專利名稱：針對fiv感染的免疫接種材料和方法
技術領域：
本發(fā)明在國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)基金No.NIHAI30904支持的研究計劃下由政府資助完成。政府在本發(fā)明中擁有一定的權(quán)利。
相關申請的交叉參考本申請要求2003年5月12日遞交的美國臨時申請Serial No.60/470,066的權(quán)利，該申請連同其所有的附圖
、核酸序列、氨基酸序列和表格在此被全文引入為參考。
背景技術：
家貓易受若干逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染，這包括貓白血病病毒(FeLV)、貓肉瘤病毒(FeSV)、內(nèi)源C型致癌RNA病毒(RD-114)和貓合胞體形成病毒(FeSFV)。在這些病毒中，F(xiàn)eLV為最重要的病原體，其引起多種癥狀，包括淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞和骨髓瘤、貧血、免疫介導的紊亂和與人獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)相似的免疫缺陷綜合癥。最近，稱為FeLV-AIDS的特殊復制缺陷型FeLV突變體更特別與免疫抑制性質(zhì)相關。
Pedersen等人(1987)最初報道了貓T-嗜淋巴細胞慢病毒(現(xiàn)在稱為貓免疫缺陷病毒，F(xiàn)IV)的發(fā)現(xiàn)。FIV的特征已經(jīng)在Yamamoto等人(1988a)、Yamamoto等人(1988b)和Ackley等人(1990)中報道。血清流行病學數(shù)據(jù)表明FIV感染為全世界家貓和野生貓固有的。多種癥狀與FIV感染有關，這包括流產(chǎn)、脫毛癥、貧血癥、結(jié)膜炎、慢性鼻炎、腸炎、齒齦炎、便血、神經(jīng)異常、齒根骨膜炎和脂溢性皮炎。家貓感染FIV的免疫學標志為貓CD4+外周血淋巴細胞的慢性和進行性缺失、CD4∶CD8細胞比例的降低和一些情況下形成CD8的淋巴細胞增加?；诜肿?、生化和免疫病理學特征，現(xiàn)在認為貓的FIV感染為是比FeLV-FAIDS更好的貓AIDS模型。
Olmsted等人(1989a)、Olmsted等人(1989b)和Talbott等人(1989)報道了FIV的克隆和序列分析。Hosie和Jarrett(1990)描述了貓感染FIV的血清學反應。根據(jù)基于每一株系引起的交叉中和抗體水平的免疫類型可將FIV病毒亞型分類(Murphy和Kingsbury，1990)。最近根據(jù)基于核苷酸序列同源性的基因型對病毒亞型分類。雖然HIV和FIV亞型分類是基于基因型(Sodora等人，1994；Rigby等人，1993和Louwagie等人，1993)，但是關于亞型的基因型和免疫類型之間的相互關系還了解的很少。FIV病毒分離物分為四種FIV亞型A、B、C和D(Kakinuma等人，1995)。已經(jīng)描述了除C亞型外所有FIV亞型的傳染性分離物和傳染性分子克隆(Sodora等人，1994)。C亞型FIV僅從加拿大貓的細胞DNA中鑒定出來(Sodora等人，1994；Rigby等人，1993；Kakinuma等人，1995)。本領域鑒定的FIV株系包括(株系亞型示于括號內(nèi))Petaluma(A)、Dixon(A)、UK8(A)、Dutch113(A)、Dutch19K(A)、UK2(A)、SwissZ2(A)、Sendai-1(A)、USCAzepy01A(A)、USCAhnky11A(A)、USCAtt-10A(A)、USCAlemy01(A)、USCAsam-01A(A)、PPR(A)、FranceWo、Netherlands、Bangston(A/B)、Aomori-1(B)、Aomori-2(B)、USILbrny03B(B)、TM2(B)、Sendai-2(B)、USCKlgri02B(B)、Yokohama(B)、USMAsboy03B(B)、USTXmtex03B(B)、USMCglwd03B(B)、CABCpbar03C(C)、CABCpbar07C(C)、CABCpady02C(C)、Shizuoka(D)和Fukuoka(D)。
在疫苗中使用FIV衍生免疫原的一個顧慮是獸醫(yī)也許不能辨別測試為FIV抗體或FIV蛋白質(zhì)陽性的貓是否已經(jīng)感染了FIV或者抗體是來自針對FIV使用FIV衍生免疫原接種的貓。因此，本領域還需要這樣的疫苗，其預防FIV感染但允許獸醫(yī)確定FIV抗體是貓感染還是免疫接種的結(jié)果。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用來自靈長類動物免疫缺陷病毒(包括HIV和SIV)的免疫原預防貓科動物感染FIV的方法和組合物。本文描述了用受試疫苗組合物接種貓科動物的方法和組合物。當用FIV攻擊時，根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物接種的貓科動物表現(xiàn)出對FIV的保護性免疫應答。
本發(fā)明也涉及選擇免疫缺陷病毒中進化保守的表位的方法。使用本發(fā)明的方法鑒定的免疫缺陷病毒中進化保守的表位也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還涉及預防人和其他動物感染免疫缺陷病毒(如HIV和FIV)的方法。
序列簡述SEQ ID.NO1為HIV-1UCD1包膜蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO2為HIV-1UCD1gag蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO3為編碼包膜蛋白的HIV-1UCD1多核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO4為編碼gag蛋白質(zhì)的HIV-1UCD1多核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID.NO5為HIV-1IIIB包膜蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO6為HIV-1IIIBgag蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO7為編碼包膜蛋白的HIV-1IIIB多核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO8為編碼gag蛋白質(zhì)的HIV-1IIIB多核苷酸的核苷酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過給動物施用來自靈長類動物免疫缺陷病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的免疫原預防貓科動物感染FIV的材料和方法。在一個實施方案中，給貓科動物施用有效數(shù)量的包含來自靈長類動物免疫缺陷病毒免疫原的組合物。此外，本文所述的多種免疫原組合物可分開和彼此組合使用。
有利的是，本發(fā)明能夠預防FIV感染，其中動物中針對FIV的免疫應答的產(chǎn)生允許獸醫(yī)或本領域其他技術人員確定動物對FIV或者FIV免疫原或抗原的免疫應答究竟是免疫接種以預防FIV感染的結(jié)果，還是否為動物感染FIV的結(jié)果。在一個實施方案中，使用本發(fā)明的疫苗組合物免疫接種的動物不產(chǎn)生與FIV gp95交叉反應的抗體。感染FIV或接受含F(xiàn)IV衍生的免疫原或抗原的疫苗的動物產(chǎn)生與FIV gp95結(jié)合的抗體。包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)的貓科動物包括家貓、野生貓和包括美洲野貓、美洲豹、山獅、老虎、美洲虎、金錢豹、美洲獅、印度豹和獅子在內(nèi)的其他野貓。
本發(fā)明也可用于使用來自靈長類動物免疫缺陷病毒(如HIV和SIV)的免疫原在貓科動物中產(chǎn)生針對FIV的細胞和/或體液免疫應答。在一個實施方案中，給貓科動物施用數(shù)量足以誘導針對FIV的免疫應答的免疫原?？捎媒】档奈锤腥綡IV的人PBMC作為指示細胞測試免疫貓的血清抗體針對HIV的病毒中和抗體活性?？蓽y試免疫的貓的HIV特異性T輔助細胞(Th)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性。可通過Th細胞因子和CTL細胞毒素的水平測量Th和CTL活性，其中所述的Th細胞因子和CTL細胞毒素由未免疫接種和免疫的貓的淋巴細胞應答于滅活的HIV全病毒體外刺激產(chǎn)生，滅活HIV全病毒可與免疫原株相同(同源)和不同(異源)。用于體外刺激的滅活異源株可來自與免疫原株相同或不同的亞型。優(yōu)選的免疫原在具有來自免疫的貓的CD4+T淋巴細胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生高水平的Th細胞因子并且是指示性的。類似地，優(yōu)選的免疫原通過免疫的貓的CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生高水平的CTL細胞毒素。
