專利名稱：取樣-應(yīng)答微流體盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷、分子和生物化學(xué)化驗(yàn)的微流體裝置和方法，更特別是涉及用于從盒上的試劑儲存器分配和配送流體、用于泵送、加熱和混合以及用于在并不夾帶氣泡和并不沖失試劑的情況下再水合干燥試劑的微流體技術(shù)。
背景技術(shù)：
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微流體裝置更多地用作診斷化驗(yàn)的工具。由Wilding在美國專利 No. 5304487中所述的裝置包括形成于可重復(fù)使用的硅基板上的“中等尺度”的槽道和腔室，該硅基板從盒外的注射器泵來灌注流體試劑。它沒有考慮盒載流體和試劑儲存和傳送。不過，實(shí)際商業(yè)應(yīng)用已經(jīng)導(dǎo)向“可消耗”盒的方向-一次性的單次使用“取樣-應(yīng)答”盒，它自身容納用于特殊化驗(yàn)所需的全部試劑或化驗(yàn)面板。在分子生物化驗(yàn)應(yīng)用中特別是這樣，其中，必須絕對避免與試樣的儲存或操作處理相關(guān)聯(lián)的污染。板載試劑可以包括液體和干試劑形式。在現(xiàn)有的成功產(chǎn)品中，這兩種試劑都遇到某些問題。這里，我們解決了與盒的槽道和腔室的初始潤濕和干燥試劑的再水合相關(guān)聯(lián)的液體處理問題。在包含微流體槽道和腔室的盒的充裝和操作過程中(特別是有塑料本體的盒)，液體潤濕通常不均勻，因此，氣穴經(jīng)常通過彎液面抵靠平面和在拐角中前進(jìn)而夾帶在流體柱中。在生物試樣的泵送和混合過程中，可能形成泡沫和氣泡，這對裝置的化驗(yàn)性能產(chǎn)生不利影響。氣泡可能由于容納干燥試劑的槽道或腔室的不均勻充裝而產(chǎn)生。試劑的再水合、潤濕和通氣與氣泡形成的問題相互聯(lián)系。在更復(fù)雜的流體網(wǎng)絡(luò)中(例如在Dubrow的美國專利No. 6068752和Kennedy的美國專利No. 6086740中所述)和在毛細(xì)管驅(qū)動流體的裝置中(例如由Buechler在美國專利申請No. 2005/0136552中或者由Wyzgol在美國專利申請No. 2004/024051中所述)，該問題加劇，已經(jīng)證明它們在塑料本體的裝置中都非常困難。由于脫氣，氣泡還可能在試樣液體的加熱過程中產(chǎn)生。已經(jīng)公知?dú)怏w的可溶性與溫度成反比，且進(jìn)行加熱的溶液很容易變得過飽和。由于脫氣而產(chǎn)生的氣泡源形成空穴，流體在該處進(jìn)行剪切，例如在微流體空腔中進(jìn)行機(jī)械或超聲波混合的過程中。氣泡在微流體“比色杯”中干擾液體的光學(xué)問診。光的通路可能由于由氣泡表面的曲率產(chǎn)生的透鏡效果和/或由于氣泡折射光而改變。氣泡還可以通過改變在氣泡界面處的溶質(zhì)濃度、通過使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性和通過影響在液體中的容積加熱速率和溫度均勻性而干擾生物化學(xué)反應(yīng)。例如，在PCR反應(yīng)中(其中，耐熱聚合酶用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的復(fù)制)，當(dāng)液體中存在氣泡時(shí)加熱和冷卻將不均勻，從而降低處理效率和限制靈敏性。氣泡的存在還降低了反應(yīng)腔室中的流體容積，且在依賴于在10-50 μ L或更小的容積內(nèi)檢測分析物的化驗(yàn)中，在反應(yīng)腔室中存在較大的捕獲氣泡能夠有效殺死該化驗(yàn)。
在依賴于速率確定的反應(yīng)中，氣泡能夠顯著干擾斜率的光學(xué)確定以及干燥試劑的均勻快速再水合(這是在具有合適基質(zhì)可用性的情況下開始反應(yīng)所需)。多種干燥試劑(例如熒光探針、酶、緩沖劑或控制分析物)可以置于微流體裝置的腔室內(nèi)，并為合適進(jìn)行化驗(yàn)所需。在潤濕過程中，夾帶一個(gè)或多個(gè)氣泡可能導(dǎo)致干試劑和試樣的不完全溶解和混合，從而降低反應(yīng)效率和降低測試的靈敏性。Lei在美國專利No. 6637463中提出通過利用表面張力特征和/或截面面積來改變平行槽道中的流動阻抗，以便使得壓力降均衡，因此使得流過多個(gè)流動通路的流量均衡。在 一個(gè)實(shí)例中，多個(gè)出口槽道用于從井中排出流體，以避免形成再循環(huán)流或流體停滯，否則將導(dǎo)致流體的低效率洗滌和捕獲氣泡。不過，各個(gè)特征都必須通過試驗(yàn)來設(shè)計(jì)并有誤差，因此設(shè)計(jì)并不耐用或者并不能很容易地適用于不同化驗(yàn)。因?yàn)槌叽绾捅砻婊瘜W(xué)的微觀變化很難在微流體循環(huán)制造中進(jìn)行控制，因此該方法已經(jīng)證明不能實(shí)際解決在微流體卡中的平行子線路之間均等分割流量的問題。且沒有提出使用具有提高潤濕特征的隔膜。Ulmanella (美國專利申請No. 2007/0280856)報(bào)道了通過物理改變腔室的底表面來控制充滿微流體腔室的流體的彎液面的努力，例如通過安裝能障以便在彎液面橫過腔室底板時(shí)減慢或停止彎液面的前邊緣，或者通過使用在底表面上的多個(gè)槽或柱，或者通過對腔室沿深度進(jìn)行雕刻以便調(diào)整毛細(xì)作用，或者通過使用注射器泵，通過離心，或者通過在腔室的出口側(cè)施加真空。這些方法都證明不能實(shí)際解決問題。毛細(xì)作用極其不可預(yù)測，并將促進(jìn)氣穴的形成，而使用注射器泵或應(yīng)用真空(如現(xiàn)有技術(shù)中通常采用)將剪切流體和沿最小阻力的通道驅(qū)動流體，從而進(jìn)一步加劇問題。例如，當(dāng)從單個(gè)進(jìn)口分支的兩個(gè)或更多微流體槽道用于流體時(shí)(例如用于在平行的多個(gè)診斷化驗(yàn)通路之間分割試樣或試劑)，流體可能充滿最容易潤濕的通路，并使得具有更高流體阻力的通道空出。在槽道之間的非常小阻力差異都將導(dǎo)致單個(gè)槽道的有利潤濕和分支平行槽道并不潤濕，該是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的問題。Ulmanella進(jìn)一步解決了干燥試劑對微流體腔室的潤濕的影響，并結(jié)束了包含中心點(diǎn)狀干燥試劑的腔室的充裝效率小于50%的情況，具有進(jìn)口側(cè)點(diǎn)狀試劑的腔室以65%的效率潤濕，但是對于具有出口側(cè)點(diǎn)狀試劑的腔室，沒有氣泡時(shí)的充裝效率增加至95%。不過，在制造過程中以毫米精度來定位試劑點(diǎn)將并不需要，也并不是在存在干燥試劑點(diǎn)時(shí)實(shí)現(xiàn)潤濕的、令人滿意的方式，因?yàn)閮?yōu)選是腔室在試劑再水合之前充分潤濕，以使得試劑的濃度不會由于沖出至下游槽道中而稀釋，當(dāng)干試劑位于腔室的下游出口處時(shí)很可能出現(xiàn)這種情況。還已知能夠降低在微流體槽道或腔室中的界面和表面張力，例如通過基板的等離子體處理或包含表面活性劑以便降低疏水性，以及通過使得槽道相交點(diǎn)呈圓角。這些處理還已知用于提高可潤濕性，但是并不有效消除機(jī)械夾帶氣泡和由于熱脫氣、空腔或停滯區(qū)域而引起的氣泡。實(shí)際上，表面活性劑能夠增大氣相傾向以形成穩(wěn)定氣泡和泡沫，該氣泡和泡沫能夠由于它們的持續(xù)性而使得化驗(yàn)性能失敗。而且通過處理(例如等離子體處理)而引起的表面變化預(yù)計(jì)將很難在制造中進(jìn)行控制，并可能是暫時(shí)的，從而在裝置的儲存過程中逐漸退化。因此，希望的是以及本發(fā)明的目的是開發(fā)機(jī)械裝置和方法，用于在化驗(yàn)槽道的初始潤濕過程中和在干試劑的再水合過程中減少氣泡的形成和夾帶，以及用于在裝置的操作過程中防止或減少氣泡的積累和干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的微流體盒(這里更通常稱為“裝置”)通常由柔性塑料本體形成，該柔性塑料本體容納有流體槽道和腔室，該流體槽道和腔室成一定圖形，并根據(jù)要在其中進(jìn)行的診斷或生物化學(xué)化驗(yàn)的需要而相互流體連通。化驗(yàn)通過在一個(gè)或多個(gè)步驟中使得試樣與一個(gè)或多個(gè)試劑反應(yīng)來進(jìn)行，通常在裝置的一個(gè)或多個(gè)槽道或腔室中，時(shí)間和溫度將有效用于形成可檢測的產(chǎn)品，該產(chǎn)品指示分析物在試樣中的存在或缺乏。盒通常是可消耗的，即它們一次使用，然后丟棄；并包含用于一個(gè)或多個(gè)化驗(yàn)所需的所有試劑。為了進(jìn)行化驗(yàn)，本發(fā)明的裝置插入主機(jī)儀器中，該主機(jī)儀器依賴于光學(xué)檢測(或其它檢測裝置)，例如分光光度計(jì)或熒光計(jì)，用于檢測表示感興趣的任何目標(biāo)分析物的存在、缺乏和/或數(shù)量的色原體或熒光團(tuán)。在優(yōu)選實(shí)施例中，在裝置中的光學(xué)窗與主機(jī)儀器中的 檢測裝置交接。不過，在光學(xué)窗中存在一個(gè)或多個(gè)氣泡可能損害分析物的檢測。氣泡還可能干擾形成可檢測產(chǎn)品所需的反應(yīng)，例如生物化學(xué)或分子反應(yīng)的擴(kuò)增子或其它產(chǎn)品，其中，氣泡可能導(dǎo)致反應(yīng)混合物的不均勻加熱、不充分混合或者干試劑的不完全或過早再造。在使用中，試樣流體弓I入本發(fā)明裝置中，然后，裝置的相互流體連通槽道和腔室單獨(dú)通過生物液體試樣、通過液體試劑或者通過試樣和一種或多種液體試劑的混合物來潤濕。裝置的可潤濕和相互流體連通的方面稱為裝置的“液壓工作部”，并包括具有槽道和腔室的一個(gè)或更多個(gè)微流體子線路。液壓裝置的控制通過氣動驅(qū)動閥、泵和隔膜來進(jìn)行，這些氣動驅(qū)動閥、泵和隔膜疊加為裝置中的腔室和槽道的單獨(dú)第二網(wǎng)絡(luò)或歧管，并由外部增壓空氣和真空源來供給。該第二網(wǎng)絡(luò)稱為裝置的“氣動工作部”。因此，裝置包括用于傳送液體的主要“液壓網(wǎng)絡(luò)”和用于傳送氣體的輔助“氣動網(wǎng)絡(luò)”。根據(jù)主機(jī)儀器(盒與該主機(jī)儀器交接以便執(zhí)行化驗(yàn))的閥和泵的邏輯電路，氣動網(wǎng)絡(luò)提供a)處理控制和b)正壓和負(fù)壓，用于驅(qū)動液體通過液壓網(wǎng)絡(luò)。試樣處理和液體試劑的混合(包括布置在裝置的液壓槽道和腔室內(nèi)的任何干試劑的再水合)產(chǎn)生這樣的問題，其中，氣泡很容易在液壓裝置的潤濕過程中夾帶至流體中。這特別在初始潤濕中產(chǎn)生，其中，氣泡通過彎液面快速前進(jìn)經(jīng)過裝置以及例如隨后通過與混合和加熱相關(guān)的成空穴或脫氣而卷入。本發(fā)明通過一種或多種流體處理機(jī)構(gòu)和方法來解決該問題。本發(fā)明的機(jī)構(gòu)、特征和方法包括氣動液壓隔膜，其特征在于I)彈性、儲存能量的氣動液壓隔膜，它設(shè)置成用于在液壓下被動地儲存液體容積，并在潤濕可潤濕微流體子線路的下游槽道或腔室的過程中釋放液體容積；2)雙層氣動液壓隔膜，它有液體中心，用于儲存和釋放液體試劑；3)設(shè)置成用于在潤濕過程中從液壓腔室中消除頂部空間的氣動液壓隔膜；或者4) 一對氣動液壓隔膜，該對氣動液壓隔膜包括使得第一液壓腔室與有閥進(jìn)口交接的第一氣動液壓隔膜和使得第二液壓腔室與有閥出口交接的第二氣動液壓隔膜；以及在第一和第二液壓腔室之間的直接升高相互連通槽道；其中該對氣動液壓隔膜設(shè)置成通過橫過第一和第二氣動液壓隔膜施加相反的壓力差來通過相互連通槽道往復(fù)地交換流體；以及液壓腔室和隔膜設(shè)置成在化驗(yàn)的潤濕、充裝、泵送或再水合步驟中防止或減少氣泡夾帶或試劑沖出。
根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)示例實(shí)施例，一個(gè)或多個(gè)液體試劑在制造時(shí)布置在裝置上的密封儲存器中。干試劑印刷或“點(diǎn)”在槽道或腔室中，并在使用時(shí)再水合。液體試劑用作緩沖齊 、稀釋劑、溶劑、洗提液、洗滌劑和再水合試劑。在這些用途中，液體根據(jù)需要通過氣動驅(qū)動而從它們的密封儲存器分配至裝置的液壓部中。在優(yōu)選的液體試劑實(shí)施例中，本發(fā)明的密封液體儲存器構(gòu)成為具有液體中心的雙層隔膜，該雙層隔膜密封地分離裝置的氣動工作部和液壓工作部。雙層隔膜由兩個(gè)不可透過薄膜層構(gòu)成，這兩個(gè)不可透過薄膜層由液體中心分開，且環(huán)繞邊緣壓接或熔合，且密封在裝置中，這樣，隔膜將液壓腔室和氣動腔室分開。朝向裝置的氣動工作部的上層由具有抗穿刺復(fù)合材料的薄膜來構(gòu)成，朝向裝置的液壓工作部的下層由具有更易于穿刺的復(fù)合材料的薄膜構(gòu)成。使得隔膜的氣動側(cè)增壓將迫使裝滿液體的儲存器抵靠布置在流體接收盆中的尖銳件或“倒刺”，并刺穿該下層，但并不刺穿上層。在破裂后，液體流入液壓腔室中，并從該液壓腔室進(jìn)入裝置的微流體可潤濕槽道。通過在隔膜的氣動側(cè)施加壓力，一個(gè)或多個(gè)一定容積的試劑能夠在壓力下壓入液壓工作部，且通過反向壓力，能夠使得流體回流。在該方面，本發(fā)明的化驗(yàn)盒的特征在于
