本發(fā)明涉及手性高效液相色譜(hplc)柱材料的制備及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精(β-cd-d2)hplc手性柱材料的制備及應(yīng)用，即將β-cd-d2制備成高效液相色譜(hplc)手性柱的方法及對手性藥物對映異構(gòu)體的拆分研究和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高效液相色譜拆分手性藥物中的光學(xué)異構(gòu)體主要由試樣和固定相之間的相互作用力來決定的，合成衍生出新型、耐用、高效的手性固定相是液相色譜手性拆分的重點工作之一。在拆分過程中，通過引入這些固定相來營造手性環(huán)境，通過這些固定相帶來的包含作用、氫鍵作用、π-π共軛等實現(xiàn)對手性對映異構(gòu)體的拆分。在hplc手性拆分中，環(huán)糊精類手性固定相因為一些自身的優(yōu)良特性得到較多重視和研究。環(huán)糊精(cd)是環(huán)狀分子，具有疏水空腔和腔外親水的羥基結(jié)構(gòu)，α、β、γ-環(huán)糊精依次含6到8個葡萄糖分子。環(huán)糊精的疏水空腔能與許多含有苯、萘等疏水基團的分子發(fā)生包含作用，又因為環(huán)糊精分子上擁有多個手性中心，還能與一些含有大基團的分子有空間位阻效應(yīng)，這些都使得環(huán)糊精擁有較強的手性識別能力。除此之外cd在水溶液中的溶解性較好、無毒害、對環(huán)境友好、無紫外吸收，不會對檢測結(jié)果進行干擾。

在分析化學(xué)中，人們利用cd良好的選擇識別能力分離各種手性物質(zhì)，特別是修飾改性后的cd具有一些比母體cd更優(yōu)異的性能。xinxinhan對早期一系列環(huán)糊精衍生物作為手性固定相的手性拆分能力進行過比較。用多種環(huán)糊精的手性衍生物對30種手性呋喃的衍生物進行了手性拆分，而天然的β-cd對這些手性呋喃類化合物沒有拆分效果，其中s-萘乙氨基甲酸酯基和3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯β-cd只能對其中少部分的化合物進行拆分。近年來，不斷有新的β-cd衍生物出現(xiàn)，chunlin等首先通過staudinger反應(yīng)將兩種環(huán)糊精衍生物通過多個尿素與硅膠基質(zhì)相連接，這兩種環(huán)糊精衍生物不同之處在于一個含有甲基氨基甲酰，另一個含有氯苯基氨基甲酰，對藥物的保留行為和流動相的影響做了探究，對兩種不同固定相的拆分機制做了闡釋。litaowang首次制備了β-cd-二氧化硅球型手性固定相，同時引入了乙烷基、三嗪基和3,5-二甲基苯基等多個官能團，提供了多個作用位點，還提供了類似于凝膠色譜的分子通道，能夠進行非手性藥物的分離，也可實現(xiàn)手性對映體的拆分，還有陰離子交換等特性，功能多樣。最近的文獻報道中，jiezhao用點擊化學(xué)的方法制備了苯基氨基甲酰雙層β-cd手性固定相。用這種雙層β-cd固定相對異惡唑啉、芐氟噻嗪、吲哚洛芬、阿托品、氧化苯乙烯和丹酰基氨基酸在反相色譜模式下都實現(xiàn)了基線分離，其中1-(3-(4-硝基-苯基)-4,5-二氫異惡唑-5-基)吡咯烷-2-酮(4nph-opr)的選擇系數(shù)達到5.25，分離度達到13.97。

高效液相色譜所取得的成就與固定相制備填裝技術(shù)的提高密不可分，現(xiàn)在固定相的填充方法較為多樣，主要分為密度法、粘度法、干法和勻漿法。

平衡密度法：因為硅膠的制作方法不一樣，硅膠的密度有差異。需要選擇與硅膠密度相近的溶劑與之混合，經(jīng)常使用的是鹵代烷烴，適當加入其它溶劑混合配置出密度適宜的混合液，避免基質(zhì)顆粒大小不一引起的分級沉降。但是鹵代烷烴的使用會造成基線難以平衡，譜圖的對稱性不佳，且毒性較大。

