專利名稱：一種電化學(xué)免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電化學(xué)免疫領(lǐng)域，特別涉及一種基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of the liver)是我國常見惡性腫瘤之一。死亡率高，在惡性腫瘤致死率中僅次于胃癌、食道癌居第三位，在部份地區(qū)的農(nóng)村中則占第二位，僅次于胃癌。我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。因此，對原發(fā)性肝癌進(jìn)行早期診斷、制定合理治療方案及評估療效尤為重要。目前用于原發(fā)性肝癌輔助診斷的主要方法有胸片、CT、以及痰細(xì)胞學(xué)檢查等，而血清腫瘤標(biāo)志物的檢測由于取樣簡單、易于接受等特點，在腫瘤篩查、診斷、評價治療療效等方面具有較大的實用價值。血清甲胎蛋白(AFP)是胚胎時期肝細(xì)胞合成的一種特殊的糖蛋白，胎兒血清中含量較高，出生1 2周后含量已不易測到，故正常成人血清中用一般方法測不到甲胎蛋白 (AFP)。因此，甲胎蛋白(AFP)可以作為原發(fā)性肝癌血清學(xué)診斷的指標(biāo)。但部分患者會檢出假陽性或假陰性，結(jié)合新的腫瘤標(biāo)志物對于提高原發(fā)性肝癌的檢出率具有重要意義。異常凝血酶原是除甲胎蛋白外公認(rèn)的有效肝癌標(biāo)志物，在肝癌的診斷、預(yù)后和療效監(jiān)測上都有一定價值。凝血酶原是由肝臟合成的依賴維生素K的凝血因子，異常凝血酶原(Abnormal Prothrombin, APT)和凝血酶原的化學(xué)結(jié)構(gòu)極其相似，區(qū)別在于異常凝血酶原(APT)分子氨基端的特定位置上的谷氨酸殘基未經(jīng)羧基化，因而缺乏結(jié)合鈣離子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在一般凝血試驗中無凝血活性。自從1984年Liebman等觀察到原發(fā)性肝癌患者血漿異常凝血酶原(APT)水平顯著升高，異常凝血酶原(APT)與肝癌的關(guān)系引起研究者的關(guān)注。雖然APT輕度升高亦可見于維生素K缺乏，但在注射維生素K后即可得到糾正，故并不影響對原發(fā)性肝癌的診斷。因此，異常凝血酶原(APT)作為原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)志物越來越受到重視，尤其在甲胎蛋白(AFP)不升高者或低度升高者體內(nèi)，異常凝血酶原(APT)往往升高，對這類原發(fā)性肝癌病人的診斷更有價值。目前，國內(nèi)外采用酶聯(lián)免疫方法測定異常凝血酶原(APT)已處于臨床應(yīng)用階段。由于酶聯(lián)免疫法靈敏度不高，不易檢測出痕量異常凝血酶原(APT)，影響對原發(fā)性肝癌檢測的準(zhǔn)確性。電化學(xué)發(fā)光(ECL)是通過在電極上施加一定波形的電壓或電流信號，進(jìn)行電解反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中共存組分反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光(ECL)與化學(xué)發(fā)光(CL)的差異在于，電化學(xué)發(fā)光(ECL)是電啟動發(fā)光反應(yīng)，而化學(xué)發(fā)光(CL)是通過化合物混合啟動發(fā)光反應(yīng)。因此，電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)易精確控制，具有靈活性和穩(wěn)定性。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI)是電化學(xué)發(fā)光和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物。在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用標(biāo)記物標(biāo)記抗體， 通過抗原與抗體的特異性反應(yīng)，根據(jù)電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對待測的抗原或抗體進(jìn)行定性、 定量分析，兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。電化學(xué)免疫分析的標(biāo)記物主要有兩類生物酶及電化學(xué)活性物質(zhì)。用作標(biāo)記物的電化學(xué)活性物質(zhì)為具有電化學(xué)
3氧化還原性質(zhì)的金屬離子和電活性的有機(jī)功能基團(tuán)。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1 IOOnm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，這大約相當(dāng)于10 100個原子緊密排列在一起的尺度。由于納米材料具有的高比表面積、高活性、特殊物理性質(zhì)及小尺寸，使得納米材料從一個惰性體轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€活潑的能提供電子和獲取電子的物體，將其引入傳感器的構(gòu)建中可明顯增強(qiáng)傳感器的響應(yīng)速度、靈敏度、選擇性等。因此，提供一種靈敏度高、特異性好的基于復(fù)合納米顆粒的電化學(xué)免疫檢測方法用來檢測異常凝血酶原(APT)，對原發(fā)性肝癌的早期診斷、病情監(jiān)測、判斷預(yù)后及其制定合理的治療方案和評估療效具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法。