a)雙層隔膜，該雙層隔膜密封地分離氣動工作部的氣動腔室和液壓工作部的液壓腔室，雙層隔膜有朝向氣動工作部的第一側(cè)面和朝向液壓工作部的第二側(cè)面，第一層形成它的第一側(cè)面，第二層形成它的第二側(cè)面，第一和第二層包圍在它們之間的液體容積作為液體中心；b)流體出口，用于接收和傳送液體容積至下游微流體子線路；以及c)尖銳件或“倒刺”，該尖銳件或倒刺布置在液壓腔室中，當(dāng)通過施加橫過隔膜的壓力差而迫使雙層隔膜與尖銳件刺穿抵接時(shí)，尖銳件用于選擇性地使得第二層破裂，并用于釋放液體容積至液壓工作部中。令人驚訝的是，通過施加在隔膜的第一層(該第一層保持完整)上的氣動壓力的連續(xù)脈沖的作用，可以以一連串的更小液體容積從板載試劑儲存器釋放液體。也可選擇，雙層隔膜的第一層是抗破裂層，第二層是易于破裂層。液體中心可以包含液體試劑、緩沖劑、再水合流體、溶劑或稀釋劑。液體的板載儲存有利于例如用于使得布置在下游腔室或槽道中的干試劑再水合、用于漂洗固相、用于從固相基板中洗提目標(biāo)分析物、用于進(jìn)行稀釋、用于進(jìn)行色層分離、用于驅(qū)動或停止反應(yīng)、或者用于檢測目標(biāo)分析物，并減小可能的繼續(xù)污染。也可選擇，液體容積進(jìn)行脫氣，且雙層隔膜為氣體不可透過。優(yōu)選是，任何夾帶的氣泡都可能重新吸收至脫氣液體中，且脫氣液體并不容易在加熱時(shí)脫氣，例如有利于PCR中的熱循環(huán)。盡管裝置為大致平面形，但是它們可以以傾斜位置(即相對于地平面成角度)安裝在主機(jī)儀器中，通常與平面成大約15度，并在各微流體子線路的下游方向通氣。當(dāng)液體試樣或試劑在上游引入液壓子線路中時(shí)，空氣向下游移動并排出。液體試樣和試劑逐漸填充和運(yùn)動經(jīng)過裝置。通過使得卡傾斜10至35度角度，在裝置中的空氣在起動加注(這里稱為“潤濕”)過程中更容易從液壓工作部排出。通過在傾斜卡的初始充裝過程中仔細(xì)管理前進(jìn)的彎液面，(特別是在充裝過程中)基本減少或防止氣泡夾帶的問題。也可選擇，液壓工作部設(shè)置成當(dāng)相對于地平面以10-35度的角度安裝在主機(jī)儀器的傾斜平臺上時(shí)進(jìn)行操作，且至少一個(gè)液壓腔室設(shè)置成具有出口和相互連通槽道，該相互連通槽道相對于腔室定位在上側(cè)，用于從腔室通氣或排出氣泡。在本發(fā)明的另一方面，在潤濕過程中的氣泡夾帶通過充裝機(jī)構(gòu)來限制，該充裝機(jī)構(gòu)包括彈性拉伸或張開的氣動液壓隔膜的被動放松機(jī)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)該被動機(jī)構(gòu)優(yōu)于通過毛細(xì)管來充裝和通過正排量泵作用或真空來充裝。液體首先在壓力下壓入專門設(shè)計(jì)的歧管中，該歧管有堆垛在“液壓腔室”頂部上的“氣動腔室”，其中，兩個(gè)腔室通過在液壓腔室的頂部拉伸的彈性隔膜來分開。也可選擇，液體可以吸入下部腔室，但是優(yōu)選是，上部氣動腔室通氣和向大氣壓力開口。兩個(gè)腔室的位置是相對的(盡管為了解釋而稱為“上部”和“下部”或“頂側(cè)”和“底側(cè)”腔室)，且并不限制該裝置的操作。當(dāng)液體容積進(jìn)入液體接收腔室時(shí)，隔膜拉伸，以便保持容積和彈性儲存變形能量(具有返回力和彈簧常數(shù)的一種勢能)。隔膜材料和變形情況選擇為使得不會超過材料的“彈性極限”。然后，通過打開通向下游槽道或腔室的閥，張開的拉伸隔膜返回它的放松狀態(tài)，流體輕柔地充滿下游流體結(jié)構(gòu)，而不會在前進(jìn)的彎液面中夾帶氣泡。這種機(jī)構(gòu)和方法已經(jīng)證明了驚人的優(yōu)點(diǎn)，其中，將流體分成進(jìn)入多個(gè)槽道。通過提供具有多個(gè)液體接收腔室(該液體接收腔室有彈性隔膜)的上游分段歧管，且各液體接收腔 室有單獨(dú)的有閥出口(該出口同步打開)，用于起動和保持液體平行流入多個(gè)下游流體子線路的液壓將隔離或“量化”，以使得進(jìn)入所有槽道的流量都基本相等和足夠。每個(gè)下游槽道的總壓和容積能夠通過選擇彈簧常數(shù)和彈性隔膜部件的變形而精確標(biāo)定，以使得液體進(jìn)入下游槽道中的恢復(fù)流量是用于充裝下游槽道至合適標(biāo)記的所需容積；對于使得流體在多個(gè)平行槽道或子線路之間均等地分割的流體操作，由分段歧管的各隔膜提供的排出容積不會不充分，也不會過量，在裝置中所需的流體操作將平行地用于多個(gè)化驗(yàn)。這是本領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步。下游的任何空氣都很容易通過前進(jìn)的彎液面而排出，并通過該裝置傳送給下游通氣□。在該方面，本發(fā)明的化驗(yàn)盒包括a)具有多個(gè)腔室的分段歧管，其中，多個(gè)腔室的各腔室通過彈性的能量儲存氣動液壓隔膜而分成液壓腔室和氣動腔室，該氣動液壓隔膜密封地安裝在該液壓腔室和氣動腔室之間，這樣，能夠串聯(lián)或并聯(lián)地通過進(jìn)口進(jìn)入各液壓腔室的液體容積將使得各能量儲存氣動液壓隔膜根據(jù)與它的排量容積成比例的在整個(gè)分段歧管上等壓力而張開；b )在充裝完成后，進(jìn)口可通過閥關(guān)閉，用于使得液壓在整個(gè)分段歧管中均衡；以及c)平行的多個(gè)通氣下游槽道，其中，多個(gè)槽道中的一個(gè)槽道與分段歧管的各液壓腔室流體連通，各通氣下游槽道有閥，用于在充裝和增壓過程中關(guān)閉，并在排出和減壓過程中打開，因此，在平行的多個(gè)通氣下游槽道的初始潤濕過程中，處于張開狀態(tài)的彈性氣動液壓隔膜的液壓將被動地轉(zhuǎn)變成使得彎液面前進(jìn)的工作。更通常是，潤濕或“起動加注”這樣提高，即通過利用彈性氣動液壓隔膜在流體張開狀態(tài)中的機(jī)械特性來進(jìn)行彎液面經(jīng)過與它流體連接的可潤濕下游微流體線路前進(jìn)的工作，從而向下游通氣口排出其中的任何氣體，且并不夾帶氣泡。該原理在使得流體均等地分割成平行地進(jìn)入多個(gè)下游微流體子線路中時(shí)特別有利。這樣，多個(gè)化驗(yàn)可以平行地進(jìn)行，單個(gè)試樣可以均等地分割成用于平行化驗(yàn)，這些平行化驗(yàn)具有單獨(dú)的下游檢測裝置。令人驚訝的是，彈性隔膜的機(jī)械特性能夠進(jìn)行標(biāo)定，以便使得一個(gè)或多個(gè)下游微流體子線路充裝至標(biāo)記，這例如在確定容積中重新構(gòu)造確定質(zhì)量的干試劑時(shí)很有利。
微流體裝置通常還可以包括布置在下游液壓網(wǎng)絡(luò)中的至少一個(gè)干燥試劑。這些試劑通常在制造過程中點(diǎn)出或印刷。在化驗(yàn)過程中，干燥試劑通過試樣或通過與如上述分配的液體試劑接觸而再水合。順便說明，我們發(fā)現(xiàn)，這里所述的被動液體潤濕機(jī)構(gòu)和方法有利地適合干試劑的再水合，而并不夾帶氣泡，這是本領(lǐng)域的另一技術(shù)進(jìn)步。在相關(guān)實(shí)施例中，我們發(fā)現(xiàn)通過在下游腔室(干燥試劑點(diǎn)在該下游腔室中)提供氣動驅(qū)動隔膜，覆蓋這些試劑點(diǎn)的隔膜能夠增壓，以便a)在腔室的潤濕處理過程中暫時(shí)密封試劑區(qū)域(通常在腔室的中心和在腔室底板上)防止與大量流體接觸；以及b)除去或消除在干燥試劑上面的幾乎全部頂部空間。當(dāng)變形成充滿液壓腔室時(shí)，隔膜并不環(huán)繞腔室的周邊充分密封。環(huán)繞隔膜進(jìn)入腔室的液體環(huán)繞該腔室的下邊緣分流，并很容易排出任何剩余空氣，該空氣在充裝過程中從液壓裝置中排出。通過放松或通過使得橫過隔膜的壓力差反向，附加流體很容易吸入腔室中，而并不形成或夾帶氣泡。試劑只在腔室的下游出口通過閥關(guān)閉之后才再水合，從而減少了試劑的沖走損失。干試劑腔室的減少死區(qū)容積也很有利。幸運(yùn)的是，這樣，干試劑點(diǎn)能夠通過合適容積的再水合試劑或試樣來精確重構(gòu)，從而保證試劑的生物活性在量上正確用于化驗(yàn)條件，這是技術(shù)上的有利改進(jìn)。 因此，本發(fā)明還可以有這樣的特征，至少一個(gè)微流體子線路具有下游反應(yīng)腔室，該下游反應(yīng)腔室具有上游進(jìn)口和下游通氣口，下游反應(yīng)腔室包含干燥試劑點(diǎn)；其特征還在于氣動液壓隔膜設(shè)置為操作成有第一位置和第二位置，在該第一位置中，隔膜張開抵靠腔室的底板，以便排出頂部空間的空氣，并在潤濕過程中形成環(huán)繞和在試劑點(diǎn)上方的保護(hù)性臨時(shí)膨脹部，在該第二位置中，隔膜松弛定位，或者吸靠腔室的頂部，以便使得腔室充滿液體容積，且暴露和以充分強(qiáng)度溶解試劑點(diǎn)，而并不夾帶氣泡或沖走試劑。干燥試劑點(diǎn)是緩沖齊U、酶、共同酶、輔因子、聚合酶、引物、分子信標(biāo)、探針、熒光團(tuán)、脫氫酶、氧化酶、反應(yīng)物、色原、基體、抗體、抗原或者控制器。還要求保護(hù)一種用于潤濕微流體盒同時(shí)限制氣泡夾帶于其中的方法，該方法包括a)泵送液體容積通過進(jìn)口進(jìn)入微流體卡的形成分段歧管的多個(gè)液壓腔室中，以使得在各液壓腔室中覆蓋液體容積的彈性氣動液壓隔膜拉伸地張開，從而等壓地使在多個(gè)液壓腔室中的液體容積增壓；b)通過閥打開分段歧管的各液壓腔室的出口，各出口與通氣下游微流體子線路流體連通；以及c)通過被動放松張開的彈性隔膜而基本相等地將液體容積分割進(jìn)入各可潤濕下游微流體子線路中，且不會夾帶氣泡。通過被動放松彈性隔膜來潤濕微流體裝置將很容易與通過毛細(xì)作用或通過主動泵送的潤濕區(qū)分，且已經(jīng)證明在克服本領(lǐng)域已知的氣泡夾帶難題方面有令人驚訝的優(yōu)點(diǎn)。還要求保護(hù)一種用于潤濕包含干燥試劑點(diǎn)的微流體盒的方法，同時(shí)限制氣泡夾帶于其中，該方法包括a)泵送液體容積通過進(jìn)口進(jìn)入微流體卡的多個(gè)液壓腔室中，以使得在各液壓腔室中覆蓋液體容積的彈性氣動液壓隔膜張開，從而等壓增壓液體容積；b)增壓在多個(gè)下游反應(yīng)腔室中的第二隔膜，各下游反應(yīng)腔室包含干燥試劑點(diǎn)，第二隔膜形成保護(hù)性的臨時(shí)膨脹部，用于密封環(huán)繞和覆蓋試劑點(diǎn)，并用于從下游反應(yīng)腔室中排出頂部空間的空氣；c)通過閥打開各液壓腔室的出口，各出口與多個(gè)下游反應(yīng)腔室中的一個(gè)流體連通；d)通過使得張開的彈性氣動液壓隔膜放松，將環(huán)繞臨時(shí)膨脹部潤濕下游反應(yīng)腔室，并將任何剩余空氣從反應(yīng)腔室排出，液體容積形成前進(jìn)的彎液面；e)選擇地關(guān)閉在下游反應(yīng)腔室下游的閥；f)升高臨時(shí)膨脹部，并將液體容積的剩余部分傳送至各反應(yīng)腔室中，從而以充分強(qiáng)度溶解試劑點(diǎn)，而沒有氣泡夾帶或試劑沖走。拉伸膨脹部通過放松或通過使得橫過第二隔膜部件的壓力差反向而升高。在另一方法中，可以使用具有氣動液壓隔膜的成對腔室來幫助用于PCR的潤濕和 試劑溶解，并用于當(dāng)通過腔室相互串聯(lián)連通時(shí)往復(fù)地泵送流體。通過向第一腔室中的第一隔膜施加交替的正和負(fù)氣動脈沖，在第二腔室中的第二隔膜同步驅(qū)動。第二隔膜可以是彈性隔膜，它用于容納和彈性儲存第一隔膜的脈沖能量。通過在兩個(gè)腔室之間來回傳送液體容積，很容易地實(shí)現(xiàn)混合。通過向各液壓腔室提供薄換熱薄膜并合適接觸加熱元件，“兩區(qū)域” PCR很容易獲得。在改進(jìn)裝置中，在腔室之間的相互連通槽道有一定輪廓并升高定位，這樣，在初始潤濕和泵送過程中，氣泡由重力推壓，以便跳過腔室，并將捕獲在加熱過程中形成的任何附加氣泡。相互連通槽道優(yōu)選是設(shè)置成在傾斜10至35度的情況下操作，并定位在成對腔室的較高側(cè)，以便減少由氣泡產(chǎn)生的干擾。流體在處于目標(biāo)核酸的變性溫度下的第一腔室和處于退火(annealing)溫度的第二腔室之間循環(huán)。裝置的塑料本體限制了裝置在PCR過程中的寄生熱量。核酸擴(kuò)增很容易實(shí)現(xiàn)每熱循環(huán)8秒或更少的速率。為了 PCR，裝置提供有擴(kuò)增試劑。通常，第一腔室包含第一試劑，第二腔室包含第二試劑。通常，試劑點(diǎn)在各腔室的中心或中心周圍區(qū)域中。在初始潤濕過程中，在腔室中的隔膜膨脹張開，以便向下按壓和覆蓋在試劑上，從而限制再水合和任何沖走，否則將在再水合流體或試樣的彎液面溶解點(diǎn)出的試劑并由溶劑前部來向下游攜帶它們時(shí)產(chǎn)生該沖走。在初始潤濕之后，吸力壓力可以施加在隔膜上，以便將流體吸入腔室中，并使得試劑在其中溶解。也可選擇，上游腔室可以增壓，以便液壓膨脹下游腔室和溶解試劑。流體的流動方向可以反向一次或多次，以便提高混合和再水合。因此，本發(fā)明還包括用于主機(jī)儀器的盒，該主機(jī)儀器有用于“兩區(qū)域熱循環(huán)”的熱界面和具有氣動裝置的氣動界面，用于驅(qū)動和控制PCR擴(kuò)增。裝置通過在兩個(gè)相互連接的液壓腔室中的成對隔膜的往復(fù)氣動液壓運(yùn)動而工作，以便使得目標(biāo)核酸周期性地變性和退火，盒優(yōu)選是具有本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)可潤濕特征，用于提高液體對腔室的潤濕，而并不夾帶氣泡。裝置還有利地用于在潤濕過程中在固定容積中溶解試劑，而沒有沖走損失，從而保證引物、緩沖劑和其它試劑在重構(gòu)時(shí)處于固定強(qiáng)度。因此，本發(fā)明的多個(gè)方面提供了在操作微流體盒用于診斷和生物化學(xué)化驗(yàn)時(shí)的新穎應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)有利地作為用于限制氣泡干擾的機(jī)構(gòu)和方法，該氣泡干擾是這些裝置的問題的長期根源。在下面的說明中將清楚本發(fā)明的某些方面和實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)知道，這些方面和實(shí)施例只是示例和解釋，并不是限制本發(fā)明。通過下面的詳細(xì)說明將清楚其它特征和優(yōu)點(diǎn)。


圖IA和IB表示了本發(fā)明的一次性、單次使用的取樣-應(yīng)答微流體盒的兩個(gè)透視圖，該盒包含用于化驗(yàn)的所有試劑，只需要引入生物試樣。圖2表示了化驗(yàn)盒插入主機(jī)儀器中，用于在其上進(jìn)行化驗(yàn)。圖3A是盒在插入主機(jī)儀器的機(jī)構(gòu)中時(shí)的詳細(xì)視圖。該機(jī)構(gòu)包括圖3B中所示的加熱歧管以及氣動控制界面。圖4是一次性微流體盒的分解圖，其中有承載液體試劑的液體中心箔隔膜包。圖5A是用于從生物試樣中提取核酸目標(biāo)物的微流體線路的透視圖；圖5B是提取方法的示意圖。圖6A-G提供了由雙層雙重隔膜形成的試劑儲存器的視圖，該雙層雙重隔膜有液體試劑中心和尖銳件或“倒刺”，該尖銳件或倒刺用于穿透和釋放液體至微流體裝置的液壓 工作部中。圖7A和7B表示了當(dāng)安裝在主機(jī)儀器中時(shí)以傾角傾斜的微流體盒。圖8A和SB表示了在微流體盒上進(jìn)行PCR的槽道和腔室網(wǎng)絡(luò)的蟲眼圖；干試劑的位置也進(jìn)行標(biāo)記。圖8C和8D表示了可選盒結(jié)構(gòu)的蟲眼圖。圖9A-9L示意表示了具有分段歧管的被動初始潤濕機(jī)構(gòu)的示意圖。圖10A-10C表示了分段歧管的操作，試劑由此在準(zhǔn)備PCR時(shí)再水合。操作順序在圖10D-G中連續(xù)。圖10D-10G表示了使用具有往復(fù)隔膜作用的雙腔室的PCR擴(kuò)增。圖11表示了從試樣提取核酸的方法的步驟，其中，具有液體中心的雙層雙重隔膜用于分配試劑。圖12表示了用于通過從具有液體中心的雙層雙重隔膜分配的液體來起動加注液壓工作部的微流體槽道的方法的步驟。圖13表示了用于在不夾帶氣泡的情況下再水合干試劑的方法的步驟。圖14A和14C是用于反向轉(zhuǎn)錄酶介質(zhì)PCR的微流體槽道和腔室網(wǎng)絡(luò)的蟲眼圖。圖14B是用于制造cDNA的同軸腔室的詳細(xì)視圖。圖14D和14E表示了具有變化特征的盒的可選結(jié)構(gòu)。圖15表示了使用本發(fā)明裝置的檢測腔室的光學(xué)窗來監(jiān)測熒光端點(diǎn)。圖16更詳細(xì)地表示了用于執(zhí)行PCR的兩件式微流體卡組件以及具有墊圈的氣動界面(用于使得卡與相容主機(jī)儀器交接)。圖17是表示在盒的檢測腔室中的正和負(fù)熒光化驗(yàn)的曲線圖，包括當(dāng)反應(yīng)混合物的溫度升高時(shí)的多次試樣掃描。圖18A和18B分析了圖17的匯集數(shù)據(jù)。雙重分子信標(biāo)-擴(kuò)增子的掃描證明了當(dāng)與相容主機(jī)儀器交接時(shí)該盒的FRET熔化曲線能力。圖19表示了當(dāng)用于相容的主機(jī)儀器中時(shí)通過本發(fā)明的裝置獲得的擴(kuò)增子的FRET數(shù)據(jù)。
