專利名稱：使用含有環(huán)氧基的聚合物涂層的塑料基片的pna芯片、制造該pna芯片的方法和使用該 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種PNA(Peptide Nucleic Acid，肽核酸)芯片，并且更具體而言，本發(fā)明涉及一種PNA芯片，其中，包括目的DNA序列的探針PNA固定在用含有環(huán)氧基的聚合物涂層的塑料基片上。
背景技術(shù)：
肽核酸(下文稱為“PNA”)最初開發(fā)為基因靶向藥物。由于PNA與互補DNA的良好的雜交性，已進行許多關(guān)于PNA的報道。PNA/DNA雜交基于PNA單鏈和互補DNA單鏈之間的強堿基配對。即，PNA最顯著的性質(zhì)是通過與互補DNA的穩(wěn)定雜交的優(yōu)異的DNA識別能力。PNA的結(jié)構(gòu)與DNA的結(jié)構(gòu)非常相似。PNA具有與DNA的帶負電荷的糖-磷酸酯骨架不同的中性肽骨架和通過酰胺鍵連接的N-(2-氨乙基)甘氨酸重復(fù)單位。已知PNA中含有的四個核堿基占據(jù)與DNA的四個堿基相似的空間尺寸并且PNA與DNA的分子間距也幾乎相同。與DNA不同，PNA不被核酸酶或蛋白酶降解，因此生物學(xué)上非常穩(wěn)定。此外，由于帶負電荷的DNA骨架，所以DNA雙鏈體的熱穩(wěn)定性受鹽濃度影響；由于PNA的中性骨架，所以PNA/DNA雙鏈體的熱穩(wěn)定性基本上不受鹽濃度的影響。PNA/DNA雙鏈體的低鹽濃度依賴性降低了PNA和DNA之間的靜電排斥，因此增強了PNA/DNA雙鏈體的熱穩(wěn)定性。
由于PNA的這些許多優(yōu)點，所以PNA在通過常規(guī)的DNA相關(guān)的方法不能達到的生物學(xué)上重要的或診斷用途中得到極大的關(guān)注。
已經(jīng)以DNA固定技術(shù)相似的方式研究了PNA固定技術(shù)。大部分現(xiàn)行的DNA固定方法基于能與分析物雜交的單鏈DNA的固定。主要使用將DNA吸附到固體表面的方法(Nikiforov和Rogers，Anal Biochem.1995)。也已開發(fā)雜交法(Proudnikov等，Anal Biochem.1998；Rehman等，Nucleic Acids Res.1999)和復(fù)合物形成法(Nilsson等，Anal Biochem.1995)。光刻法是眾所周知為固定主要化學(xué)合成的寡核苷酸的方法(Gerhold等，Trends Biochem Sci.1999)。通過硅烷單層(Rogers等，AnalBiochem.1999)、自組裝單層(Higashi等，J Colloid Interface Sci.1999)等介導(dǎo)載體與摻入到寡核苷酸中的反應(yīng)基之間的共價鍵。在上述方法中，通過如吸附的物理方法固定生物物質(zhì)受到空間或結(jié)構(gòu)的限制，并且由于非特異性吸附具有如高本底信號的檢測限制。此外，由于能將環(huán)氧硅烷涂覆在玻璃基片上但不能涂覆在塑料基片上，所以基片的改進受到限制。
可通過點樣、微陣列技術(shù)、光刻法或電子尋址制造生物分子或聚合物的陣列。點樣是通過微機器人的三維運動將生物分子滴在目的位置，和微陣列技術(shù)是使用自來水筆樣針的微陣列形成。光刻法通過選擇性地將光照在目的位置以僅將生物分子粘著于表面目的位置，和電子尋址通過選擇性地向微電極陣列施加電壓進行，以僅將生物分子固定在預(yù)定電極上。在本發(fā)明中，通過非接觸噴墨印刷點樣制備PNA陣列。
在尋找現(xiàn)有技術(shù)的上述問題的解決方案時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在通用的塑料基片上摻入或涂覆含有環(huán)氧基的聚合物能有效和節(jié)省成本地固定PNA，并因此完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明提供了一種能以有效和節(jié)省成本的方式在通用塑料基片上固定PNA的新型PNA芯片。
本發(fā)明也提供了一種有效地制造所述PNA芯片的方法。
本發(fā)明也提供了一種使用所述PNA芯片檢測SNP(SingleNucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)的方法。
技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個技術(shù)方案，提供了一種PNA芯片，其中，含有目的DNA序列的探針PNA固定在用含有環(huán)氧基的聚合物涂層的塑料基片上。