該檢測方法采用雙抗體夾心法，使固載在電極表面的異常凝血酶原抗體與樣品溶液中的異常凝血酶原發(fā)生免疫反應(yīng)，再和納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物結(jié)合?；诩{米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)活性，測得的循環(huán)伏安還原峰峰電流值與異常凝血酶原濃度呈正相關(guān)，進(jìn)而檢測檢測樣品中異常凝血酶原的濃度。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物的制備方法，將硫堇加入石墨烯水溶液中，超聲處理，制得硫堇-石墨烯復(fù)合物；將所述硫堇-石墨烯復(fù)合物加入到殼聚糖溶液中，制得殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒；將所述殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒在水中超聲分散，與HPtCl6混合后加入水中，再逐滴加入NaBH4 做還原劑，反應(yīng)后離心收集沉淀，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物。石墨是由一層層以蜂窩狀有序排列的平面碳原子堆疊而形成的，石墨的層間作用力較弱，很容易互相剝離，形成薄薄的石墨片。當(dāng)把石墨片剝成單層之后，這種只有一個碳原子厚度的單層就是石墨烯。石墨烯不僅是一直材料中最薄的一種，而且非常堅固堅硬；石墨烯是一種二維晶體，最大的特性是其中導(dǎo)電電子不僅能在晶格中無障礙地移動，而且速度極快，到了光速的1/300，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了電子在金屬導(dǎo)體或半導(dǎo)體中的移動速度。硫堇(Thi)是一種平面剛性芳環(huán)結(jié)構(gòu)的噻吩類小分子化合物，具有良好的氧化還原電化學(xué)活性，同時其具有兩個氨基，可以通過共價結(jié)合和靜電作用吸附納米顆粒，應(yīng)用于生物傳感器中。殼聚糖(chitosan，CS)含有豐富的親水性氨基和羥基，并且不溶于水和堿溶液。 憑借易成膜、化學(xué)惰性、無毒、低成本和良好的生物相容性被化學(xué)修飾電極和生物傳感器的研究。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1 IOOnm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，這大約相當(dāng)于10 100個原子緊密排列在一起的尺度。納米材料所具有的高比表面積、高活性、特殊物理性質(zhì)及小尺寸等特性使之成為非常有前景的傳感器制備材料。由于納米材料具有的大比表面、高表面，這使得納米材料從一個惰性體轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€活潑的能提供電子和獲取電子的物體，將其引入傳感器的構(gòu)建中，可明顯增強(qiáng)傳
4感器的響應(yīng)速度、靈敏度、選擇性等。納米材料因具有良好的吸附能力、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等特點已廣泛應(yīng)用到到電化學(xué)免疫傳感器中，作為生物活性的載體。納米鉬所采用的原料為鉬金(platinum)金屬單質(zhì)，元素符號為Pt，與金銀一起統(tǒng)稱為貴金屬元素，硬度為4 4. 5度，相對密度為21. 45，比重為15 19或21. 4，延展性強(qiáng)， 耐熔、耐摩擦、耐腐蝕，在高溫下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。納米鉬的粒徑大小為1 3nm，因此大大提高了鉬金固有的性能，如催化效果、分散效果、去除自由基效果等。基于石墨烯良好的導(dǎo)電性，硫堇分子的氧化還原電化學(xué)活性，殼聚糖具有豐富的氨基和良好的生物相容性等特點，本發(fā)明將石墨烯與硫堇制得納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物。本發(fā)明還提供了上述制備方法制得的納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的一種納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物的制備方法，包含如下步驟步驟1 將5mg硫堇加入4. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的石墨烯水溶液，在20°C下持續(xù)超聲4h，用乙醇和去離子水分別離心洗滌，除去未與石墨烯結(jié)合的硫堇，制得硫堇-石墨烯復(fù)合物；步驟2 將所述硫堇-石墨烯復(fù)合物加入到5. 5mL 10mg/mL的殼聚糖溶液中，60°C 連續(xù)攪拌12h，逐滴加入30 μ L 0. lmol/L的醋酸，室溫下攪拌lOmin，在90°C的油浴中持續(xù)加熱lh，用0. 2-0. 26- μ m的尼龍膜過濾，制得殼聚糖包裹的硫堇_石墨烯納米顆粒；步驟3 將所述殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒在水中超聲分散，取5mg與 80-150 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的HPtCl6混合均勻后加入到IOmL水中，劇烈攪拌5min，逐滴加入0. 25mL 1 OOmmo 1/L的NaBH4,攪拌30min后，8000rpm離心lOmin，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物。