具體實(shí)施方式
盡管下面的詳細(xì)說明包含用于示例說明目的的特定細(xì)節(jié)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)可以對下面的細(xì)節(jié)進(jìn)行多種變化和改變。下面提出的定義幫助解釋要求保護(hù)的本發(fā)明。定義“盒”是設(shè)計(jì)成用于通過插入主機(jī)儀器中來操作的分析裝置。主機(jī)儀器提供用于執(zhí)行化驗(yàn)的氣動壓力、脈沖和檢測裝置。盒包含液壓工作部和氣動工作部，并可以包括嵌入的微流體“卡”，該微流體卡有嵌入的微流體槽道和腔室。試樣和試劑液體在盒或卡的液壓網(wǎng)絡(luò)中傳送；流體流量由氣動網(wǎng)絡(luò)來控制和驅(qū)動，該氣動網(wǎng)絡(luò)與液壓裝置在選定連接點(diǎn)、槽道和腔室處交接。通常，盒或卡的本體由柔性塑料來制造，并可以通過層壓、模制或它們的組合來形成。塑料可以包括但不局限于聚碳酸酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、環(huán)聚烯烴、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、嫁接(graft)和塊的共聚物、以及它們的復(fù)合材料。優(yōu)選的盒由卷材原料(rollstock)制造,并包括印刷于其上的干試劑。
裝置的“液壓工作部”包括將在化驗(yàn)過程中由試樣或液體試劑潤濕的、相互連通的槽道和腔室的網(wǎng)絡(luò)。液壓網(wǎng)絡(luò)設(shè)置成有用于執(zhí)行化驗(yàn)步驟的微流體子線路。裝置的“氣動工作部”包括用于向裝置的液壓裝置提供動力和進(jìn)行控制的氣動驅(qū)動閥、泵、隔膜以及相互連接的線路和歧管的一個(gè)網(wǎng)絡(luò)或若干網(wǎng)絡(luò)。盒裝置的氣動工作部與在主機(jī)儀器上的正壓源和負(fù)壓源交接，并與控制和驅(qū)動液壓網(wǎng)絡(luò)中的液體的閥、隔膜、泵和其它氣動驅(qū)動元件交接。裝置的“微流體工作部”包括由在化驗(yàn)過程中潤濕的內(nèi)部槽道和腔室的網(wǎng)絡(luò)形成的液壓工作部以及由閥控制和泵驅(qū)動線路(該閥控制和泵驅(qū)動線路由在主機(jī)儀器上的正壓源和負(fù)壓源來提供動力)形成的氣動工作部。微流體工作部可以分成微流體子線路，其中，各子線路包括用于在液體試樣或試劑上執(zhí)行特殊功能的槽道和腔室。微流體子線路可以組織成串聯(lián)子線路(例如用于提取、擴(kuò)增和檢測核酸目標(biāo)物)和并聯(lián)子線路以及網(wǎng)絡(luò)(例如用于通過分割試樣而在單個(gè)試樣上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)物的化驗(yàn))?！绊敳俊薄ⅰ暗撞俊?、“上”、“下”、“上面”、“下面”、“向上”、“向下”、“高于”、“底板”、“頂”
等是表示相對位置，而不是絕對位置，除非涉及特定參考框架，例如“地平面”，該地平面認(rèn)為與相交的鉛垂線垂直?！皾櫇瘛笔侵冈诤械囊簤汗ぷ鞑績?nèi)部的塑料表面的初始水合。由于界面張力效果，初始潤濕能夠包括克服較大能障，且是在這些裝置中的毛細(xì)管流的主要阻力因素?！澳繕?biāo)分析物”、“感興趣的分析物”或“目標(biāo)分子”可以包括核酸、蛋白質(zhì)、抗原、抗體、碳水化合物、細(xì)胞組分、血脂、受體配體、小分子例如藥物等。目標(biāo)核酸包括基因、部分基因、基因的調(diào)控序列、mRNAs、rRNAs、tRNAs、siRNAs、cDNA，并可以是單鏈、雙鏈或三鏈。一些核酸目標(biāo)物有多形態(tài)、單核苷酸多態(tài)性、缺失和替代剪接序列，如等位基因變異。在單分子中可以存在多個(gè)目標(biāo)功能區(qū)，例如，免疫原可以包括多個(gè)抗原決定簇?？贵w包括可變區(qū)域、恒定區(qū)域和Fe區(qū)域，該Fe區(qū)域是靜止抗體中的值。目標(biāo)分析物通常并不在制造時(shí)提供盒，而是包含在要化驗(yàn)的液體試樣中。相反，“控制分析物”通常提供盒，或者例行存在于特殊類型的試樣中，并進(jìn)行化驗(yàn)以便保證化驗(yàn)的合適性能。加標(biāo)試樣可以用于某些質(zhì)量控制測試和用于標(biāo)定，如本領(lǐng)域公知。
“用于擴(kuò)增的方式”它的初始技術(shù)是聚合酶鏈反應(yīng)(稱為PCR)，該聚合酶鏈反應(yīng)在Ausubel等人(在分子生物學(xué)中的當(dāng)前規(guī)范，John Wiley和Sons, Baltimore, Md. 1989)和 Innis 等(“PCR 規(guī)范”，Academic Press, Inc. , San Diego Calif. , 1990)的美國專利No. 4683195,4683202和4800159中詳細(xì)介紹。聚合酶鏈反應(yīng)方法需要熱循環(huán)，為本領(lǐng)域公知。簡單地說，在PCR中，制備兩個(gè)引物序列，這兩個(gè)引物序列與目標(biāo)序列的相對互補(bǔ)鏈上的區(qū)域互補(bǔ)。過量的脫氧核苷三磷酸與DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)一起添加到反應(yīng)混合物中。當(dāng)目標(biāo)序列存在于試樣中時(shí)，引物將粘在目標(biāo)上，聚合酶將通過添加在核苷酸上而使得引物沿標(biāo)記物序列延伸。通過升高和降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物將與模板分離，以便形成反應(yīng)產(chǎn)物，過量的引物將粘在模板上和反應(yīng)產(chǎn)物上，并重復(fù)該處理。通過添加熒光嵌入劑，能夠?qū)崟r(shí)檢測到PCR產(chǎn)品。其它擴(kuò)增規(guī)范包括LAMP (DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(“LCR”)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，還 可以使用“滾轉(zhuǎn)循環(huán)”、“RACE”和“單面PCR”，也稱為“不對稱PCR”，具有過量合成與可檢測探針互補(bǔ)的鏈的優(yōu)點(diǎn)。這些各種非PCR擴(kuò)增規(guī)范在診斷化驗(yàn)中有各種優(yōu)點(diǎn)，但是PCR仍然是在分子生物實(shí)驗(yàn)室中和在臨床診斷中的主力。這里對于微流體PCR所述的實(shí)施例應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是能夠執(zhí)行一種或多種擴(kuò)增規(guī)范的普通級微流體裝置的代表和示例。通常，核酸擴(kuò)增或延伸包括使得一種或多種目標(biāo)核酸(該目標(biāo)核酸能夠有不同序列)與包含反應(yīng)組分的“主混合物”混合，用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)和使得該反應(yīng)混合物處于允許目標(biāo)核酸擴(kuò)增的溫度條件中。在主混合物中的反應(yīng)組分能夠包括緩沖劑，該緩沖劑調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的PH值；一種或多種天然核苷酸(對應(yīng)于A、C、G和T或U-通常以等濃度存在)，該天然核苷酸提供了核酸合成所需的能量和核苷酸；引物或引物對，它們粘附在模板上，以便于開始核酸合成；以及聚合酶，該聚合酶將核苷酸添加在進(jìn)行合成的互補(bǔ)核酸鏈上。不過，用于擴(kuò)增的方式還包括使用變化或“非標(biāo)準(zhǔn)”或“非天然”的基團(tuán)(例如在Prudent的美國專利No. 7514212以及Marshall的美國專利No. 7517651和7541147中所述)來幫助檢測核酸目標(biāo)。這里使用的“用于檢測的裝置”是指用于顯示端點(diǎn)(即化驗(yàn)結(jié)果)的裝置，它可以是定性的或定量的，并可以包括裝備有分光光度計(jì)，熒光光度計(jì)，照度計(jì)、光電倍增管，光電二極管，濁度計(jì)，光子計(jì)數(shù)器，電壓表，電流表，PH計(jì)，電容傳感器，射頻發(fā)射機(jī)，磁阻計(jì)，或霍爾效應(yīng)器件的機(jī)器。在蓋板中的放大透鏡、光學(xué)濾波器、有色流體和有標(biāo)簽探針可以用于提高化驗(yàn)結(jié)果的檢測和解釋?！皹?biāo)簽”或“標(biāo)志”包括但不局限于染料，例如發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)；以及化學(xué)發(fā)光物，如現(xiàn)有技術(shù)已知。在磁珠上裝飾的QDot (例如涂覆有ZnS的CdSe)或者QDot和順磁性Fe3O4微粒的混合物是提高本發(fā)明的化驗(yàn)的靈敏性的有利方法。還預(yù)期熒光熄滅檢測端點(diǎn)。與酶連接免疫化驗(yàn)相關(guān)聯(lián)的各種基板和產(chǎn)品發(fā)色團(tuán)也為本領(lǐng)域公知，并提供了用于放大檢測信號的裝置，以便提高化驗(yàn)的靈敏性，例如“向上轉(zhuǎn)變”熒光團(tuán)?！胺肿有艠?biāo)”是單鏈發(fā)夾形低聚核苷酸探針，它設(shè)計(jì)成報(bào)告特定核酸在溶液中的存在。分子信標(biāo)包括四個(gè)組分莖、發(fā)夾環(huán)、端部標(biāo)簽熒光團(tuán)和相對端部標(biāo)簽熄滅劑。當(dāng)發(fā)夾狀信標(biāo)沒有粘附在目標(biāo)上時(shí)，熒光團(tuán)和熄滅劑布置成靠近在一起，熒光受到抑制。當(dāng)存在互補(bǔ)目標(biāo)核苷酸序列時(shí)，信標(biāo)的莖打開，以便與目標(biāo)雜化。這使得熒光團(tuán)和熄滅劑分離，從而使得熒光團(tuán)能夠發(fā)出熒光。也可選擇，分子信標(biāo)也包括熒光團(tuán)，該熒光團(tuán)在端部標(biāo)簽供體附近發(fā)光?！安ㄩL移動分子信標(biāo)”包含附加收獲熒光團(tuán)，從而使得熒光團(tuán)能夠更強(qiáng)地發(fā)光。分子信標(biāo)的當(dāng)前評論包括Wang K等人，2009，Molecular engineering of DNA :分子信標(biāo)；Angew Chem Int Ed Engl，48 (5) : 856-870 ;Cissell KA 等人，2009，Resonance energytransfer methods of RNA detection, Anal Bioanal Chem 393 (I) : 125-35 以及 Li Y 等人，2008，Molecular Beacons:an optimal multifunctional biological probe,BiochemBiophys Res Comm 373 (4) :457-61。最新進(jìn)步包括 Cady NC，2009，Quantum dot molecularbeacons for DNA detection. Methods Mol Biol554:367-79。熒光核酸化驗(yàn)包括通過標(biāo)記引物和基于探針的檢測化學(xué)物質(zhì)而擴(kuò)增。熒光產(chǎn)品能夠在化驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行化驗(yàn)，或者通過實(shí)時(shí)測量擴(kuò)增產(chǎn)品的量。盡管并不限制，TaqMan探針(Applied Biosystems)(它依賴于具有3’熄滅劑結(jié)構(gòu)的5’指示器染料的位移和聚合酶介質(zhì)水解)、FRET雜化探針、基于低FRET的雙探針(Roche)、小槽粘接劑共軛雜化探針(MGB探針，Applied Biosystems)、Eclipse 探針、Locked NA 探針(Exiqon/Roche)、Amplifluor引物化學(xué)物質(zhì)、Scorpions引物化學(xué)物質(zhì)、LUX引物、Qzyme引物、RT-PCR都特別適用于本發(fā)明。焚光探針包括插入探針，例如SyberiaGreen (分子探針)、溴化乙錠或者噻唑 桔；FRET 探針；Tii(|Man⑨探針(Roche Molecular Systems);分子信標(biāo)探針；Black HoleQuencher (Biosearch Technologies) ; \.l(; 15·Κλ'IiJlSC馨,探針(Nanogen) ；Scorpions (DxS Ltd)探針、LUX 引物探針(Invitrogen)、Sunrise 探針(Oncor)、MGB-Pleiades(Nanogen)等。探針技術(shù)的最新進(jìn)步例如參考Lukhtanov EA等人2007，Novel DNA probeswith low background and high hybridization-triggered fluorescence, Nucl AcidsRes 35:e30o逆轉(zhuǎn)錄酶用于分析RNA目標(biāo)，并需要單獨(dú)的步驟來形成cDNA。最新進(jìn)步包括Krasnoperov LN 等人，[2010. Luminescent probes for ultrasensitive detection ofnucleic acids. Bioconjug Chem 2010 Jan 19epub]。除了化學(xué)染料，探針還包括綠色熒光蛋白質(zhì)、量子點(diǎn)和納米點(diǎn)，它們都發(fā)熒光。分子例如核酸和抗體以及對化驗(yàn)?zāi)繕?biāo)有親和作用的其它分子可以通過熒光團(tuán)來標(biāo)記，以便形成用于本發(fā)明的熒光化驗(yàn)的探針。“FRET”(熒光諧振能量傳遞)是能夠研究分子相互作用的熒光技術(shù)。它取決于當(dāng)兩個(gè)分子在雜化中緊鄰時(shí)能量從一個(gè)熒光團(tuán)向另一熒光團(tuán)(即供體和熄滅劑)的傳遞。最近進(jìn)展包括Carmona AK等，2009，The use of fluorescence resonance energytransfer(FRET)peptides for measurement of clinically important proteolyticenzymes, Ann Acad Bras Cienc 81 (3):381-92。除非上下文中另外要求，在整個(gè)說明書和隨后的權(quán)利要求中，詞語“包括”和它的變化形式(例如“包含”)將認(rèn)為是開放的、包含在內(nèi)的意思，也就是作為“包括但不局限于”。在整個(gè)說明書中，“一個(gè)實(shí)施例”、“實(shí)施例”、“一個(gè)方面”或者“方面”的意思是結(jié)合該實(shí)施例或方面所述的特殊性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或特征可以包含在一個(gè)實(shí)施例中，但并不必須在本發(fā)明的所有實(shí)施例中。而且，這里所述的本發(fā)明的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或特征可以在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中以任意合適方式來組合?！俺Ｒ?guī)的”是表示在本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)中已知的術(shù)語?！按蠹s”和“大致”是不嚴(yán)格的擴(kuò)展措辭，說明是“或多或少”、“近似”或“幾乎”的狀態(tài)，其中，變化將是明顯沒有意義的，或者是相等的效用或功能，還表示除了標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)則或限制之外還有明顯很小的差別。

