥苯基)丙酸；4-羥-(2-氨乙基)苯酚；4-羥-N，N，N-三甲基benzenemethaminium；-氨基-對-羥基氫化肉桂酸；4-羥基苯乙胺；N-(4-羥苯基)N-乙酰苯胺；2，7-二氯熒光素二乙酸酯等。
在產(chǎn)生上述染料的氧化反應(yīng)中，優(yōu)選使用氧化劑如過氧化氫，和氧化酶如過氧化物酶作為氧化劑參與氧化反應(yīng)。然而，當(dāng)然，參與上述氧化反應(yīng)的氧化劑不僅限于此，其可以是各種已知的氧化劑和氧化酶。
上述發(fā)光材料如化學(xué)發(fā)光材料的例子包括螢火蟲熒光素，Cypridina熒光素；aequorin；光澤精衍生物；魯米諾衍生物；吖啶鎓(acridinium)酯；peroxalate等。
四唑(鎓)鹽的例子包括2，3，5-三苯基四唑(鎓)鹽；2，5-二苯基-3-(1-萘基)-2H-四唑(鎓)鹽；3，3-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯基)-4，4’-二基]-雙[2-(4-硝苯基)-5-苯基-2H-四唑(鎓)]鹽；3，3-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯基)-4，4’-二基]-雙[2，5-二苯基-2H-四唑(鎓)]鹽；2-(4-碘苯基)-3-(4-硝苯基)-5-苯基-2H-四唑(鎓)鹽；2-(4-碘苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑(鎓)鹽；2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑(鎓)鹽；3，3’-(1，1’-聯(lián)苯基-4，4’-二基)-雙(2，5-二苯基-2H-四唑(鎓))鹽；3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑(鎓)鹽等。
被還原而產(chǎn)生染料的化合物的例子包括還原形式，如1，1’-二甲基-4，4’-二吡啶鎓(bipyridilium)鹽，和1，1’-二芐基-4，4’-二吡啶鎓(bipyridilium)鹽。且，7-羥-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物等也可被還原而產(chǎn)生熒光染料。這種產(chǎn)生熒光染料的試劑的例子包括通過還原7-羥-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物，5-氰基-2，3-雙(4-甲苯基)-2H-四唑(鎓)鹽，2，3-雙(4-氰基苯基)-5-氰基-2H-四唑(鎓)鹽等而產(chǎn)生的熒光物質(zhì)。
在產(chǎn)生這種染料的還原反應(yīng)中，優(yōu)選使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸等作為還原劑參與還原反應(yīng)。然而，參與上述還原反應(yīng)的還原劑不僅限于此，其可以是各種已知的還原劑和還原酶。
上述可通過pH改變而顯色或變色的化合物的例子包括磺酞染料如溴甲酚綠，溴酚藍(lán)，酚紅，溴代鄰苯三酚紅，和鄰苯三酚紅；三苯甲烷染料如孔雀綠，和玫紅酸；喹啉染料如喹哪啶紅，和N-(對-羥苯基)-2，6-二氯-對-苯醌亞胺；噁嗪酮染料如7-羥-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物；香豆素染料如6，7-二羥-4-甲基香豆素；導(dǎo)電的高分子化合物如苯胺低聚物。
上述重氮鹽的例子包括與吲哚酚偶合產(chǎn)生偶氮染料的2-甲氧基-4-嗎啉重氮苯鹽；與糞膽色素原偶合產(chǎn)生偶氮染料的3，3’-二甲氧聯(lián)苯基-4，4’-重氮鹽。在此類中，還有其它涉及產(chǎn)生重氮鹽反應(yīng)的試劑。這種試劑的例子包括在有亞硝酸鹽存在的情況下產(chǎn)生重氮鹽的4-氨基苯胂酸；與上述重氮鹽偶合產(chǎn)生偶氮染料的N-1-萘基亞乙基二胺。此外，這種試劑的其它例子包括在亞硝酸鹽存在的情況下，通過偶合產(chǎn)生偶氮染料的2，4-二氯苯胺；和N，N-二乙基-N’-1-萘基萘基亞乙基二胺草酸鹽(Tsuda試劑)。還包括亞硝酸鹽。
上述用于顯色反應(yīng)的試劑的例子包括，但不限制于用于檢測醛的過氧化氫和1，4-二氨基苯；用于檢測醛的2，3-二甲基-2，3-雙(羥氨基)丁烷；用于檢測醛的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮和一種氧化劑；用于檢測仲胺的1OH-吩噻嗪和溴；用于檢測硫醇的2，2’-二硫代吡啶等。
