專利名稱：一種高靈敏度均相dna雜交熒光測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及均相DNA雜交測定技術(shù)，具體地說是一種通過時(shí)間分辨熒光測定的高靈敏度均相DNA雜交熒光測定法。
背景技術(shù)：
DNA雜交測定是最為廣泛使用的傳染病診斷、基因診斷、腫瘤診斷、微生物分類學(xué)研究的方法之一，如文獻(xiàn)所述，文獻(xiàn)1S.Inoue，R.Honde，J.Clin.Microbiol.，1990，28，1469.文獻(xiàn)2T.Sekiya，M.Fushimi，H.Hori，S.Hishmura，T.Sugimura，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1984，81，4771.文獻(xiàn)3I.C.Hsu，R.A.Metcalf，T.Sun，J.A.Welsh，N.J.Wang，C.C.Harris Naure，1991，350，427。然而，傳統(tǒng)的DNA雜交分析法由于需要目標(biāo)DNA的固定相、預(yù)雜交、雜交、洗滌等許多步驟，操作繁雜費(fèi)時(shí)，加之固-液相間的雜交反應(yīng)相當(dāng)慢，也導(dǎo)致測定時(shí)間較長。
為解決上述問題，目前研究開發(fā)的均相DNA雜交測定法有關(guān)技術(shù)方案主要有三種首先是基于熒光共振能量傳遞的均相DNA雜交測定法，該方法使用兩種熒光標(biāo)記物修飾的DNA探針，其中一種熒光標(biāo)記物是熒光共振能量傳遞的能量給予體，另一種是能量接受體，當(dāng)兩種DNA探針在溶液中與目標(biāo)DNA雜交后，兩種熒光標(biāo)記物相互靠近，因此通過測定熒光共振能量傳遞后能量接受體的熒光，即可在均相溶液中定量測定目標(biāo)DNA的濃度，如文獻(xiàn)所述，文獻(xiàn)4C.Flores，P.C.Zamecnik，D.E.Woif，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988，85，8790.文獻(xiàn)5J-L.Mergny，A.S.Boutorine，T.Garestier，F(xiàn).Belloc，M.Rougée，N.V.Bulychev，A.A.Koshikin，J.Bourson，A.V.Lebedev，B.Valeur，N.T.Thuong，C.Hélène，NucleicAcide Res，1944，22，920。但是，該方法由于受能量給予體及非能量傳遞部分能量接受體在激發(fā)光下產(chǎn)生的強(qiáng)本底熒光的影響，所以測量靈敏度較低，不適合用于高靈敏度的測定。另一種是基于在DNA雜交體上形成二乙基三胺五乙酸(DTPA)-Tb3+-水楊酸三元熒光配合物的均相DNA雜交測定法；如文獻(xiàn)6所述A.Oser，G.Valet，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，29，1167。該方法同時(shí)使用DTPA-Tb3+和水楊酸修飾的兩種DNA探針用于DNA雜交反應(yīng)，當(dāng)兩種被修飾的DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后，DTPA-Tb3+與水楊酸相互靠近，進(jìn)而形成DTPA-Tb3+-水楊酸三元熒光配合物，通過測定形成的三元熒光配合物的熒光即可測得目標(biāo)DNA的濃度。由于DTPA-Tb3+-水楊酸三元熒光配合物具有長壽命的熒光，該方法可用時(shí)間分辨熒光法進(jìn)行測定。但是由于DTPA-Tb3+-水楊酸三元熒光配合物為弱熒光性配合物，其不足之處是靈敏度仍較低，其最低檢測下限僅為1×10-9mol/L。第三種均相DNA雜交測定法，是基于Eu3+熒光標(biāo)記物與有機(jī)熒光標(biāo)記物Cy5之間熒光共振能量傳遞的均相時(shí)間分辨熒光DNA雜交測定法，如文獻(xiàn)7所述S.Sueda，J.Yuan，K.Matsumoto，Bioconjugate Chem.，2000，11，827。