平衡粘度法：是采用諸如聚乙二醇、乙二醇、甘油之類的高粘度試劑，然后混合配制高粘度勻漿液，從而有效地阻止顆粒的沉降。但是，用這類高粘度勻漿液填充的話，壓力很大，必須有更高的裝柱壓力，對泵的要求很高，而且裝填時間很長。最后裝填好的色譜柱的柱效也不高，色譜峰的對稱性也差，所以很少人使用這種方法。

干法：將制備好的固定相填料依次裝入空管中，同時需要震動和旋轉(zhuǎn)。柱頭和柱尾分別連接氮氣和真空泵可以使柱效能有一定的提升，然后用溶劑高速流過色譜柱數(shù)小時。此過程要反復(fù)多次以確保色譜柱的裝填沒有空隙，比較適合粒徑大于20μm的填料。但是干法填裝還是會使填料附著在內(nèi)壁上，且會因為強烈的靜電作用導(dǎo)致相互排斥，色譜柱難以填充得均勻緊密。

勻漿法：對于粒徑小于20μm的填料，會因為靜電荷的作用而有很高的表面能，在干燥狀態(tài)下會粘連在一起，所以對于小粒徑的色譜填料需要選擇一種合適的溶劑或者是幾種溶劑的混合液作為分散液，常用的分散液有甲苯異丙醇(90/10)(v/v)，丙酮異丙醇(50/50)(v/v)，四氯化碳甲醇(95/5)(v/v)，三氯甲烷甲醇(50/50)(v/v)。然后經(jīng)超聲處理，使填料高度分散，形成勻漿液，然后再用高壓泵，用頂替液快速將填料填充到色譜柱里，得到均勻緊密的柱床。

本申請人將雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精(縮寫β-cd-d2)用于高效液相色譜領(lǐng)域，與硅膠基質(zhì)鍵合后，作為手性柱材料用于多種手性對映體的拆分。首先將衍生物合成后用多種分析儀器對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進了表征確認，再將產(chǎn)物與硅膠基質(zhì)相鍵合，對得到的β-環(huán)糊精衍生物手性固定相填料，用掃描電鏡和透射電鏡對其表征確認，再用勻漿法制備色譜柱。該色譜柱用于沙美特羅、西替利嗪、丙卡特羅、特布他林的手性拆分，得到了這幾種β-腎上腺激動劑以及拉米夫定、頭孢呋辛和頭孢曲松對映體拆分的最佳高效液相色譜分離條件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種新型手性高效液相色譜(hplc)柱材料的制備及應(yīng)用技術(shù)，具體涉及了一種雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精(縮寫β-cd-d2)手性hplc柱材料的制備及應(yīng)用，即將β-cd-d2制備成高效液相色譜(hplc)手性柱的方法及對手性藥物對映異構(gòu)體的拆分研究。這些工作是基于以下步驟進行：(1)、用β-cd-d2構(gòu)建手性環(huán)境，與高效液相色譜硅珠(全多孔球形硅膠基質(zhì))鍵合成固定相填料，進而制備成手性柱，應(yīng)用于高效液相色譜(hplc)中。(2)、通過適當?shù)谋碚魇侄螌ふ沂中蕴盍现苽涞淖罴雅浞郊胺磻?yīng)。(3)用所制得的β-cd-d2手性柱可建立沙美特羅單一對映體的制備方法。(4)用所制得的β-cd-d2手性柱可拆分藥物，建立了沙美特羅、特布他林、丙卡特羅、西替利嗪、拉米夫定、頭孢呋辛和頭孢曲松等手性藥物的對映體拆分和定量分析方法，部分手性藥物可通過該手性柱制備獲得單一對映體。