參考附圖，圖IA和IB表示了本發(fā)明的一次性、單次使用的取樣-應(yīng)答微流體盒的兩個(gè)透視圖，該盒包含用于化驗(yàn)的全部試劑，只需要引入生物試樣。在該典型實(shí)施例中，盒100包括具有蓋板103的保護(hù)底架或本體102，以方便進(jìn)行處理。蓋板包括和包含用于添加試樣的進(jìn)口孔104。盒的凸出前端105插入主機(jī)儀器的空間對接的壁凹中(圖2)。盒本體的凸出前端包括光學(xué)窗切口 101，該光學(xué)窗切口 101與空間對接的壁凹的后側(cè)鏡對齊，用于當(dāng)插入主機(jī)儀器中時(shí)進(jìn)行目標(biāo)分析物的反射透射和熒光檢測，盡管并不局限于此。在盒的底側(cè)上還有熱界面110，用于加熱微流體盒的區(qū)域；以及一次性墊圈111，用于將盒密封地設(shè)置在主機(jī)儀器的空間對接的壁凹中的氣動控制界面上。盒本體可以包括微流體卡，如圖 16中所示，不過，微流體工作部可以選擇地與盒本體成一體。圖2表明了化驗(yàn)盒100可逆地插入(雙箭頭)主機(jī)儀器200的空間對接的壁凹201中?；?yàn)的執(zhí)行通過大致如圖所示的操作人員界面來控制。光學(xué)窗101與主機(jī)儀器的底架202內(nèi)部的檢測裝置對齊。圖3A是盒在插入主機(jī)儀器的機(jī)構(gòu)中時(shí)的詳細(xì)視圖。傾斜安裝板300用于將機(jī)構(gòu)(和盒)的角度設(shè)置在固定角度Θ (參考圖7B)，這幫助在初始潤濕時(shí)排出空氣和夾帶的氣泡。主機(jī)儀器包括具有軌道安裝掃描檢測器頭部303的光學(xué)組件和用于與盒的光學(xué)窗101交接的機(jī)動夾持機(jī)構(gòu)304。光學(xué)組件和空間對接的壁凹安裝為浮動平臺的一部分，該浮動平臺螺栓連接在傾斜安裝板上，但是懸浮安裝，以使得盒可以夾持抵靠熱控制模塊310和氣動界面口 330 (見圖3B)。主機(jī)儀器、空間對接的壁凹和光學(xué)插件的進(jìn)一步說明在共同待審的國際專利申請公開No. W02010/088514中提供，該國際專利申請公開No. W02010/088514的標(biāo)題為 “PORTABLE HIGH GAIN FLUORESENCE DETECTION SYSTEM”，該文獻(xiàn)整個(gè)被本文參引。熱控制模塊310和具有10個(gè)氣動口的氣動控制界面330在圖3B中更詳細(xì)地表示，該圖3B包括傾斜安裝板300的局部視圖。盒的底側(cè)(該底側(cè)通過作為熱界面的薄層導(dǎo)熱聚合物來密封)與第一、第二、第三和第四“區(qū)域”加熱元件(311、312、313、314)的上表面接觸。風(fēng)扇315用于冷卻。第一加熱兀件的頂表面提供有鏡面320,并結(jié)合主機(jī)儀器的光學(xué)裝置來操作，用于當(dāng)盒對齊在空間對接的壁凹中時(shí)通過光學(xué)窗101來透射和捕獲反射光和/或突光發(fā)光。圖4是一次性微流體盒100的分解圖，其中有在脆弱液體儲存器中的板載液體試齊U。各試劑儲存器是承載液體試劑的雙層雙重隔膜包。盒的底架將試劑儲存器(421、422、423、424)支承在殼體內(nèi)的分開井426中。如這里所示的盒是設(shè)計(jì)成用于PCR的盒，并包括四種液體試劑。還表示了在盒底架102的前部前端105上的光學(xué)窗切口 101。用于隔離在化驗(yàn)中產(chǎn)生的液體廢物的吸收墊430處在底架內(nèi)部并在蓋板103下面。盒100是一次性的，并密封以便防止生物有害廢物流失。在裝置的蓋103上的試樣進(jìn)口 104是裝置中的僅有的外部流體可進(jìn)入口。所有試劑(包括任何干試劑和任何液體試劑或再水合流體)都提供于裝置的結(jié)構(gòu)中。在盒底架的底側(cè)提供有兩個(gè)“卡”容納微流體工作部，即“外側(cè)卡”410和“內(nèi)側(cè)卡”400。這些卡組成層疊和/或模制層，并包含設(shè)計(jì)成用于PCR化驗(yàn)的液壓和氣動網(wǎng)絡(luò)。它們通常為柔性的，并由塑料制造，例如聚對苯二甲酸乙二醇酯，盡管并不局限于此。盤409是用于從試樣中除去核酸的玻璃固相吸附劑。在安裝固相盤409后需要密封補(bǔ)片425來密封外側(cè)卡的液壓工作部。外側(cè)卡410包含流體線路，該流體線路與液體試劑儲存器421、422、423、424以及固相吸附劑盤409 —起工作，以便通過圖5B中概括的規(guī)范來提取核酸。內(nèi)側(cè)卡400通過在兩個(gè)卡400和410之間的流體界面(交疊舌片411a/411b，用于形成卡接頭)來接收凈化的核酸，并在嵌入卡內(nèi)的微流體槽道的液壓網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。內(nèi)側(cè)卡包括薄的表面薄膜，該表面薄膜形成檢測窗口 101a，該檢測窗口 IOla密封包圍在卡本體內(nèi)的檢測腔室的頂部和底部。這些腔室包含少于50 μ L的流體，并通過與圖3Β的加熱塊接觸而加熱。墊圈111提供為用于在卡舌片411b處使得氣動控制界面與內(nèi)側(cè)卡的底表面密封，這使得主機(jī)儀器的氣動分配歧管連接和延伸至微流體裝置內(nèi)。圖5A是外側(cè)卡411的透視圖，該外側(cè)卡411與盒底架以及液體試劑儲存器交接，用于從生物試樣中提取核酸目標(biāo)物；圖58是提取方法的示意圖。在基于Boom方法(美國專利No. 5234809)的提取處理中，試樣首先與溶解緩沖劑(該溶解緩沖劑包括促溶劑和清潔劑的混合物)混合，并與固相吸附劑409接觸。在通過多個(gè)等分的洗滌緩沖劑洗滌之后(該洗滌緩沖劑傳送給廢物)，吸附的核酸501通過稀釋緩沖劑溶液進(jìn)行洗提，并通過舌片411a下面的流體連通口系統(tǒng)而傳遞給(開口箭頭，至圖7A)內(nèi)側(cè)卡400上的分段歧管。該分段歧管的液體內(nèi)容物用于核酸擴(kuò)增，如后面所述。在提取的各步驟中都需要液體試劑。各液體試劑儲存在具有液體中心的雙層箔隔膜中，且液體在氣動促動器的控制下釋放，該氣動促動器將雙層隔膜推向尖銳件，該尖銳件(只)使得隔膜的底層破裂，并迫使液體進(jìn)入卡的液壓工作部中。該處理在圖6A-6G中表示。圖6A-6G提供了在形成有井426的密封內(nèi)部腔室615中的試劑儲存器囊袋600的多個(gè)視圖，該試劑儲存器囊袋600由具有液體試劑中心601的雙層(即兩層)隔膜(層602、603)以及布置在儲存器下面的“尖銳件”610或“倒刺”來形成，尖銳件的尖端朝向上，抵靠兩個(gè)隔膜層603a/603b的下部。尖銳件部件610形成為用于穿刺和釋放液體內(nèi)容物進(jìn)入微流體盒或卡的液壓工作部中。圖6A表示了液體充裝囊袋或儲存器，該液體充裝囊袋或儲存器包括環(huán)繞液體中 心的兩個(gè)隔膜層。這兩層通過在圖6B和6C中的囊袋而以剖視圖表示。層602和603包圍液體中心601。這兩層在邊緣604處密封。聚酯和其它塑料的箔涂覆層用于形成隔膜層602、603。頂層602通常堅(jiān)韌、有柔性和抗穿刺。相反，底層603設(shè)計(jì)成由尖銳件610穿刺，并通過試劑出口槽道611 (圖6D)而釋放它的內(nèi)容物至盒的微流體工作部中，這里并沒有按比例表示。圖6B表示了雙面凸的儲存器，該儲存器有通過密封邊緣604a來包圍液體中心601a的隔膜層602a和603a，圖6C表示了平凸形儲存器，該儲存器有通過密封邊緣604b來包圍液體中心601b的隔膜層602b和603b，它們各自在裝配和使用中有特殊優(yōu)點(diǎn)。在圖6D中，試劑儲存器表示為安裝成在盒殼體的試劑腔室615中包圍液體中心601的雙重隔膜。唇緣密封件605使得氣動工作部606與液壓工作部612隔離。盡管并不局限于此，唇緣密封件605可以通過由UV激活粘接劑或本領(lǐng)域已知的其它密封方法進(jìn)行膠接而形成。當(dāng)由空氣通過氣動控制口 607來增壓時(shí)，雙重隔膜組件(600)的下表面壓靠尖銳件610，以使得底部薄膜層603破裂，但是頂部薄膜層602并不破裂(圖6B-6C)。這樣，機(jī)構(gòu)成為微尺寸的氣動隔膜驅(qū)動液體分配器。令人驚訝的是，一旦液體中心被刺穿，連續(xù)氣動脈沖可以用于迫使微升容積的液體連續(xù)通過出口槽道611進(jìn)入液壓工作部。試劑出口槽道611與在化驗(yàn)反應(yīng)中涉及的液壓網(wǎng)絡(luò)的槽道和腔室流體連通(根據(jù)潤濕、混合、洗提等)。塑料蓋層616和617密封該腔室615。圖6E-6G提供了尖銳件部件610的詳細(xì)視圖，該尖銳件部件610設(shè)計(jì)成使得下部薄膜層602的穿刺不會環(huán)繞該尖銳件的輪廓自密封。圖6E是正面視圖；圖6 是側(cè)視圖，圖6G是CAD產(chǎn)生的等距視圖。盡管并不局限于所示的確切形狀和詳細(xì)尺寸，但是該尖銳件形成為等分圓錐620或截頭圓錐，具有倒刺尖端621和平的第一面622，該第一面622通過附加模制凸出的凸形第二小面623和凹入的凹形第三小面624而變化，該凹形第三小面624形成出口槽道611的嘴。在尖銳件的凸出尖端中特別模制的凹形(凹形第三小面624)特別與第二小面623的凸形組合，從而挫敗了薄膜層要封閉隔膜603中的裂口的趨勢，從而保證作為基本氣動驅(qū)動“龍頭”來操作，它形成為用于刺穿和排出隔膜中心的液體。該龍頭保持打開，流體響應(yīng)通過口 607施加的控制氣動壓力而自由地流動。盤625幫助儲存器的流體 排出至出口槽道611中。在大量試驗(yàn)之后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)截頭圓錐的倒刺尖端621的半徑為O. 004至O. 0045英寸時(shí)尖銳件的穿刺作用最有利，且該特征的優(yōu)選半徑確定為O. 004英寸(千分之四英寸)。通過對比發(fā)現(xiàn)，在該范圍外的尖銳件并不這么有效。可以選擇，本發(fā)明的微流體盒的特征可以是具有用于刺穿試劑儲存器的尖銳件，其中，該尖銳件為截頭圓錐截面，該圓錐由有選擇地刺穿雙重隔膜的刺破敏感層的尖端形成，該尖端有半徑為O. 0040至O. 0045英寸的切割點(diǎn)。截頭圓錐截面提供有平的第一小面、形成于該平的第一小面上的凸形第二小面以及形成于該凸形第二小面上的凹形第三小面，該凹形第三小面形成流體出口的嘴，該嘴從該處降低，用于將釋放的液體排出至液壓工作部中。在具有液體中心的試劑儲存器的優(yōu)選實(shí)施例中，雙層隔膜的第一層防止破裂，而靠近尖銳件的第二層易于破裂。第一層可以是具有外部尼龍薄膜的層壓聚合物，它設(shè)置成抗穿刺，而第二層可以是具有外部聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜的層壓聚合物，它設(shè)置成易于穿刺。合適的聚合物層還可以包含夾層金屬化層，并可由例如Technipaq Inc (CrystalLake, IL)獲得，具有層壓的聚乙烯/金屬/聚合物夾層的三層結(jié)構(gòu)。在兩個(gè)隔膜部件之間的相對聚乙烯薄膜用于能夠熱密封。UV激活膠水可以用于形成密封件或墊圈，以便將隔膜裝配至盒殼體中。圖7A和7B表示了當(dāng)安裝在主機(jī)儀器中時(shí)以一定傾角傾斜的內(nèi)側(cè)微流體卡400。卡在它的側(cè)部傾斜大約15度(Θ )，如圖7B中所示，該圖7B是穿過包圍在卡中的三個(gè)檢測腔室的剖視圖?？ǖ膬A角設(shè)置成在潤濕和充裝過程中使得卡內(nèi)的空氣浮動導(dǎo)向一個(gè)或多個(gè)通氣口，且產(chǎn)生的任何氣泡都捕獲在卡的上游槽道和腔室中，限制進(jìn)入卡的加熱區(qū)域和檢測腔室中。由圖5B的核酸洗提操作產(chǎn)生的流體501進(jìn)入內(nèi)側(cè)卡，如圖所示，并送入在后面的圖中所示的微流體槽道和腔室的網(wǎng)絡(luò)中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，10至35度的傾角有利于減小由氣泡夾帶引起的干擾，并可以通過將主機(jī)儀器設(shè)置成容納傾斜平臺(微流體卡或盒在化驗(yàn)過程中支承在該傾斜平臺上)而用于自動化驗(yàn)系統(tǒng)。還可以提供振動輔助裝置，以便進(jìn)一步使得氣泡與關(guān)鍵通路隔離。這些特征也幫助在初始潤濕過程中除去空氣，從而減少可用于氣泡形成的全部空氣。圖8A和8B表示了在微流體卡400內(nèi)用于執(zhí)行PCR的槽道和腔室的網(wǎng)絡(luò)800的“蟲眼圖”(仰視圖)。附圖表示了形成微流體子線路的內(nèi)部可潤濕表面的外觀，但是為了清楚，槽道和腔室的深度進(jìn)行了夸大。如圖8A中所示，當(dāng)表示三個(gè)槽道a、b和c時(shí)，洗提液501(包含試樣的任何核酸)通過通路801而通入卡中，并進(jìn)入三個(gè)腔室的分段歧管802’，該分段歧管802’的目的是使得流體均等地分開進(jìn)入三個(gè)下游槽道中，并輕柔和均勻地迫使流體進(jìn)入下游腔室804和805，同時(shí)在內(nèi)部塑料表面的初始潤濕過程中避免夾帶氣泡。閥811首先關(guān)閉。圖8B的機(jī)構(gòu)表示單個(gè)槽道。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使得液體容積(一定容積的液體)501首先在多個(gè)槽道之間分開將由于不均勻潤濕而出現(xiàn)問題，但是希望能夠平行地進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增或化驗(yàn)。作為對實(shí)際情況的簡化，在充裝處理的第一階段，液體501在壓力下進(jìn)入三個(gè)腔室的歧管802’。各腔室802a、802b、、802c通過彈性隔膜(見圖9I-9L，900)而水平截開，該彈性隔膜使得流體內(nèi)容物與交接氣動腔室(即在由隔膜分開的兩個(gè)空腔堆垛的通氣上部空腔)隔離，并在充裝過程中被動拉伸。在該步驟中，壓力在多個(gè)槽道之間相等。在充裝過程中，隔膜下面的空氣通過通氣口 803而離開，該通氣口 803包含作為衛(wèi)生特征的氣體可透過和液體不可透過的過濾膜，該過濾膜在潤濕時(shí)密封。