它集熒光共振能量傳遞與時(shí)間分辨熒光測定兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，克服了使用常規(guī)有機(jī)熒光標(biāo)記物進(jìn)行熒光共振能量傳遞時(shí)本底熒光較大的缺點(diǎn)，因此靈敏度也較高，其最低檢測下限可達(dá)2×10-10mol/L。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測效果好、靈敏度更高、基于時(shí)間分辨熒光測定的高靈敏度均相DNA雜交熒光測定法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為使用乙二胺四乙酸的銪配合物標(biāo)記5’-末端或3’-末端的DNA探針，和一種二齒β-二酮標(biāo)記3’-末端或5’-末端的DNA探針，同時(shí)用于DNA的雜交反應(yīng)；當(dāng)二種標(biāo)記DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后，EDTA-Eu3+與β-二酮相互靠近進(jìn)而形成EDTA-Eu3+-β-二酮強(qiáng)熒光性三元熒光配合物，通過時(shí)間分辨熒光法測定形成的三元熒光配合物的熒光強(qiáng)度即可測得目標(biāo)DNA的濃度。
本發(fā)明可按下述步驟進(jìn)行操作1.用二齒β-二酮標(biāo)記DNA探針在pH值9.0-9.6的0.1-1.0mol/L碳酸鈉緩沖溶液中，DNA探針與溶于干燥有機(jī)溶劑中的二齒β-二酮，室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，分離已標(biāo)記的DNA探針和未反應(yīng)的標(biāo)記物，用pH值7.4-8.2的0.05-0.2mol/L Tris-HCl緩沖溶液或碳酸氫銨緩沖溶液展開。收集標(biāo)記的DNA，放置4℃保存；2.用EDTA-Eu3+標(biāo)記DNA探針在pH值9.4-10.0的0.1-1mol/L碳酸鈉緩沖溶液中，DNA探針與異硫氰基苯基乙二氨四乙酸，攪拌溶解后溶液室溫放置36-72小時(shí)，加入銪離子溶液室溫?cái)嚢?-10分鐘，分離已標(biāo)記的DNA探針和未反應(yīng)的標(biāo)記物，用pH值7.4-8.2的0.05-0.2mol/L Tris-HCl緩沖溶液或碳酸氫銨緩沖溶液展開。收集標(biāo)記的DNA，放置4℃保存；3.雜交和熒光測定用pH值7.4-8.2含有0.1-1mol/L NaCl的0.05-0.2mol/L Tris-HCl緩沖溶液配制含有目標(biāo)DNA、二齒β-二酮標(biāo)記的DNA探針和EDTA-Eu3+標(biāo)記DNA探針的溶液，在40-80℃放置10-30分鐘后，室溫放置30-120分鐘，然后進(jìn)行各種熒光性質(zhì)和時(shí)間分辨熒光測定。
其中所述本發(fā)明常使用的二齒β-二酮的結(jié)構(gòu)式如下 其中R，R1結(jié)構(gòu)如下 或 R中所述R′為R′＝-NH2，-NCS，-SO2Cl， 或 R1＝CnF2n+1，n＝1，2，3，4，5其中二齒β-二酮可用如下方法制備1)β-二酮的合成在干燥惰性溶劑中，于甲醇鈉存在下，用氟代羧酸乙酯與含有活潑甲基的酮進(jìn)行Claisen酯縮合反應(yīng)，蒸去溶劑后，加入稀硫酸溶液，收集沉淀，反復(fù)洗滌，重結(jié)晶提純，得中間產(chǎn)物；2)在中間產(chǎn)物上導(dǎo)入活性官能團(tuán)
在干燥有機(jī)溶劑中，利用氯磺化反應(yīng)、硝基的胺基還原反應(yīng)、胺基的異硫氰基化反應(yīng)、胺基的三氯三氮唑偶和反應(yīng)及羧基的N-羥基琥珀酰胺酯化反應(yīng)，在中間產(chǎn)物上導(dǎo)入活性官能團(tuán)，得目標(biāo)產(chǎn)物。