本發(fā)明還提供了一種電化學(xué)免疫檢測方法，包括如下步驟步驟1 將納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與PBS混勻，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的待測蛋白抗體，離心收集沉淀，用封閉液溫育，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的待測蛋白抗體共耦合物；步驟2 將玻碳電極拋光成鏡面，超聲清洗，置于氯金酸溶液中，恒電位沉積，用二次水沖洗干凈，置于待測蛋白抗體溶液中，封閉液溫育，制得免疫電極；將所述免疫電極與含有不同濃度待檢蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品溫育，置于所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的待測蛋白抗體共耦合物中溫育，制得工作電極；以所述工作電極，鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極的三電極體系中，采用線性掃描伏安法進(jìn)行電化學(xué)檢測，以工作電極和免疫電極的響應(yīng)電流值之差和標(biāo)準(zhǔn)品中待檢蛋白的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；步驟3 如步驟2，將所述免疫電極與待測樣品溫育，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測試，測得待測樣品的電化學(xué)峰峰電流強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取對應(yīng)的待檢蛋白的濃度。作為優(yōu)選，為了除去非特異性結(jié)合位點，本發(fā)明采用封閉液牛血清白蛋白。作為優(yōu)選，為了保證充分結(jié)合，本發(fā)明選用溫育的溫度為20 40°C。
作為優(yōu)選，為了保證充分結(jié)合，本發(fā)明選用溫育的時間為40 120min。作為優(yōu)選，所述緩沖液為含有H2A的pH值為5 6的醋酸緩沖溶液。作為優(yōu)選，所述線性掃描伏安法，電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 6 0. 2V。作為優(yōu)選，所述待檢蛋白為腫瘤標(biāo)志蛋白。腫瘤標(biāo)志物(Tumor Marker)由腫瘤組織自身產(chǎn)生，可反映腫瘤存在和生長的一類生化物質(zhì)，它們或不存在于正常成人組織而僅見于胚胎組織，或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量，它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)。主要有胚胎抗原、糖類抗原、天然自身抗原、細(xì)胞角蛋白、腫瘤相關(guān)的酶、激素以及某些癌基因等。腫瘤標(biāo)志蛋白是由腫瘤組織自身產(chǎn)生，可反映腫瘤存在和生長的蛋白類物質(zhì)。電化學(xué)免疫分析法(Electrochemical Immunoassay, ECIA)是將免疫技術(shù)與電化學(xué)檢測結(jié)合的一種免疫分析新方法，基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)，將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量，兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。因此，本發(fā)明提供的電化學(xué)檢測方法可以通過抗原抗體的特異性反應(yīng)，用來檢測腫瘤標(biāo)志蛋白。優(yōu)選地，所述腫瘤標(biāo)志蛋白包括胃泌素前體釋放肽、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、 CYFRA21-1、AFP、異常凝血酶原、CEA、CA242、CA125、CA199、CA153、CA724、CA50、f-PSA、 t-PSA、Free β-hCG、SCCA, β2-MG。腫瘤標(biāo)志蛋白按照腫瘤組織產(chǎn)生不同，包括分化抗原；胚胎抗原(AFP，CEA)；同工酶(NSE)；激素(HCG)；組織特異性抗原(PSA,free PSA)；粘蛋白、糖蛋白、糖脂(CA125)；電化學(xué)發(fā)光儀上?？蓹z驗一下標(biāo)志物AFP、CEA、CA199、CA724、CA125、CA153、NSE、Cyfra21-l、 PSA、free PSA。優(yōu)選地，所述待檢蛋白為異常凝血酶原。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供了一種電化學(xué)免疫檢測方法，包括如下步驟步驟1 納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物的制備25mg/mL納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇_石墨烯納米復(fù)合物2. OmL與IOmL PBS混勻，加入質(zhì)量體積比為10% (g/mL)的K2CO3，調(diào)節(jié)pH值至9. 5，加入500ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體400-500 μ L，輕微攪拌， 4°C孵育12h，8000rpm離心分離lOmin，用0. 25%的BSA溶液進(jìn)行封閉，保存于4°C pH值為 7. 