本發(fā)明將雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精用于高效液相色譜(hplc)領(lǐng)域，將其與硅膠基質(zhì)鍵合后，作為柱材料制備手性hplc柱，用于多種手性對映體的拆分。首先將衍生物合成后用紫外和紅外對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進了確認表征，對該衍生物以前未進行的熒光特性和xrd粉末衍射特性也進行了表征。將產(chǎn)物與硅膠基質(zhì)相鍵合，對得到的β-環(huán)糊精衍生物手性固定相填料，用掃描電鏡和透射電鏡對其表征確認和篩選，再用勻漿法制備色譜柱。該色譜柱用于沙美特羅、特布他林、丙卡特羅、西替利嗪的手性拆分，得到了這幾種β-腎上腺激動劑的最佳高效液相色譜分離條件，建立了相關(guān)單一對映體的制備或定量分析方法。獲得了對拉米夫定、頭孢呋辛和頭孢曲松等多種手性物質(zhì)的理想拆分效果：本發(fā)明利用雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精制成手性固定相填料，可建立多種手性物質(zhì)單一對映體的hplc拆分及定性定量檢測新方法。結(jié)果顯示此種制備hplc柱的方法是有效的，可成功地將β-cd-d2鍵合到硅膠基質(zhì)上，再填充至hplc柱內(nèi)，也進一步表明此種hplc柱制備法是可行的。用上述β-環(huán)糊精衍生物制備手性hplc柱的方法是有創(chuàng)新性的工作，在hplc手性固定相中運用的相關(guān)工作也是有創(chuàng)新性的。

經(jīng)中科院武漢科技查新咨詢檢索中心出具查新報告顯示，未見文獻報道。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在于：

1、首次用β-環(huán)糊精衍生物作為手性固定相對沙美特羅、丙卡特羅、拉米夫定進行手性拆分，未見文獻報道，該技術(shù)彌補了這一領(lǐng)域的空白。

2、提供了一種新型β-環(huán)糊精衍生物的高效液相色譜柱填料，確定了用雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精作為手性選擇劑，制備手性hplc柱的方法，拓展了這一物質(zhì)的應(yīng)用范圍。

3、用雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精衍生物制成的制備型手性hplc柱從消旋體中可得到純化的d(+)-沙美特羅和l(-)-沙美特羅單一對映體純品，為沙美特羅單一對映體制備提供了一種新方法。

4、在雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精衍生物手性hplc柱上獲得了可分離沙美特羅、特布他林、丙卡特羅、西替利嗪、拉米夫定、頭孢呋辛和頭孢曲松等手性物質(zhì)的分離條件，在最佳條件下均可實現(xiàn)基線分離，據(jù)此可建立多種手性物質(zhì)單一對映體hplc定量測定新方法。