本發(fā)明的測定原理如下由現(xiàn)有技術(shù)，如文獻(xiàn)8所述J.Yuan，K.Matsumoto，Anal.Sci.，1996，12，31。Eu3+與β-二酮的配合物具有很強(qiáng)的長壽命熒光。但是，由于Eu3+與二齒β-二酮的配合物的穩(wěn)定常數(shù)在103-106水平，如文獻(xiàn)所述，文獻(xiàn)9W.D.Horrocks，D.R.Sudnick，J.Am.Chem.Soc.，1979，101，334.文獻(xiàn)10A.G.Goryushko，N.K.Davidenko，Russ J.Inorg.Chem.，1985，25，1470，所以Eu3+與β-二酮形成的配合物的穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致這類配合物在低濃度時(shí)分解進(jìn)而其熒光消失。而本發(fā)明是通過DNA雜交后，使得EDTA-Eu3+-β-二酮三元熒光配合物固定在生成的DNA雜交體上的方法，這樣即使在非常低的濃度下熒光配合物也不分解，而給出可測定的熒光信號(hào)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.靈敏度更高。采用本發(fā)明的方法其檢測的下限可達(dá)到5.7×10-12mol/L(相當(dāng)于每次測定DNA的絕對含量為5.7×10-16mol)，該結(jié)果要低于現(xiàn)有技術(shù)均相DNA雜交測量法的檢測下限2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。本發(fā)明是目前靈敏度最高的均相DNA雜交測定法。
2.具有足夠的熒光強(qiáng)度和足夠長的熒光壽命。由于本發(fā)明利用與目標(biāo)DNA雜交后形成的配合物具有足夠的熒光強(qiáng)度和足夠長的熒光壽命，進(jìn)而可用時(shí)間分辨熒光測定法來測定目標(biāo)DNA的濃度。
3.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明可以進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測定，也可以利用本發(fā)明的方法開發(fā)各種傳染病診斷、基因診斷、腫瘤診斷等臨床診斷試劑和相關(guān)方法。


圖1為均相DNA雜交熒光測定法原理示意圖。
圖2為兩種標(biāo)記DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后溶液的熒光光譜。其中實(shí)線為目標(biāo)DNA存在時(shí)的熒光光譜，虛線為無目標(biāo)DNA存在時(shí)的熒光光譜。
圖3為31mer目標(biāo)DNA的均相雜交時(shí)間分辨熒光測定工作曲線，其中bg為本底熒光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1同時(shí)使用乙二胺四乙酸的銪配合物標(biāo)記5’-末端(或3’-末端)的DNA探針，和一種二齒β-二酮標(biāo)記3’-末端(或5’-末端)的DNA探針用于DNA雜交反應(yīng)。當(dāng)兩種標(biāo)記DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后，EDTA-Eu3+與二齒β-二酮相互靠近進(jìn)而形成EDTA-Eu3+-β-二酮強(qiáng)熒光性三元熒光配合物，通過時(shí)間分辨熒光測定法測定形成的三元熒光配合物熒光強(qiáng)度即可測得目標(biāo)DNA的濃度。
1.標(biāo)記DNA探針用二齒β-二酮標(biāo)記物的合成本實(shí)施例使用一種含有氯磺酰基的新型二齒β-二酮，5-(4”-氯磺?；?1’，1”-聯(lián)苯-4’-基)-1，1，1，2，2-五氟-3，5-戊二酮(CDPP)來標(biāo)記DNA探針。CDPP的合成反應(yīng)分兩步進(jìn)行，其反應(yīng)原理如下列反應(yīng)方程式所示，
具體過程如下(1)5-(1’，1”-聯(lián)苯-4’-基)-1，1，1，2，2-五氟-3，5-戊二酮的合成在70ml干燥乙醚中分別加入3.0g的甲醇鈉，3.84g(20mmol)的五氟丙酸乙脂和3.92g(20mmol)的4’-乙?；?lián)苯后，室溫下密封攪拌24小時(shí)。蒸去溶劑后生成物加入100ml的15％硫酸，室溫下攪拌十五分鐘后，過濾并收集沉淀，沉淀用水反復(fù)洗滌，產(chǎn)物用100ml乙醇重結(jié)晶，得2.88g(42.4％收率)的目標(biāo)產(chǎn)物。元素分析結(jié)果(C17H11F5O2)計(jì)算值(％)C，59.65；H，3.24。實(shí)測值(％)C，59.82；H，3.92。1H NMR(丙酮-d6)測定結(jié)果8.28(d，2H)；7.92(d，2H)；7.79(d，2H)；7.50(m，3H)；7.07(s，1H)。