上述用于產(chǎn)生熒光物質(zhì)的試劑的例子包括，但不限制于用于檢測胍基化合物的2-羥-1，2-二苯基ethanone；用于檢測組胺的鄰-苯二醛；用于檢測亞精胺的鄰-苯二醛；用于檢測.-酮酸的1，2-二氨基-4，5-二茴香醚等。
上述通過酶反應(yīng)形成染料或熒光物質(zhì)的酶底物的例子包括，但不限制于作為胰凝乳蛋白酶底物的N-甲苯磺?；?L-苯丙氨酸-2-甲基吖啶酮；作為氨肽酶底物的L-丙氨酸-2-甲基吖啶酮；用于測量酯酶的7-乙酰氧基-N-甲基喹啉(鎓)鹽；作為酯酶底物的7-乙酰氧基-3H-吩噁嗪-3-酮；作為磷酸酶底物的4-甲基umbeliferil磷酸鹽；作為磷酸酶底物的5，10，15，20-四(4-膦?；u苯基)卟吩等。此外，所述的酶或酶底物可與，例如抗體或其片段化學(xué)結(jié)合。
上述形成絡(luò)合物并顯色或變色的化合物包括配體，其通過配價(jià)鍵或離子鍵與金屬離子或陰離子形成絡(luò)合物，產(chǎn)生染料或熒光物質(zhì)等。與金屬離子形成絡(luò)合物而顯色或變色的化合物的例子包括被認(rèn)為是金屬指示劑或色實(shí)電解質(zhì)(chromoionophores)的化合物，及通過與有色過渡金屬離子形成絡(luò)合物而顯色的化合物。這種化合物的具體例子包括乙二胺四乙酸；2，2-雙吡啶；1-羥-2-(2-羥苯偶氮基)苯；二苯并-18-冠-6；二環(huán)己基并-18-冠-6；環(huán)狀多元胺；杯狀[4]芳烴；3-[N，N-雙(羧甲基)氨甲基]-1，2-二羥蒽醌；5’，5”-二溴代鄰苯三酚磺酞；2-羥-1-(1-羥-2-萘偶氮基)-6-硝基-4-萘磺酸鹽；2，6-二氯-4’-羥-3’，3”-二甲基品紅酮-5’，5”-二羧酸鹽；3，3’-雙[N，N-雙(羧甲基)氨甲基]熒光素；8-[N，N-雙(羧甲基)氨甲基]-4-甲基傘形酮；2，7-雙(2-胂羧基苯偶氮基)-1，8-二羥-3，6-萘二磺酸；5-氯-2-羥-3-(2，4-二羥苯偶氮基)苯磺酸；5-[(六氫化-2，4，6-三氧-5-嘧啶基)亞氨基]-2，4，6(1H，3H，5H)-嘧啶三酮鹽；2-(5-溴-2-吡啶偶氮基)-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯胺鹽；1，8-二羥-2-(2-吡啶偶氮基)-3，6-萘二磺酸鹽；2-亞硝基-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚等。
特別是，可與一價(jià)陽離子形成有色絡(luò)合物的化合物的例子包括四[3，5-雙(三氟甲基)苯基]硼酸鹽；四苯基磷鹽等。
特別是，可與鈣離子形成熒光絡(luò)合物的化合物的例子包括1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥-3-氧-9-呫噸基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸鹽；五乙酰氧基甲基1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥-3-氧-9-呫噸基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸鹽；1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基(benzofuranyloxy)]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸鹽；五乙酰氧基甲基1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基(benzofuranyloxy)]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸鹽；1-[2-氨基-5-(6-羧基-2-吲哚基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸鹽；五乙酰氧基甲基1-[2-氨基-5-(6-羧基-2-吲哚基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸鹽；8-氨基-2-[(2-氨基-5-甲基苯氧基)甲基]-6-甲氧基喹啉-N，N，N’，N’-四乙酸鹽；五乙酰氧基甲基8-氨基-2-[(2-氨基-5-甲基苯氧基)甲基]-6-甲氧基喹啉-N，N，N’，N’-四乙酸鹽；3，3’-雙[N，N-雙(羧甲基)氨甲基]熒光素；8-[N，N-雙(羧甲基)氨甲基]-4-甲基傘形酮等。