附圖說明

圖1：β-cd-d2的紫外掃描(uv)圖譜；

圖2a：β-cd的紅外掃描(ir)圖譜；

圖2b：β-cd-a2的紅外掃描(ir)圖譜；

圖2c：β-cd-d2的紅外掃描(ir)圖譜；

圖3：β-cd，β-cd-a2，β-cd-d2的液體熒光掃描圖譜；

圖4：β-cd，β-cd-a2，β-cd-d2的粉末固體熒光掃描圖譜；

圖5a：β-cd的x射線粉末衍射(xrd)圖；

圖5b：β-cd-a2的x射線粉末衍射(xrd)圖；

圖5c：β-cd-d2的x射線粉末衍射(xrd)圖；

圖6a：β-cd-d2鍵合硅膠固定相填料在1μm時透射電鏡掃描圖；

圖6b：裸硅膠基質(zhì)在1μm時透射電鏡掃描圖；

圖6c：β-cd-d2鍵合硅膠固定相填料在2μm時透射電鏡掃描圖；

圖6d：裸硅膠基質(zhì)在2μm時透射電鏡掃描圖；

圖7a：β-cd-d2鍵合硅膠放大15000倍掃描電鏡圖；

圖7b：β-cd-d2鍵合硅膠放大7000倍掃描電鏡圖；

圖7c：β-cd-d2鍵合硅膠放大5000倍掃描電鏡圖；

圖7d：β-cd-d2鍵合硅膠放大1500倍掃描電鏡圖；

圖7e：裸硅膠基質(zhì)放大25000倍掃描電鏡圖；

圖7f：裸硅膠基質(zhì)放大10000倍掃描電鏡圖；

圖7g：裸硅膠基質(zhì)放大1300倍掃描電鏡圖；

圖7h：板結(jié)的β-cd-d2鍵合硅膠放大9000倍掃描電鏡圖；

圖7l：板結(jié)的β-cd-d2鍵合硅膠放大4000倍掃描電鏡圖；

圖8：由β-cd-d2鍵合硅膠hplc手性柱拆分沙美特羅標準品與溶劑的對照實驗；

圖9：由β-cd-d2鍵合硅膠hplc手性柱制備沙美特羅兩對映異構(gòu)體hplc圖；

圖10：由β-cd-d2鍵合硅膠hplc手性柱制備所得左旋沙美特羅單一對映體的圓二色譜圖；

圖11a：特布他林拆分hplc圖；

圖11b：特布他林拆分溶劑對比hplc圖；

圖12a：丙卡特羅拆分hplc圖；

圖12b：丙卡特羅拆分溶劑對比hplc圖；

圖13a：拉米夫定拆分hplc圖；

圖13b：拉米夫定拆分溶劑對比hplc圖

圖14：西替利嗪拆分hplc圖；

圖15：頭孢呋辛拆分hplc圖；

圖16：頭孢曲松拆分hplc圖。

具體實施方式

下面申請人將結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明的新手性hplc柱的制備和應(yīng)用過程做詳細說明，目的在于使本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明有更進一步的理解。

實施例1：雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精(β-cd-d2)的制備

依據(jù)文獻(丁志剛，任維衡，習(xí)玲玲等，β-環(huán)糊精衍生物的合成及對脲酶的抑制作用.催化化學(xué)，1996，6(17)：567-569.)制得β-cd-d2后，用紫外、紅外光譜、熒光和xrd等手段確定是所要目標化合物。

具體做法：先將馬來酸酐和β-cd(摩爾比15:1)置于恒溫水浴80℃反應(yīng)8小時，停止反應(yīng)，后處理得粉末狀產(chǎn)物即為β-cd-馬來酸酐(簡稱β-cd-a2)，置于干燥器中備用。將β-cd-a2和氯乙酸(摩爾比1:4)置于錐形瓶中，在80℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)8小時，取出冷卻至室溫，后處理得白色粉末狀產(chǎn)物即為β-cd-d2。

具體反應(yīng)過程如下所示:

1、紫外掃描(uv)圖譜

圖1中的所有化合物均以超純水為溶劑，濃度為1.0×10^-6mol/l。a為β-cd，在近紫外光區(qū)沒有吸收，是因為β-cd只有碳-碳單鍵，碳-氧單鍵，有不飽和鍵，發(fā)生的是σ-σ^*，n-σ的躍遷，需要較高能量，吸收波長在遠紫外光區(qū)。b為β-cd-a2，因為馬來酸酐的引入，有了碳碳雙鍵，碳氧雙鍵，且有π-π共軛效應(yīng)，所以在230nm處有強吸收。c為β-cd-d2，其中的碳碳雙鍵被破壞，π-π共軛效應(yīng)消失，所以210nm處出現(xiàn)酯基和羧基的特征弱吸收。紫外光譜的譜圖初步說明得到了目標產(chǎn)物。

2、紅外掃描(ir)圖譜

圖2b(β-cd-a2的ir圖)與圖2a(β-cd的ir圖)相比較明顯多出了1725cm^-1處的c＝o的伸縮振動峰，1640cm^-1處的c＝c的伸縮振動峰，且c＝o與c＝c共軛，譜帶強度增大。1157cm^-1，1220cm^-1處有c-o-c的伸縮振動譜帶，說明馬來酸酐接在了β-環(huán)糊精上。圖2c(β-cd-d2的ir圖)與圖2b相比較，依然有1725cm^-1處的c＝o的伸縮振動峰，但是因為沒有c＝c，沒法形成共軛，譜帶強度明顯減弱，進一步說明最終產(chǎn)物合成成功。