(2)CDPP的合成向12.5g攪拌下的氯磺酸中慢慢加入2.50g(7.30mmol)的5-(1’，1”-聯(lián)苯-4’-基)-1，1，1，2，2-五氟-3，5-戊二酮，室溫下攪拌反應(yīng)7小時(shí)后，反應(yīng)液小心緩慢地滴加入攪拌下的200ml冰-水中。離心收集沉淀，用冷水充分洗滌后過濾，生成物真空干燥48小時(shí)以上，得2.46g(收率73.2％)的CDPP黃色粉末。元素分析結(jié)果(C17H10F5O4SCl)計(jì)算值(％)C，46.32；H，2.29。實(shí)測值(％)C，46.33；H，2.11。1H NMR(丙酮-d6)測定結(jié)果8.35(d，2H)；8.07(d，2H)；8.20(d，2H)；8.28(d，2H)；7.12(s，1H)。
2.用CDPP標(biāo)記DNA探針(5’)GACCTAGCACTGGTA(3’)-O3PO-CH2CH(CH2OH)(CH2)4-NH2向200μl含有9.54×10-5mol/L的(5’)GACCTAGCACTGGTA(3’)-O3PO-CH2CH(CH2OH)(CH2)4-NH2(從日本Cosumo Bio公司購入)的溶液中加入50μl pH值9.1的1.0mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液后，加入100μl溶有2mgCDPP的干燥惰性溶劑DMF(DimethylFormamide；N，N-二甲基甲酰胺)溶液。反應(yīng)液室溫下攪拌2小時(shí)后，用NAP-柱(Pharmacia產(chǎn)品)分離已標(biāo)記的DNA探針和未反應(yīng)的標(biāo)記物，用pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液展開。收集標(biāo)記的DNA，放置4℃保存。
3.用EDTA-Eu3+標(biāo)記DNA探針NH2-(CH2)6-OPO3-(5’)CTGCGTCATGAACAG(3’)向100μl含有2.1×10-4mol/L的NH2-(CH2)6-OPO3-(5’)CTGCGTCATGAACAG(3’)(從日本Cosumo Bio公司購入)的溶液中加入100μl pH值9.8的0.2mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液后，加入1.1mg的異硫氰基苯基乙二氨四乙酸(isothiocyanobenzyl-EDTA，Dojindo產(chǎn)品)。攪拌溶解后溶液室溫放置四十八小時(shí)，加入250μl的1.0×10-2mol/LEuCl3溶液，然后室溫?cái)嚢?0分鐘。用NAP-柱(Pharmacia產(chǎn)品)分離已標(biāo)記的DNA探針和未反應(yīng)的標(biāo)記物，用pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液展開。收集標(biāo)記的DNA，放置4℃保存。
4.雜交條件和熒光測定選用31mer目標(biāo)DNA，(5’)CTGTTCATGACGCAGATACCAGTGCTAGGTC(3’)(從日本Cosumo Bio公司購入)，與兩種標(biāo)記探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。用pH值7.8含有0.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液配制含有1.0×10-7mol/L 31mer目標(biāo)DNA，1.0×10-7mol/L CDPP標(biāo)記的DNA探針和1.0×10-7mol/L EDTA-Eu3+標(biāo)記DNA探針的溶液用于熒光性質(zhì)的測定。溶液在50℃放置十分鐘后室溫放置90分鐘，然后進(jìn)行熒光發(fā)射光譜和熒光壽命的測定。測定儀器用Perkin-Elmer LS 50B熒光分光光度計(jì)，激發(fā)光波長為340nm。