包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的靈長類動物免疫缺陷病毒包括HIV和SIV。就HIV而言，該病毒可為HIV-1或HIV-2。在一個實施方案中，HIV為HIV-1。本領域描述了若干不同HIV-1株，包括HIV-1IIIB、HIV-1UCD1、HIV-1LAV和HIV-1BRU。在本文所述的代表性實施方案中，本發(fā)明的免疫原來自稱為HIV-1IIIB和/或HIV-1UCD1的HIV-1株。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的SIV株為SIVsyk、SIVsmm、SIVmac、SIVmnd、SIVl’hoest、SIVagm和SIVcpz(Whetter等人，1999)?？茖W文獻中描述了很多HIV和SIV基因的核苷酸序列，存儲于序列數(shù)據(jù)庫(如NCBI Genbank)中，并在出版的專利申請書和發(fā)行的專利中公開。例如HIV-1和HIV-2分離物的全基因組序列公開在Genbank登錄號NC 001802和NC 001722中。類似地，HIV和SIV基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列已經(jīng)公開并為本領域所熟知。HIV的序列也公開于可在網(wǎng)站http//www.hiv.lanl.gov/content/index獲得的數(shù)據(jù)庫中。編碼蛋白質(zhì)的靈長類動物免疫缺陷病毒基因包括env、gag、pol和nef。
來自靈長類動物免疫缺陷病毒的免疫原可為孤立的形式或在任何適當?shù)慕M合物中提供。優(yōu)選地，靈長類動物免疫缺陷病毒免疫原在組合物中提供并以在貓科動物中誘導對免疫原強烈的細胞介導和體液免疫應答的方式施用。在一個實施方案中，可以病毒感染細胞或無細胞全病毒的形式提供免疫原?？梢詼缁罨驕p毒病毒的方式處理病毒感染細胞中的病毒或無細胞病毒。滅活或減毒病毒的方法為本領域已知并包括例如用多聚甲醛、福爾馬林、苯酚、紫外線、提高的溫度等處理。美國專利No.6,503,753描述了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的光滅活方法，其從而滅活HIV病毒。靈長類動物免疫缺陷病毒也可制備成復制缺陷的。美國專利No.6,500,623描述了HIV復制缺陷病毒顆粒并設想生產(chǎn)這樣的病毒顆粒。產(chǎn)生滅活、減毒和復制缺陷病毒的其他技術為本領域已知。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原來源于靈長類動物免疫缺陷病毒的病毒蛋白質(zhì)或免疫原性片段或其變體。本發(fā)明中可用作免疫原的蛋白質(zhì)包括(但不限于)env、gag、pol、tat、rev和/或nef基因編碼的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，可用于本發(fā)明的env基因編碼的包膜蛋白包括包膜蛋白gp120和gp160，這包括其片段、gp120和gp160的融合物以及gp120和gp160變體，包括糖基化變體，其包括未糖基化的gp120和/或gp160蛋白質(zhì)。胞內(nèi)蛋白質(zhì)將gp160切割成gp41和gp120部分。gp41部分包含包膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中gp120位于感染的細胞或病毒體表面。gp120分子由大約60kd的多肽核心組成，但是N連接的糖基化可使蛋白質(zhì)的分子量增加到大約120kd。與本發(fā)明組合使用的病毒包膜蛋白可為未修剪的或修剪的(見例如美國專利No.5,849,533)。包膜蛋白變體描述于美國專利No.5,846,546。免疫學模擬的HIV gp120和/或gp160包膜蛋白合成肽也可用于本發(fā)明(見例如美國專利No.5,763,160)。在代表性的實施方案中，組合HIV-1IIIB的gp120和gp160包膜蛋白作為免疫原。在一個實施方案中，HIV-1UCD-1的包膜多肽包含SEQ ID NO1中展示的氨基酸序列。在一個實施方案中，HIV-1IIIB的包膜多肽包含SEQ ID NO5中展示的氨基酸序列。
也可根據(jù)本發(fā)明使用靈長類動物免疫缺陷病毒gag基因編碼的蛋白質(zhì)，如HIV的p17基質(zhì)蛋白、p24衣殼蛋白、p7核殼體蛋白和SIV的p27蛋白質(zhì)以及它們的片段和變體。在代表性的實施方案中，用HIV-1UCD-1的p24蛋白質(zhì)作為免疫原。在一個實施方案中，HIV-1UCD-1的p24多肽包含SEQ ID NO2的132-362氨基酸。在一個實施方案中，HIV-1IIIB的p24多肽包含SEQ ID NO6的132-363氨基酸。美國專利No.5,700,469中描述了p24蛋白質(zhì)的免疫片段。靈長類動物免疫缺陷病毒pol基因編碼的蛋白質(zhì)(如HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)蛋白酶(PR)和Rnase H以及它們的片段和變體)也可用于本發(fā)明。也可根據(jù)本發(fā)明使用HIV的內(nèi)切核酸酶蛋白質(zhì)p31以及其片段和變體，其為HIV pol基因3’末端編碼的蛋白質(zhì)。美國專利No.5,401,628中描述了HIV的p31蛋白質(zhì)的免疫肽片段。靈長類動物免疫缺陷病毒的tat和rev基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白和靈長類動物免疫缺陷病毒的nef、vif、vpr、vpu和vpx基因編碼的輔助蛋白以及這些蛋白質(zhì)的片段和變體也可用于本發(fā)明。
可通過重組方法合成或制備與靈長類動物免疫缺陷病毒免疫原或抗原區(qū)域?qū)碾牟⒂糜诒景l(fā)明的方法中。在一個實施方案中，可制備與靈長類動物免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)重疊片段對應的肽并用于本發(fā)明的方法中。任何多肽片段的適當組合可用于根據(jù)本發(fā)明的方法免疫接種動物。例如，與病毒蛋白質(zhì)羧基端區(qū)域?qū)碾钠慰梢院团c蛋白質(zhì)的氨基端區(qū)域和跨膜區(qū)域?qū)碾钠我煌褂谩?br> 重組病毒或基于病毒載體的表達構(gòu)建體也可考慮用于本發(fā)明，其中所述的病毒或表達構(gòu)建體包含靈長類動物免疫缺陷病毒核苷酸序列，例如HIV或SIV env、gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、gag/pol或env-gag/pol序列它們的片段或變體。考慮將任何可用于制備重組載體/HIV或重組載體/SIVA構(gòu)建體的適當病毒載體用于本發(fā)明。例如來源于腺病毒、禽痘、貓皰疹病毒、痘苗、金絲雀痘、昆蟲痘、豬痘和其他本領域已知的病毒載體可用于本發(fā)明的組合物和方法。可使用本領域已知的標準基因工程技術構(gòu)建編碼并且可在適當宿主細胞中表達HIV或SIV元件的重組多核苷酸載體。
包含編碼一種或多種靈長類動物免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)或者其片段或變體的核酸的DNA或RNA疫苗也可考慮用于本發(fā)明。核酸可以質(zhì)?；蛘婧吮磉_構(gòu)建體形式提供。DNA疫苗和制劑在例如出版的專利申請20040076632、20040047878、20040009941、20020156037、20020032165和20010004531中有所描述。
正如在此使用的，術語“表達構(gòu)建體”指核酸序列的組合，以提供有效連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。正如在此使用的，術語“有效連接”指所述元件的并列，其中元件之間的關系允許們以其預期方式發(fā)揮作用?？傊行нB接的元件為相鄰關系。
本發(fā)明的表達構(gòu)建體通常也包括在用于表達表達構(gòu)建體的目的宿主細胞中發(fā)揮作用的調(diào)節(jié)元件。因此，本領域的技術人員可選擇調(diào)節(jié)元件用于例如細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、昆蟲宿主細胞、哺乳動物宿主細胞和人宿主細胞的調(diào)節(jié)元件。調(diào)節(jié)元件包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯終止序列、增強子和多腺苷酸化元件。
本發(fā)明的表達構(gòu)建體可包含與編碼本發(fā)明肽的多核苷酸序列有效連接的啟動子序列。啟動子可使用本領域已知的標準技術整合到多核苷酸中。多拷貝啟動子和復合啟動子可用于本發(fā)明的表達構(gòu)建體中。在優(yōu)選的實施方案中，啟動子與轉(zhuǎn)錄起始位點的距離可與天然遺傳環(huán)境中相同。在基本不降低啟動子活性的前體下允許此距離一定的改變。轉(zhuǎn)錄起始位點一般包含在表達構(gòu)建體中。