在本發(fā)明中，所述塑料基片可以是可用聚合物涂覆的任一塑料基片。優(yōu)選地，所述塑料基片是由選自包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚降冰片烯、COC(環(huán)烯烴共聚物)、氟化聚酰亞胺、聚苯乙烯(PS)、SBC(苯乙烯丁二烯共聚物)、ABS(丙烯腈丁二烯苯乙烯)、SAN(苯乙烯丙烯腈)和聚砜的組的材料制成的透明塑料基片。普通塑料基片相對于普通玻璃基片更便宜并且不需要單獨的表面處理。此外，與易碎的玻璃基片不同，塑料基片是韌性的，并因此在運輸、儲藏和處理上是優(yōu)異的。此外，由于無熒光發(fā)射，所以透明塑料基片能容易地檢測信號。
在本發(fā)明中，含有環(huán)氧基的聚合物可以是具有環(huán)氧基的任一聚合物，但優(yōu)選含有環(huán)氧基的丙烯酸單體和無環(huán)氧基的丙烯酸單體的共聚物。根據(jù)塑料基片的類型可以任意選擇共聚物。特別是，通過調(diào)節(jié)含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體的重量比可以調(diào)節(jié)共聚物中環(huán)氧基的含量。此外，使用適當?shù)膯误w可以增強共聚物對PNA的接近性。
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述含有環(huán)氧基的聚合物是如由下式1表示的含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體和高粘性丙烯酸酯單體的共聚物<式1>
-[CR3R3-CR1R3-X]n-其中，R1是含有環(huán)氧基的酯，R3是氫或烷基，和X是高粘性丙烯酸酯化合物。
在本發(fā)明中，高粘性丙烯酸酯單體可以是能增強丙烯酸酯的UV-固化涂覆的任一丙烯酸酯單體(參見T.Jaworek，Macromol Symp.，159，197，2000；Cliff Roffey，“Photogeneration of Reactive Species for UVCuring”，1997)。優(yōu)選地，所述高粘性丙烯酸酯單體是在25℃具有8-6,000cp的粘性的丙烯酸酯單體，并且更優(yōu)選為選自包括二季戊四醇羥基五丙烯酸酯(DPHA)、9-乙二醇二丙烯酸酯(9-EGDA)、季戊四醇三-四丙烯酸酯(PETA)、聚乙二醇400二丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯和二季戊四醇六丙烯酸酯的組。
在本發(fā)明的另一實施方式中，所述含有環(huán)氧基的聚合物是如由下式2表示的含有環(huán)氧基的丙烯酸單體和能粘著于所述塑料基片的粘性丙烯酸酯衍生物的共聚物<式2>
-[CR3R3-CR1R3-CR3R3-CR2R3]n-其中，R1是含有環(huán)氧基的酯，R2是烷基酯，和R3是氫或烷基。
在本發(fā)明中，所述粘性丙烯酸酯衍生物可以是與制成塑料基片的單體類型相似的任一丙烯酸酯衍生物，以使包括丙烯酸酯衍生物的聚合物具有與塑料基片相似的物理性質(zhì)以保證聚合物容易地粘著于塑料基片上。優(yōu)選地，所述粘性丙烯酸酯衍生物選自包括甲基丙烯酸甲酯(MMA)、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯(EMA)、丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸正丙酯、丙烯酸異丙酯和甲基丙烯酸異丙酯的組。當所述塑料基片由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成時，由于PMMA與MMA的物理性質(zhì)幾乎相同，所以特別優(yōu)選使用甲基丙烯酸甲酯(MMA)作為粘性丙烯酸酯衍生物。
在本發(fā)明中，含有環(huán)氧基的聚合物中環(huán)氧基的含量，即，含有環(huán)氧基的聚合物中含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體的含量可以為0.1～100wt％，優(yōu)選10wt％或更高，并且更優(yōu)選20～30wt％。如果環(huán)氧基的含量低于10wt％，由于低環(huán)氧基密度，在狹窄區(qū)域內(nèi)積累PNA是困難的，所以降低了熒光信號。另一方面，由于PNA的固定率與環(huán)氧基的密度不成正比，所以不優(yōu)選環(huán)氧基的含量高于40wt％。這可能因為相對提高涂覆溶液中含有的環(huán)氧基促進埋藏表面環(huán)氧基，因此防止了表面環(huán)氧基與PNA的有效反應(yīng)。
在本發(fā)明中，探針PNA的胺端基可以直接與涂覆在塑料基片上的含有環(huán)氧基的聚合物的環(huán)氧基結(jié)合。然而，優(yōu)選向探針PNA的胺端基加入含有胺基和存在或不存在醚的C5-8羧酸連接劑(linker)。該連接劑增強了探針PNA的空間方向性，因此優(yōu)化了PNA/DNA雜交。