繼續(xù)增壓將使得腔室802中的隔膜膨脹，這樣，當(dāng)通過打開閥811 (以及全部下游閥)而釋放時(shí)，增壓液體在由彈性隔膜900 (該彈性隔膜900在腔室802的充裝過程中擴(kuò)張)施加的恢復(fù)彈簧力或壓力推壓時(shí)均勻地流入三個(gè)(或更多)平行槽道內(nèi)。因?yàn)榛謴?fù)壓力能夠精確控制和進(jìn)行限制，并作為隔膜的彈簧常數(shù)的函數(shù)，且因?yàn)槟軌蚓_控制彈性隔膜的移動容積，因此下游槽道的潤濕或“起動加注”的程度能夠以容積充裝移液管的方式精確標(biāo)定，這顯然是本領(lǐng)域的進(jìn)步。彈性隔膜由作為隔膜材料的聚氨酯、聚偏二氯乙烯和/或聚酯來獲得。一種這樣的材料是Saranex (Dow Chemical),它是作為復(fù)合材料薄膜而夾在聚烯烴層之間的聚偏二氯乙烯擠出片材。也可以使用其它材料。有利的是，各腔室802的被動拉伸隔膜900 (圖9A-9L)這樣成為能量儲存裝置，用于將流體分配至一個(gè)或多個(gè)平行的下游槽道中，而沒有夾帶氣泡。通過知道下游容積，在拉伸隔膜中的能量可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，以使得各平行槽道都充裝至標(biāo)記，與容積移液管中相同，充裝的容積通常達(dá)不到各分支中的檢測腔室806和最終閥結(jié)構(gòu)812，但是充分潤濕腔室804和805。在潤濕過程中，通過末端通氣口 807，在穩(wěn)定前進(jìn)的彎液面前面的所有下游結(jié)構(gòu)都沒有空氣，該末端通氣口 807在需要時(shí)可以通過在表示為通氣口 803的形式下由憎水性液體不可透過和氣體可透過的隔膜覆蓋而在衛(wèi)生條件下工作。因?yàn)樵诟裟に沙诘倪^程中液體不會通過氣動超壓而被迫流動，這并不取決于毛細(xì)管流，且是有限的，因此彎液面逐漸和規(guī)則地前進(jìn)，從而限制在它的尾跡中夾帶的氣穴。這是本領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步，從而能夠在并不夾帶氣泡的情況下精確地充裝平行的下游網(wǎng)絡(luò)。該方法通過卡的傾角和通過從槽道和腔室的連接處消除拐角半徑(因?yàn)楣战怯袝r(shí)會局部增加表面張力，這可能阻礙潤濕)而有利。在該方法的進(jìn)一步改進(jìn)中，腔室804和805也裝備有內(nèi)部隔膜。與腔室802的被動撓曲隔膜不同，腔室804和805的隔膜的氣動面不與大氣相通，并能夠由從壓力歧管供給的正氣動壓力或負(fù)氣動壓力來主動驅(qū)動，因此用作泵。在充裝循環(huán)中，隔膜向下“張開”或“膨脹”，以便占據(jù)下部液壓腔室的容積，從而減少或消除腔室的任何死區(qū)容積。在腔室的外側(cè)底邊緣處滲透經(jīng)過這些隔膜的液體將充分潤濕腔室和排出任何殘余的空氣。然后，通過在關(guān)閉閥812后釋放隔膜，液體從上游吸入，以便充滿和占據(jù)腔室的容積。在該方法的進(jìn)一步改進(jìn)中，干試劑布置在腔室804和805中，干試劑的性質(zhì)與要進(jìn)行的化驗(yàn)的性質(zhì)相關(guān)。試劑通常點(diǎn)在腔室的中心附近。在初始潤濕過程中，隔膜充分向下張開，以便占據(jù)下部液壓腔室的容積，從而減少其中的死區(qū)容積，并當(dāng)潤濕腔室的剩余死區(qū)容積時(shí)保護(hù)性地覆蓋干試劑點(diǎn)，并防止溶解和沖走。在閥812關(guān)閉和通過使得橫過隔膜的壓力差反向而使得腔室充滿液體之后，試劑以充分的強(qiáng)度快速溶解。干試劑的位直在圖8B中標(biāo)記。如圖所不，具有特殊功能的干試劑布直在指定腔室中。干試劑點(diǎn)821例如包含主混合物和引物，它們優(yōu)選是混合，并在有目標(biāo)模板時(shí)變性。該腔室804優(yōu)選是加熱至足以使得模板核酸變性的溫度。腔室805例如包含干燥聚合酶822，并處于適合引物和目標(biāo)退火和開始聚合的溫度。在檢測腔室806中，干試劑點(diǎn)820包含探針，例如“分子信標(biāo)”或插入染料，它們用于檢測在擴(kuò)增中產(chǎn)生的擴(kuò)增子。檢測腔室806在“頂部”和“底部”由薄膜光學(xué)窗來界定，并反射地透射，用于擴(kuò)增目標(biāo)的熒光計(jì)檢測。順便 說明，底部薄膜層也有效用于熱量從鏡面加熱元件(圖3B中所示)傳遞，卡在化驗(yàn)過程中與該加熱元件交接，因此該底部薄膜層也能夠稱為“熱-光學(xué)窗”，例如通過如后面所示的熱熔曲線而有利于化驗(yàn)。圖8C和8D介紹了用于PCR的可選盒830。在該盒中，在試樣進(jìn)口 831處在壓力下進(jìn)入盒的試樣501在三岔口 833處分開，并充裝三個(gè)腔室832a、832b、832c中的各個(gè)，這三個(gè)腔室832a、832b、832c在憎水性通氣口 834處獨(dú)立地通氣。各腔室832包含彈性氣動液壓隔膜，該隔膜在充裝過程中在拉伸時(shí)在容納于腔室內(nèi)的液體容積上施加壓力。腔室可以通過從上游泵注入一系列增壓容積而充裝。流入分配歧管的三個(gè)分支中的流體并不必須均等分割，但是在各腔室(832a、832b、832c)中的容積和壓力等壓和均衡，因?yàn)榉侄纹绻苓M(jìn)行平衡。在充裝處理過程中，下游閥835關(guān)閉。在分段歧管836的增壓完成和平衡之后，閥835打開，以使得腔室832的彈性隔膜能夠放松，同時(shí)被動地將液體內(nèi)容物推入擴(kuò)增腔室837和838內(nèi)。在該處理過程中，腔室837和838的隔膜元件膨脹，以便占據(jù)下部液壓腔室，這樣，頂部空間消除，且在腔室中的任何干燥試劑都防止由前進(jìn)的彎液面沖走。PCR擴(kuò)增如對于圖8A和圖SB所述來進(jìn)行。下游閥839打開，以便通過在兩個(gè)腔室837和838中的增壓隔膜而將任何擴(kuò)增產(chǎn)品通過前室840傳送給檢測腔室846，同時(shí)閥835關(guān)閉。任何空氣都通過末端通氣口 847而沖出系統(tǒng)外。優(yōu)選是，印刷或點(diǎn)在前室中的干燥探針841在注入檢測腔室中之前進(jìn)行溶解和與擴(kuò)增子混合，這提高了界定檢測腔室的熱-光學(xué)窗的透明性，并減少或防止用作分子信標(biāo)或FRET探針的某些染料自動發(fā)熒光。通過使得卡在傾角Θ下工作，如圖7中所示，空氣有利地排泄至在上側(cè)布置于檢測腔室上的通氣口。由圖8D可見，檢測腔室846和擴(kuò)增腔室837、838的進(jìn)口、出口和通氣口不對稱布置。當(dāng)盒或卡在主機(jī)儀器的傾斜平臺上傾斜時(shí)(參考圖3A和7B)，在擴(kuò)增腔室之間的連通口(842、843)和與檢測腔室相連的末端通氣口(848)相對于腔室自身升高，且輪廓設(shè)置成克服幾何形狀的任何表面張力效果。因此，通過在潤濕過程中的液體前進(jìn)，在系統(tǒng)中的空氣有利地從系統(tǒng)沖出，該液體首先充裝腔室的底部方面，且在PCR過程中通過與加熱相關(guān)的液體脫氣而產(chǎn)生的任何氣泡將有利地捕獲在擴(kuò)增腔室之間，以便不會干擾傳熱，且不會進(jìn)入檢測腔室。
在更多方法細(xì)節(jié)中，圖9A-9L表示了通過分段歧管來被動初始潤濕的簡化時(shí)序和示意步驟或階段。剖視圖和平面圖表示為使得能夠看見前進(jìn)彎液面的進(jìn)程。在第一圖(圖9A)中，在分段歧管腔室802中的隔膜900表示為由于通過打開的閥910而從左側(cè)進(jìn)入的液體試劑而向上張開、脹大，且隔膜的氣動面在905處與大氣通氣。下游腔室903干燥，閥911關(guān)閉。在右側(cè)的圖9B的平面圖中監(jiān)測試劑點(diǎn)905的初始干狀態(tài)。在圖9C中，閥910和閥911都關(guān)閉，閥912打開用于排氣。隔膜900增壓，并向下張開覆蓋試劑點(diǎn)905 ;在圖9D中通過點(diǎn)劃線902a表示了隔膜的覆蓋區(qū)與腔室903的底部接觸。在圖9E中，閥910保持關(guān)閉，閥911和912打開。如圖9F的平面圖中所示，前進(jìn)的彎液面開始進(jìn)入腔室903。在圖9G中，液體繼續(xù)潤濕腔室903，并充滿在腔室的周邊環(huán) 繞由隔膜形成的折疊頂?shù)娜魏嗡绤^(qū)容積。持續(xù)該處理，如圖91中的快照所示。在左側(cè)在圖9G和91的時(shí)間間隔快照中表示了被動拉伸隔膜900在腔室802中逐漸縮小。在圖9K中可以看見，當(dāng)閥910和912都關(guān)閉時(shí)，橫過隔膜902施加的壓力能夠反向，以使得液體從分段歧管腔室901吸入并充滿腔室903，從而溶解干燥試劑905。圖9L中圖示表示了完全溶解。在該處理過程中，空氣從潤濕區(qū)域有效排出，首先通過消除腔室903中的死區(qū)空間，然后通過隔膜900的放松而逐漸除去剩余的空氣，最后通過密封排泄系統(tǒng)和將腔室802的內(nèi)容物吸入腔室903內(nèi)，以便溶解和定量混合為試劑溶液。充裝下游腔室的液體容積能夠通過設(shè)置彈性隔膜900和腔室802的排出容積來精確控制；被動的下游流體潤濕的速率通過選擇彈性隔膜900的彈簧常數(shù)來控制。圖10A-10C表示了用于起動加注PCR反應(yīng)的上述發(fā)明機(jī)構(gòu)的進(jìn)一步優(yōu)選應(yīng)用，其中，表示了系統(tǒng)具有用于核酸基體和聚合酶的熱循環(huán)的兩個(gè)區(qū)域。全部流體系統(tǒng)都容納于卡或盒本體1000中。分段歧管腔室1001向大氣通氣，并包含被動彈性隔膜1002，該被動彈性隔膜1002能夠儲存通過閥1003從左側(cè)進(jìn)入的增壓流體。如圖IOB中所示，該隔膜1002在流體進(jìn)入過程中張開，然后關(guān)閉閥1003。在腔室1010和1020中的隔膜1011和1021分別增壓為形成在干燥試劑點(diǎn)1012和1022上方的保護(hù)膨脹部，并從腔室中排出死區(qū)空間的空氣，如圖IOB中所示。下游閥1023和1033在該階段打開，以使得排出的空氣通過末端通氣口 1034而從系統(tǒng)排出。在圖IOC中，閥1004打開，液體進(jìn)入兩個(gè)腔室(PCR將在這兩個(gè)腔室中進(jìn)行)，首先進(jìn)入的量足以用于腔室的起動加注。在圖IOD至G中繼續(xù)該順序。流體引入足以充滿變性熱腔室1010的量，但是不再多了 ；向隔膜1011施加真空以幫助該處理。圖IOD表示了“熱”或“變性”腔室1010處于真空，液體吸入以便充滿該腔室。在任何干試劑1012定量溶解，且核酸充分變性之后，腔室1010的液體內(nèi)容物在適合引物退火的溫度下傳遞給第二腔室1020，以使能夠通過試劑點(diǎn)1022的溶解而開始的聚合酶介質(zhì)擴(kuò)展。圖IOE表示了通過使得橫過兩個(gè)隔膜的壓力差反向而使得液體從熱腔室泵送至“退火”腔室。該處理在圖IOF中再次反向，表示兩個(gè)隔膜的往復(fù)泵送作用，以便迫使液體在1010處的熱區(qū)域(該熱區(qū)域與加熱塊313接觸，圖3B)和在1020處的退火區(qū)域(該退火區(qū)域與加熱塊312接觸)之間來回運(yùn)動。這種往復(fù)氣動液壓作用是通過裝置中的熱循環(huán)而進(jìn)行核酸擴(kuò)增的基礎(chǔ)。最后，具有任何擴(kuò)增子的流體注入檢測腔室中，如圖IOG中所示。這里所述的檢測腔室裝備有一對光學(xué)窗1035。
在更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)中，使用附加溫度站和具有熱塊314 (圖3B)的相連熱界面，例如用于在PCR類型擴(kuò)增處理之前進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄酶介質(zhì)合成。因此，附加腔室可能很有用，幾何形狀和結(jié)構(gòu)可以通過合理延伸本發(fā)明的教導(dǎo)而變化(進(jìn)行必要修正)。在潤濕過程中，在各腔室中的隔膜用于減小初始死區(qū)容積。隨后，使用橫過隔膜施加壓力差，以便利用一系列隔膜組件和閥元件作為泵和混合元件，用于流體容積通過裝置的液壓工作部進(jìn)行液壓運(yùn)動。逆轉(zhuǎn)錄酶裝置的第一實(shí)施例在圖14A-14C中表示，并將在下面更詳細(xì)介紹。圖11-13概括了上述方法的步驟。圖11表示了用于從試樣中提取核酸的方法的步驟，其中，具有液體中心的雙層雙重隔膜用于分配試劑。在起動主機(jī)儀器之后，液體試樣布置在微流體盒中，且盒插入儀器的空間對接的壁凹內(nèi)。主機(jī)儀器閱讀在微流體盒上的條形碼(該條形碼表示要進(jìn)行的化驗(yàn)的類型)。液體試樣吸入混合腔室中，且細(xì)胞溶解緩沖劑分配給液體試樣并與其混合。為了分配溶解緩沖劑，“液體中心隔膜”通過氣動驅(qū)動而推壓抵靠尖銳件，從而使得隔膜的底層破裂，并泵送液體至卡內(nèi)。然后，試樣溶解產(chǎn)物與位于卡中的腔室內(nèi)的固相核酸吸附劑接觸，將耗盡的試樣溶解產(chǎn)物弓丨導(dǎo)至盒上的廢物區(qū)。乙醇溶 液從第二液體中心隔膜部件分配，并用于從固相吸附劑中洗滌污染物。洗滌步驟可以重復(fù)。洗液分離至盒上的廢物。固相基體主要在空氣流中干燥，以便除去剩余溶劑。然后，洗提緩沖器從最后的液體中心隔膜儲存器進(jìn)行分配，并與固相基體接觸。然后，具有洗提核酸501的洗提液傳遞給分段歧管，用于進(jìn)入檢測子線路。在這里提供的實(shí)例中，具有PCR擴(kuò)增的核酸化驗(yàn)在洗提液中進(jìn)行。其它核酸擴(kuò)增方法為本領(lǐng)域已知，由這里的教導(dǎo)和圖示可知，這些方法可以通過改造本發(fā)明的裝置的多個(gè)部件來實(shí)施。圖12表示了用于通過從具有液體中心601 (如圖6D中所示)的雙層雙重隔膜分配的液體來“起動加注”(即潤濕加載)液壓工作部的槽道和腔室的方法的步驟。在由通過使得裝有緩沖劑的試劑儲存器破裂而釋放的洗提緩沖劑對核酸提取液501進(jìn)行洗提之后，流體能夠在與固相吸附劑409 (圖4)接觸時(shí)振蕩，以便高效吸附核酸。洗提液再在壓力下泵送至微流體卡的分段腔室中，以使得覆蓋腔室的彈性隔膜張開和儲存潛能。分段腔室進(jìn)口密封，且整個(gè)分段歧管的壓力快速均衡。然后，打開通向各槽道的下游閥。全部下游流體槽道和腔室都在該操作過程中通氣，這對于下游可潤濕表面的潤濕或起動加注很有利。優(yōu)選是，當(dāng)彈性隔膜放松，從而釋放它的儲存能量時(shí)，隔膜的彈性輕柔但穩(wěn)定地迫使液體容積均等和平行地進(jìn)入下游槽道和腔室中，前進(jìn)的彎液面排出任何剩余空氣，且并不夾帶氣泡，這是本領(lǐng)域的進(jìn)步。液體容積這樣分開至分支的平行流體通路中。圖13表示了在并不夾帶氣泡或沒有試劑沖出的情況下再水合干試劑的方法的步驟。在本發(fā)明的盒的制造過程中，干燥試劑點(diǎn)印刷在試劑腔室的中心。試劑腔室設(shè)置成具有交疊的可增壓隔膜。添加液體試樣，且盒插入主機(jī)儀器的空間對接的壁凹中，該主機(jī)儀器提供壓力和閥指令，用于盒的操作。試樣首先在壓力下泵送至不排氣的分段腔室中，這使得覆蓋分段腔室中的液體的彈性能量儲存隔膜張開。前述下游試劑腔室通氣，其中的可增壓隔膜進(jìn)行增壓，以便形成環(huán)繞和在干燥試劑點(diǎn)上方的保護(hù)性臨時(shí)密封件。然后，打開分段腔室的下游閥；彈性隔膜放松，隔膜恢復(fù)的彈性能量輕柔地迫使試樣流體進(jìn)入下游試劑腔室中，從而排出保護(hù)性臨時(shí)密封件周圍的任何剩余空氣。最后，橫過可增壓隔膜的壓力差反向或釋放，從而暴露試劑點(diǎn)，并將全部容積的液體吸入試劑腔室中，從而使得試劑點(diǎn)有利地在全部強(qiáng)度下溶解在試樣流體中，而并不夾帶氣泡，這是本領(lǐng)域的進(jìn)步。