就在動物細胞中表達而言，本發(fā)明的表達構(gòu)建體可包含能驅(qū)動多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的適當啟動子。如果細胞為哺乳動物細胞，那么表達載體中可使用這樣的啟動子，如肌動蛋白啟動子、金屬硫蛋白啟動子、NF-κB啟動子、EGR啟動子、SRE啟動子、IL-2啟動子、NFAT啟動子、骨鈣蛋白啟動子、SV40早期啟動子和SV40晚期啟動子、Lck啟動子、BMP5啟動子、TRP-1啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒長末端重復啟動子、STAT啟動子或免疫球蛋白啟動子。
本發(fā)明的表達構(gòu)建體可任選地含有轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯終止序列、信號肽序列和/或增強子元件。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域一般可從真核或病毒基因序列的3’非翻譯區(qū)獲得。轉(zhuǎn)錄終止序列可位于編碼序列的下游以提供有效的終止。信號肽為一組短的氨基端序列，其編碼負責把有效連接的肽移到一系列翻譯后細胞目的地的信號，這個范圍從特定細胞器區(qū)室到蛋白質(zhì)作用位點和胞外環(huán)境。通過使用有效連接的信號肽序列引導肽到預期細胞和/或胞外目的地被設想用于本發(fā)明的免疫原。化學增強子為增加基因轉(zhuǎn)錄的順式作用元件，并可包括在表達構(gòu)建體中?；瘜W增強子為本領域已知并包括(但不限于)細胞巨化病毒(CMV)早期啟動子增強子元件和SV40增強子元件。表達構(gòu)建體中也可包括指導結(jié)構(gòu)基因編碼的mRNA多腺苷酸化的DNA序列。
表達構(gòu)建體的5’和3’端可包括獨特的限制性內(nèi)切酶位點以允許插入多核苷酸載體。正如在此使用的，術語“載體”指任何遺傳元件，其包括例如質(zhì)粒、粘粒、染色體、噬菌體、病毒等等，當與適當控制元件聯(lián)系時，其能復制并且可在細胞間轉(zhuǎn)移多核苷酸序列。載體含有允許載體在所選宿主細胞中復制的核苷酸序列?？色@得許多可進行表達和/或克隆的載體，包括(但不限于)pBR322、pUC系列、M13系列和pBLUESCRIPT載體(Stratagene，La Jolla，CA)。
本發(fā)明的多核苷酸、載體和表達構(gòu)建體也可通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法體內(nèi)引入(經(jīng)由合成陽離子脂質(zhì)制備的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DNA)(Felgner等人，1987)。合成陽離子脂質(zhì)(LIPOFECTIN，Invitrogen Corp.，La Jolla，CA)可用于制備脂質(zhì)體來包裹本發(fā)明的多核苷酸、載體和表達構(gòu)建體。本發(fā)明的多核苷酸、載體和表達構(gòu)建體也可以裸DNA，使用本領域已知的方法(如轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔法、磷酸鈣沉淀)和生物射彈法引入。
正如在此使用的，術語“核酸”和“多核苷酸序列”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸聚合體并且除非另有限制，包括已知的可以天然存在核苷酸相似方式發(fā)揮作用的天然核苷酸類似物。多核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA鏈序列和翻譯成蛋白質(zhì)的RNA序列。多核苷酸序列包括全長序列以及來源于全長序列的較短序列。應該理解，特定的多核苷酸序列包括天然序列或可引入以在特定宿主細胞中提供密碼子偏好性的序列的簡并密碼子。進入本發(fā)明范圍之內(nèi)的多核苷酸序列還包括與代表性序列特異雜交的序列。多核苷酸包括如單鏈或雙鏈體的正義和反義鏈。
本發(fā)明的方法考慮用本發(fā)明的疫苗組合物初次免疫。隨后的或二次的免疫也考慮為本方法的范圍之內(nèi)。用于二次免疫的疫苗組合物可與用于初次免疫的組合物相同或不同。例如，動物的初次免疫可使用基于重組載體的HIV或SIV構(gòu)建體，具有單一或多個株系的組分，然后用疫苗組合物二次加強，二次加強的疫苗組合物包含HIV或SIV感染的細胞系或者HIV或SIV多肽、或者無細胞HIV或SIV病毒，也具有單一或多個株系的組分。初次免疫也可使用HIV和/或SIV DNA疫苗。在一個實施方案中，重組載體構(gòu)建體用于初次免疫，而蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)加上重組載體構(gòu)建體、亞單位疫苗組合物用于二次加強。此外，本發(fā)明考慮這樣的方法，其中用于初次免疫的免疫原為HIV或SIV來源的免疫原，例如HIV p24蛋白質(zhì)，用于二次免疫的免疫原來源于FIV，例如FIV gp95和/或gp36蛋白質(zhì)或者全FIV病毒或FIV感染的細胞。用本發(fā)明的疫苗組合物免疫接種的其他方法是本領域的技術人員顯而易見的，并考慮為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在一個實施方案中，將來源于多種靈長類動物免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)的免疫原組合施用給動物。在代表性的實施方案中，給貓科動物施用包含HIV-1p24免疫原和HIV-1gp120及gp160免疫原的組合物。在另一個代表性實施方案中，給貓科動物施用包含HIV-1 p24作為唯一免疫原的組合物。
本發(fā)明也涉及預防貓科動物感染FIV或通過給動物施用組合物以產(chǎn)生針對FIV的免疫應答的材料和方法，其中所述的組合物包含來源于靈長類動物免疫缺陷病毒的免疫原和來源于FIV的免疫原。FIV衍生的免疫原在本領域已有所描述。見例如美國專利No.5,118,602、5,565,319、5,510,106、5,275,813、5,037,753和4,861,720?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的FIV免疫原可來自FIV的單一亞型或株系，或者免疫原可來源于FIV的多種亞型。多亞型FIV免疫原已在美國專利No.5,846,825、6,254,872和6,447,993中描述。
在本發(fā)明方法的一個實施方案中，給貓科動物施用的免疫原包含在靈長類動物免疫缺陷病毒和FIV之間保守的表位。在另一個實施方案中，保守的表位存在于免疫缺陷病毒的包膜蛋白中。具有與本發(fā)明表位拓撲學等價的構(gòu)象并且與結(jié)合保守表位的抗體結(jié)合相同的抗原結(jié)合區(qū)的分子(模擬表位)也考慮在本發(fā)明范圍之內(nèi)。一般地，模擬表位為肽分子，但是模擬表位也可從其他非肽分子制備。
本發(fā)明也涉及來自靈長類動物免疫缺陷病毒的免疫原，其中免疫原為蛋白質(zhì)或肽并且包含在靈長類動物免疫缺陷病毒和FIV之間保守的表位。在代表性實施方案中，免疫原包含HIV-1IIIB的gp120和gp160蛋白質(zhì)，任選地包含HIVUCD1的p24蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，免疫原包含HIVUCD1的p24蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及編碼蛋白質(zhì)或肽的多核苷酸，其中所述的蛋白質(zhì)或肽包含來自免疫缺陷病毒的免疫原的保守表位。
本發(fā)明還涉及與來自靈長類動物免疫缺陷病毒和FIV的免疫原的表位交叉反應的抗體?？贵w可為多克隆或單克隆形式?？贵w可來源于能產(chǎn)生針對所述表位的抗體的任何動物，包括例如人、猿、猴子、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、豬、奶牛和貓科動物。非人類抗體也考慮在本發(fā)明范圍之內(nèi)，其與來自靈長類動物免疫缺陷病毒和FIV的免疫原的表位交叉反應，但是已經(jīng)使用本領域已知的標準技術“人源化”，如使用美國專利No.5,530,101、5,585,089、5,693,762、6,180,370和6,407,213中所述的技術“人源化”。
本發(fā)明的肽和/或多肽免疫原也可以多抗原肽(MAP)構(gòu)建體形式提供。Tam(1988)中描述了MAP構(gòu)建體的制備。MAP構(gòu)建體利用多拷貝的免疫原合成其上的賴氨酸殘基核心基質(zhì)(Posnett等人，1988)。多MAP構(gòu)建體可根據(jù)本發(fā)明的方法以疫苗組合物的形式制備和施用，每一個構(gòu)建體含有相同或不同的免疫原。在一個實施方案中，MAP構(gòu)建體連同一種或多種佐劑提供和/或施用。