根據(jù)本發(fā)明的另一技術(shù)方案，提供了一種制造PNA芯片的方法，該方法包括以10～90∶80～5∶1～10的比例混和含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體、高粘性丙烯酸酯單體和光引發(fā)劑；在塑料基片上涂覆該混合物；通過UV固化該混合物；和在塑料基片上點樣探針PNA印刷溶液。
根據(jù)本發(fā)明的又一技術(shù)方案，提供了一種制造PNA芯片的方法，該方法包括以10～99∶1～89∶0.1～0.5的比例混和含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體、具有與塑料基片相似物理性質(zhì)的丙烯酸酯衍生物和自由基引發(fā)劑；自由基聚合該混合物；在塑料基片上涂覆通過在溶劑中溶解所得的聚合物獲得的溶液；和在塑料基片上點樣探針PNA印刷溶液。
在本發(fā)明中，可以向探針PNA印刷溶液中加入適當濃度、優(yōu)選0.01～1.0M、更優(yōu)選0.05～0.5M的堿，以有效地進行探針PNA的胺基和聚合物的環(huán)氧基之間的親核取代反應(yīng)，以因此輔助探針PNA的固定。該堿可以是如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀的普通堿或路易斯酸。
根據(jù)本發(fā)明在所述自由基引發(fā)劑存在下制造PNA芯片的方法可另外包括在點樣探針PNA印刷溶液之前，將涂覆聚合物的塑料基片在30％或更高的濕度條件下保存4小時或更長時間。如果在低于30％的濕度條件下保存涂覆聚合物的塑料基片，可降低所述環(huán)氧基和胺基之間的反應(yīng)效率，因此導(dǎo)致信號降低。優(yōu)選在50～95％的濕度條件中保存涂覆聚合物的塑料基片。將涂覆聚合物的塑料基片保存4小時或更長時間以蒸發(fā)有機溶劑。
根據(jù)本發(fā)明的又一技術(shù)方案，提供了一種檢測SNP的方法，該方法包括將含有靶DNA的反應(yīng)樣品施加在上述PNA芯片上；雜交探針PNA與靶DNA；洗滌PNA芯片以除去非特異性反應(yīng)產(chǎn)物；和基于PNA/DNA雜交檢測熒光信號。
現(xiàn)將參照顯示本發(fā)明的示例性實施方式的附圖更加全面地描述本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種如由下式1或2表示的用于生物分子固定的含有環(huán)氧基的聚合物材料<式1>
-[CR3R3-CR1R3-X]n-<式2>
-[CR3R3-CR1R3-CR3R3-CR2R3]n-其中，R1是C3-12含有環(huán)氧基的酯，R2是C2-16烷基酯，R3是氫或C1-16烷基，X是高粘性丙烯酸酯化合物，和n取決于單體的濃度和反應(yīng)持續(xù)時間但可以是10～2,000。
使用丙烯酸酯化合物，通過UV固化(參見T.Jaworek，MacromolSymp.，159，197，2000；Clff Roffey，“Photogeneration of Reactive Speciesfor UV Curing”，1997)或自由基聚合(參見Bevington，J.C.，在“Comprehensive Polymer Science”第3卷，65，1989；Tedder，J.M.，Angew.Chem.，Iht.Ed.Engl.，21，401，1982)合成所述聚合物材料。
在所述聚合物材料的合成中，可以使用兩種或多種丙烯酸酯單體。兩種或多種所述丙烯酸酯單體的不同組合能適當?shù)卣{(diào)節(jié)環(huán)氧基的含量，因此提供具有適當環(huán)氧基含量的聚合物材料。
在通過UV固化形成聚合物涂層的情況下，使用含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體和至少一種高粘性丙烯酸酯單體。所述丙烯酸酯單體可以是具有兩個或多個乙烯基的單體。本發(fā)明提供了UV固化涂覆溶液的組成、丙烯酸酯單體的組成比例和用于UV固化的有效涂覆方法。
在通過自由基聚合形成聚合物涂層的情況下，使用含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體、與塑料基片具有相似物理性質(zhì)的丙烯酸酯衍生物和普通自由基引發(fā)劑(偶氮化合物、過氧化物、氧化還原引發(fā)劑)(Graememoad，“the chemistry offree radical polymerization”，1995)。如上所述，通過含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體的重量比可以確定環(huán)氧基的含量。