此外，還包括與陰離子形成有色絡(luò)合物的四苯基鉮鹽，與氯離子形成絡(luò)合物從而減小熒光強(qiáng)度的N-乙氧羰基甲基-6-甲氧基喹啉鎓溴化物，與硼形成絡(luò)合物的8-羥-1-(亞水楊氨基)-3，6-萘二磺酸鹽。
特別是，舉例說明了上述試劑可檢測的物質(zhì)被檢物質(zhì)是葡萄糖，葡萄糖氧化酶，過氧化物酶，4-AA，和N-甲基-N(2-羥-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺；被檢物質(zhì)為膽固醇，膽固醇氧化酶，過氧化物酶，4-AA，和N-甲基-N-(2-羥-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺；被檢物質(zhì)為乳酸，乳酸鹽脫氫酶，NAD+，黃遞酶，和四唑(鎓)紫；被檢物質(zhì)為堿性磷酸梅，磷酸對硝基苯。
然后，對形成電化學(xué)可檢測物質(zhì)的試劑進(jìn)行詳細(xì)的解釋。
所述電化學(xué)可檢測的試劑包括，例如，電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的氧化形式和還原形式，與特定離子形成離子鍵或配價(jià)鍵從而形成絡(luò)合物的配體等。
所述電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)是化學(xué)物質(zhì)，其用酶等氧化或還原被檢物質(zhì)，它們直接或間接從被檢物質(zhì)接受電子或給被檢物質(zhì)提供電子。當(dāng)這種電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的還原形式或氧化形式在電極上被氧化或還原時(shí)，可根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)量化被檢物質(zhì)。
具體地說，電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)包括1，1-二甲基-4，4’-二吡啶鎓鹽；1，1’-二芐基-4，4’-二吡啶鎓鹽；1，4-二氨基苯；2-甲基-1，4-naphtoquinone；N-甲基phenadinium鹽；1-羥-5-甲基phenadinium鹽；1-甲氧基-5-甲基phenadinium鹽；9-二甲基氨基苯并-.-吩噁嗪-7-鎓(ium)鹽；二茂鐵衍生物；六氰基離子(II)鹽；7-羥-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物；3，7-二氨基-5-苯基phenadinium鹽；3-(二乙氨基)-7-氨基-5-苯基phenadinium鹽；1，4-苯二醇；1，4-二羥-2，3，5-三甲苯；N，N，N’，N’-四甲基-1，4-苯二胺；.2，2’-聯(lián)-1，3-二硫醇；2，6-二甲基苯醌；2，5-二甲基苯醌；2，3，5，6-四甲基-2，5-環(huán)己二烯-1，4-二酮；2，6-二氯-4-[(4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)己二烯-1酮；2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)己二烯-1酮；7-(二乙氨基)-3-亞氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪鹽；3，7-雙(二甲氨基)吩噁嗪-5-鎓鹽等。
配體，特別是與陽離子形成絡(luò)合物的配體的例子包括四[3，5-雙(三氟甲基)苯基]硼酸鹽；四苯基磷鹽；纈氨霉素；環(huán)(N，N’-二辛基-D-門冬酰-L-脯氨酰-L-丙氨酰)2；雙(苯并-15-冠-5)；雙[(苯并-15-冠-5)-4-甲基]庚二酸鹽；雙(12-冠-4)；雙[(12-冠-4)甲基]-2-月桂基-2-甲基丙二酸鹽；14-冠-4；月桂基-甲基-14-冠-4；6，6-二芐基-1，4，8，11-四氧雜環(huán)十四烷；二苯并-18-冠-6；二環(huán)己基-18-冠-6；4，16-二-N-十八基氨基甲?；?3-氧雜丁酰基-1，7，10，13，19-五氧雜-4，16-二氮雜環(huán)二十一烷等。