比較例用pH值7.8含有0.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液配制僅含有兩種標(biāo)記DNA探針(各1.0×10-7mol/L)而不含有目標(biāo)DNA的溶液用于熒光性質(zhì)的測定。溶液在50℃放置十分鐘后室溫放置90分鐘，然后進(jìn)行熒光發(fā)射光譜和熒光壽命的測定。測定儀器用Perkin-Elmer LS 50B熒光分光光度計(jì)，激發(fā)光波長為340nm。
如圖2所示兩種標(biāo)記DNA探針在目標(biāo)DNA存在和不存在時(shí)溶液的熒光光譜表明兩種溶液均給出在615nm的最大熒光發(fā)光峰，這說明在兩種溶液中均形成了EDTA-Eu3+-CDPP三元熒光配合物。但是從圖可以看出，有目標(biāo)DNA溶液的發(fā)光強(qiáng)度要遠(yuǎn)大于沒有目標(biāo)DNA溶液的發(fā)光強(qiáng)度，兩者的差約為3倍。
利用含目標(biāo)DNA雜交后的溶液測得EDTA-Eu3+-CDPP三元熒光配合物的熒光壽命為420μs，這說明該配合物有足夠長的熒光壽命用于時(shí)間分辨熒光測定。
為評價(jià)本發(fā)明用于均相DNA雜交分析的靈敏度和實(shí)用性，用pH值7.8含有0.05mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液配制一系列含有1.0×10-8mol/L的兩種標(biāo)記DNA探針和不同濃度的31mer目標(biāo)DNA的溶液用于時(shí)間分辨熒光測定。各溶液在50℃放置十分鐘后室溫放置90分鐘，然后將各溶液加入到96微孔板中(100μl/孔)進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測定。測定使用VICTOR 1420時(shí)間分辨熒光測定儀(Wallac產(chǎn)品)，測定條件為激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長615nm，延遲時(shí)間100μs，窗口時(shí)間400μs，循環(huán)時(shí)間隔1.0ms。
圖3給出了31mer目標(biāo)DNA的均相雜交時(shí)間分辨熒光測定工作曲線，該圖中直線為扣除本底熒光(目標(biāo)DNA的濃度為0時(shí)的熒光)后的工作曲線，其直線方程為log(熒光強(qiáng)度)＝0.392log(目標(biāo)DNA的濃度)+2.524(r＝1.000)。利用本底熒光信號(hào)值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算該方法的最低檢測下限為5.7×10-12mol/L(相當(dāng)于每次測定DNA的絕對量為5.7×10-16mol)，該結(jié)果要低于其它均相DNA雜交測量法的檢測下限2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。
另外，本發(fā)明在β-二酮上進(jìn)行硝基的胺基還原反應(yīng)、胺基的異硫氰基化反應(yīng)、胺基的三氯三氮唑偶和反應(yīng)及羧基的N-羥基琥珀酰胺酯化反應(yīng)，導(dǎo)入活性官能團(tuán)的反應(yīng)方程式實(shí)例如下
權(quán)利要求
1.一種高靈敏度均相DNA雜交熒光測定法，其特征在于使用乙二胺四乙酸的銪配合物標(biāo)記5’-末端或3’-末端的DNA探針，和一種二齒β-二酮標(biāo)記3’-末端或5’-末端的DNA探針，同時(shí)用于DNA的雜交反應(yīng)；當(dāng)二種標(biāo)記DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后，EDTA-Eu3+與β-二酮相互靠近進(jìn)而形成EDTA-Eu3+-β-二酮強(qiáng)熒光性三元熒光配合物，通過時(shí)間分辨熒光法測定形成的三元熒光配合物熒光強(qiáng)度即可測得目標(biāo)DNA的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高靈敏度均相DNA雜交熒光測定法，其特征在于可按下述步驟進(jìn)行操作；(1)用二齒β-二酮標(biāo)記DNA探針在pH值9.0-9.6的0.1-1.0mol/L碳酸鈉緩沖溶液中，DNA探針與溶于干燥有機(jī)溶劑中的二齒β-二酮，室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，分離已標(biāo)記的DNA探針和未反應(yīng)的標(biāo)記物，用pH值7.4-8.2的0.05-0.2mol/L Tris-HCl緩沖溶液或碳酸氫銨緩沖溶液展開。