0的PBS溶液中，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物；步驟2:將玻碳電極(Φ = 4mm)拋光成鏡面，超聲清洗，晾干，置于1 %的氯金酸(HAuCl4)溶液中，在-0. 2V下恒電位沉積30-50s，取出，用二次水沖洗干凈，晾干，置于 0. 5-1.0 μ g/mL異常凝血酶原抗體溶液中，于4°C浸泡吸附8h，置于0. 25% BSA溶液中， 37°C溫育lh，取出，水洗，制得免疫電極；將所述免疫電極與80-120 μ L的異常凝血酶原， 于37°C反應(yīng)25min，用PBS沖洗去掉未結(jié)合的蛋白樣品，置于80-120 μ L所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物中，37°C下反應(yīng)25min，用PBS溶液洗，以除去非特異性吸咐的所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物，制得工作電極；以所述工作電極，鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極的三電極體系，在含有2. 0 3. Om mol/L的H2R的0. lmol/L醋酸緩沖溶液(pH = 5 6)中進(jìn)行，中采用線性掃描伏安法進(jìn)行電化學(xué)檢測，以工作電極和免疫電極的響應(yīng)電流值之差和標(biāo)準(zhǔn)品中待檢蛋白的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 6 0. 2V ；步驟3 如步驟2，將所述免疫電極與待檢樣品混合溫育，進(jìn)行電化學(xué)檢測，測得待測樣品的電化學(xué)峰峰電流強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取對應(yīng)的待檢蛋白的濃度。本發(fā)明提出一種以納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物。應(yīng)用該納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物能夠方便制備夾心免疫分析方法中的檢測抗體。基于石墨烯良好的導(dǎo)電性，硫堇分子的氧化還原電化學(xué)活性，殼聚糖具有豐富的氨基和良好的生物相容性等特點，納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物能有效固載大量辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體，同時增強(qiáng)酶活性中心電子的傳輸速率，從而增強(qiáng)電極響應(yīng)信號，提高了免疫傳感器靈敏度。本發(fā)明提供的電化學(xué)免疫檢測方法線性響應(yīng)范圍為0. 8 800ng/mL，檢測下限為0. 23ng/mL,特異性好，靈敏度高，對異常凝血酶原(APT)的診斷具有重要意義。


圖1示實施例4基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法制得的異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，單位為ng/mL ；縱坐標(biāo)為檢測得到峰電流均值，單位為μ A。圖2示實施例5基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法制得的異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，單位為ng/mL ；縱坐標(biāo)為檢測得到峰電流均值，單位為μ A。圖3示實施例6基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法制得的異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，單位為ng/mL ；縱坐標(biāo)為檢測得到峰電流均值，單位為μ A。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種基于上述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明本發(fā)明中，硫堇、殼聚糖、HPtCl6,異常凝血酶原(APT)、異常凝血酶原抗體 (anti-APT)、辣根過氧化物酶標(biāo)記異常凝血酶原抗體(HRP-anti-APT)均購自美國Sigma公司；石墨烯購自南京先鋒納米材料科技有限公司；人體血清樣品均來自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤中心，檢測組(患者血清)216名，其中男108名，女108名；對照組(正常人血清)100名，其中男50名，女50名。實施例1納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物的制備將5mg硫堇加入4. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的石墨烯水溶液，在20°C下持續(xù)超聲 4h，用乙醇和去離子水分別離心洗滌，除去未與石墨烯結(jié)合的硫堇，制得硫堇-石墨烯復(fù)合物；將所述硫堇-石墨烯復(fù)合物加入到5. 5mL 10mg/mL的殼聚糖溶液中，60°C連續(xù)攪拌 12h，逐滴加入30 μ L 0. lmol/L的醋酸，室溫下攪拌lOmin，在90°C的油浴中持續(xù)加熱lh，用 0. 2 μ m的尼龍膜過濾，制得殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒；將所述殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒在水中超聲分散，取5mg與80 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的HPtCl6混合均勻后加入到IOmL水中，劇烈攪拌5min，逐滴加入0. 