與陰離子形成絡(luò)合物的配體包括四苯基鉮鹽，6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉(鎓)鹽等。
除了上述顆粒，無機(jī)凝膠和試劑外，還詳細(xì)說明了包含在試劑層中的試劑，所述試劑層還可包括通常所用的添加劑等，只要它們不會(huì)抑制試劑層分離固體的能力和被檢物質(zhì)與試劑間的反應(yīng)。
例如，上述樣品是人的血液，固體是血細(xì)胞，液體是血漿。既然這樣，在等滲的情況下，血細(xì)胞中紅細(xì)胞的較長直徑為6-9μm，隨著試劑的pH值和鹽濃度的改變，紅細(xì)胞的大小和狀態(tài)也發(fā)生改變，如果試劑層的pH值和鹽濃度不合適，則紅細(xì)胞不能被捕獲在試劑層顆粒間的空隙中。適用于這種情況的添加劑是，例如，緩沖液如bis-tris緩沖液(由雙(2-羥乙基)亞氨基-Tris(羥甲基)甲烷和鹽酸制備的緩沖液)，磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，和N-(2-乙酰胺)亞氨基二乙酸鹽緩沖液；和中性鹽，如氯化鈉等。
此外，在利用光學(xué)變化通過測量反射光檢測被檢物質(zhì)時(shí)，可將透光物質(zhì)作為底層，且可使用三氧化鈦的粉末等作為添加劑，其可通過反射或散射測量光來增加測量光的反射率。
此外，可使用表面活性劑作為添加劑來改善液體的展開。這種表面活性劑的例子包括糖-烷基醚如正-辛基-.-D-喃葡萄糖；糖-烷基硫醚如正-辛基-.-D-硫代喃葡萄糖和正-庚基-.-D-硫代喃葡萄糖；糖酰胺如正-辛?；?N-甲葡糖酰胺和正-壬?；?N-甲葡糖酰胺；糖酯如.-D-吡比喃果糖基-.-D-喃葡萄糖一癸酸鹽；N，N-雙(3-D-葡糖酰氨丙基)脫氧膽酰胺(deoxycholamide)。
試劑層的厚度可影響液體的展開距離，即厚度較大則液體展開距離較大，厚度較小則液體展開距離較小。因此，試劑層的適宜厚度可根據(jù)所希望的液體展開距離而變化，優(yōu)選5-130μm，更優(yōu)選30-100μm，更優(yōu)選50-90μm。如果與上述范圍相比，試劑層的厚度太小，則液體的展開不能充分進(jìn)行，進(jìn)而妨礙了被檢物質(zhì)的準(zhǔn)確檢測或測量，而如果與上述范圍相比，試劑層的厚度太大，則需使用大量樣品檢測被檢物質(zhì)。
對上述底層的形狀或材料沒有特殊的限制，只要它能夠支持上述試劑層。然而，優(yōu)選所述底層的表面具有親水區(qū)域，并在此親水區(qū)域上支持試劑層。由于這個(gè)原因，在將樣品點(diǎn)樣到試劑層后，上述親水區(qū)域會(huì)對液體的展開產(chǎn)生較大的影響。
所述液體由于其自身的重量而在試劑層的垂直方向展開，且由于毛細(xì)管作用而在試劑層的垂直方向和水平方向展開。另一方面，上述親水區(qū)域?qū)λ哂辛己玫挠H和性，可減弱液體的表面張力，其是水溶性的。因此，所述親水區(qū)域作用于試劑層中的液體，使它在水平方向流動(dòng)，親水區(qū)域的這一作用可以向下傾斜的方向展開液體。親水區(qū)域?qū)λ椒较虻淖饔镁哂休^大的應(yīng)用區(qū)域，且僅在水平方向進(jìn)行，因此其對液體在水平方向展開的幫助大于毛細(xì)管作用對液體在水平方向展開的幫助。因此，在通過測量透射光來測量全血中的被檢物質(zhì)時(shí)，可在試劑層的水平方向上，距離血細(xì)胞附著位置較遠(yuǎn)的位置檢測被檢物質(zhì)，這是因?yàn)檠?xì)胞可能會(huì)干擾被檢物質(zhì)的檢測；優(yōu)選測量透射光。
優(yōu)選所述底層具有一個(gè)親水區(qū)域和一個(gè)疏水區(qū)域。所述親水區(qū)域，當(dāng)它以適宜的大小和形狀(例如，多邊形，方形，圓形，橢圓形，其組合的形狀等)形成時(shí)，可制成大小適宜的試劑層，因此它是優(yōu)選的。且，具有親水區(qū)域和疏水區(qū)域的底層可通過對親水材料進(jìn)行疏水處理，例如用疏水物質(zhì)如硅氧烷或油涂覆親水材料或通過對疏水材料進(jìn)行親水處理而制成。
優(yōu)選由透光物質(zhì)制成的底層，這是因?yàn)樗赏ㄟ^測量透射光時(shí)發(fā)生的光學(xué)變化來檢測被檢物質(zhì)。上述透光物質(zhì)包括，例如，無機(jī)化合物如玻璃，有機(jī)聚合物如透明塑料等。