圖14A和14C是用于逆轉(zhuǎn)錄酶介質(zhì)PCR的微流體槽道或腔室的網(wǎng)絡(luò)的蟲眼圖。圖中表示了具有三個(gè)平行槽道a、b和c的裝置。試樣501在槽道之間分割，這樣，例如可以平行地進(jìn)行三個(gè)(或更多)單獨(dú)的多重化驗(yàn)。與前述實(shí)施例不同，這里，試劑1220印刷在槽道1205中，而不是在隔膜驅(qū)動腔室中。不過保持圖9中明確說明的被動潤濕原理液體通過能量儲存隔膜(該能量儲存隔膜已經(jīng)通過上游泵來起動加注)的被動放松而排出至槽道中。該原理有效地限制了夾帶空氣，并有效地平衡在從公共分段歧管分支的平行槽道中流動的流體，各槽道提供有離散的被動隔膜。利用這種被動驅(qū)動潤濕原理的裝置(如這里所實(shí)現(xiàn))是本領(lǐng)域的進(jìn)步，從而克服了與現(xiàn)有技術(shù)的毛細(xì)管潤濕和主動潤濕裝置相關(guān)聯(lián)的缺陷。在一個(gè)實(shí)施例中，圖14A和14C表示了用于在本發(fā)明的另一微流體卡中進(jìn)行rtPCR的槽道和腔室的網(wǎng)絡(luò)1200。在該“蟲眼圖”中，為了清楚，對槽道和腔室的深度進(jìn)行夸大。洗提液501 (包含試樣的任何核酸)通過通路1201而通入卡中，并進(jìn)入流體互連的三腔室分段歧管1202，該分段歧管1202的目的是使得流體均等地分開進(jìn)入三個(gè)下游流動通道中，并輕柔和均勻地迫使流體通過下游閥1204、試劑槽道1205、閥1206和進(jìn)入腔室1207，同時(shí)在內(nèi)部塑料表面的初始潤濕過程中避免夾帶氣泡。閥1204首先關(guān)閉。 在充裝處理的第一階段中，液體501在壓力下進(jìn)入多腔室歧管1202。各腔室1202通過彈性隔膜(見圖9，900)而水平截開，該彈性隔膜使得流體內(nèi)容物與腔室中的通氣上部氣動空腔隔離，并在充裝過程中被動拉伸。在充裝過程中，隔膜下面的空氣通過通氣口 1203而離開，該通氣口 1203包含作為衛(wèi)生特征的氣體可透過、液體不可透過的過濾膜，該過濾膜在潤濕時(shí)密封，并允許增大壓力，從而使得隔膜膨脹。繼續(xù)增壓將使得腔室1202中的隔膜通過液體而膨脹，這樣，當(dāng)通過打開閥1204 (以及全部下游閥)而釋放時(shí)，增壓液體在由彈性隔膜施加的恢復(fù)力推壓時(shí)均勻地流入三個(gè)(或更多)平行下游槽道內(nèi)?；謴?fù)壓力能夠控制和進(jìn)行限制，并作為隔膜的彈簧常數(shù)的函數(shù)。彈性隔膜的容積排量能夠進(jìn)行控制，因此下游槽道的潤濕(或“起動加注”)的程度能夠以容積充裝移液管的方式來標(biāo)定出標(biāo)記。等量分割試樣的能力在微流體裝置中平行地進(jìn)行化驗(yàn)時(shí)很有利，且這在試圖通過毛細(xì)管流動和通過抽吸或正排量方法(例如注射器泵)時(shí)將成為問題，因?yàn)椴荒鼙ＷC在各槽道內(nèi)的流動以相等速率前進(jìn)。令人驚訝的是，當(dāng)利用通過在分段歧管中的匹配隔膜的被動放松來驅(qū)動的潤濕原理時(shí)，對于多個(gè)平行槽道，該問題已經(jīng)很好地得以解決。腔室1207和1208裝備有內(nèi)部隔膜，該內(nèi)部隔膜在液壓腔室和氣動腔室之間交接。不過，與腔室1202的被動撓曲隔膜不同，腔室1207和1208的隔膜的氣動面不與大氣相通，并能夠由從外部源供給的正氣動壓力或負(fù)氣動壓力來主動驅(qū)動，因此用作泵。在充裝循環(huán)中，隔膜充分向下“張開”至液壓空腔中，以便減少或消除腔室的任何死區(qū)容積。在腔室的外側(cè)底邊緣處滲透經(jīng)過這些隔膜的液體將充分潤濕腔室和排出任何殘余的空氣。然后，通過在關(guān)閉閥1209后釋放隔膜，液體在抽吸壓力下從上游吸入，以便充滿液壓腔室1207的整個(gè)容積，空氣已經(jīng)完全從系統(tǒng)中沖出。在變化形式中，一個(gè)氣動腔室與大氣通氣，并從動于不通氣隔膜的作用。兩個(gè)腔室通過閥而與其余線路元件隔離。當(dāng)主動隔膜脈動為具有正壓力時(shí)，迫使液體通向鄰接腔室；當(dāng)主動隔膜脈動為具有負(fù)壓力時(shí)，液體從相鄰腔室吸入。也可選擇，被動隔膜可以是彈性隔膜。在該方法的進(jìn)一步改進(jìn)中，干試劑布置在腔室1207和1208中以及槽道1205中。試劑通常點(diǎn)在液壓腔室或槽道的底板上，其中，通道的寬度允許印刷頭進(jìn)入。點(diǎn)在槽道1205中的試劑1220包括在合適緩沖劑中的逆轉(zhuǎn)錄酶和核苷酸基質(zhì)。通常，PCR主混合物和合適的引物提供為在腔室1207中的試劑點(diǎn)1221。點(diǎn)1222是脫水Taq試劑點(diǎn)。點(diǎn)1223包括可選的檢測試劑，例如熒光探針。多個(gè)單獨(dú)的點(diǎn)可以利用在各腔室或槽道中的輥式或板式處理來印刷。在洗提液501中的RNA目標(biāo)通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用而轉(zhuǎn)變成cDNA，通常在20至45°C的溫度下。該作用在洗提緩沖劑中的槽道1205中實(shí)現(xiàn)，并在圖14B中更詳細(xì)地表示，其中，閥1204和1206通過包含干燥試劑點(diǎn)1220的變化槽道段1205來分開。試劑例如逆轉(zhuǎn)錄酶溶解在經(jīng)過特殊變化槽道段的試樣。還提供了用于使酶完全作用的基質(zhì)和任何余因子。在初始潤濕過程中，在腔室1207和1208中的隔膜充分向下張開至液壓腔室中，以便減小其中的死區(qū)容積，且由隔膜提供的覆蓋保護(hù)地密封了底部的干試劑點(diǎn)，防止在潤濕過程中過早溶解和沖走。通氣口 1211打開，以便排出由于流體(該流體通常為平滑前進(jìn)的彎液面)進(jìn)入而排出的空氣。在閥1209關(guān)閉以及通過使得橫過隔膜的壓力反向而使得腔室 1207充滿液體(即吸入液體至腔室中)之后，閥1206也關(guān)閉。任何點(diǎn)入的試劑以充分的強(qiáng)度快速溶解，沒有稀釋，基本如參考圖8對于直接PCR處理所述，其中，不需要由RNA目標(biāo)物形成cDNA。因此，裝置的改造能夠靈活，并可以用于多種分子化驗(yàn)處理。優(yōu)選是，腔室1207加熱至足以使得模板核酸變性的溫度。腔室1208例如包含干燥聚合酶1222，并處于適合引物和目標(biāo)物退火和適合開始聚合的溫度。PCR的熱啟動例如通過溶解在腔室1208中的Taq聚合酶試劑點(diǎn)1222來開始。然后，通過將交替的壓力施加給兩個(gè)腔室1207和1208的隔膜，流體可以通過隔膜的往復(fù)氣動液壓作用而從變性狀態(tài)至退火狀態(tài)來回運(yùn)動，且在該處理過程中發(fā)現(xiàn)鏈延長和擴(kuò)增，成功地產(chǎn)生擴(kuò)增子。在檢測腔室1210中，干試劑點(diǎn)1223包含探針，例如“分子信標(biāo)”，該分子信標(biāo)用于檢測在擴(kuò)增中產(chǎn)生的任何擴(kuò)增子。與前面相同，檢測腔室1210通過薄膜光學(xué)窗而在頂部和底部界定，并反射透射，用于擴(kuò)增目標(biāo)物的熒光計(jì)檢測。順便說明，底部薄膜層還有效用于熱量從鏡面加熱元件(圖3B中所示)傳遞，卡在化驗(yàn)過程中與該加熱元件交接，因此該底部薄膜層也能夠稱為“熱-光學(xué)窗”，例如通過如后面所示的熱熔曲線而有利于化驗(yàn)或確認(rèn)擴(kuò)增子識別，如后面所述(圖 17U8A 和 18B)。圖14D和14E介紹了用于PCR的可選盒1230。在該盒中，在試樣進(jìn)口 1231處在壓力下進(jìn)入盒的洗提液501在三岔口 1233處分開，并充裝三個(gè)腔室1232a、1232b和1232c中的每一個(gè)，這三個(gè)腔室1232a、1232b和1232c在憎水性通氣口 1234處獨(dú)立地通氣。各腔室1232包含彈性氣動液壓隔膜，該隔膜在拉伸或張開時(shí)在容納于腔室內(nèi)的液體容積上施加壓力。需要時(shí)，腔室可以通過從上游泵注入一系列增壓容積而充裝，流入分配歧管的三個(gè)分支中的流體并不必須均等分割，但是在各腔室(1232a、1232b、1232c)中的容積和壓力是相等的，因?yàn)榉侄纹绻芷胶?。在充裝處理過程中，下游閥1235關(guān)閉。在分段歧管1236的增壓完成之后，閥1235和1237打開，以使得腔室1232的彈性隔膜能夠放松，同時(shí)被動地將液體內(nèi)容物推入逆轉(zhuǎn)錄槽道1238內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄在適合逆轉(zhuǎn)錄酶的緩沖劑、基質(zhì)和溫度條件下進(jìn)行；緩沖劑和任意增強(qiáng)因子通常供給為腔室1238中的干燥試劑點(diǎn)1257。然后，試樣推入擴(kuò)增腔室1247和1248中。各擴(kuò)增腔室裝備有氣動液壓隔膜。在該處理過程中，腔室1247和1248的隔膜元件在氣動壓力下膨脹，這樣，頂部空間消除，且在腔室中的任何干燥試劑都通過膨脹的隔膜(該隔膜張開至液壓腔室中，以便覆蓋試劑點(diǎn))而防止由前進(jìn)的彎液面沖走。PCR擴(kuò)增如對于圖14A和圖14C所述來通過逆轉(zhuǎn)錄而在cDNA上進(jìn)行。下游閥1249打開，以便通過給在兩個(gè)腔室1247和1248中的隔膜增壓而將任何擴(kuò)增產(chǎn)品通過前室1250傳送給檢測腔室1251，同時(shí)閥1237關(guān)閉。在各階段，系統(tǒng)中的任何空氣都通過末端通氣口 1252而沖走。優(yōu)選是，印刷或點(diǎn)在前室1250中的干燥探針1253在注入檢測腔室中之前進(jìn)行溶解和與擴(kuò)增子混合，這提高了界定檢測腔室的熱-光學(xué)窗的透明性，并減少或防止用作分子信標(biāo)或FRET探針的某些染料自動發(fā)熒光。由圖14E可見，檢測腔室1251和擴(kuò)增腔室1247、1248的進(jìn)口、出口和通氣口不對稱布置。當(dāng)裝置在主機(jī)儀器的傾斜平臺上傾斜時(shí)(參考圖3A和7B)，在擴(kuò)增腔室之間的連通口( 1254、1255)和與檢測腔室相連的末端通氣口( 1256)相對于腔室自身升高，且輪廓設(shè)置成克服幾何形狀的任何表面張力效果。因此，通過在潤濕過程中的液體前進(jìn)，在系統(tǒng)中的空氣有利地從系統(tǒng)沖出，該液體首先充裝腔室的下部方面，且在用于PCR的往復(fù)泵送過程中 通過與加熱相關(guān)的液體脫氣而產(chǎn)生的任何氣泡將有利地捕獲在擴(kuò)增腔室之間，以便不會干擾傳熱，且不會進(jìn)入檢測腔室。也可選擇，逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA和擴(kuò)增可以在圖8的一個(gè)盒中進(jìn)行。這通過將逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT, AMV-RT)和基質(zhì)點(diǎn)入第一擴(kuò)增腔室804中和通過首先保溫在40至50°C來實(shí)現(xiàn)。核酸在存在核糖核酸酶(RNAase)抑制劑的情況下進(jìn)行提取。用于單罐(one-pot)rtPCR的合適緩沖劑在文獻(xiàn)中介紹，并導(dǎo)致RNA目標(biāo)物基本預(yù)先擴(kuò)增，從而提高了可檢測分子目標(biāo)物的靈敏性和范圍。用于單罐r(nóng)tPCR的緩沖系統(tǒng)例如由Young [Young等人，1993. Detectionof Hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcription-polymerase chainreaction assay. J Clin Microbiol 31:882-86]和其它人介紹。通常添加核糖核酸酶抑制劑。圖15表示了使用本發(fā)明的裝置的檢測腔室的光學(xué)窗來監(jiān)測熒光端點(diǎn)。物鏡1520用于透射裝有液體試樣1501的檢測腔室1500。檢測腔室由上部光學(xué)窗1502和下部光學(xué)窗1503來界定。腔室擱置在加熱塊311的鏡面320上，因此，該加熱塊實(shí)現(xiàn)雙重功能反射回光通路，用于反射由腔室中的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)吸收或發(fā)出的光射線；以及用于調(diào)節(jié)流體中的檢測化學(xué)物質(zhì)的溫度。該結(jié)構(gòu)例如在FRET檢測中和對核酸目標(biāo)物檢測的確認(rèn)很有價(jià)值。由目標(biāo)分子1510發(fā)射的光子可以以光錐發(fā)射，該光錐由物鏡捕獲，或者可以由鏡面320反射，從而形成目標(biāo)分子的虛擬圖像1511，再由物鏡捕獲，從而增加靈敏性。檢測腔室因此由加熱塊311的本體中的“虛擬檢測腔室”(虛線)來鏡像。優(yōu)選是，通過裝置以傾斜角0布置在主機(jī)儀器中的空間對接的壁凹中(見圖7B)，形成于檢測腔室中的氣泡1505通過重力而被推離腔室的中心。同時(shí)，鏡的平滑表面320也提高了傳熱，且下部光學(xué)窗1503也用作傳熱薄膜。傳熱薄膜優(yōu)選是非常薄，并強(qiáng)行與加熱塊311進(jìn)行熱接觸。優(yōu)選的傳熱薄膜在共同待審的美國專利No. 7544506和7648835中介紹，但是也可以包括例如類似尺寸的循環(huán)聚烯烴薄膜。組件因此用作熱-光學(xué)窗，從而提高存在的任何擴(kuò)增子或其它可檢測粒子的加熱和光學(xué)觸發(fā)。圖16表示了用于進(jìn)行PCR的微流體工作部和具有墊圈的氣動界面(該氣動界面用于與主機(jī)儀器的微流體工作部交接)的典型復(fù)雜水平。為了示例說明，圖中表示了流體槽道和腔室，該流體槽道和腔室包括具有微流體子線路的液壓工作部和用于操作分子檢測化驗(yàn)的氣動工作部，它們的示例細(xì)節(jié)已經(jīng)在這里介紹。外側(cè)卡410和內(nèi)側(cè)卡400在公共氣動連接點(diǎn)處連接，該公共氣動連接點(diǎn)在操作過程中利用一次性墊圈405來與氣動控制界面密封，以便氣動控制和驅(qū)動卡的液壓工作部。該組件1600大致安裝在包含試劑儲存器的盒底架中，如參考圖4所述?？ǖ奈⒘黧w工作部包括由內(nèi)部槽道和腔室(該內(nèi)部槽道和腔室在化驗(yàn)過程中進(jìn)行潤濕)的網(wǎng)絡(luò)形成的液壓工作部以及由閥控制和泵驅(qū)動線路(該閥控制和泵驅(qū)動線路由在主機(jī)儀器上的正和負(fù)氣壓源來提供動力)形成的氣動工作部。隔膜閥氣動打開和關(guān)閉，以便控制化驗(yàn)步驟。布置在液壓工作部和氣動工作部之間的界面處的更大隔膜也用作氣動液壓裝置，用于使得流體運(yùn)動和用于使得流體的運(yùn)動轉(zhuǎn)變成勢能，例如成擴(kuò)增腔室中的分段歧管和/或被動驅(qū)動泵的彈性張開隔膜元件的形式。