靈長類動物免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)的天然、重組或合成多肽和其肽片段也可根據(jù)本發(fā)明方法用作疫苗組合物。在一個實施方案中，不同的多肽以組合制品施用給貓科動物。在代表性的實施方案中，給貓科動物施用HIV-1gp120/160和HIV-1 p24多肽。在另一個實施方案中，來自不止一種HIV株的HIV多肽組合到疫苗組合物中并用于接種宿主動物。例如，基于至少兩個HIV-1株系的HIV包膜糖蛋白的多肽可組合到疫苗中。多肽可包含“雜合”或“嵌合”多肽，其氨基酸序列來自至少兩種不同HIV株的多肽的連接。制備HIV多肽的方法為本領域熟知。例如，可使用固相合成方法(Merrifield，1963)合成HIV多肽。也可使用重組DNA技術產(chǎn)生HIV多肽，其中編碼HIV蛋白質(zhì)或肽的多核苷酸分子在宿主細胞(如細菌、酵母或哺乳動物細胞系)中表達，并使用本領域標準技術純化。
根據(jù)本發(fā)明的方法，本文所述的免疫原組合物以誘導針對隨后FIV對宿主感染或攻擊的保護性免疫的有效數(shù)量和方式給易感宿主(一般為家貓)施用。免疫原一般通過注射腸胃外施用，例如皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)，或者通過口腔或鼻內(nèi)施用，或者通過此類途徑的任何組合施用。免疫原通常給宿主動物施用至少兩次，兩次施用間隔一周或幾周。然而，也考慮起始或加強施用免疫原的其他用藥法，并且可依賴于醫(yī)生的判斷和待治療的具體宿主動物。
可根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原可與可藥用載體或稀釋劑一起提供。用于本發(fā)明的化合物和組合物可根據(jù)制備可藥用組合物的已知方法制備。制劑在大量本領域技術人員熟知并且易于獲得的資料中詳細描述。例如，E.W.Martin，Easton Pennsylavania編寫的《Remington’s PharmaceuticalScience》(Mack Publishing Company，第19版，1995)描述了可結(jié)合本發(fā)明使用的制劑。總之，配制本發(fā)明的組合物以便有效數(shù)量的免疫原與適當?shù)妮d體組合，以促進組合物的有效施用。用于本發(fā)明方法的組合物也可為多種形式。這些形式包括例如固體、半固體和液體劑型，如片劑、丸劑、粉末劑、液體溶液或懸浮液、栓劑、可注射和輸注的溶液和噴霧劑。優(yōu)選的形式依賴于目的施用方式和治療應用。組合物也優(yōu)選地包含本領域技術人員已知的常規(guī)可藥用載體和稀釋劑。與目的肽模擬物一起使用的載體或稀釋劑的實例包括(但不限于)水、鹽水、油(包括礦物油)、乙醇、二甲基亞砜、明膠、環(huán)糊精、硬脂酸鎂、葡萄糖、纖維素、糖、碳酸鈣、甘油、鋁、淀粉以及等價載體和稀釋劑，或者任何這些物質(zhì)的混合物。本發(fā)明免疫原的制劑也可包含懸浮劑、保護劑、潤滑劑、緩沖液、防腐劑和穩(wěn)定劑。為在所需治療處理中施用此類藥劑，本發(fā)明的藥用組合物有利地包含以包括載體和稀釋劑的總組合物的重量計0.1-45％，尤其是1-15％的免疫原。
可通過本領域已知的方法制備本發(fā)明的免疫原組合物。例如，免疫原一般制備成可注射劑，例如液體溶液或懸浮液。免疫原以與劑量形式相容的方式并在接受者中治療有效和致免疫的數(shù)量施用。本領域技術人員可容易地確定特定免疫原制劑的最佳劑量和施用方式。
如上面提到的，免疫原制劑中的病毒和細胞可使用本領域已知的方法滅活或減毒。疫苗制劑中無細胞完整或部分病毒的數(shù)量通常為約0.1-5mg，更通常的為約0.2-2mg。包含病毒感染的細胞系的制劑的劑量通常每劑量含有約106-108個細胞，更通常地每劑量含有約5×106-7.5×107個細胞。依賴于接受藥劑的動物的大小、年齡等，用于貓科動物的一劑中蛋白質(zhì)或肽免疫原的數(shù)量為約0.1-10000μg，或者約1-5000μg，或者約10-1000μg，或者約25-750μg，或者約50-500μg，或者約100-250μg。
在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原與一種或多種增加動物對免疫原免疫應答的佐劑一起提供。本發(fā)明的免疫原可與任何適當?shù)淖魟┗虮绢I域已知的佐劑一起提供和/或施用。可用于本發(fā)明免疫原制劑的佐劑包括蘇氨酰胞壁酰二肽(MDP)(Byars等人，1987)、Ribi佐劑系統(tǒng)組分(Corixa Corp.，Seattle，WA)(包括細胞壁骨架(CWS)成分、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑或其組合)。多種適合用于本發(fā)明方法和疫苗的其他佐劑(如鋁、氫氧化鋁和皂苷)為本領域所熟知并考慮用于本發(fā)明。細胞因子(γ-IFN、GM-CSF、CSF等等)和淋巴因子(IL-I、IL-2等)也用作疫苗組合物的佐劑和/或添加物并考慮為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。包含本發(fā)明免疫原的組合物中可包含一種或多種不同的細胞因子和淋巴因子。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原與淋巴因子白細胞介素-12(IL-12)組合施用給動物，其中所述的白細胞介素-12與另一種佐劑組合。同樣特別考慮為本發(fā)明范圍之內(nèi)的為淋巴因子白細胞介素-18(IL-18)用作佐劑組合物的部分。在一個實施方案中，用于本發(fā)明的佐劑組合物包含IL-12和IL-15，或IL-15和IL-18，或IL-12和IL-18，或IL-12、IL-15和IL-18的組合。優(yōu)選地，細胞因子為在貓科動物中具有生物活性的種類。更優(yōu)選地，細胞因子為貓科動物細胞因子，例如貓IL-12、貓IL-15、貓IL-18等等。在代表性的實施方案中，靈長類動物來源的免疫原與包括CWS和IL-12和/或IL-18在內(nèi)的Ribi佐劑系統(tǒng)組分組合施用。
下面列出了本文所用的FIV株縮寫株(亞型) 縮寫Petaluma(A)FIVPetDixon(A) FIVDixUK8(A) FIVUK8Bangston(B)FIVBangAomori-1(B)FIVAom1株(亞型) 縮寫Aomori-2(B)FIVAom2Fc1(B) FIVFC1Shizuoka(D)FIVShiDutch113(A)FIVDut113Dutch19K(A)FIVDut19UK2(A) FIVUK2SwissZ2(A) FIVSwiZ2Sendai-1(A)FIVSen1Sendai-2(B)FIVSen2USCAzepy01A(A) FIV
USCAhnky11A(A) FIVUSC11USCAtt-10A(A)FIVUSC10USCAlemy01(A)FIVUSCAsam-01A(A) FIVPPR(A) FIVPPRFranceWo FIVFraNetherlands FIVNetUSILbrny03B(B) FIVUSI03TM2(B) FIVTM2USCKlgri02B(B) FIVUSC02Yokohama(B) FIVYokUSMAsboy03B(B) FIVUSMA03USTXmtex03B(B) FIVUST03USMCglwd03B(B) FIVUSMC03CABCpbar03C(C) FIVCAB03CABCpbar07C(C) FIVCAB07CABCpady02C(C) FIVCAB02Fukuoka(D) FIVFuku本發(fā)明也涉及使用動物模型篩選免疫缺陷病毒(如HIV和FIV)間保守表位的方法，其中所述的表位可用于免疫接種免疫缺陷病毒感染的人或動物。在本方法的一個實施方案中，HIV從HIV感染的病情長期穩(wěn)定患者分離。如本文所用的，術語“病情長期穩(wěn)定”指表現(xiàn)穩(wěn)定的CD4計數(shù)達至少10年，表現(xiàn)低病毒載量(即血漿病毒水平低到RT-PCR檢測不到的水平)并且一般表現(xiàn)很少或沒有病癥的HIV感染患者。制備經(jīng)分離的HIV免疫原并用于免疫接種貓科動物(如家貓)。在本方法的一個實施方案中，用HIV蛋白質(zhì)的肽片段作為免疫原。優(yōu)選地，制備代表全長HIV蛋白質(zhì)的重疊片段用作免疫原。在一個實施方案中，給不同的貓施用肽片段的不同組合以鑒定這樣的片段，其含有針對FIV感染提供最強預防保護的表位。隨后用FIV攻擊免疫接種的貓。預防貓在FIV攻擊時被感染的免疫原包含進化保守的表位并可用作免疫原免疫接種免疫缺陷病毒感染的人、貓科動物和其他哺乳動物。免疫原優(yōu)選地預防貓感染一種以上亞型的FIV。可制備包含進化保守表位的免疫原片段并使用本發(fā)明方法檢測以進一步分離表位。也可對片段測序以確定表位的一級氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，包含用本發(fā)明方法篩選的進化保守表位的免疫原可用于免疫接種感染HIV的人。在本方法的一個實施方案中，用于免疫接種貓的免疫原為HIV p24蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。本發(fā)明也涉及用本發(fā)明方法鑒定的免疫缺陷病毒進化保守表位。