3、熒光光譜

圖3中a、b、c分別為β-cd、β-cd-a2、β-cd-d2對應(yīng)的液體熒光掃描圖譜，β-cd、β-cd-a2、β-cd-d2都以超純水為溶劑，濃度均為1.0×10^-6mol/l。可看出在水溶液中3種物質(zhì)結(jié)構(gòu)上的共軛差異無法體現(xiàn)出來，所得最大熒光發(fā)射波長峰都在274nm附近，說明溶液中主要以β-cd環(huán)產(chǎn)生的發(fā)射波長為主導(dǎo)。

圖4中a、b、c分別為β-cd、β-cd-a2、β-cd-d2對應(yīng)的固體熒光掃描圖譜；固體粉末狀時三種結(jié)構(gòu)的物質(zhì)產(chǎn)生的共軛體系有差異，故而能看出在298nm激發(fā)波長的照射下得出了不同的發(fā)射波長掃描圖。

4、x射線粉末衍射(xrd)圖

圖譜5b較譜圖5a的銳利衍射峰明顯增加，響應(yīng)增強，這可能是因為馬來酸酐引入后，雙鍵使β-cd環(huán)糊精的剛性結(jié)構(gòu)增強，分子更加有序。當雙鍵破壞以后，圖譜5c中的銳利衍射峰減少。說明β-cd、中間產(chǎn)物β-cd-a2以及最終產(chǎn)物β-cd-d2的結(jié)構(gòu)有一定差異，進一步說明產(chǎn)物合成成功。

實施例2β-cd-d2手性hplc柱的制備

用實施例1合成的手性分離材料——雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精(β-cd-d2)作為hplc手性選擇劑，制備手性hplc柱填料，進而制備高效液相色譜hplc柱，用透射電鏡和掃描電鏡，可確認填料制備的優(yōu)劣。

1、高效液相色譜柱填料的制備方法

制備方法為：先將商用粒徑5μm的硅珠(全多孔球形硅膠基質(zhì))酸化，干燥后備用；β-cd-d2在交聯(lián)劑γ-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(β-cd-d2與交聯(lián)劑摩爾比5:1)存在下、n2氛圍中，加入已處理好的全多孔球形硅膠(本實施例β-cd-d2與全多孔球形硅膠質(zhì)量比為1:2)，100℃條件下攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)完全后過濾、洗滌、干燥，備用。

2、手性hplc柱填料的表征

把制備好的手性hplc柱填料先用透射電子顯微鏡觀察顯示明顯較未反應(yīng)的裸硅膠基質(zhì)顆粒大，再用場發(fā)射掃描電鏡(zeisssigma)掃描表征，掃描結(jié)果如圖6、圖7所示。

從圖6可見：a、c分別是β-cd-d2固定相填料顆粒在透射電鏡放大到1μm、2μm時的表征圖譜，b、d為裸硅膠基質(zhì)在透射電鏡放大到1μm、2μm時的圖譜，可以看出鍵合β-cd-d2后的硅膠直徑比未鍵合的硅膠明顯增大。

由圖7可知，a、b、c、d分別是β-cd-d2鍵合硅膠放大15000倍、7000倍、5000倍、1500倍的掃描電鏡譜圖，e、f、g是裸硅珠放大25000倍、10000倍、1300倍的掃描電鏡譜圖，可以清楚看到裸硅膠基質(zhì)表面光滑(如e、f、g所示)，即使放大25000倍也是光滑的，而鍵合后的硅膠基質(zhì)被β-cd-d2均勻包裹，理想鍵合反應(yīng)后硅膠表面呈現(xiàn)出均勻的層狀物質(zhì)，與反應(yīng)條件控制不佳的h、l(β-cd-d2與全多孔球形硅膠質(zhì)量比1.7:1)中發(fā)生板結(jié)情況的硅膠基質(zhì)完全不同，這也是保證高柱效的前提。