收集標(biāo)記的DNA，放置4℃保存；(2)用EDTA-Eu3+標(biāo)記DNA探針在pH值9.4-10.0的0.1-1mol/L碳酸鈉緩沖溶液中，DNA探針與異硫氰基苯基乙二氨四乙酸，攪拌溶解后溶液室溫放置36-72小時(shí)，加入銪離子溶液室溫?cái)嚢?-10分鐘，分離已標(biāo)記的DNA探針和未反應(yīng)的標(biāo)記物，用pH值7.4-8.2的0.05-0.2mol/LTris-HCl緩沖溶液或碳酸氫銨緩沖溶液展開。收集標(biāo)記的DNA，放置4℃保存；(3)雜交和熒光測定用pH值7.4-8.2含有0.1-1mol/L NaCl的0.05-0.2mol/L Tris-HCl緩沖溶液配制含有目標(biāo)DNA、二齒β-二酮標(biāo)記的DNA探針和EDTA-Eu3+標(biāo)記DNA探針的溶液，在40-80℃放置10-30分鐘后，室溫放置30-120分鐘，然后進(jìn)行各種熒光性質(zhì)和時(shí)間分辨熒光測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述高靈敏度均相DNA雜交熒光測定法，其特征在于其中所述二齒β-二酮的結(jié)構(gòu)式如下 其中R，R1結(jié)構(gòu)如下 或 R中所述R′為R′＝-NH2，-NCS，-SO2Cl， 或 R1＝CnF2n+1，n＝1，2，3，4，5
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述高靈敏度均相DNA雜交熒光測定法，其特征在于其中所述二齒β-二酮可用如下方法制得1)β-二酮的合成在惰性溶劑中，于甲醇鈉存在下，用氟代羧酸乙酯與含有活潑甲基的酮進(jìn)行Claisen酯縮合反應(yīng)，蒸去溶劑，加入稀硫酸溶液，收集沉淀，反復(fù)洗滌，重結(jié)晶提純，得中間產(chǎn)物；2)在中間產(chǎn)物上導(dǎo)入活性官能團(tuán)在干燥有機(jī)溶劑中，利用氯磺化反應(yīng)、硝基的胺基還原反應(yīng)、胺基的異硫氰基化反應(yīng)、胺基的三氯三氮唑偶和反應(yīng)及羧基的N-羥基琥珀酰胺酯化反應(yīng)，在中間產(chǎn)物上導(dǎo)入活性官能團(tuán)，得目標(biāo)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種高靈敏度均相DNA雜交熒光測定法。它使用乙二胺四乙酸的銪配合物標(biāo)記5’－末端或3’－末端的DNA探針，和一種二齒β－二酮標(biāo)記3，－末端或5’－末端的DNA探針，同時(shí)用于DNA的雜交反應(yīng)；當(dāng)二種標(biāo)記DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后，EDTA－Eu與β－二酮相互靠近進(jìn)而形成EDTA－Eu－β－二酮強(qiáng)熒光性三元熒光配合物，通過時(shí)間分辨熒光法測定形成的三元熒光配合物熒光強(qiáng)度即可測得目標(biāo)DNA的濃度。本發(fā)明的方法靈敏度更高，應(yīng)用范圍廣。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1399126SQ0112796
公開日2003年2月26日 申請日期2001年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月25日
發(fā)明者袁景利, 王桂蘭 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所