本發(fā)明也涉及這樣的方法，其在人和其他動物中誘導針對包含免疫缺陷病毒(如HIV和FIV)中進化保守表位的免疫原、抗原或病毒的免疫應答。在一個實施方案中，以足夠誘導針對免疫原或抗原和任何呈現(xiàn)免疫原的病毒或細胞的免疫應答的數(shù)量和持續(xù)時間向人或動物施用包含用本文所述方法鑒定的一種或多種免疫缺陷病毒進化保守表位的免疫原或抗原。所誘導的免疫應答可為體液介導或細胞介導或兩者均有。在一個誘導針對HIV免疫應答的實施方案中，給人施用包含從HIV鑒定的進化保守表位的免疫原?？紤]在本發(fā)明范圍之內(nèi)的免疫原包括(但不限于)HIV p24蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。在一個實施方案中，本方法所用的免疫原包括HIV-1UCD1p24蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。
本發(fā)明也涉及預防人和其他動物(如貓)感染免疫缺陷病毒(如HIV和FIV)的方法。在本方法的一個實施方案中，以足以免疫接種人或動物并為人或動物感染免疫缺陷病毒提供某種水平的預防的持續(xù)時間向人或動物施用包含一種或多種用本文所述方法鑒定的免疫缺陷病毒進化保守表位的有效數(shù)量的免疫原或抗原，，。在一個預防HIV感染的實施方案中，用包含從HIV鑒定的進化保守表位的免疫原免疫人?？紤]在本發(fā)明范圍之內(nèi)的免疫原包括(但不限于)HIV p24蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。在一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的免疫原包括HIV-1UCD1p24蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。
免疫原一般通過注射(例如皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射)腸胃外施用。其他適當?shù)氖┯梅绞桨谇换虮莾?nèi)施用。通常給人或其他動物至少施用兩次免疫原，每一次施用之間間隔一周或數(shù)周。然而，也考慮起始和加強施用免疫原的其他方案，并可依賴于醫(yī)生的判斷和接受治療的患者。
可通過本領域熟知的方法制備本發(fā)明的免疫原組合物。例如免疫原一般制備成可注射劑，例如液體溶液或懸浮液。免疫原以與給藥制劑相容并在接受者中治療有效和致免疫的數(shù)量施用。本領域的技術人員容易地確定特定免疫原制劑的最佳劑量和施用方式。
可根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原可與可藥用載體或稀釋劑一起提供。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原與一種或多種增強人或動物針對免疫原的免疫應答的佐劑一起提供。本發(fā)明的免疫原可與本領域已知的任何適當佐劑一起提供和/或施用。
本發(fā)明也涉及這樣的組合物，其包含來源于靈長類動物免疫缺陷病毒的免疫原和貓細胞因子或淋巴因子。免疫原可來源于HIV，這包括HIV-1(例如HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU)和HIV-2。組合物的HIV免疫原包括(但不限于)HIV gp160、gp120、gp41、p24、p31、p17、p7或HIVgag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu或vpx基因編碼的蛋白質(zhì)、或者它們的片段或變體。在一個實施方案中，淋巴因子為貓IL-12、IL-15和或IL-18。在代表性實施方案中，免疫原為HIV-1 p24，淋巴因子為貓IL-18。組合物也可包含佐劑，如本文所述的佐劑之一。
本發(fā)明涉及這樣的試劑盒和給藥制劑，其在一種或多種容器中包含來源于靈長類動物免疫缺陷病毒本發(fā)明的免疫原和貓細胞因子或淋巴因子。免疫原可來源于HIV(例如HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU)和HIV-2。組合物的HIV免疫原包括(但不限于)HIV gp160、gp120、gp41、p24、p31或HIV gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu或vpx基因編碼的蛋白質(zhì)、或者它們的片段或變體。在一個實施方案中，淋巴因子為貓IL-12、IL-15和或IL-18。在代表性實施方案中，免疫原為HIV-1 p24，淋巴因子為貓IL-18。試劑盒和給藥制劑也可包括佐劑，如本文所述的佐劑之一。
本文所涉及或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版物全部整體引入作為參考，但是引用的程度不應使它們與本說明書的明確教導不一致。
下列為描述實施本發(fā)明的方法的實施例。這些實施例不應解釋為限制性的。除非另外注明，所有百分比以重量計，所有溶劑混合比例以體積計。
實施例1四只SPF貓的每一只(n＝4)用HIV-1疫苗制劑A或HIV-1疫苗制劑B以3周間隔免疫四次并在最后一次加強之后三周用15倍貓感染劑量(CID50)體內(nèi)來源的FIVBangston接種物攻擊。另外四只SPF貓(對照組)不接受免疫接種但是類似地用FIV攻擊。HIV-1疫苗制劑A由混合于0.5mlRibi佐劑系統(tǒng)中的200μg HIV-1UCD1p24、25μg HIV-1IIIBgp120(ImmunoDiagnostics Inc.，Woburn，MA)和25μg HIV-1IIIBgp160(ImmunoDiagnostics Inc.)組成，其中所述的Ribi佐劑系統(tǒng)包含含有5μg重組人白細胞介素-12(rHuIL-12)的細胞壁骨架(CWS)組分(每劑25μg細胞壁骨架)(Corixa Corp.，Seattle，WA)。HIV-1疫苗制劑B由混合于含5μgrHuIL-12的0.5ml Ribi佐劑系統(tǒng)CWS組分的200μg HIV-1UCD1p24組成。重組HIV-1UCD1p24用QIAexpress pQE載體(Qiagen Inc.，Valencia，CA)在大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，所表達的6個組氨酸標記的p24產(chǎn)物通過Ni-NTA親和層析(Qiagen Inc.)純化。體內(nèi)來源的FIV接種物由兩只感染FIVBangston的貓的混合血漿組成，使用每對數(shù)稀釋物3-4只SPF貓在體內(nèi)滴定(Pu等人，2001)。
此研究結(jié)果顯示于表1。作為額外的測定FIV感染狀態(tài)的方法，使用逆轉(zhuǎn)錄酶RT測定法和原病毒PCR作為病毒檢測系統(tǒng)進行病毒分離。用HIV-1疫苗制劑A免疫并隨后用FIV攻擊的四只貓中的一只(1/4)和用HIV-1疫苗制劑B免疫并隨后用FIV攻擊的四只貓中的兩只(2/4)通過病毒分離為FIV陰性，并且在攻擊后16周喪失抗FIV p24的抗體和不產(chǎn)生抗FIV gp95的抗體，而剩余的貓產(chǎn)生抗FIV gp95的抗體并產(chǎn)生較強的持續(xù)的抗FIV p24抗體反應。所有四只對照貓在攻擊后16周產(chǎn)生抗FIV p24的抗體和抗gp95的抗體并且在攻擊后13周為病毒分離物陽性。因此，表明HIV-1疫苗制劑B在預防貓受FIV攻擊方面比HIV-1疫苗制劑A(僅有HIV-1 p24)具有更好或相等的效力，這表明HIV-1UCD1p24為可誘導針對FIV攻擊的保護性免疫的疫苗組分。所有用HIV-1疫苗制劑A免疫的四只貓和用HIV-1疫苗制劑B免疫的四只貓中三只在第四次接種之后產(chǎn)生抗FIV p24的交叉反應抗體。
既然在HIV-1接種的表現(xiàn)對FIV保護性免疫應答的貓中沒有抗FIVgp95的交叉反應抗體，那么FIV gp95的抗體的有無分別為動物是否為接種HIV或感染FIV的標志。此外，本研究結(jié)束時接種貓中FIV p24交叉反應抗體的喪失也表示接種的貓是受保護免于FIV攻擊的。
實施例2在隨后的研究中，四只無特異病原體(SPF)貓的每一只用HIV-1/UCD1(HIV-1UCD1)p24或HIV-1/LAV(HIV-1LAV)p24疫苗以每劑250μg免疫，其中疫苗溶于添加有每劑5μg重組人IL-12(rHuIL-12)的1ml Ribi佐劑(每劑25μg CWS(細胞壁骨架))中。另一組三只SPF貓接受無Ribi佐劑或rHuIL-12的HIV-1UCD1p24以評價佐劑的重要性。對照組貓接受Ribi佐劑或PBS。所有的貓以三(3)周間隔免疫接種三(3)次并于最后一次免疫后三周用15 CID50的體內(nèi)來源的FIV-Bangston(FIVBang)攻擊。如表2所示，四只用含佐劑的HIV-1UCD1p24免疫接種的貓中的四只(4/4)在所有四只對照貓攻擊之后感染FIV的劑量下處不受FIV感染。用含佐劑的HIV-1UCD1p24免疫接種的受保護貓在攻擊后54周為FIV感染陰性，因此它們?yōu)橥耆鼙Ｗo的。表2顯示的結(jié)果表明HIV-1UCD1p24疫苗(4只貓中的4只或者100％受保護)比HIV-1LAVp24疫苗(4只貓中的2只或者50％受保護)更有效。接受不含佐劑的HIV-1UCD1p24的組在用FIV攻擊時具有最小的感染保護(3只貓中的1只或者33％受保護)。