有機(jī)聚合物如透明的塑料，即使它們是疏水聚合物，也可通過紫外線輻射，用甲硅烷醇處理等，而對它們的表面進(jìn)行親水處理。通過進(jìn)行這種親水處理，透明塑料可被用作底層。這種有機(jī)聚合物的例子是，例如聚烯烴樹脂如聚乙烯，聚丙烯和聚氟乙烯；聚苯乙烯；聚對一酸乙二酯等。
本發(fā)明的測試片可通過在上述底層上涂覆一種無機(jī)溶膠(一種無機(jī)膠凝劑分散在其中的膠體溶液)來制造，其具有均勻分散或溶解在其中的上述試劑，并具有以層形式均勻分散在其中的上述顆粒。上述顆粒可分散在無機(jī)溶膠中，或通過預(yù)先將無機(jī)膠凝劑的粉末與顆?；旌?，并將水或水基分散介質(zhì)加入到混合粉末中而分散在無機(jī)溶膠中，其中上述試劑是均勻分散或溶解的。且，可將上述試劑均勻分散或溶解在上述無機(jī)溶膠中，或在加入無機(jī)膠凝劑之前，將上述試劑預(yù)先均勻分散或溶解在水基分散介質(zhì)中。
此外，還可通過通常所用的方法在底層上形成上述無機(jī)溶膠層。例如，可通過均勻涂敷并使用刮片等達(dá)到預(yù)定的厚度來成層。然而，優(yōu)選在底層上提供一種預(yù)定形狀的親水區(qū)域，并根據(jù)親水區(qū)域的面積，給親水區(qū)域提供適量的無機(jī)溶膠，這是因?yàn)闊o機(jī)溶膠可在親水區(qū)域上擴(kuò)散，從而在底層上形成厚度均勻的試劑層。
所述試劑層可通過除去上述底層上的無機(jī)溶膠中的一部分水而形成，從而使無機(jī)凝膠粘合顆粒的性質(zhì)不至變差。從無機(jī)溶膠中除去水的過程可通過在一定條件下干燥來完成，其可防止試劑變性，且不會(huì)妨礙被檢物質(zhì)的檢測結(jié)果；干燥條件可根據(jù)試劑的種類而改變，例如，在25℃干燥，在40-50℃干燥，在減壓條件下干燥，在低溫條件下干燥(例如，5℃左右)，或在這些相結(jié)合的條件下干燥。在所用試劑易變性的條件下，通常優(yōu)選在低溫條件下干燥無機(jī)溶膠，從而抑制試劑變性。
本發(fā)明的測試片可通過將至少液體中含被檢物質(zhì)的樣品點(diǎn)樣在試劑層的適當(dāng)位置上，并檢測在試劑層中顯色的被檢物質(zhì)與試劑間的反應(yīng)，來檢測被檢物質(zhì)。
所述樣品，其是本發(fā)明測試片的測試對象，可以是僅由液體組成，不包括固體的樣品，但更優(yōu)選本發(fā)明的測試片用于分析既包括固體又包括液體的樣品，這是因?yàn)樗哂蟹蛛x固體的能力，其可分離樣品中的固體并檢測液體中的被檢物質(zhì)。這種樣品的例子是，血細(xì)胞作為固體，血漿作為液體的血液(全血)。且，除全血之外，本發(fā)明的測試片還可用于分析生物材料(生物樣品)如尿，食品，藥物，天然存在的痕量物質(zhì)，工業(yè)化學(xué)物質(zhì)，消耗的痕量物質(zhì)等。
在這里，樣品的其中一個(gè)實(shí)施例是全血，并說明了分析樣品時(shí)，本發(fā)明測試片的狀況。
因?yàn)楸景l(fā)明測試片的試劑層是由上述顆粒，上述無機(jī)凝膠，和上述試劑形成的一種多孔結(jié)構(gòu)，因此將全血點(diǎn)在試劑層上時(shí)，可使血細(xì)胞保留在試劑層上，而血漿從點(diǎn)樣的位置，在試劑層的水平方向上展開。在這種情況下，因?yàn)樗鲈噭雍袩o機(jī)凝膠，因此點(diǎn)樣在試劑層上的全血在試劑層上幾乎不展開，且試劑層上的血細(xì)胞幾乎不擴(kuò)散。因此，可在展開至一定程度的位置上檢測血漿中的被檢物質(zhì)，其中所述展開是從血細(xì)胞附著位置開始，在試劑層的水平方向上展開的，從而使測量光不會(huì)被血細(xì)胞遮擋，因此可通過測量透射光來測量被檢物質(zhì)。且，因?yàn)檠?xì)胞在試劑層上幾乎不擴(kuò)散，因此在試劑層上幾乎不能形成血細(xì)胞層，且因?yàn)樗且环N多孔結(jié)構(gòu)，因此所述試劑層的氧滲透性非常好。因?yàn)檠?xì)胞在試劑層上幾乎不擴(kuò)散，且因?yàn)檠獫{在試劑層的水平方向上展開，因此所述試劑層在檢測被檢物質(zhì)時(shí)所需的樣品量小于上述多層測試片所需的樣品量。
此外，因?yàn)樵谠噭又?，所述顆粒與無機(jī)凝膠粘合形成一種多孔結(jié)構(gòu)，試劑層中的試劑，試劑和被檢物質(zhì)間的反應(yīng)產(chǎn)物，傾向于被無機(jī)凝膠吸附，從而抑制試劑和反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步展開，因此可很容易地長久維持試劑層中它們的分布濃度。因此，可更準(zhǔn)確地測量被檢物質(zhì)。