25mL 1 OOmmo 1/L的NaBH4，攪拌30min后， SOOOrpm離心lOmin，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物。實施例2納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物的制備將5mg硫堇加入4. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的石墨烯水溶液，在20°C下持續(xù)超聲 4h，用乙醇和去離子水分別離心洗滌，除去未與石墨烯結(jié)合的硫堇，制得硫堇-石墨烯復(fù)合物；將所述硫堇-石墨烯復(fù)合物加入到5. 5mL 10mg/mL的殼聚糖溶液中，60°C連續(xù)攪拌 12h，逐滴加入30 μ L 0. lmol/L的醋酸，室溫下攪拌lOmin，在90°C的油浴中持續(xù)加熱lh，用 0. 26 μ m的尼龍膜過濾，制得殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒；將所述殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒在水中超聲分散，取5mg與120 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的HPtCl6混合均勻后加入到IOmL水中，劇烈攪拌5min，逐滴加入0. 25mL IOOmmo 1/L的NaBH4，攪拌30min后， SOOOrpm離心lOmin，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物。實施例3納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物的制備將5mg硫堇加入4. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的石墨烯水溶液，在20°C下持續(xù)超聲 4h，用乙醇和去離子水分別離心洗滌，除去未與石墨烯結(jié)合的硫堇，制得硫堇-石墨烯復(fù)合物；將所述硫堇-石墨烯復(fù)合物加入到5. 5mL 10mg/mL的殼聚糖溶液中，60°C連續(xù)攪拌 12h，逐滴加入30 μ L 0. lmol/L的醋酸，室溫下攪拌lOmin，在90°C的油浴中持續(xù)加熱lh，用 0. 22 μ m的尼龍膜過濾，制得殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒；將所述殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒在水中超聲分散，取5mg與150 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的HPtCl6混合均勻后加入到IOmL水中，劇烈攪拌5min，逐滴加入0. 25mL IOOmmo 1/L的NaBH4，攪拌30min后， SOOOrpm離心lOmin，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物。實施例4基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)檢測方法檢測異常凝血酶原(APT)納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物的制備25mg/mL實施例1制備的納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物 2. OmL分別與IOmL PBS混勻，加入單位為g/mL的質(zhì)量體積比為10%的K2CO3,調(diào)節(jié)pH值至 9. 5，加入500ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體400 μ L，輕微攪拌，4°C孵育iai，8000rpm離心分離lOmin，用0. 25%的BSA溶液進(jìn)行封閉，保存于4°C pH值為7. O的 PBS溶液中，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物；免疫電極的制備將玻碳電極(Φ = 4mm)拋光成鏡面，超聲清洗，晾干，置于1 %
8的氯金酸(HAuCl4)溶液中，在-0. 2V下恒電位沉積30s，取出，用二次水沖洗干凈，晾干，置于0. 5 μ g/mL異常凝血酶原抗體溶液中，于4°C浸泡吸附8h，置于0. 25% BSA溶液中，37°C 溫育lh，取出，水洗，制得免疫電極；工作電極的制備將所述免疫電極與80 μ L的異常凝血酶原，于37°C反應(yīng)25min， 用PBS沖洗去掉未結(jié)合的蛋白樣品，置于80 μ L所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物中，37°C下反應(yīng)25min， 用PBS溶液洗，以除去非特異性吸咐的所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物，制得工作電極；電化學(xué)檢測采用三電極體系，所述工作電極，鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，在在含有2. Ommol/L的H2O2的0. lmol/L醋酸緩沖溶液(pH = 5) 中，進(jìn)行電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 2 0. 6V的循環(huán)伏安電化學(xué)檢測。進(jìn)行三次循環(huán)伏安掃描，記錄下三次掃描得到的還原峰電流值。