實施例3進行另一項研究以確定HIV-1LAVp24疫苗誘導的保護是否為可重復的。在本研究中，三只SPF貓用每劑200μg的HIV-1LAVp24疫苗免疫，其中所述的疫苗在添加每劑5μg rHuIL-12的1ml Ribi佐劑(每劑25μgCWS(細胞壁骨架))中配制。此外，三只SPF貓的每一只用每劑200μg的FIVBangp24或FIV-Petaluma+Shizuoka(FIVPet/Shi)p24疫苗免疫，其中所述的疫苗在添加每劑5μgrHuIL-12的1ml Ribi佐劑(每劑25μgCWS(細胞壁骨架))中配制。FIVPet/Ship24疫苗由溶于添加rHuIL-12的Ribi佐劑中的130μg FIVPetp24和70μgFIVShip24組成。三只對照貓接受佐劑。免疫和攻擊方案(包括攻擊接種物的和劑量)與實施例2所述相同。如表3所示，用HIV-1LAVp24疫苗免疫接種的三只貓中的三只(3/3)受保護所有三只對照貓感染的劑量。用FIVBangp24免疫接種的3只貓中只有1只，用FIVPet/Ship24免疫接種的3只貓中有2只受保護。這些結(jié)果驗證了HIV-1LAVp24疫苗也與FIV疫苗一樣有效。而且，HIV-1 p24疫苗與FIVPet/Ship24疫苗同樣有效并且可能比FIVBangp24疫苗抗FIVBang攻擊更有效。
實施例4進行另一項研究以評價降低p24劑量和改變佐劑的細胞因子添加的影響。三只SPF貓用每劑200μg的HIV-1UCD1p24抗原免疫，其中所述的HIV-1UCD1p24抗原在添加重組貓IL-18(rFeIL-18；5μg/劑量)而非rHuIL-12的1ml Ribi佐劑中配制(每劑25μg CWS(細胞壁骨架))。為確定佐劑中細胞因子添加的影響，另外三只SPF貓用每劑200μg的HIV-1UCD1p24抗原免疫，其中所述的HIV-1UCD1p24抗原在無細胞因子添加的Ribi佐劑(每劑25μg CWS(細胞壁骨架))中配制。作為對照，兩只SPF貓的每一只用添加rFeIL-18的Ribi佐劑、單獨的Ribi佐劑或PBS免疫。除了稍微提高的25CID50攻擊劑量外，免疫和攻擊方案與實施例2和3相同。如表4所示，用在添加rFeIL-18的Ribi佐劑中配制的HIV-1UCD1p24疫苗免疫的三只貓中的兩只(2/3)受保護，而用只有Ribi佐劑配制的HIV-1 p24疫苗免疫接種的三只貓中只有一只(1/3)受保護。所有對照貓在攻擊后5-9周感染。因此，在Ribi/FeIL-18中配制的HIV-1UCD1p24疫苗展示了保護作用(3只貓中的兩只)。此外，表明在Ribi/FeIL-18中配制的HIV-1UCD1p24疫苗比在只有Ribi佐劑(無FeIL-18)中配制的疫苗更有效(2/3受保護的貓對1/3受保護的貓)。
實施例5在另一項研究中，攻擊株從FIVBang(其為A/B亞型)變?yōu)镕IVFC1(其為B亞型)以檢測HIV-1 p24疫苗是否會預防貓感染其他FIV攻擊株。FIVBang具有基團特異性抗原(gag)、聚合酶(pol)和屬于A亞型的被膜(env)基因序列的小部分(V1-V3區(qū)域)，而env基因的大部分(V4-V9區(qū)域)屬于B亞型。因此，F(xiàn)IVBang為A和B亞型的重組體。另一方面，F(xiàn)IVFC1在gag、pol和env處具有B亞型基因序列并且完全為B亞型株。gag由基質(zhì)-核心-核殼體組成并且核心基因為p24基因。因此，HIV-1UCD1和HIV-1LAVp24疫苗預防貓感染具有A亞型p24的FIVBang。此研究檢測HIV-1 p24疫苗是否預防貓感染具有B亞型p24的FIVFC1。
四只SPF貓用每劑200mg的HIV-1UCD1p24免疫，其中所述的HIV-1UCD1p24溶于添加每劑5μg rHuIL-12的1ml Ribi佐劑(每劑25μgCWS(細胞壁骨架))中。為進行比較，另外四(4)只SPF貓用商業(yè)購買的溶于與疫苗一起提供的佐劑中的二元亞型(dual-subtype)FIVPet/Shi疫苗(FEL-O-VAX FIV；Forth Dodge Animal Health，Overland Park，Kansas)免疫。三只對照貓接受PBS免疫。除了FIVFC1的攻擊接種物為15CID50外，免疫和攻擊方案與實施例2和3所述相同。如表5所示的結(jié)果，用HIV-1UCD1p24疫苗免疫的四只貓中的三只(3/4)和所有四只FEL-O-VAXFIV免疫貓受保護于所有三只對照貓感染的劑量。因此，HIV-1 p24疫苗預防貓具有B亞型p24并與FIVBang攻擊株顯著不同的攻擊株(FIVFC1)。
實施例6實施例1到實施例5所述研究的結(jié)果總結(jié)于表6中?？傮w上，用Ribi/rHuIL-12或Ribi/rFeIL-18佐劑中配制的HIV-1UCD1p24疫苗免疫的15只貓中有11只(73.3％)受保護。類似地，用Ribi/rHuIL-12中配制的HIV-1LAVp24免疫的7只貓中有5只(71.4％)受保護。僅用Ribi/rHuIL-12配制的HIV-1 p24的最初免疫分析表明HIV-1UCD1p24疫苗(7/8受保護的貓或者87％受保護)可能比HIV-1LAVp24疫苗(5/7受保護的貓或者71％受保護)更有效。但是，在用溶于Ribi/rHuIL-12或Ribi/rFeIL-18的HIV-1 p24疫苗免疫的22只貓中的16只(72.7％)的綜合總數(shù)(combined total)中觀察到了完全消除性保護(sterilizing protection)，其在保護方面基本高于用FIVp24疫苗免疫后的6只貓中的3只(50％)。
應理解為本文所述的實施例和實施方案僅為描述目的，建議本領域的技術人員在此基礎上進行多種修飾或改變并且，并且這些修飾或改變包括在此申請的精神和范圍，以及附屬權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
表1.HIV-1蛋白質(zhì)對FIVBang攻擊感染的免疫原性和效力(研究1)

Pre＝接種前；V3＝第三次接種后；V4＝第四次接種后。
4、7、10、13、16和18wpc＝FIV攻擊后的4、7、10、13、16和18周。
核心p24和被膜抗體陰性(-/-)(FIV gp95；HIV gp120/160)。
p24抗體陽性但是被膜抗體陰性(+/-)。
核心p24和被膜抗體陽性(+/+)。
H＝抗有高分子量(p70)蛋白質(zhì)抗體但沒有抗FIV被膜(gp95)抗體。
ND＝未測定表2.HIV-1蛋白質(zhì)免疫原性(3X免疫接種)和抗A/B亞型FIVBang攻擊感染(15CID50)的效力(研究2)

Pre＝接種前；V3＝第三次接種后；4、6、9、16、20、48和54wpc＝用FIV-Bang(A/B亞型)體內(nèi)接種物(合并的感染血漿)攻擊后4、6、9、16、20、48和54周。Ribi+IL-12由含每劑25μg細胞壁骨架的Ribi佐劑和每劑5μg人IL-12組成。
FIV免疫印跡中核心p24和被膜(FIV gp95)抗體陰性(-/-)表明仍為FIV感染陰性。FIV免疫印跡中p24抗體陽性但是被膜抗體陰性(+/-)。除非抗p24抗體效價強于以前的效價，接種的貓可能仍為病毒感染陰性。然而，對PBS對照來說，這樣的免疫印跡反應性表明了FIV感染。FIV免疫印跡中核心p24和被膜抗體陽性(+/+)表明在接種組和PBS對照組中FIV感染陽性。
FIV病毒分離陰性(-)和陽性(+)基于RT和PCR。20/54wpc時FIV病毒分離陰性(-/-)代表了20wpc和54wpc時進行的分離。這些動物仍然存活并用于1年的加強攻擊研究。20wpc時FIV病毒分離陽性并由于在20wpc時收獲組織后對動物進行了安樂死而在48wpc未檢測(+/T)。
表3.HIV-1和FIV p24蛋白質(zhì)免疫原性(3x免疫接種)和抗A/B亞型FIVBang攻擊感染(15CID50)的效力(研究3)

Pre＝接種前；V3＝第三次接種后；5、8、10、12、15和18wpc＝用FIV-Bang體內(nèi)接種物(合并的感染血漿)攻擊后5、8、10、12、15和18周。Ribi+IL-12由含每劑25μg細胞壁骨架的Ribi佐劑和每劑μg的人IL-12組成。
FIV免疫印跡中核心p24和被膜(FIV μg95)抗體陰性(-/-)表明仍然未FIV感染陰性。FIV免疫印跡中p24抗體陽性而被膜抗體陰性(+/-)。除非抗p24抗體效價強于以前的效價，接種的貓可能仍為病毒感染陰性。然而，對PBS對照來說，這樣的免疫印跡反應性表明了FIV感染。FIV免疫印跡中核心p24和被膜抗體陽性(+/+)表明在接種組和PBS對照組中FIV感染陽性。
FIV病毒分離陰性(-)和陽性(+)基于RT和PCR。由于對麻醉的反應而在收獲樣品后意外死亡，cat#637缺少FIV免疫印跡和病毒分離(ND＝未進行)。
表4.HIV-1p24蛋白質(zhì)免疫原性(3x免疫接種)和抗A/B亞型FIVBang攻擊感染(25CID50)的效力(研究4)

Pre＝接種前；V3＝第三次接種后；5、7、9和12wpc＝用FIV-Bang(亞型A/B)體內(nèi)接種物(混合感染血漿)攻擊后5、7、9、12、16和19周。Ribi+FeIL-18由含每劑25μg細胞壁骨架的Ribi佐劑和每劑5μg貓IL-18組成。