對本發(fā)明的被檢物質(zhì)沒有特殊的限制，只要它是存在于上述液體中的，且能被上述試劑檢測的物質(zhì)；例如，上述樣品中的被檢物質(zhì)可以是一種生物樣品葡萄糖，膽固醇，乳酸，堿性磷酸酶等。所述液體可以是水溶性的或水不溶性的；通常，在很多情況下它是水溶性的，且在本發(fā)明中優(yōu)選是水溶性的。
對檢測上述被檢物質(zhì)的方法沒有特殊的限制，只要它能檢測上述試劑和被檢物質(zhì)之間的反應(yīng)；例如，通過上述試劑與被檢物質(zhì)間的反應(yīng)而產(chǎn)生的光學(xué)變化來檢測被檢物質(zhì)的方法，通過上述試劑與被檢物質(zhì)間的反應(yīng)而產(chǎn)生的電化學(xué)變化來檢測被檢物質(zhì)的方法等。在檢測被檢物質(zhì)的這些方法中，使用與被檢物質(zhì)定量反應(yīng)的試劑不僅能檢測被檢物質(zhì)，而且能通過測量光學(xué)變化，電化學(xué)變化等來量化被檢物質(zhì)。
在通過光學(xué)變化檢測被檢物質(zhì)的方法中，可通過用由透光物質(zhì)制成的底層，并通過測量透射光，反射光等來測量上述光學(xué)變化而檢測被檢物質(zhì)。光學(xué)變化通常是指被檢物質(zhì)與上述試劑間的著色反應(yīng)，不僅是著色，還可以是脫色，發(fā)熒光，發(fā)光等。且，在量化被檢物質(zhì)，例如，測量上述光學(xué)變化時(shí)，可利用通常所用的吸光計(jì)或熒光計(jì)或應(yīng)用拉曼分光光度測定法。
通過上述電化學(xué)變化檢測被檢物質(zhì)的方法包括一種利用氧化-還原反應(yīng)的方法，一種當(dāng)被檢物質(zhì)是離子時(shí)，利用從所述離子產(chǎn)生絡(luò)合物的方法。
利用上述氧化-還原反應(yīng)的方法包括，例如，使用通常所用的電極如碳電極，在上述電極能夠進(jìn)行測量的電位范圍(在碳電極中，通常為-1.2V-+1.0V)內(nèi)，還原或氧化通過氧化-還原反應(yīng)產(chǎn)生的上述試劑的氧化形式或還原形式及被檢物質(zhì)，并在這種情況下測量電位，從而量化被檢物質(zhì)。上述氧化-還原反應(yīng)可以是一種被檢物質(zhì)和試劑直接提供和接受電子的反應(yīng)，或它們間接提供和接受電子的反應(yīng)。
利用上述絡(luò)合物的方法包括，例如，使用電極表面具有多孔聚合物層的液膜電極，用上述試劑浸滲液膜電極從而通過配價(jià)鍵或離子鍵選擇性地將所述試劑與被檢物質(zhì)結(jié)合，使生成物遷移到聚合物層中，并測量產(chǎn)生的膜電位，然后量化被檢物質(zhì)。
附圖簡述

圖1是表示按照本發(fā)明實(shí)施例1制造的測試片的圖；圖2是表示圖1所示測試片的狀態(tài)的圖，其中將1μl全血點(diǎn)樣在試劑層上；圖3是表示圖1所示測試片的狀態(tài)的圖，其中將0.5μl全血點(diǎn)樣在試劑層上；圖4是表示圖1所示測試片的狀態(tài)的圖，其中將0.1μl全血點(diǎn)樣在試劑層上。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述以下，提出本發(fā)明的實(shí)施例，從而更詳細(xì)地說明本發(fā)明。在本發(fā)明的實(shí)施例中，將使用血液(全血)作為樣品，使用血液中的葡萄糖(Glc)作為被檢物質(zhì)的測試片作為本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行說明。
<實(shí)施例1>
首先，對底層進(jìn)行說明。在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用了Milli-Q水，其是在Milli-Q Labo(由Nippon Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))中通過處理蒸餾水而得到的。所述蒸餾水是通過使用純凈水生產(chǎn)設(shè)備Autostill WG 220型(由Yamato Scientific Co.，Ltd.生產(chǎn))產(chǎn)生的。
首先，在用乙醇-Milli-Q水清洗透明的聚苯乙烯板并干燥后，在紫外線照射裝置(PL16-110，光源低壓水銀燈110W，均由Sen Lights Co.生產(chǎn))中，用紫外線照射1-30分鐘(優(yōu)選3分鐘)，然后使上述透明的聚苯乙烯板的表面經(jīng)過親水處理，制成底層1。將底層1的親水區(qū)域的形狀制成葫蘆形，其是通過將兩個(gè)直徑5mm的圓聯(lián)結(jié)起來形成的。