在通過熱聚合形成聚合物涂層的情況下，除了含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體外，使用含有烷基酯的丙烯酸酯單體。
在通過UV固化形成聚合物涂層中，所述高粘性丙烯酸酯單體可以是二季戊四醇羥基五丙烯酸酯(DPHA)、9-乙二醇二丙烯酸酯(9-EGDA)、季戊四醇三-四丙烯酸酯(PETA)、聚乙二醇400二丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、或二季戊四醇六丙烯酸酯。
即，通過UV固化形成的聚合物涂層包括含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體和至少一種上述高粘性丙烯酸酯單體。
在通過UV固化形成聚合物涂層中，含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體和高粘性丙烯酸酯單體的重量比可以為0.1∶99.9至100∶0。優(yōu)選調(diào)節(jié)用于生物分子固定的含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體的含量至10wt％或更高。
所述自由基聚合可以在90℃或更低進行以防止環(huán)氧基的開環(huán)反應(yīng)。
在所述自由基聚合中，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)持續(xù)時間可以調(diào)節(jié)合成的聚合物的平均分子量。優(yōu)選自由基聚合進行1～6小時以制備目的涂覆溶液并保證涂覆透明度或防止裂縫。
通過使用過量的如甲醇的醇沉淀終止所述自由基聚合。
自由基聚合后干燥的聚合物可溶于四氫呋喃、二氯甲烷等中，以制備含有0.1～5％聚合物的涂覆溶液。為了防止裂縫形成或提供透明度，優(yōu)選制備含有1～3％聚合物的涂覆溶液。
待涂覆上述聚合物層的基片可以是普通硅片或玻璃，優(yōu)選塑料基片，并且更優(yōu)選透明塑料基片。常規(guī)地，加工良好的貴重玻璃主要用作芯片基片。然而，在本發(fā)明中，具有易操作性的普通廉價塑料基片用于克服玻璃基片的缺點。通常，術(shù)語“透明塑料基片”包括由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚降冰片烯、COC(環(huán)烯烴共聚物)、氟化聚酰亞胺、聚苯乙烯(PS)、SBC(苯乙烯丁二烯共聚物)、ABS(丙烯腈丁二烯苯乙烯)、SAN(苯乙烯丙烯腈)或聚砜制成的基片。
用于在塑料基片上涂層形成的聚合物涂覆可通過浸漬、噴射、印刷方法等完成。優(yōu)選在50％或更高的濕度條件下保存后使用涂覆聚合物的塑料基片。如果涂覆聚合物的塑料基片保存在低濕度條件下，可以降低PNA固定效率。
根據(jù)本發(fā)明，在適當濃度的堿(氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、路易斯酸)存在下，通過如微陣列點樣的容易和廉價的方法可以完成生物分子的強固定，即，PNA固定在含有環(huán)氧基的塑料基片上。
根據(jù)本發(fā)明，制備含有堿性催化劑的印刷緩沖液，以將PNA的胺基結(jié)合到涂覆在基片上的環(huán)氧基。使用噴墨陣列機(inkjet arrayer)注入所述印刷緩沖液，在基片表面上提供容易和廉價的PNA固定。優(yōu)選地，所述PNA固定在50～60％的濕度條件下在約23℃進行。
本發(fā)明提供了使用上述制備的PNA陣列用于特異性PNA/DNA雜交必需的最佳緩沖溶液、反應(yīng)條件和有效的洗滌方法。
用于PNA/DNA雜交的緩沖溶液可以是含有5X SSC、50mMHEPES、1％SDS和0.1％BSA的緩沖溶液。不需要進行單獨的封閉過程以防止非特異性雜交。
PNA/DNA雜交后，可以分別使用含有1X、0.1X、0.01X和0.001XSSC(各5分鐘)的四種洗滌緩沖溶液。
下文，將參照以下實施例將更加詳細地描述本發(fā)明。以下實例用于說明的目的并不意限制本發(fā)明的范圍。
有益效果如上述，根據(jù)本發(fā)明，可以有效和節(jié)省成本的方式將探針PNA固定在通用塑料基片上。固定探針PNA的基片的使用能夠檢測不同的基因變異。此外，預(yù)計使用基于PNA優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)的PNA芯片可以克服普通DNA芯片的缺點。