FIV免疫印跡中核心p24和被膜(FIV gp95)抗體陰性(-/-)表明仍為FIV感染陰性。FIV免疫印跡中p24抗體陽性但是被膜抗體陰性(+/-)。除非抗p24抗體效價強于以前的效價，接種的貓可能仍為病毒感染陰性。然而，對PBS對照來說，這樣的免疫印跡反應性表明了FIV感染。FIV免疫印跡中核心p24和被膜抗體陽性(+/+)表明在接種組和PBS對照組中FIV感染陽性。
FIV病毒分離陰性(-)和陽性(+)基于RT和PCR。
表5.HIV-1p24蛋白質(zhì)的免疫原性(3x免疫接種)和抗B亞型FIVFC1攻擊感染(15CID50)的和效力(研究5)

Pre＝接種前；V3＝第三次接種后；5，7，9和12wpc＝用FIV-FC1(B亞型)體內(nèi)接種物(合并感染血漿)攻擊后5、7、9、12和16周。Ribi+II-12由含每劑25μg細胞壁骨架的Ribi佐劑和每劑5μg人IL-18組成。
FIV免疫印跡中核心p24和被膜(FIV gp95)抗體陰性(-/-)表明仍為FIV感染陰性。FIV免疫印跡中p24抗體陽性但是被膜抗體陰性(+/-)。除非抗p24抗體效價強于以前的效價，接種的貓可能仍為病毒感染陰性。然而，對PBS對照來說，這樣的免疫印跡反應性表明了FIV感染。
FIV免疫印跡中核心p24和被膜抗體陽性(+/±)表明Fel-O-Vax FIV組中抗體來自疫苗，并且這些貓未感染。
FIV免疫印跡中核心p24和被膜抗體陽性(+/+)表明在接種組和PBS對照組中FIV感染陽性。
FIV病毒分離陰性(-)和陽性(+)基于RT和PCR。
表6.總結(jié)表

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1.抑制或預防貓科動物感染貓免疫缺陷病毒(FIV)的方法，所述方法包括給所述動物施用有效數(shù)量的來源于靈長類動物免疫缺陷病毒的免疫原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述靈長類動物免疫缺陷病毒為人免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述HIV為HIV-1或HIV-2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述HIV-1選自HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原為病毒感染的細胞或無細胞全病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒以滅活或減毒病毒的方式處理或者該病毒為復制缺陷。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述病毒通過多聚甲醛、福爾馬林、苯酚、紫外線或高溫處理滅活或減毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原為所述靈長類動物免疫缺陷病毒的多肽或其免疫原性片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述多肽由所述靈長類動物免疫缺陷病毒的env、gag、pol、tat、rev、vif、vpr、vpu或nef基因編碼。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述多肽為選自gp120和gp160的包膜蛋白或其免疫原性片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述多肽為包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO5所示氨基酸序列的HIV包膜蛋白或其免疫原性片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述多肽為HIV的p24蛋白質(zhì)或其免疫原性片段或者SIV的p27蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述p24蛋白質(zhì)為HIV-1UCD1的p24蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原為包含靈長類動物免疫缺陷病毒多核苷酸序列的重組病毒或重組表達構(gòu)建體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述多核苷酸序列為HIV-1、HIV-2或SIV序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述多核苷酸序列包含所述靈長類動物免疫缺陷病毒的一個或多個env、gag、pol、tat、rev、vif、vpr、vpu或nef基因或其免疫原性片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述多核苷酸序列編碼HIV gp160、gp120、gp41、p31、p24、p17或p7多肽或者其免疫原性片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括在施用來源于所述靈長類動物免疫缺陷病毒的所述免疫原后施用有效數(shù)量的來源于貓免疫缺陷病毒(FIV)的免疫原。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原與可藥用載體或稀釋劑一起提供或施用。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原與一種或多種增強所述動物對該免疫原免疫應答的佐劑一起提供或施用。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原經(jīng)皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、口腔施用或由鼻內(nèi)施用。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述佐劑選自蘇氨酰胞壁酰二肽(MDP)、包含細胞壁骨架(CWS)的Ribi佐劑系統(tǒng)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鋁、氫氧化鋁和皂苷。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原與細胞因子或淋巴因子組合施用。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述細胞因子或淋巴因子為貓細胞因子或淋巴因子。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原與白細胞介素-12、白細胞介素-15或白細胞介素-18組合施用。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原包含靈長類動物免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)的免疫原性或抗原性肽。
27.在貓科動物中抑制或產(chǎn)生針對FIV的免疫應答的方法，該方法包括給所述動物施用有效數(shù)量的來源于靈長類動物免疫缺陷病毒的免疫原。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述靈長類動物免疫缺陷病毒為人免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述HIV為HIV-1或HIV-2。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述HIV-1選自HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原為病毒感染的細胞或無細胞全病毒。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述病毒以滅活或減毒病毒的方式處理或者該病毒為復制缺陷。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述病毒通過用多聚甲醛、福爾馬林、紫外線和高溫處理滅活或減毒。
34.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原為所述靈長類動物免疫缺陷病毒的多肽或者其免疫原性片段。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述多肽由所述靈長類動物免疫缺陷病毒的env、gag、pol、tat、rev、vif、vpr、vpu或nef基因編碼。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述多肽為選自gp120和gp160的包膜蛋白或其免疫原性片段。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述多肽為HIV的p24蛋白質(zhì)或者其免疫原性片段，或者為SIV的p27蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述p24蛋白質(zhì)為HIV-1UCD1的p24蛋白質(zhì)。