接下來，說明試劑層的制造。
將無機(jī)膠凝劑Laponite XLG，Bis-Tris緩沖溶液(pH6.5)，POD(過氧化物酶)，GOD(葡萄糖氧化酶)，4-AA(4-氨基安替比林(4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮))，和TOOS(N-乙基-N-(2-羥-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)，和膠乳顆粒OTG-2(平均粒徑4.5μm)在Mili-Q水中混合，達(dá)到下列表1所述的那些終濃度，從而得到Laponite XLG的膠體溶液(溶膠)。
下列表1中的“U”是一種單位(U單位)，表示在30℃時(shí)，每分鐘將1μmol底物轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物的酶活性的量。
表1(試劑配方A)試劑制造商 終濃度Raponite XLG Nippon Silica Industrial Co.，Ltd.0.5(重量％)Bis-Tris Dojindo Laboratories Co.，Ltd.0.5mmol/LPOD Toyobo Co.，Ltd. 7.5×103U/LGOD Toyobo Co.，Ltd. 25×103U/L4-AA Dojindo Laboratories Co.，Ltd.7.5μmol/LTOOS Dojindo Laboratories Co.，Ltd.7.5μmol/LOTG-2(4.5μm)Nippon Paint Co.，Ltd.12.5(重量％)將通過上述操作獲得的無機(jī)溶膠點(diǎn)樣在通過上述操作獲得的底層1的親水區(qū)域上，4℃時(shí)干燥1小時(shí)，從而制造出圖1所示的試劑層2。
接下來，對用上述操作獲得的測試片檢測血液中的葡萄糖進(jìn)行說明。
在各測試片的試劑層2的葫蘆形的頂端分別點(diǎn)樣1，0.5或0.1μl的新鮮全血(指尖血)。圖2-4表示將全血點(diǎn)樣后，測試片的狀態(tài)。
首先，討論所得血漿的量，在點(diǎn)樣1μl和0.5μl時(shí)，如圖2和3所示，在5秒鐘內(nèi)，血漿的量足以濕潤直徑5mm的試劑層2。在點(diǎn)樣0.1μl時(shí)，如圖4所示，血漿的量可濕潤大約2/3的，直徑5mm的試劑層2。在點(diǎn)樣1μl時(shí)，可觀察到，有很多血細(xì)胞和血漿仍然停留在全血的點(diǎn)樣位置上。
然后，討論對葡萄糖的反應(yīng)，血漿濕潤的部分顯淡紅色，這足以通過目測法加以證實(shí)。這主要是TOOS的顏色(λmax＝555nm)。
從上所述可知，本發(fā)明的測試片可通過點(diǎn)樣極小量的全血來檢測血漿中的葡萄糖。且，本發(fā)明的測試片可按照上面所述很簡單地制造。
<實(shí)施例2>
接下來，除了固定raponite XLG和其它試劑的量，并按照下列表2改變所用顆粒的量外，按照與實(shí)施例1相同的方式制造具有不同試劑層厚度的測試片，并測量預(yù)期的試劑層厚度。預(yù)期的厚度是通過在SEM上觀察試劑層的截面并計(jì)算而得到的膜厚度(μm)。
在具有不同試劑層厚度的各個(gè)測試片上點(diǎn)樣全血，并測量血漿的遷移距離。所述遷移距離是在點(diǎn)樣全血5秒內(nèi)，所分離的血漿從點(diǎn)樣位置到頂部的遷移距離(mm)。
表2

由表2可知，試劑層的厚度根據(jù)所用顆粒的量而變化，且在具有較大厚度的試劑層中，血漿的遷移距離更大。
<實(shí)施例3>
接下來，除使用下列表3所述終濃度的各試劑外，按照與實(shí)施例1相同的方式制造測試片。按照與上述實(shí)施例2相同的方式，測量各測試片中試劑層的預(yù)期厚度，并將全血點(diǎn)樣在試劑層上，接著測量血漿在這種情況下的遷移距離。表3表示各測試片的試劑配方，表4表示預(yù)期的遷移距離和厚度的測量結(jié)果。
表3(試劑配方B，C)

表4

由表3和4可知，如果pH保持不變，血漿的遷移距離取決于所用顆粒的量，即試劑層的厚度，即使試劑的使用量變得更大或更小。
<實(shí)施例4>
接下來，除了使用下列表5所述終濃度的各試劑外，按照與上述實(shí)施例1相同的方式制造測試片。在本實(shí)施例中，使用了具有不同粒徑(4.5μm和6.6μm)的顆粒。按照與上述實(shí)施例2相同的方式，將全血點(diǎn)樣在各測試片的試劑層上，接著測量血漿在這種情況下的遷移距離。表5表示各測試片的試劑配方，表6表示預(yù)期的遷移距離和厚度的測量結(jié)果。