通過結(jié)合附圖詳細描述其示例性實施方式，本發(fā)明的上述和其它特征和優(yōu)點將變得更清楚明了，其中圖1為說明根據(jù)本發(fā)明在通用塑料基片上涂覆含有環(huán)氧基的聚合物層和將PNA固定到所述聚合物層上的示意順序圖；圖2A和2B分別為根據(jù)本發(fā)明對于聚合物層中環(huán)氧基的含量PNA固定率的評價結(jié)果的熒光圖像和陣列信息；圖3為圖2A的熒光圖像的圖解定量分析數(shù)據(jù)；圖4說明PNA陣列的PNA/DNA雜交結(jié)果，以確定PNA固定前涂覆聚合物的塑料基片的最佳保存條件；圖5A和5B分別為靶DNA和陣列信息的PNA/DNA雜交結(jié)果的熒光圖像分析數(shù)據(jù)；圖6A和6B分別為對于rtL180野生型和rtL180突變體環(huán)氧基含量的PNA/DNA雜交結(jié)果的圖解定量分析數(shù)據(jù)；圖7A為說明根據(jù)本發(fā)明用于優(yōu)化PNA/DNA雜交的連接劑的示意圖，和圖7B說明不同類型的所述連接劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖8A和8B分別為根據(jù)本發(fā)明用于通過連接劑介導(dǎo)的PNA/DNA雜交的熒光圖像和點陣列；圖9A和9B為圖8A的熒光圖像的圖解定量分析數(shù)據(jù)；以及圖10A和10B為對于探針PNA濃度PNA/DNA雜交檢測敏感性的定量分析數(shù)據(jù)。
具體實施例方式
實施例1通過UV固化制備涂覆含有環(huán)氧基的聚合物的基片以適當?shù)谋壤?10～90∶80～5∶1～10)混和欲用于摻入環(huán)氧基的環(huán)氧丙氧基甲基丙烯酸甲酯(GMA)、9-乙二醇二丙烯酸酯(9-EGDA)和光引發(fā)劑(Irgacure 184，汽巴-嘉基化學(xué)公司)。光引發(fā)劑完全溶解后，用旋涂機以500rpm涂覆6秒然后以1,000～4,000rpm涂覆20秒將所得的混合物涂覆在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基片上。然后，所得的基片在氮環(huán)境中暴露于254nm UV并干燥。上述方法不局限于丙烯酸酯單體和塑料基片，并可以用于多種類型的單體和基片。如此制備的含有環(huán)氧基的聚合物具有下式-[CH2C(CH3)(C(O)OCH2CHCH2)CH2CH(C(O)O(CH2CH2O)9C(O)CHCH2)]n-。用DPHA或PETA代替9-EGDA的UV固化可制備GMA和DPHA或PETA的聚合物。圖1為說明根據(jù)本發(fā)明在通用塑料基片上涂覆含有環(huán)氧基的聚合物層并將PNA固定到含有環(huán)氧基的聚合物層上的示意順序圖。
實施例2通過自由基聚合制備涂敷含有環(huán)氧基聚合物的基片以適當?shù)谋壤?99～10∶1～89∶0.1～0.5∶0.1～0.5)混和欲用于摻入環(huán)氧基的環(huán)氧丙氧基甲基丙烯酸甲酯(GMA)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、自由基引發(fā)劑(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶醇，TMPO)和分子量調(diào)節(jié)劑。在75℃下加熱該混合物2小時，然后在90℃下加熱0.5～3小時。考慮到該反應(yīng)混合物的粘性根據(jù)MMA的重量比變化極大，在該反應(yīng)混合物完全固化前終止該反應(yīng)。當該反應(yīng)混合物的粘性達到適當水平時，向其加入過量的甲醇，劇烈攪拌并再結(jié)晶。將所得的晶體在真空中干燥一天。通過NMR評估如此制得的聚合物的環(huán)氧基含量并通過GPC評估其平均分子量。在四氫呋喃中溶解0.1～5wt％的該聚合物。將PMMA基片固定在旋涂機上并通過旋涂機涂覆2ml含有該聚合物的涂覆溶液(參見圖1)。所述的含有環(huán)氧基的聚合物具有下式-[CH2C(CH3)(C(O)OCH2CHCH2)CH2C(CH3)(C(O)OCH3)]n-，并且平均分子量(Mw)為75，000～250，000。用EMA代替MMA以如上述自由基聚合相同的方式可以制備GMA和EMA的聚合物。
在使用前將涂覆聚合物的基片在50％或更高的濕度條件下保存4小時。如果涂覆聚合物的基片在低濕度條件下保存，可以降低環(huán)氧基和胺基之間的反應(yīng)效率，導(dǎo)致信號降低。圖4說明PNA陣列的PNA/DNA雜交結(jié)果以確定PNA固定前涂覆聚合物的塑料基片的最佳保存條件。將該涂覆含有環(huán)氧基的聚合物的塑料基片暴露于多種濕度條件(10、20～30、＞50％)。在圖4中，PM/MM比表示在DNA/PNA雜交中完全匹配(PM)與不匹配(MM)的平均熒光信號比值，并且單個堿基差異導(dǎo)致PM和MM之間的信號差異。較高的PM/MM比表示探針PNA對靶DNA更優(yōu)異的特異性。參考圖4，當所述涂覆聚合物的基片在30％或更高、優(yōu)選50％或更高的濕度條件下保存時，信號敏感性(PM/MM比)更優(yōu)異。
