杯吡啶-芘四磺酸四鈉鹽超分子熒光傳感器及其對(duì)atp水解反應(yīng)的應(yīng)用
【專利說明】杯吡啶-芘四磺酸四鈉鹽超分子熒光傳感器及其對(duì)ATP水 解反應(yīng)的應(yīng)用
[0001] 本專利得到國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21402141)、天津市應(yīng)用基礎(chǔ) 與前沿技術(shù)研宄計(jì)劃（青年項(xiàng)目）（15JCQNJC05400)、天津師范大學(xué)引進(jìn)人才基金項(xiàng)目（自 然科學(xué)）（5RL122)和天津師范大學(xué)市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研宄基金課題資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于超分子材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽超分子熒光傳感 體系的制備，并利用該體系實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP在堿性磷酸酶催化下水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程 的監(jiān)測，以及對(duì)堿性磷酸酶的選擇性檢測。
【背景技術(shù)】
[0003] 酶反應(yīng)在生物體內(nèi)無處不在且非常重要，許多疾病都與酶的非正常表達(dá)有關(guān)， 因此對(duì)于生理中進(jìn)行的酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和進(jìn)程的監(jiān)測，以及相關(guān)酶的檢測在生物醫(yī)藥 領(lǐng)域是非常有意義的，SM:l)S.Samantaray，R.Sharma，T.Chattopadhyaya，K. S.D.Gupta,R.Ralhan.J.CancerRes.Clin.Oncol.2004,130,37 - 44 ；2) A.Spaltenstein,ff.M.Kamierski,J.F.Miller,V.Samano.Curr.Top.Med. Chem.2QQ^,5,1589 - 1607 ；3)T.Guo,D.ff.Hobbs.Curr.Med.Chem.2QQ^,13, 1811-1829。超分子串聯(lián)檢測技術(shù)在這一領(lǐng)域已經(jīng)體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，參見：R.N.Dsouza,A.Hennig,W.M.Nau.CSe?.及/r.J2012, 7次 3444 - 3459。例如：負(fù)電荷的磺化杯 芳烴和正電荷的熒光染料構(gòu)筑的超分子熒光傳感體系已經(jīng)成功應(yīng)用于許多陽離子型酶反 應(yīng)底物在相關(guān)酶催化下水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程的監(jiān)測，以及相關(guān)酶的選擇性檢測，參 見：1)D.-S.Guo,V.D.Uzunova，X.Su，Y.Liu,W.M.Nau. 5bi. 2011，名 1722 - 1734 ；2)M.Florea,S.Kudithipudi,A.Rei,M.J.Gonzalez-Alvarez,A.Jeltsch,ff.M.Nau.Chem.Bur.7； 2012,IS,3521 -3528 ；3)D.-S.Guo,J.Yang,Y. Liu. 及/r.J2013，7另8755 - 8759。然而，應(yīng)用于陰離子型酶反應(yīng)底物的超分子 串聯(lián)檢測體系還鮮有報(bào)道。
[0004]ATP是一類陰離子型酶反應(yīng)底物，且ATP在堿性磷酸酶催化下的水解反應(yīng)是生物 體內(nèi)十分重要的供能反應(yīng)，它無時(shí)無刻不在發(fā)生，對(duì)生物機(jī)體十分重要！因而，對(duì)ATP在堿 性磷酸酶催化下水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程的監(jiān)測意義重大。此外，文獻(xiàn)報(bào)道在諸多癌細(xì) 胞內(nèi)堿性磷酸酶CIAP的含量都要高于其在正常細(xì)胞中的表達(dá)值，參見：C.Wang，Q.-S. Chen,Z.-Q.Wang,X.Zhang.也職見CXe?. ?及/.2010，必8612-8615。因而，對(duì) 于堿性磷酸酶CIAP的選擇性檢測在生物醫(yī)藥領(lǐng)域也有著廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 杯吡啶是一類富含吡啶陽離子的環(huán)狀化合物，具有良好的水溶性以及和陰離子 客體鍵合的潛能。該化合物可以以3-溴甲基吡啶為原料簡便高效的進(jìn)行合成，參見：S. Shinoda,M.Tadokoro,H.Tsukube,R.Arakawa,Chem.Commun.1998，181 - 182。