表5(試劑配方D，E)

表6

由表5和6可知，如果pH保持不變，即使顆粒的粒徑變大或變小，血漿的遷移距離也不會(huì)改變。由于pH改變所造成的血漿遷移距離的改變證實(shí)了所分離血細(xì)胞狀態(tài)的改變與pH的改變有關(guān)；例如，由于血細(xì)胞收縮，血細(xì)胞遷移至試劑層更里的部分，從而使血漿在試劑層中的流動(dòng)性降低。
<對照實(shí)施例>
除了用HPC-M(羥乙基丙基纖維素由Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd生產(chǎn))，其是一種有機(jī)膠凝劑，使用時(shí)的終濃度為2重量％，代替rapomteXLG外，按照與實(shí)施例1相同的方式制造試劑層和測試片。將新鮮的全血(指尖血)點(diǎn)樣在所得測試片的試劑層上，但血漿沒有滲透到試劑層中，且所點(diǎn)的全血沒有分離。
工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明，有一種測試片，其可通過在底層上形成的試劑層來檢測樣品中的被檢物質(zhì)，其中所述樣品包含固體和液體，而被檢物質(zhì)則包含在液體中，且所述試劑層是由顆粒和無機(jī)凝膠形成的，所述試劑層可捕獲固體從而分離固體和液體，且該試劑層還包括一種試劑，該試劑可引起液體中被檢物質(zhì)的可檢測反應(yīng)，按照本發(fā)明，該測試片是通過測量透射光來測量被檢物質(zhì)的，其具有良好的氧滲透性，能夠非常準(zhǔn)確地測量被檢物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種測試片，其具有分離含固體和液體的樣品中的固體，從而檢測包含在液體中的被檢物質(zhì)的能力，該測試片具有多孔結(jié)構(gòu)的試劑層及支持該試劑層的底層，其中該多孔結(jié)構(gòu)的試劑層含有顆粒，無機(jī)凝膠，和與被檢物質(zhì)發(fā)生可檢測反應(yīng)的試劑，其中所述顆粒與所述無機(jī)凝膠彼此粘合，使顆粒之間形成空隙，從而捕獲固體成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試片，其中所述樣品是包含血細(xì)胞和血漿的血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試片，其中所述底層的表面具有親水區(qū)域，且所述親水區(qū)域支持所述試劑層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試片，其中所述顆粒的粒徑為0.5-10μm，顆粒的終濃度為1-30重量％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試片，其中形成無機(jī)凝膠的無機(jī)膠凝劑的終濃度為0.1-3重量％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試片，其中所述試劑是一種通過與被檢物質(zhì)反應(yīng)而引起光學(xué)變化的試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測試片，其中所述底層是由透光物質(zhì)制成的。
全文摘要
一種具有分離固體成分能力的試片，其特征在于它包括多孔試劑層及該試劑層的支持物，所述多孔試劑層含有顆粒，無機(jī)凝膠，和與被檢物質(zhì)發(fā)生可檢測反應(yīng)的試劑，其中所述顆粒通過所述無機(jī)凝膠彼此粘合，使顆粒之間形成空隙從而捕獲固體成分。因此，該試片可用于分離全血中的血細(xì)胞成分，其中所述全血含有血細(xì)胞成分和血漿成分，該試片還可用于檢測被檢物質(zhì)，如包含在血漿成分中的葡萄糖。使用所述試片，利用透射光，可測量被檢物質(zhì)，且該試片顯示出良好的氧滲透性，因而可更準(zhǔn)確地測量被檢物質(zhì)。
文檔編號G01N33/52GK1429339SQ01809552
公開日2003年7月9日 申請日期2001年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月15日
發(fā)明者平井香, 米原聰 申請人:阿克雷株式會(huì)社