3、固定相的裝填

采用勻漿法進行裝填，高壓泵一次填裝進各種規(guī)格液相色譜不銹鋼空柱當中，沖洗，甲醇飽和。

通過uv、ir、熒光和xrd對β-cd-d2的合成進行了表征，用tem，sem對β-cd-d2hplc固定相填料鍵合前后的硅膠基質(zhì)進行了表征，達到預(yù)期目標。用勻漿法制得了β-cd-d2手性固定相高效液相色譜柱。

4、所用的儀器與試劑分別為：

pelambdabio35紫外-可見分光光度計(美國)；nexus470型智能傅立葉紅外光譜儀(美國thermonicolet公司)；vgmultilab2000光電子能譜儀(美國)；tecnaig²20s-twin透射電子顯微鏡(捷克)；hitachisu8010型掃描電子顯微鏡(日本)；酸度計(上海偉業(yè)，phs-3c型)；β-環(huán)糊精(國藥集團)；順丁烯二酸酐(國藥集團)；氯乙酸(天津市亞麗區(qū)天大化學(xué)試劑)；全多孔球形硅膠(蘭州化物所)。

實施例3用實施例2制備的手性雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精手性hplc柱分離手性藥物

將雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精制備成β-cd-d2手性固定相填料，進而裝填為高效液相色譜柱用于手性物質(zhì)的拆分，可建立分離沙美特羅、特布他林、丙卡特羅、拉米夫定、西替利嗪、頭孢呋辛和頭孢曲松7種手性藥物的對映體拆分和定量分析方法，還可通過該手性柱制備獲得沙美特羅單一對映體，據(jù)此可建立多種手性物質(zhì)單一對映體hplc定量測定新方法。

1、主要儀器及試劑

thermoultimate3000(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，lc-15c島津高效液相色譜儀(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)，依利特液相色譜儀(分析型p230ⅱ,制備型p270)；紫外檢測器(分析型uv230，ⅱ制備型uv230+)，as3120超聲波清洗器(寧波科生儀器廠)，zd-2型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)，cj-1型電磁攪拌器(上海華光儀器儀表廠)，溶劑過濾器(上海津騰有限公司)，0.2μm微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)，100μl微量進樣器(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)，bp211d電子分析天平(sartorius)，乙腈(ar，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，磷酸二氫鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，三乙胺(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，超純水(美國moleculer超純水機生產(chǎn))，沙美特羅替卡松粉吸入劑(葛蘭素史克公司)，沙美特羅標準品(中國食品藥品檢定研究院)特布他林標準品(中國食品藥品檢定研究院)，丙卡特羅標準品(中國食品藥品檢定研究院)。拉米夫定對映體混合物(中國食品藥品檢定研究所)，西替利嗪(中國藥檢所)。

市售舒利迭沙美特羅替卡松粉吸入劑每吸(泡)內(nèi)含50微克沙美特羅(昔萘酸鹽形式)和250微克丙酸氟替卡松。用甲醇溶劑制得沙美特羅溶液樣品1.1×10^-4mol/l作為原液，實驗過程中根據(jù)需要稀釋到不同濃度進行使用。每次進樣前均由0.22μm的有機系濾膜過濾。

標準樣品為昔萘酸沙美特羅化學(xué)對照品，用甲醇溶劑制得沙美特羅標準品溶液1.3×10^-3mol/l作為原液，實驗過程中根據(jù)需要稀釋到不同濃度進行使用。每次進樣前均由0.22μm的有機系濾膜過濾。