在該附圖中，外側(cè)卡410用于從生物試樣進(jìn)行核酸提取，內(nèi)側(cè)卡400用于擴(kuò)增和檢測。在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)很容易設(shè)想其它組合，這并不由提供的示例實(shí)例來限制。圖17、18A和18B是通過本發(fā)明的微流體盒獲得的化驗(yàn)結(jié)果類型的代表，不過并不 局限于此。圖17表示了收集用于分子信標(biāo)的掃描數(shù)據(jù)，該分子信標(biāo)與擴(kuò)增子水合。掃描軸(曲線圖的X軸)橫切分別表示正和負(fù)測試狀態(tài)的檢測井，可以看見，信號局限于檢測井。在附圖中，試樣在檢測腔室中的溫度系統(tǒng)性變化時(shí)重復(fù)掃描。掃描在曲線圖中交疊，以便表示光學(xué)掃描裝置的空間保真性。對于35°C、65°C、70°C、75°C和80°C測試狀態(tài)的熒光掃描進(jìn)行了標(biāo)記。在40、45、50、55和60°C以及85和90°C下的測試掃描曲線圖沒有很好地區(qū)分，與預(yù)期相同，沒有逐個(gè)標(biāo)記。可以看見，熒光信號是溫度的函數(shù)。在該實(shí)例中，觀察到當(dāng)雙鏈探針目標(biāo)物熔化時(shí)熒光熄滅增加，即信號在35°C下最大，在80°C下基本沒有。在圖18A中，重新標(biāo)繪了信號與用于正(2301，實(shí)線)和負(fù)(無目標(biāo)，2302，虛線)測試狀態(tài)的溫度的數(shù)據(jù)。在圖18B中，標(biāo)繪了一階導(dǎo)數(shù)，表示大約70°C的FRET熔化溫度。實(shí)例I作為實(shí)例，本發(fā)明的裝置表示為用于通過檢測在人的試樣(例如糞便)中的病原體的核酸來診斷傳染病。感興趣的示例是在基因檢測腸桿菌科細(xì)菌狀0-抗原血清中使用的rfb基因以及stxl和stx2基因(用于志賀毒素)。這些基因例如在腹瀉疾病中感興趣的志賀氏菌、沙門氏菌、彎曲桿菌和大腸桿菌的血清中發(fā)現(xiàn)。負(fù)糞試子在2. 5ml的PBS中稀釋，并通過0157:H7細(xì)菌培養(yǎng)液來增量。稀釋試樣250 y L裝載在本發(fā)明的盒上用于分析。這些盒裝有用于PCR和分子信標(biāo)擴(kuò)增檢測所需的全部干燥和液體試劑。在DNA提取之后，目標(biāo)物和引物在94°C下變性2分鐘，然后以大約12秒每熱循環(huán)進(jìn)行用于PCR擴(kuò)增的循環(huán)。在裝載后，具有設(shè)計(jì)成與盒相容的熱、氣動和光學(xué)界面的儀器用于在試樣上運(yùn)行多重核酸化驗(yàn)。桿菌DNA用作在擴(kuò)增中的內(nèi)部正控制；負(fù)控制也運(yùn)行，且不產(chǎn)生誤報(bào)。用于桿菌的FAM標(biāo)簽探針通過第一熒光(激發(fā)485nm，發(fā)射535nm)來檢測。CALfluor Red 610標(biāo)簽探針(激發(fā)590nm,發(fā)射610nm)用于檢測在該化驗(yàn)中的目標(biāo)分析物。Biplex擴(kuò)增產(chǎn)品在或接近最小80目標(biāo)復(fù)制每次提取的情況下進(jìn)行檢測，內(nèi)部控制背景估計(jì)在400000復(fù)制，表示很高水平的靈敏性和專業(yè)性。光學(xué)裝置的詳細(xì)說明在共同待審的國際專利申請公開No. PCT/US10/22581中介紹，該國際專利申請No. PCT/US10/22581的標(biāo)題為 PORTABLE HIGH GAIN FLUORESCENCE DETECTION SYSTEM，該文獻(xiàn)整個(gè)被本文參引用于所有目的。
用于在本發(fā)明的裝置中在糞便試樣中的stx2 (2411),stxl (2412)和rfb (2413)基因檢測的擴(kuò)增子FRET曲線在圖19中示出?？刂茢?shù)據(jù)沒有表示。實(shí)例2使用板載干試劑和液體試劑，血液試樣可以進(jìn)行處理，且與麻疹病毒相關(guān)的RNA在30分鐘或更少時(shí)間內(nèi)檢測。在第一步驟中，cDNA在圖14中所示的一個(gè)裝置中在大約50°C的培養(yǎng)溫度下由試樣形成，然后，逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品使用具有雙重溫度區(qū)域控制的兩個(gè)微流體腔室(1221、1222)來進(jìn)行PCR,大致如美國專利No. 7544506,7648835,7763453和7763453中所述，它們共同待審，在待審申請中的標(biāo)題是“Integrated Nucleic AcidAssays”,這些文獻(xiàn)都整個(gè)被本文參引用于所有目的。然后,使用對準(zhǔn)擴(kuò)增目標(biāo)物的FAM熒光標(biāo)記分子信標(biāo)來檢測擴(kuò)增子。也可選擇，包括California紅標(biāo)記RNA酶P級外顯子序列(這通常是任何真正的人類血液樣本的特征)以及在單罐反應(yīng)混合物中的多重?cái)U(kuò)增的控制用于確認(rèn)該化驗(yàn)。表示本發(fā)明的元件和特征的各種組合的其它實(shí)例也很容易證明。根據(jù)本發(fā)明教 導(dǎo)構(gòu)成的裝置可以用于與例如以下相關(guān)聯(lián)的目標(biāo)核酸(DNA或RNA)的分子化驗(yàn)由細(xì)菌中選擇的傳染物(包括鮑氏不動桿菌、馬駒放線桿菌、炭疽桿菌、馬爾他布魯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、博得式菌百日咳、支氣管敗血性博得式菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、白喉棒狀桿菌屬、伯氏考克斯氏體、嚙蝕艾肯氏菌、大腸桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、新兇手弗朗西絲氏菌、壞死梭桿菌基形亞種、流感嗜血桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、反硝化金氏菌、侵肺軍團(tuán)菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、粘膜炎莫拉氏菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎支原體、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟菌、多殺巴斯德氏菌、普通變形菌、奇異變形菌、綠膿桿菌、腐敗假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌、傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、蒼白密螺旋體、鼠疫耶爾森氏菌、或者霍亂弧菌)；立克次氏體(包括肺炎衣原體、沙眼衣原體、普氏立克次氏體、或者地方性斑疫傷寒立克次氏體)；病毒(包括麻疫病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、登革病毒、西方馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉人馬腦炎病毒、腸道病毒、流感病毒、鳥流感、冠狀病毒屬、SARS冠狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、副流感病毒、漢坦病毒屬、狂犬病病毒、銀出血熱病毒、玻璃維亞出血熱病毒、薩比亞病毒、瓜納瑞托病毒、剛果-克里米亞半島的出血熱病毒、拉沙出血熱病毒、馬爾堡病毒、依波拉病毒、山谷熱病毒、凱薩努森林病病毒、鄂木斯克出血熱、黃熱病毒、天花病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、猴痘病毒、或者口蹄疫病毒)；真菌物質(zhì)(包括球孢子絲蟲、白色念珠菌、新型隱球菌、莢膜組織胞漿菌、皮炎芽生菌、申克孢子絲、或者曲霉)；寄生物質(zhì)(包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、鼠弓漿蟲、虐原蟲bergeri、猛氏裂體吸蟲、埃及裂體吸蟲、日本裂體吸蟲、痢疾內(nèi)變形蟲、巴貝蟲屬、鼠弓漿蟲、克魯茲錐蟲、利什曼蟲ssp、布魯斯錐蟲、旋毛形線蟲、犬弓首線蟲、美洲板口線蟲、人鞭蟲、蠕形住腸線蟲、犬復(fù)孔絳蟲、痢疾內(nèi)變形蟲、麥地那龍線蟲、班氏絲蟲、布魯格絲蟲屬maldi、帝汶布魯線蟲、糞類圓線蟲、似引蛔線蟲、旋盤尾絲蟲、福納氏蟲、華枝睪吸蟲、隱孢子蟲、利什曼蟲屬)；或者基因或序列，包括抗生素抗性基因、與毒性或產(chǎn)毒性相關(guān)聯(lián)的基因、分子標(biāo)記、單核苷酸多形性、昆蟲基因、蜜蜂病原體基因、植物基因、植物病害物質(zhì)、與具有病菌或致癌物質(zhì)情況的細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記、線粒體核苷酸序列、質(zhì)粒序列、信使RNA、核蛋白體RNA、或者目標(biāo)核酸面板等，它們可能令人感興趣或有用。且可能用于在哺乳動物或椎骨中的傳染物質(zhì)的分子診斷，廣義上包括家畜、獸醫(yī)和水產(chǎn)養(yǎng)殖用途。還可以用于更通常患有病原體情況的植物、動物或昆蟲的診斷用途，例如傳染病等。使用具有本發(fā)明特征的盒裝置的免疫和生物化學(xué)化驗(yàn)也設(shè)想和要求用于診斷用途。盡管上面介紹了本發(fā)明的特定實(shí)施例，但是可以使用多種可選形式、變化形式和等效物。因此，本發(fā)明的范圍將并不由上述說明書來確定，而是應(yīng)當(dāng)參考附加權(quán)利要求以及它們的等效物的全部范圍來確定。附加權(quán)利要求并不解釋為包括裝置加功能的限制，除非該限制在給定權(quán)利要求中使用措辭“用于 的裝置”來明顯敘述。在本說明書中涉及和/或在附加意見中引用的所有美國專利、美國專利申請公開文獻(xiàn)、美國專利申請、外國專利、外國專利申請和非專利公開文獻(xiàn)都整個(gè)被本文參引。實(shí)施例的方面可以在需要時(shí)變化，以便利用多種專利、申請和文獻(xiàn)的思想來提供進(jìn)一步的實(shí)施例。這些和其它變化可以根據(jù)上述說明而用于實(shí)施例。通常，在下面的權(quán)利要求中，使用的 術(shù)語并不認(rèn)為是將權(quán)利要求限制為在說明書中所述的特定實(shí)施例，而是應(yīng)當(dāng)認(rèn)為包括所有可能實(shí)施例以及該權(quán)利要求的等效物的全部范圍。因此，權(quán)利要求并不由本發(fā)明的說明書來限定。
權(quán)利要求
1.一種用于化驗(yàn)在生物試樣中的一種目標(biāo)分析物或若干目標(biāo)分析物的微流體盒，該微流體盒包括 a)塑料的絕熱的盒本體，該盒本體包圍 i)液壓工作部，該液壓工作部包括試樣進(jìn)口、用于化驗(yàn)的一種或更多種板載液體試劑或干試劑、以及具有槽道和腔室的可潤濕下游微流體子線路，該槽道和腔室與所述上游進(jìn)口流體連通，并在下游通氣口處通氣；以及 )氣動工作部，該氣動工作部包括用于接收氣動壓力的一個(gè)進(jìn)口或若干個(gè)進(jìn)口以及具有槽道和腔室的氣動子線路，用于從該一個(gè)進(jìn)口或若干個(gè)進(jìn)口傳送所述氣動壓力；以及 b)至少一個(gè)氣動液壓隔膜，該氣動液壓隔膜設(shè)置成使得所述可潤濕微流體子線路的液壓腔室與所述氣動子線路的氣動腔室交接，所述氣動液壓隔膜有朝向所述液壓腔室的第一側(cè)面和朝向所述氣動腔室的第二側(cè)面； 其特征在于 所述氣動液壓隔膜從以下方面選擇 A)彈性、儲存能量的氣動液壓隔膜，它設(shè)置成用于在液壓下被動地儲存液體容積，并在潤濕所述可潤濕微流體子線路的下游槽道或腔室的過程中釋放所述液體容積； B)雙層氣動液壓隔膜，它有液體中心，用于儲存和釋放液體試劑； C)設(shè)置成用于在潤濕過程中從液壓腔室中消除頂部空間的氣動液壓隔膜；或者 D)一對氣動液壓隔膜，該對氣動液壓隔膜包括使得第一液壓腔室與有閥的進(jìn)口交接的第一氣動液壓隔膜和使得第二液壓腔室與有閥的出口交接的第二氣動液壓隔膜；以及在所述第一液壓腔室和第二液壓腔室之間升高的相互連通的槽道；其中所述對氣動液壓隔膜設(shè)置成通過橫過所述第一氣動液壓隔膜和第二氣動液壓隔膜施加相反的壓力差來通過所述槽道往復(fù)地交換流體；以及 其中所述液壓腔室和隔膜設(shè)置成在化驗(yàn)的潤濕、充裝、泵送或再水合步驟中防止或減少氣泡夾帶或試劑沖失。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微流體盒，其中所述液壓工作部設(shè)置成當(dāng)相對于地平面以10-35度的傾角Θ安裝在主機(jī)儀器的傾斜平臺上時(shí)進(jìn)行操作，且至少一個(gè)液壓腔室設(shè)置成具有出口和相互連通的槽道，該相互連通的槽道相對于所述腔室定位在上側(cè)，用于從所述腔室通氣或排出氣泡。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的微流體盒，其中所述液壓工作部包括多個(gè)具有槽道和腔室的可潤濕下游微流體子線路，這些槽道和腔室與所述上游進(jìn)口流體連通，并在一個(gè)或更多個(gè)下游通氣口處通氣，其中，所述多個(gè)可潤濕微流體子線路設(shè)置成平行地執(zhí)行各化驗(yàn)，且各所述可潤濕微流體子線路提供有單獨(dú)的檢測腔室。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微流體盒，其中處于張開狀態(tài)的所述彈性氣動液壓隔膜的液壓和液體容積通過打開下游閥而被動地轉(zhuǎn)變成使得彎液面前進(jìn)至可潤濕下游微流體子線路中的工作，該可潤濕下游微流體子線路與其流體連通，從而將任何氣體排向所述下游通氣口。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流體盒，其中對所述彈性的被動操作氣動液壓隔膜的所述液體容積和液壓進(jìn)行標(biāo)定，以便使得所述下游微流體子線路充裝至標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微流體盒，其中下游可潤濕微流體子線路的多個(gè)腔室設(shè)置成各自有彈性的被動操作氣動液壓隔膜，用于使得所述下游可潤濕微流體子線路均等地充裝至標(biāo)記，其中，各所述子線路設(shè)置成平行地執(zhí)行各化驗(yàn)，且各所述子線路提供有單獨(dú)的檢測腔室。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微流體盒，其中所述氣動液壓隔膜是聚氨酯隔膜、聚偏二氯乙烯隔膜、聚烯烴隔膜、聚酯隔膜、聚乙烯隔膜、聚對苯二甲酸乙二醇酯隔膜、尼龍隔膜、或者它們的層疊或共同擠出的組合，并可選地包括金屬化薄膜層。