實施例3PNA-Cy3固定在本實施例中，用實施例1和2制備的涂覆聚合物的塑料基片評估了對于GMA含量的PNA固定率。為此，在上述基片上固定Cy3-標記的PNA rtL-180w(PNAGENE.Inc)。根據(jù)以下實施例4進行印刷溶液制備和點樣。通過調(diào)節(jié)GMA含量，所述塑料基片具有20％、30％、40％和50％的不同的環(huán)氧含量。通過所述Cy3-標記的PNA rtL-180w的熒光強度可以直接確定PNA rtL-180W的固定率。在本實驗中，試驗了不同的PNA濃度，即，500、400、300、200和100nM。圖2A和2B中分別說明了固定在含有不同含量的環(huán)氧基的基片上的PNA的熒光圖像和陣列信息。圖3為圖2A的熒光圖像的圖解定量分析數(shù)據(jù)。在圖3中，不含PNA-cy3的點樣組合物的熒光強度(S/B比)用作本底信號。參考圖3，在20％和30％的環(huán)氧含量，PNA固定率是最大的。甚至在40％和50％的環(huán)氧含量，PNA固定無問題發(fā)生。在本實施例中所用的PNArtL-180w具有以下序列rtL 180wN末端(5′)-GTTTCTCC*TGGCT-C末端(3′)-Cy3(SEQID NO2)實施例4印刷溶液制備和PNA陣列制造在50μM蒸餾水中溶解PNA寡核苷酸(13-mer，PANAGENE，Inc.)。作為所述PNA寡核苷酸，使用PNAA、rtL-180w和rtL-180m。PNAA用作PNA/DNA雜交的陽性對照。所述rtL-180w是HBV(乙型肝炎病毒)RNA聚合酶(GeneIn有限公司)的特異序列，并且所述rtL-180m是導(dǎo)致拉米夫定(lamivudine)抗性的HBV RNA聚合酶的變化序列。所述rtL-180w和rtL-180m之間的差異僅僅為一個堿基(C-A)。所述rtL-180w和rtL-180m用作用于鑒定SNP(單核苷酸多態(tài)性)的檢測序列。0.1N NaOH溶液用于輔助PNA固定。對于各PNAA、rtL-180w和rtL-180m，以1∶1～0.5的比例混和通過在蒸餾水中溶解PNA寡核苷酸制得的溶液和所述NaOH溶液，并在96-孔板中上樣。用噴墨陣列機(Cartesian)將制備的樣品點樣在PMMA基片上，然后在50％或更高的濕度和23～24℃的溫度下保存16小時，以誘導(dǎo)環(huán)氧基和胺基之間的充分反應(yīng)。在點樣期間，增加濕度以均勻地維持點大小。
在本實施例中所用的探針PNA寡核苷酸(13-mer)具有以下序列探針A(人工序列)N末端(5′)-TTCCACCAGATGG-C末端(3′)(SEQ ID NO1)探針W(rtL-180w)N末端(5′)-GTTTCTCC*TGGCT-C末端(3′)(SEQ ID NO2)
探針M(rtL-180m)N末端(5′)-GTTTCTCA*TGGCT-C末端(3′)(SEQ ID NO3)。
實施例5芯片上的反應(yīng)和SNP檢測用蒸餾水洗滌實施例4中制備的固定PNA的PMMA基片5分鐘以除去殘留的NaOH，然后無單獨封閉雜交。使用含有5X SSC(含有氯化鈉和檸檬酸鈉的pH 7.0的緩沖液)、50mM HEPES、1％SDS和0.1％BSA的雜交緩沖液。用名為花青3(Cy3)的熒光染料標記的DNA(1pM～100nM)作為靶標。雜交溶液中的靶DNA在94℃變性5分鐘，然后在42℃孵育60分鐘。通常，相對于DNA，PNA具有高一度的熔解溫度(Tm)(每一個堿基)。為了除去非特異性PNA/DNA雜交，用1XSSC緩沖液、0.1X SSC緩沖液、0.01X SSC緩沖液和0.001X SSC緩沖液進行洗滌(各5分鐘)。然后，將PNA陣列完全除去水分，并用熒光檢測激光掃描儀(Axon Instrument有限公司)在焦點位置65和PMT 400的條件下測定DNA/PNA雜交引起的熒光信號。圖5A和5B中分別說明使用不同靶DNA和陣列信息的PNA/DNA雜交結(jié)果的熒光圖像。與人工PNA序列互補的DNA寡核苷酸(陽性對照)、用于鑒定普通HBV感染的DNA寡核苷酸和用于鑒定抗拉米夫定HBV感染的DNA寡核苷酸分別用作圖5A中(A)、(B)和(C)中的靶DNA。參考圖5A和5B，探針PNA與對應(yīng)的靶DNA特異性雜交。圖6A和6B分別說明對于rtL-180w和rtL-180m的環(huán)氧基含量PNA/DNA雜交結(jié)果的圖解定量分析數(shù)據(jù)。從圖6A和6B，可以看出在20％和30％的環(huán)氧含量發(fā)生最大水平的PNA/DNA雜交。
在本實施例中所用的靶DNA寡核苷酸(13-mer)具有以下序列靶A5′Cy3-CCATCTGGTGGAA-3′(SEQ ID NO4)靶W5′Cy3-AGCCAG*GAGAAA-3′(SEQ ID NO5)
靶M5′Cy3-AGCCAT*GAGAAA-3′(SEQ ID NO6)。