測得的循環(huán)伏安還原峰峰電流值隨異常凝血酶原(APT)的濃度增加而增強(qiáng)，電流變化與異常凝血酶原(APT)成正比。以異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，將三次循環(huán)伏安掃描得到的以工作電極和免疫電極的還原峰電流值之差求平均值作縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 I = 5. 210LogCAPT+0. 157?；诩{米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物的電化學(xué)免疫檢測方法檢測人血清樣品中異常凝血酶原(APT)人體血清樣品均來自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤中心，檢測組(患者血清)216名，其中男108名，女108名；對照組(正常人血清)100名，其中男50名，女50名。將制備好的免疫電極分別與80 μ L血清樣品溶液，于37V反應(yīng)25min，用PBS沖洗去掉未結(jié)合的蛋白樣品，置于80 μ L納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物溶液中，在37°C下反應(yīng)25min，用PBS溶液洗3次，以除去非特異性吸咐的共耦合物。電化學(xué)檢測采用三電極體系，免疫電極為工作電極，鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，在含有3. Ommol/L的H2A的0. lmol/L醋酸緩沖溶液(PH = 6)中進(jìn)行，采用電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 2 0. 6V的循環(huán)伏安電化學(xué)對免疫電極進(jìn)行三次循環(huán)伏安掃描，并記錄下三次掃描得到的還原峰電流值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到對應(yīng)的異常凝血酶原(APT)的濃度。實施例5基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)檢測方法檢測異常凝血酶原(APT)納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物的制備25mg/mL實施例2制備的納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物 2. OmL分別與IOmL PBS混勻，加入質(zhì)量體積比為10% (g/mL)的K2CO3,調(diào)節(jié)pH值至9. 5，加入500ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體450 μ L，輕微攪拌，4°C孵育12h， 8000rpm離心分離lOmin，用0. 25%的BSA溶液進(jìn)行封閉，保存于4°C pH值為7. 0的PBS溶液中，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物；免疫電極的制備將玻碳電極(Φ = 4mm)拋光成鏡面，超聲清洗，晾干，置于1 % 的氯金酸(HAuCl4)溶液中，在-0. 2V下恒電位沉積40s，取出，用二次水沖洗干凈，晾干，置于1. 0 μ g/mL異常凝血酶原抗體溶液中，于4°C浸泡吸附8h，置于0. 25% BSA溶液中，37°C 溫育lh，取出，水洗，制得免疫電極；工作電極的制備將所述免疫電極與100μ L的異常凝血酶原，于37°C反應(yīng)25min， 用PBS沖洗去掉未結(jié)合的蛋白樣品，置于100 μ L所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物中，37°C下反應(yīng)25min， 用PBS溶液洗，以除去非特異性吸咐的所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物，制得工作電極；電化學(xué)檢測采用三電極體系，所述工作電極，鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，在在含有2. 5mmol/L的H2A的0. lmol/L醋酸緩沖溶液(pH = 5. 8) 中，進(jìn)行電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 2 0. 6V的循環(huán)伏安電化學(xué)檢測。進(jìn)行三次循環(huán)伏安掃描，記錄下三次掃描得到的還原峰電流值。測得的循環(huán)伏安還原峰峰電流值隨異常凝血酶原(APT)的濃度增加而增強(qiáng)，電流變化與異常凝血酶原(APT)成正比。以異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，將三次循環(huán)伏安掃描得到的以工作電極和免疫電極的還原峰電流值之差求平均值作縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 I = 5. 276LogCAPT+0. 135。基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物的電化學(xué)免疫檢測方法檢測人血清樣品中異常凝血酶原(APT)人體血清樣品均來自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤中心，檢測組(患者血清)216名，其中男108名，女108名；對照組(正常人血清)100名，其中男50名，女50名。