8.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的微流體盒，其特征還在于 a)具有多個(gè)腔室的分段歧管，其中，所述多個(gè)腔室的各所述腔室通過彈性的能量儲存氣動液壓隔膜而分成液壓腔室和氣動腔室，該氣動液壓隔膜密封地安裝在該液壓腔室和氣動腔室之間，這樣，能夠串聯(lián)或并聯(lián)地通過進(jìn)口進(jìn)入各所述液壓腔室的液體容積將使得各所述能量儲存氣動液壓隔膜根據(jù)與它的排量容積成比例的等壓力而張開； b)在充裝完成后，所述進(jìn)口可通過閥關(guān)閉，用于使得所述液壓在整個(gè)所述分段歧管中均衡；以及 c)平行的多個(gè)通氣下游槽道，其中，所述多個(gè)槽道中的一個(gè)所述槽道與所述分段歧管的各所述液壓腔室流體連通，各所述通氣下游槽道有閥，用于在充裝和增壓過程中關(guān)閉，并在排出和減壓過程中打開，因此，在所述平行的多個(gè)通氣下游槽道的初始潤濕過程中，處于張開狀態(tài)的所述彈性氣動液壓隔膜的所述液壓將被動地轉(zhuǎn)變成使得彎液面前進(jìn)的工作。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微流體盒，其中各所述下游通氣槽道流體地設(shè)置為通向微流體子線路的進(jìn)口，且各所述彈性的能量儲存氣動液壓隔膜用于使得液體容積在各所述下游微流體子線路之間均等地分割。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的微流體盒，其中所述各微流體子線路包括至少一個(gè)反應(yīng)腔室，該反應(yīng)腔室提供為用于使得液體試劑、干試劑或它們的組合與液體試樣混合；以及至少一個(gè)檢測腔室，該檢測腔室設(shè)置成與用于檢測一個(gè)目標(biāo)分析物或若干目標(biāo)分析物的檢測裝置交接。
11.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的微流體盒，其中所述氣動腔室與大氣通氣。
12.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的微流體盒，還包括板載試劑儲存器，用于將液體容積分配至所述液壓工作部的微流體子線路中，其中，所述試劑儲存器的特征在于是 a)雙層隔膜，該雙層隔膜密封地分離所述氣動工作部的氣動腔室和所述液壓工作部的液壓腔室，所述雙層隔膜有朝向所述氣動工作部的第一側(cè)面和朝向所述液壓工作部的第二側(cè)面，第一層形成它的所述第一側(cè)面，第二層形成它的所述第二側(cè)面，所述第一和第二層包圍所述液體容積作為在它們之間的液體中心； b)流體出口，用于接收和傳送所述液體容積至所述下游微流體子線路；以及 c)尖銳件，該尖銳件布置在所述液壓腔室中，當(dāng)通過施加橫過所述隔膜的壓力差而迫使所述雙層隔膜與尖銳件刺穿抵接時(shí)，所述尖銳件用于使得所述第二層破裂，并用于釋放所述液體容積至所述液壓工作部中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的微流體盒，其中所述雙層隔膜的所述第一層抗破裂，所述第二層容易破裂。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的微流體盒，其中所述第一層是層壓聚合物，具有設(shè)置成抗穿刺的外部尼龍基層，所述第二層是層壓聚合物，具有設(shè)置成易于穿刺的外部聚對苯二甲酸乙二醇酯部件。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的微流體盒，其中所述板載試劑儲存器設(shè)置成通過施加于其上的氣動壓力的連續(xù)脈沖作用而釋放連續(xù)液體容量。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任意一項(xiàng)所述的微流體盒，其中所述液體容積包括液體反應(yīng)物、緩沖劑、再水合流體或稀釋劑，用于化驗(yàn)步驟的所述液體容積選擇為用于使得布置在下游腔室或槽道中的干試劑再水合、用于漂洗固相、用于從固相基板中洗提一種目標(biāo)分析物或若干種目標(biāo)分析物、用于進(jìn)行稀釋、用于進(jìn)行色層分離、用于驅(qū)動或停止反應(yīng)、或者用于檢測所述一種目標(biāo)分析物或若干種目標(biāo)分析物，也可選擇，對所述液體容積進(jìn)行脫氣，且所述雙層隔膜為氣體不可透過。
17.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的微流體盒，還包括具有液壓腔室的至少一個(gè) 微流體子線路，該液壓腔室形成為下游反應(yīng)腔室，具有上游進(jìn)口和下游通氣口，所述下游反應(yīng)腔室包含一個(gè)干燥試劑點(diǎn)或多個(gè)干燥試劑點(diǎn)； 其特征還在于 所述氣動液壓隔膜設(shè)置為操作成有第一位置和第二位置，在該第一位置中，隔膜張開抵靠腔室的底板，以便排出頂部空間的空氣，并在潤濕過程中形成環(huán)繞和覆蓋一個(gè)試劑點(diǎn)或多個(gè)試劑點(diǎn)的保護(hù)性臨時(shí)膨脹部，在該第二位置中，隔膜松弛定位，或者吸靠在腔室的頂部，以便使得腔室充滿液體容積，且暴露和以充分強(qiáng)度溶解試劑點(diǎn)，而并不夾帶氣泡或沖走試劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述干燥試劑點(diǎn)是緩沖劑、酶、共同酶、輔因子、聚合酶、引物、分子信標(biāo)、探針、熒光團(tuán)、脫氫酶、氧化酶、反應(yīng)物、色原、基體、抗體、抗原或者控制器。
19.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的微流體盒用于進(jìn)行PCR，其中，所述微流體盒還包括 與第一液壓腔室交疊的第一氣動液壓隔膜和與第二液壓腔室交疊的第二氣動液壓隔膜，所述第一液壓腔室和第二液壓腔室有流體相互連通的槽道； 用于兩區(qū)域PCR熱循環(huán)的熱界面，其中，所述第一液壓腔室的第一熱界面設(shè)置成用于對著第一加熱元件，所述第二液壓腔室的第二熱界面設(shè)置成對著第二加熱元件； 其中，所述第一氣動液壓隔膜設(shè)置成有用于在PCR擴(kuò)增過程中在所述第一和第二液壓腔室之間驅(qū)動往復(fù)流體流的氣動裝置； 其特征在于 所述相互連通的槽道設(shè)置成在10-35度的傾角Θ下操作，以便降低由氣泡產(chǎn)生的干擾。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的微流體盒，其中所述第二氣動液壓隔膜是彈性體隔膜，并通過所述第一氣動液壓隔膜的推壓而被動地工作。
21.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的微流體盒，還包括檢測腔室，該檢測腔室在第一相對側(cè)由光學(xué)窗包圍，在第二相對側(cè)由熱-光學(xué)窗包圍，其特征在于 所述檢測腔室設(shè)置成在10-35度的傾角Θ下操作，以便使得空氣和氣泡沖向布置于其上側(cè)的通氣口。
22.—套工具，包括一個(gè)或更多個(gè)根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的一次性微流體盒，該一次性微流體盒用作主機(jī)儀器中的消耗品，所述微流體盒有用于對核酸、蛋白質(zhì)、抗原、抗體、代謝物或酶進(jìn)行至少一種化驗(yàn)的板載試劑，也可選擇，該微流體盒在其中有惰性氣體的氣密包裝中。
23.—套工具，包括一個(gè)或更多 個(gè)根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的一次性微流體盒，該一次性微流體盒用作主機(jī)儀器中的消耗品，所述微流體盒有用于進(jìn)行至少一種核酸化驗(yàn)的板載試劑，各盒包裝在氣密密封囊中，還有使用說明書，其中，用戶只需要將要化驗(yàn)的生物液體試樣置于試樣進(jìn)口孔中，并將所述微流體盒插入所述主機(jī)儀器中，所述盒有全部引物、酶輔因子、鹽、緩沖劑、聚合酶和檢測化學(xué)物質(zhì)，用于檢測所述液體試樣的目標(biāo)核酸(DNA或RNA)，該目標(biāo)核酸與以下相關(guān)聯(lián)細(xì)菌(包括鮑氏不動桿菌、馬駒放線桿菌、炭疽桿菌、馬爾他布魯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、博得式菌百日咳、支氣管敗血性博得式菌、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、白喉棒狀桿菌屬、伯氏考克斯氏體、哨蝕艾肯氏菌、大腸桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、新兇手弗朗西絲氏菌、壞死梭桿菌基形亞種、流感嗜血桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、反硝化金氏菌、侵肺軍團(tuán)菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、粘膜炎莫拉氏菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎支原體、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟菌、多殺巴斯德氏菌、普通變形菌、奇異變形菌、綠膿桿菌、腐敗假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌、傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、蒼白密螺旋體、鼠疫耶爾森氏菌、或者霍亂弧菌)；立克次氏體(包括肺炎衣原體、沙眼衣原體、普氏立克次氏體、或者地方性斑疹傷寒立克次氏體)；病毒(包括麻疹病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、登革病毒、西方馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉人馬腦炎病毒、腸道病毒、流感病毒、鳥流感、冠狀病毒屬、SARS冠狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、副流感病毒、漢坦病毒屬、狂犬病病毒、銀出血熱病毒、玻璃維亞出血熱病毒、薩比亞病毒、瓜納瑞托病毒、剛果-克里米亞半島的出血熱病毒、拉沙出血熱病毒、馬爾堡病毒、依波拉病毒、山谷熱病毒、凱薩努森林病病毒、鄂木斯克出血熱、黃熱病毒、天花病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、猴痘病毒、或者口蹄疫病毒)；真菌物質(zhì)(包括球孢子絲蟲、白色念珠菌、新型隱球菌、莢膜組織胞漿菌、皮炎芽生菌、申克孢子絲、或者曲霉)；寄生物質(zhì)(包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、鼠弓漿蟲、虐原蟲bergeri、猛氏裂體吸蟲、埃及裂體吸蟲、日本裂體吸蟲、痢疾內(nèi)變形蟲、巴貝蟲屬、鼠弓漿蟲、克魯茲錐蟲、利什曼蟲ssp、布魯斯錐蟲、旋毛形線蟲、犬弓首線蟲、美洲板□線蟲、人鞭蟲、蠕形住腸線蟲、犬復(fù)孔絳蟲、痢疾內(nèi)變形蟲、麥地那龍線蟲、班氏絲蟲、布魯格絲蟲屬maldi、帝汶布魯線蟲、糞類圓線蟲、似引蛔線蟲、旋盤尾絲蟲、福納氏蟲、華枝睪吸蟲、隱孢子蟲、利什曼蟲屬)；抗生素抗性基因、與毒性或產(chǎn)毒性相關(guān)聯(lián)的基因、分子標(biāo)記、單核苷酸多形性、昆蟲基因、蜜蜂病原體基因、植物基因、植物病害物質(zhì)、與具有病菌或致癌物質(zhì)情況的細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記、線粒體核苷酸序列、質(zhì)粒序列、信使RNA、核蛋白體RNA、或者目標(biāo)核酸面板等。
24.一種用于潤濕微流體盒同時(shí)限制氣泡夾帶于其中的方法，該方法包括 a)泵送液體容積通過進(jìn)口并進(jìn)入微流體卡的多個(gè)液壓腔室中，以使得在各所述液壓腔室中覆蓋所述液體容積的彈性氣動液壓隔膜拉伸地張開，從而等壓地使在所述多個(gè)液壓腔室中的所述液體容積增壓； b)通過閥打開各所述液壓腔室的出口，各所述出口與通氣下游微流體子線路流體連通；以及c)基本相等地將所述液體容積分割進(jìn)入各所述可潤濕下游微流體子線路中。
25.一種用于潤濕包含干燥試劑點(diǎn)的微流體盒的方法，同時(shí)限制氣泡夾帶于其中，該方法包括 a)泵送液體容積通過進(jìn)口并進(jìn)入微流體卡的多個(gè)液壓腔室中，以使得在各所述液壓腔室中覆蓋所述液體容積的彈性氣動液壓隔膜張開，從而等壓地使所述液體容積增壓； b)使在多個(gè)下游反應(yīng)腔室中的第二隔膜增壓，各所述下游反應(yīng)腔室包含干燥試劑點(diǎn)，第二隔膜形成保護(hù)性的臨時(shí)膨脹部，用于密封環(huán)繞和覆蓋試劑點(diǎn)，并用于從下游反應(yīng)腔室中排出頂部空間的空氣； c)通過閥打開各所述液壓腔室的出口，各所述出口與所述多個(gè)下游反應(yīng)腔室中的一個(gè)流體連接； d)通過使得張開的彈性氣動液壓隔膜放松，將環(huán)繞所述臨時(shí)膨脹部潤濕下游反應(yīng)腔室，并將任何剩余空氣從反應(yīng)腔室排出，液體容積形成前進(jìn)的彎液面； e)選擇地關(guān)閉在下游反應(yīng)腔室下游的閥；以及 f)升高所述臨時(shí)膨脹部，并將液體容積的剩余部分傳送至各反應(yīng)腔室中，從而以充分強(qiáng)度溶解試劑點(diǎn)，而沒有氣泡夾帶或試劑沖走。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述干燥試劑點(diǎn)是緩沖劑、酶、共同酶、輔因子、聚合酶、引物、分子信標(biāo)、探針、熒光團(tuán)、脫氫酶、反應(yīng)物、色原、基體、抗體、抗原或者控制器。
27.一種用于化驗(yàn)一種目標(biāo)分析物或若干目標(biāo)分析物的方法，該方法包括提供具有板載液體試劑的微流體盒，該液體試劑密封地封入基本氣體不可透過的隔腔中，其中，所述液體試劑基本脫氣，所述盒有用于將所述液體試劑分配至其中的微流體工作部中的裝置，所述脫氣液體試劑防止或減少與混合、泵送或加熱相關(guān)聯(lián)的氣泡形成。
28.如在本申請的說明書中獨(dú)立或集中介紹的裝置、卡、盒、步驟、特征、元件、整體、組分和/或方法，以及兩個(gè)或更多所述裝置、卡、盒、步驟、特征、元件、整體、組分和/或方法的任意和全部組合。
全文摘要
一種微流體盒和方法用于在其上進(jìn)行診斷、分子或生物化學(xué)化驗(yàn)，其中，用于化驗(yàn)所需的所有干燥和/或液體試劑都包含在盒中，且化驗(yàn)只需要添加試樣。引入了氣動液壓特征、腔室和隔膜技術(shù)，用于克服在微流體盒的操作過程中的氣泡干擾和試劑沖走的問題。盒插入主機(jī)儀器中，用于執(zhí)行化驗(yàn)，且盒提供為消耗品。
文檔編號B01L3/00GK102740976SQ201180007370
公開日2012年10月17日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者C·F·巴特雷爾, I·斯普拉格, J·卡波丹諾, M·S·布拉格德 申請人:精密公司