2、沙美特羅的分離

采用按照實施例2制備的β-cd-d2手性hplc柱(柱尺寸150mm×φ4.6mm)，用hplc儀對沙美特羅進行了手性拆分，最佳條件為：緩沖液磷酸二氫鈉-三乙胺和乙腈為流動相，緩沖液ph值9.2，緩沖液濃度為0.5mmol/l，v(緩沖液)：v(乙腈)＝65:35，沙美特羅濃度1.1×10^-4mol/l，流速0.5ml/min，進樣量20ul，檢測波長254nm，溫度20?！娣蛛x度rs為2.88，如圖8a所示，實現(xiàn)了基線分離，沙美特羅濃度在1.325×10^-5mol/l～2.650×10^-4mol/l范圍左旋和右旋沙美特羅兩對映體與峰高和峰面積均有線性相關(guān)性，前峰峰高-濃度標準曲線方程為y＝0.08469x-0.3713(r＝0.9901),前峰峰面積-濃度標準曲線方程為y＝15.005x-71.46(r＝0.9995)；后峰峰高-濃度標準曲線方程為y＝0.9979+2.726x(r＝0.9956)，后峰峰面積-濃度標準曲線方程為y＝1.031×103x-3.550×10²(r＝0.9997)。重復(fù)進樣7次，兩峰峰高峰面積rsd均在10％以內(nèi)。經(jīng)驗證溶劑甲醇對實驗無影響，如圖8b所示。沙美特羅兩對映體洗脫強度大，峰形對稱，出峰時間短，本實驗建立了一種新的沙美特羅兩對映體的拆分檢測方法，在圖9條件(流動相體積比為v(緩沖液)：v(乙腈)＝85:15，其余條件同前。)下制備(柱尺寸150mm×φ10mm，將該柱用于進樣體積為10ml的制備型hplc儀。)收集前后峰與溶劑的混合溶液測定圓二色譜，確定后峰為左旋沙美特羅單一對映體，如圖10所示。

3、特布他林的分離

特布他林(1.98×10^-3mol/l，溶劑為超純水，進樣體積20μl)在β-cd-d2制備的手性柱(柱尺寸150mm×φ4.6mm)上拆分最佳條件為，緩沖液檸檬酸-三乙胺，ph值為3.5，檸檬酸濃度26.1mmol/l，流動相由緩沖液檸檬酸-三乙胺、四氫呋喃和乙腈按照65:10:25(v:v:v)的比例組成，流速0.5ml/min，柱溫25?！娣蛛x度rs達到3.51，實現(xiàn)了基線分離，如圖11a所示，確定了溶劑峰無干擾，如圖11b所示。且重復(fù)進樣7次，各組分的相關(guān)參數(shù)rsd均在6.24％以內(nèi)，特布他林消旋體濃度在9.9×10^-5mol/l-3.96×10^-4mol/l的濃度范圍內(nèi)，具有線性相關(guān)性，前峰峰高-濃度標準曲線方程為y＝0.7577+10.978x，線性相關(guān)系數(shù)r＝0.9976，前峰峰面積-濃度標準曲線方程為y＝-0.01257+0.5811x，線性相關(guān)系數(shù)r＝0.9970；后峰峰高-濃度標準曲線方程為y＝2.846+3.304x，線性相關(guān)系數(shù)r＝0.9808，后峰峰面積-濃度標準曲線方程為y＝0.07912+0.3099x，線性相關(guān)系數(shù)r＝0.9948。用峰面積定量，特布他林兩對映體的線性相關(guān)系數(shù)可達到0.99以上。