將制備好的免疫電極分別與100 μ L血清樣品溶液，于37°C反應(yīng)25min，用PBS沖洗去掉未結(jié)合的蛋白樣品，置于100 μ L納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物溶液中，在37°C下反應(yīng)25min，用PBS溶液洗3次，以除去非特異性吸咐的共耦合物。電化學(xué)檢測采用三電極體系，免疫電極為工作電極，鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，在含有2. 5mmol/L的H2A的0. lmol/L醋酸緩沖溶液(PH = 5. 4)中進(jìn)行，采用電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 2 0. 6V的循環(huán)伏安電化學(xué)對免疫電極進(jìn)行三次循環(huán)伏安掃描，并記錄下三次掃描得到的還原峰電流值， 并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到對應(yīng)的異常凝血酶原(APT)的濃度。實施例6基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)檢測方法檢測異常凝血酶原(APT)納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物的制備25mg/mL實施例3制備的納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物 2. OmL分別與IOmL PBS混勻，加入質(zhì)量體積比為10% (g/mL)的K2CO3,調(diào)節(jié)pH值至9. 5，加入500ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體500 μ L，輕微攪拌，4°C孵育12h， 8000rpm離心分離lOmin，用0. 25%的BSA溶液進(jìn)行封閉，保存于4°C pH值為7. 0的PBS溶液中，制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物；免疫電極的制備將玻碳電極(Φ = 4mm)拋光成鏡面，超聲清洗，晾干，置于1 % 的氯金酸(HAuCl4)溶液中，在-0. 2V下恒電位沉積50s，取出，用二次水沖洗干凈，晾干，置于0. 75 μ g/mL異常凝血酶原抗體溶液中，于4°C浸泡吸附他，置于0. 25% BSA溶液中，37°C溫育lh，取出，水洗，制得免疫電極；工作電極的制備將所述免疫電極與120μ L的異常凝血酶原，于37°C反應(yīng)25min， 用PBS沖洗去掉未結(jié)合的蛋白樣品，置于120 μ L所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物中，37°C下反應(yīng)25min， 用PBS溶液洗，以除去非特異性吸咐的所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的異常凝血酶原抗體共耦合物，制得工作電極；電化學(xué)檢測采用三電極體系，所述工作電極，鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，在含有2. 8mmol/L的H2O2的0. lmol/L醋酸緩沖溶液(pH = 6)中， 進(jìn)行電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 2 0. 6V的循環(huán)伏安電化學(xué)檢測。進(jìn)行三次循環(huán)伏安掃描，記錄下三次掃描得到的還原峰電流值。測得的循環(huán)伏安還原峰峰電流值隨異常凝血酶原(APT)的濃度增加而增強(qiáng)，電流變化與異常凝血酶原(APT)成正比。以異常凝血酶原(APT)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，將三次循環(huán)伏安掃描得到的以工作電極和免疫電極的還原峰電流值之差求平均值作縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為I = 5. 04LogCAPT+0. 522?；诩{米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物的電化學(xué)免疫檢測方法檢測人血清樣品中異常凝血酶原(APT)人體血清樣品均來自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤中心，檢測組(患者血清)216名，其中男108名，女108名；對照組(正常人血清)100名，其中男50名，女50名。將制備好的免疫電極分別與120 μ L血清樣品溶液，于37°C反應(yīng)25min，用PBS沖洗去掉未結(jié)合的蛋白樣品，置于120 μ L納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原抗體共耦合物溶液中，在37°C下反應(yīng)25min，用PBS溶液洗3次，以除去非特異性吸咐的共耦合物。電化學(xué)檢測采用三電極體系，免疫電極為工作電極，鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，在含有2. 2mmol/L的H2A的0. lmol/L醋酸緩沖溶液(PH = 5. 2)中進(jìn)行，采用電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 2 0. 6V的循環(huán)伏安電化學(xué)對免疫電極進(jìn)行三次循環(huán)伏安掃描，并記錄下三次掃描得到的還原峰電流值， 并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到對應(yīng)的異常凝血酶原(APT)的濃度。