實施例6通過PNA連接劑的PNA/DNA雜交為了優(yōu)化PNA/DNA雜交，將起間隔區(qū)作用的C5-8含有胺基的酸連接到PNA的胺端基。圖7A為說明根據(jù)本發(fā)明用于優(yōu)化PNA/DNA雜交的連接劑的示意圖，和圖7B說明不同類型連接劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
在圖7B中，O-連接劑為2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙酸，M-連接劑為2-氨基乙氧基乙酸，和C-連接劑為6-氨基己酸。所述含有胺基的酸通過肽鍵與PNA連接，并且如上述實施例，含有胺基的酸的胺基與含有環(huán)氧基的聚合物層的環(huán)氧基反應(yīng)，以將PNA固定到所述聚合物層上。與PNA連接的連接劑防止固定的PNA在表面上聚集，并使PNA分子對靶DNA分子有代表性。結(jié)果，起間隔區(qū)作用的連接劑改善了探針PNA對靶DNA的可接近性。在本實施例中，使用環(huán)氧含量為20％和30％的涂覆含有環(huán)氧基的聚合物的基片提供PNA固定和PNA/DNA雜交的最大效率。除了使用連接劑外，以與實施例4和5相同的方式進行PNA固定和PNA/DNA雜交。圖8A和8B分別說明用于通過不同類型的連接劑介導(dǎo)的PNA/DNA雜交的評價結(jié)果的熒光圖像信息和陣列信息。
圖8B的點陣列中表示連接劑和PNA的類型。在圖8B中，H2O+NaOH為陰性對照，rtL-W(M)為沒有連接劑的普通野生型(突變體)PNA，O-W(M)為連接O-連接劑的rtLW(M)PNA，M-W(M)為連接M-連接劑的rtLW(M)PNA，和C6-W為連接C6-連接劑的rtLW PNA。PNA-cy3用作位置標記。圖9A和9B為圖8A的熒光圖像的圖解定量分析數(shù)據(jù)。
在圖9A和9B中，rtLW(M)為無連接劑的普通野生型(突變體)PNA，rtLW(M)-3為連接O-連接劑的rtLW(M)PNA，rtLW(M)-4為連接M-連接劑的rtLW(M)PNA，和rtLW(M)-5為連接C6-連接劑的rtLW(M)PNA。從圖9A和9B，可以看出，相對于無連接劑的探針PNA，連接連接劑的探針PNA顯示對靶DNA更優(yōu)異的特異性。
在本實施例中所用的連接連接劑的探針PNA的序列如下W(rtL 180w)-連接劑5′Cy3-AGCCAG*GAGAAA-3′-連接劑M(rtL 180m)-連接劑5′Cy3-AGCCAT*GAGAAA-3′-連接劑。
實施例7用于PNA/DNA雜交的PNA陣列的敏感性評價以低于公知的PNA的濃度的10uM或5uM PNA點樣實施例1和2中制備的涂覆聚合物的基片。根據(jù)實施例4和5中描述的方法評價PNA/DNA雜交中靶DNA的敏感性。點樣5uM PNA(低濃度)的雜交強度特征顯示與25uM PNA相似的水平。這可能是因為，由于比DNA更高的Tm值，PNA顯示比DNA高的結(jié)合親和力，并且由于無荷電率，所以無排斥力。圖10A和10B說明對于探針PNA的濃度PNA/DNA雜交的檢測敏感性的定量分析數(shù)據(jù)。
序列表<110>LG化學(xué)株式會社<120>使用含有環(huán)氧基的聚合物涂層的塑料基片的PNA芯片、制造該PNA芯片的方法和使用該PNA芯片檢測單核甘酸多態(tài)性的方法<130>PN054718<160>6<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>A序列<400>1ttccaccaga tgg 13<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>W序列(rtL180w)<400>2gtttctcctg gct 13<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M序列(rtL180m)<400>3gtttctcatg gct 13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>A靶序列
<400>4ccatctggtg gaa 13<210>5<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>W靶序列<400>5agccaggaga aa 12<210>6<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M靶序列<400>6agccatgaga aa 1權(quán)利要求
1.一種PNA(肽核酸)芯片，其中，含有目的DNA序列的探針PNA固定在用含有環(huán)氧基的聚合物涂層的塑料基片上。