39.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原為包含靈長類動物免疫缺陷病毒多核苷酸序列的重組病毒或重組表達構(gòu)建體。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述多肽序列為HIV-1、HIV-2或SIV序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述多核苷酸序列包含該靈長類動物免疫缺陷病毒的一個或多個env、gag、pol、tat、rev、vif、vpr、vpu或nef基因或者其免疫原性片段。
42.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述多核苷酸序列編碼HIV gp160、gp120、gp41、p31、p24、p17或p7多肽或者其免疫原性片段。
43.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述方法還包含在施用來源于所述靈長類動物免疫缺陷病毒的所述免疫原后施用有效數(shù)量的來源于貓免疫缺陷病毒(FIV)的免疫原。
44.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原與可藥用載體或稀釋劑一起提供或施用。
45.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原與一種或多種增強所述動物對該免疫原免疫應答的佐劑一起提供或施用。
46.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原經(jīng)皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、口腔施用或由鼻內(nèi)施用。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述佐劑選自蘇氨酰胞壁酰二肽(MDP)、包括細胞壁骨架(CWS)的Ribi佐劑系統(tǒng)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鋁、氫氧化鋁和皂苷。
48.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原與細胞因子或淋巴因子組合施用。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述細胞因子或淋巴因子為貓細胞因子或淋巴因子。
50.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述與白細胞介素-12、白細胞介素-15或白細胞介素-18組合施用。
51.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原包含靈長類動物免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)的免疫原性或抗原性肽。
52.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫應答為細胞免疫應答。
53.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫應答為體液免疫應答。
54.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫原誘導T-輔助細胞因子和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)細胞毒素的產(chǎn)生。
55.篩選病毒蛋白質(zhì)表位的方法，其中所述表位在HIV和FIV間進化保守，該方法包括a)從感染所述HIV的長期病情穩(wěn)定患者中分離HIV；b)用來源于所述HIV的免疫原免疫接種貓科動物；c)用感染性FIV攻擊該貓科動物；d)確定該貓科動物是否預防感染所述FIV，其中預防該貓科動物感染的免疫原為包含所述HIV和FIV間進化保守表位的免疫原的標志。
56.組合物，其包含來源于靈長類動物免疫缺陷病毒的免疫原和貓細胞因子或淋巴因子。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的組合物，其中所述貓淋巴因子為白細胞介素。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述白細胞介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21和IL-22。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述白細胞介素選自IL-12、IL-15和IL-18。
60.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述靈長類動物免疫缺陷病毒為HIV或FIV。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的組合物，其中所述HIV為HIV-1或HIV-2。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的組合物，其中所述HIV-1病毒選自HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU。
63.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述免疫原包含HIV env、pol、gag、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因的多核苷酸序列。
64.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述免疫原包含HIV的gp160、gp120、gp41、p31、p24、p17或p7多肽或其免疫原性片段。
65.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中所述免疫原為HIV p24多肽或其免疫原性片段，并且所述白細胞介素選自貓IL-12、IL-15和IL-18。
66.試劑盒，其在一個或多個容器中包含a)來源于靈長類動物免疫缺陷病毒的免疫原；和b)貓細胞因子或淋巴因子。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的試劑盒，其中所述貓淋巴因子為白細胞介素。
68.根據(jù)權(quán)利要求66的試劑盒，其中所述白細胞介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21和IL-22。
69.根據(jù)權(quán)利要求66的試劑盒，其中所述白細胞介素選自IL-12、IL-15和IL-18。
70.根據(jù)權(quán)利要求66的試劑盒，其中所述靈長類動物免疫缺陷病毒為HIV或FIV。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的試劑盒，其中所述HIV為HIV-1或HIV-2。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述HIV-1病毒選自HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU。
73.根據(jù)權(quán)利要求66的試劑盒，其中所述免疫原包含HIV env、pol、gag、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因的多核苷酸序列。
74.根據(jù)權(quán)利要求66的試劑盒，其中所述免疫原包含HIV的gp160、gp120、gp41、p31、p24、p17或p7多肽或者其免疫原性片段。
75.根據(jù)權(quán)利要求66的試劑盒，其中所述免疫原為HIV p24多肽或其免疫原性片段，并且所述白細胞介素選自貓IL-12、IL-15和IL-18。
76.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原誘導T-輔助細胞因子和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)細胞毒素的產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用來源于靈長類動物免疫缺陷病毒(包括HIV和SIV)的免疫原預防貓科動物感染FIV的方法和組合物。描述了用受試疫苗組合物接種貓科動物的方法。在用FIV攻擊時，根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物接種的貓科動物表現(xiàn)出針對FIV的保護性體液和細胞免疫應答。
文檔編號C07K14/155GK1812810SQ200480018243
公開日2006年8月2日 申請日期2004年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月12日
發(fā)明者J·K·亞馬莫托 申請人:佛羅里達大學研究基金公司