實施例7基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法與ELISA檢測方法的比較人體血清樣品均來自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤中心，檢測組(患者血清)216名，其中男108名，女108名；對照組(正常人血清)100名，其中男50名，女50名。ELISA檢測異常凝血酶原(APT) :ELISA試劑盒購自上海銳谷生物科技有限公司。與實施例4至6中基于納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法的檢測結(jié)果比較，血清樣品為檢測組患者血清，共216個樣本，其中男性患者108名，女性患者108名，平均分為18組，每組血清樣本6個，男性女性血清樣本各3個， 結(jié)果見表1。表1電化學(xué)免疫檢測方法與ELISA檢測方法的結(jié)果
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物的制備方法， 其特征在于，將硫堇加入石墨烯水溶液中，超聲處理制得硫堇-石墨烯復(fù)合物；將所述硫堇-石墨烯復(fù)合物加入到殼聚糖溶液中，制得殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒；將所述殼聚糖包裹的硫堇-石墨烯納米顆粒超聲分散，與HPtCl6混合后，逐滴加入NaBH4還原制得所述納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法制得的納米鉬殼聚糖雙重包裹硫堇-石墨烯的納米復(fù)合物。
3.一種電化學(xué)免疫檢測方法，其特征在于，包括如下步驟步驟1 制備如權(quán)利要求2所述的納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的待測蛋白抗體共耦合物；步驟2:將玻碳電極預(yù)處理后置于待測蛋白抗體溶液中充分結(jié)合，封閉以去掉非特異性結(jié)合位點，制得免疫電極；將所述免疫電極與含有不同濃度待檢蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品充分結(jié)合， 置于所述納米鉬殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的待測蛋白抗體共耦合物中充分結(jié)合，制得工作電極；采用線性掃描伏安法進(jìn)行電化學(xué)檢測，以工作電極和免疫電極的響應(yīng)電流值之差和標(biāo)準(zhǔn)品中待檢蛋白的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；步驟3 如步驟2，將所述免疫電極與待測樣品溫育，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測試，測得待測樣品的電化學(xué)峰峰電流強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取對應(yīng)的待檢蛋白的濃度。
4.如權(quán)利要求3所述的電化學(xué)免疫檢測方法，其特征在于，所述玻碳電極預(yù)處理包括將所述玻碳電極拋光成鏡面，超聲處理后置于氯金酸溶液中，恒電位沉積。
5.如權(quán)利要求3所述的電化學(xué)免疫檢測方法，其特征在于，所述緩沖液為含有H2A的 PH值為5 6的醋酸緩沖溶液。
6.如權(quán)利要求3所述的電化學(xué)免疫檢測方法，其特征在于，所述線性掃描伏安法，電位掃描速度為50mV/s，掃描范圍為-0. 6 0. 2V。
7.如權(quán)利要求1至6任一項所述的電化學(xué)免疫檢測方法，其特征在于，所述待檢蛋白為腫瘤標(biāo)志蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的電化學(xué)免疫檢測方法，其特征在于，所述腫瘤標(biāo)志蛋白包括胃泌素前體釋放肽、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、CYFRA21-1、AFP、異常凝血酶原、CEA、CA242, CA125、CA199、CA153、CA724、CA50、f-PSA、t_PSA、Free β -hCG、SCCA, β 2-MG。
9.如權(quán)利要求8所述的電化學(xué)免疫檢測方法，其特征在于，所述待檢蛋白為異常凝血酶原。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基于納米鉑殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)免疫檢測方法。該檢測方法采用雙抗體夾心法，使固載在電極表面的異常凝血酶原(APT)抗體與樣品溶液中的異常凝血酶原(APT)發(fā)生免疫反應(yīng)，再和納米鉑殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物與異常凝血酶原(APT)抗體共耦合物結(jié)合?；诩{米鉑殼聚糖雙重包裹的硫堇-石墨烯納米復(fù)合物的電化學(xué)活性，測得循環(huán)伏安還原峰峰電流值進(jìn)而檢測檢測樣品中異常凝血酶原的濃度。本發(fā)明提供的電化學(xué)免疫檢測方法線性響應(yīng)范圍為0.8～800ng/ml，檢測下限為0.23ng/ml，特異性好，靈敏度高，對異常凝血酶原(APT)的診斷具有重要意義。
文檔編號B82Y40/00GK102226779SQ20111007584
公開日2011年10月26日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者仲召陽, 關(guān)偉, 單錦露, 卿毅, 戴楠, 李夢俠, 王東 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院