2.權(quán)利要求1所述的PNA芯片，其中，所述塑料基片為由選自包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚降冰片烯、COC(環(huán)烯烴共聚物)、氟化聚酰亞胺、聚苯乙烯(PS)、SBC(苯乙烯丁二烯共聚物)、ABS(丙烯腈丁二烯苯乙烯)、SAN(苯乙烯丙烯腈)和聚砜的組的材料制成的透明塑料基片。
3.權(quán)利要求1所述的PNA芯片，其中，所述含有環(huán)氧基的聚合物為含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體和無環(huán)氧基的丙烯酸酯單體的共聚物。
4.權(quán)利要求3所述的PNA芯片，其中，所述含有環(huán)氧基的聚合物為如由下面式1表示的含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體和高粘性丙烯酸酯單體的共聚物-[CR3R3-CR1R3-X]n-，(1)其中，R1是含有環(huán)氧基的酯，R3是氫或烷基，和X是高粘性丙烯酸酯化合物。
5.權(quán)利要求4所述的PNA芯片，其中，所述高粘性丙烯酸酯單體為選自包括二季戊四醇羥基五丙烯酸酯(DPHA)、9-乙二醇二丙烯酸酯(9-EGDA)、季戊四醇三-四丙烯酸酯(PETA)、聚乙二醇400二丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯和二季戊四醇六丙烯酸酯的組。
6.權(quán)利要求3所述的PNA芯片，其中，所述含有環(huán)氧基的聚合物是如由下面式2表示的含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體和能夠粘著于所述塑料基片上的粘性丙烯酸酯衍生物的共聚物-[CR3R3-CR1R3-CR3R3-CR2R3]n-，(2)其中，R1是含有環(huán)氧基的酯，R2是烷基酯，和R3是氫或烷基。
7.權(quán)利要求6所述的PNA芯片，其中，所述粘性丙烯酸酯衍生物選自包括甲基丙烯酸甲酯(MMA)、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯(EMA)、丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸正丙酯、丙烯酸異丙酯和甲基丙烯酸異丙酯的組。
8.權(quán)利要求1所述的PNA芯片，其中，所述含有環(huán)氧基的聚合物中環(huán)氧基的含量為20～30％的范圍。
9.權(quán)利要求1所述的PNA芯片，其中，含有胺基和存在或不存在醚的C5-8羧酸連接劑與所述探針PNA的胺端基連接。
10.一種制造PNA芯片的方法，該方法包括以10～90∶80～5∶1～10的比例混和含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體、高粘性丙烯酸酯單體和光引發(fā)劑；在塑料基片上涂覆所述混合物；通過紫外光固化所述混合物；以及在塑料基片上點樣探針PNA印刷溶液。
11.一種制造PNA芯片的方法，該方法包括以10～99∶1～89∶0.1～0.5的比例混和含有環(huán)氧基的丙烯酸酯單體、具有與塑料基片相似物理性質(zhì)的丙烯酸酯衍生物和自由基引發(fā)劑；自由基聚合所述混合物；將通過在溶劑中溶解所得的聚合物制得的含有聚合物的溶液涂覆到塑料基片上；以及在塑料基片上點樣探針PNA印刷溶液。
12.權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，所述探針PNA印刷溶液含有0.01～1.0M的堿以輔助PNA固定。
13.權(quán)利要求11所述的方法，還包括在點樣前將含有聚合物的溶液涂層的塑料基片在30％或更高濕度條件下保存4小時或4小時以上。
14.一種檢測SNP(單核苷酸多態(tài)性)的方法，該方法包括將含有靶DNA的反應(yīng)樣品應(yīng)用于權(quán)利要求1至9任一項的PNA芯片；探針PNA與靶DNA進行雜交；洗滌所述PNA芯片以除去非特異性反應(yīng)產(chǎn)物；以及基于PNA/DNA雜交檢測熒光信號。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種PNA(肽核酸)芯片，其中，含有目的DNA序列的探針PNA固定在用含有環(huán)氧基的聚合物涂層的塑料基片上。因此，可以有效和節(jié)省成本的方式通過含有環(huán)氧基的聚合物層將單鏈PNA固定在透明塑料基片上。基于PNA/DNA雜交的熒光信號檢測能夠鑒定SNP(單核苷酸多態(tài)性)。
文檔編號B01J19/00GK1957093SQ200580016198
公開日2007年5月2日 申請日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日
發(fā)明者河廷玟, 蔣才英, 金仁壽 申請人:Lg化學(xué)株式會社