4、丙卡特羅的分離

用β-cd-d2手性hplc柱(柱尺寸150mm×φ4.6mm)對丙卡特羅標準品(1.70×10^-4mol/l，溶劑為超純水，進樣體積20μl)，在反相模式下進行了手性拆分，成功分離了丙卡特羅(r,r/s)和(s,r/s)光學(xué)異構(gòu)體，并對分離條件進行了優(yōu)化，最大分離度rs達到6.61(流動相配比v甲醇:v異丙醇：v緩沖液＝80：15:5，緩沖液ph值為8.7，磷酸二氫鈉-三乙胺緩沖液中磷酸二氫鈉濃度為5mmol/l，溫度為20，℃檢測波長為280nm，流動相流速1.2ml/min)，如圖12a所示。重復(fù)進樣9次，兩對映體即前后峰的各項色譜參數(shù)rsd均在6.45％以下，丙卡特羅標準品在3.51×10^-5mol/l到1.79×10^-3mol/l濃度范圍內(nèi)前后峰峰高、峰面積與濃度有線性相關(guān)性，前峰峰高-濃度標準曲線方程為y＝-5.6887+16.6883x(r＝0.9914)，前峰峰面積-濃度標準曲線方程為y＝-24.7230+25.4066x(r＝0.9977)，后峰峰高-濃度標準曲線方程為y＝-5.6887+16.6883x(r＝0.9934)，后峰峰面積-濃度標準曲線方程為y＝-24.7230+25.4066x(r＝0.9977)。(兩對映體的線性相關(guān)系數(shù)均達到0.99以上)，而且確定了溶劑峰的干擾是可以扣除的(如圖12b所示)。

5、拉米夫定的分離

用β-cd-d2手性hplc柱(柱尺寸150mm×φ4.6mm)對拉米夫定進行拆分，用緩沖液檸檬酸三乙胺和乙腈組成流動相，緩沖液檸檬酸三乙胺濃度為5.0×10^-3mol/l且ph為4.0，檸檬酸三乙胺與乙腈的體積比為45：55；拉米夫定濃度為2.26×10^-4mol/l(溶劑為超純水)，進樣量為20μl；流動相流速為0.8ml/min，紫外檢測波長為270nm，溫度為25℃，成功實現(xiàn)了拉米夫定的最佳分離，分離度為4.35，拉米夫定的分離結(jié)果如圖13a所示。拉米夫定對映體混合物在1.0×10^-5～9.04×10^-4mol/l濃度范圍內(nèi)，樣品濃度與峰高、峰面積有線性相關(guān)性，對映體前峰的峰高與濃度的線性方程為y＝2.218+24.784x，相關(guān)系數(shù)r＝0.9886，對映體前峰的峰面積與濃度的線性方程為y＝520.564+891.062x，相關(guān)系數(shù)r＝0.9716，對映體后峰的峰高與濃度的線性方程為y＝-1.777+6.458x，相關(guān)系數(shù)r＝0.9900，對映體后峰的峰面積與濃度的線性方程為y＝105.226+218.568x，相關(guān)系數(shù)r＝0.9749。(用峰高定量，兩對映體的線性相關(guān)系數(shù)可達到0.99)，在最佳分離條件下，重復(fù)進樣8次，前后峰峰高、峰面積和半高寬的rsd均在8.17％以內(nèi)。而且確定了溶劑峰的干擾是可以扣除的(如圖13b所示)。

6、西替利嗪的分離

用β-cd-d2手性hplc柱(柱尺寸150mm×φ4.6mm)對西替利嗪(1.20×10^-4mol/l，溶劑為超純水，進樣量為20μl)進行拆分，在流動相配比v(緩沖液):v(甲醇)＝85：15，緩沖液ph值為7.5，緩沖液磷酸二氫鈉-三乙胺中磷酸二氫鈉濃度為5mmol/l，溫度為25，℃檢測波長為270nm，流動相流速1.0ml/min的最佳條件下，分離結(jié)果如圖14所示。

7、頭孢呋辛和頭孢曲松的分離

分別用β-cd-d2手性hplc柱(柱尺寸150mm×φ4.6mm)對頭孢呋辛和頭孢曲松進行拆分(2.17×10^-3mol/l，溶劑為超純水，進樣體積20μl)，在流動相配比v(緩沖液):v(乙腈)＝85：15，緩沖液ph值為3.0，緩沖液檸檬酸-三乙胺中檸檬酸濃度為5mmol/l，溫度為25，℃檢測波長為270nm，流動相流速1.0ml/min的最佳條件下，對頭孢呋辛和頭孢曲松的分離結(jié)果如圖15和圖16所示。