然 而，基于杯吡啶的超分子應(yīng)用還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)分析，提供一種杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽超分子熒 光傳感體系，并利用該體系實(shí)現(xiàn)了超分子串聯(lián)檢測技術(shù)對(duì)陰離子型酶反應(yīng)底物ATP在堿性 磷酸酶CIAP催化下水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程的監(jiān)測，以及對(duì)CIAP的選擇性檢測。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容： 一種杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽超分子熒光傳感器，其特征在于：構(gòu)筑單元以杯吡啶為 主體，以芘四磺酸四鈉鹽為客體，通過主-客體包結(jié)配位相互作用構(gòu)筑超分子熒光傳感體 系；其結(jié)構(gòu)式如下：
本發(fā)明進(jìn)一步公開了杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽超分子熒光傳感器的制備方法，其特征 在于：將杯吡啶和芘四磺酸四鈉鹽溶解于水中，均勻混合后得到超分子熒光傳感器；超分 子熒光傳感器中杯吡啶和芘四磺酸四鈉鹽的濃度分別為0.004mmol/L和0.001mmol/L。
[0008] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽超分子熒光傳感器在監(jiān)控ATP 水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程以及檢測堿性磷酸酶CIAP中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所述的監(jiān)控ATP水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程以及檢測堿性磷酸酶CIAP指的 是：當(dāng)ATP加入到杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽水溶液中時(shí)，由于ATP和杯吡啶的鍵合能力較 強(qiáng)，芘四磺酸四鈉鹽并未被包結(jié)，顯示出強(qiáng)熒光信號(hào)；再將CIAP酶加入到上述三元體系中， 隨著ATP在CIAP酶作用下的水解反應(yīng)進(jìn)行，體系中ATP越來越少，AMP越來越多，但AMP和 杯吡啶的鍵合能力大大減弱了，因而芘四磺酸四鈉鹽開始逐漸和杯吡啶鍵合，導(dǎo)致其熒光 信號(hào)隨著ATP在CIAP酶作用下的水解反應(yīng)進(jìn)行而逐漸猝滅，直至平衡。這樣就實(shí)現(xiàn)了堿性 磷酸酶CIAP催化下ATP水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程被杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽超分子熒 光傳感器所監(jiān)測。由于ATP水解反應(yīng)只能專一在堿性磷酸酶CIAP的催化下進(jìn)行，所以其它 酶無法實(shí)現(xiàn)該過程，因而也實(shí)現(xiàn)了該熒光傳感器對(duì)堿性磷酸酶CIAP的選擇性檢測。
[0010] 本發(fā)明公開的杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽超分子熒光傳感器所具有的積極效果在 于： 基于杯吡啶一芘四磺酸四鈉鹽的超分子熒光傳感器，制備方法高效簡便，主、客體原料 用量少；該超分子熒光傳感器可以對(duì)陰離子型酶反應(yīng)底物ATP在堿性磷酸酶CIAP催化下水 解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測；該超分子熒光傳感器可以對(duì)堿性磷酸酶CIAP進(jìn)行選 擇性檢測，由于諸多癌細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶CIAP的含量都要高于其在正常細(xì)胞中的表達(dá)值， 因而，對(duì)于堿性磷酸酶CIAP的選擇性檢測在生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒂兄鴱V泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0011] 圖1為芘四磺酸四鈉鹽水溶液（0. 001mmol/L)和杯吡啶（0. 004mmol/L) -芘四 磺酸四鈉鹽（0.001mmol/L)水溶液的熒光光譜曲線圖，圖中顯示：未加入杯吡啶時(shí)芘四磺 酸四鈉鹽水溶液具有強(qiáng)熒光發(fā)射，加入4倍量的杯吡啶后芘四磺酸四鈉鹽水溶液的熒光就 基本完全被猝滅，這表明杯吡啶和芘四磺酸四鈉之間通過超分子相互作用形成了具有良好 響應(yīng)性的熒光傳感器； 圖2為隨著杯吡啶的加入，芘四磺酸四鈉鹽水溶液（0. 001mmol/L)熒光發(fā)射強(qiáng)度的變 化圖； 圖3為以杯吡啶的濃度為橫坐標(biāo)，以385nm的熒光發(fā)射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，杯吡啶和芘四 磺酸四鈉鹽的鍵合常數(shù)擬合圖； 圖4為杯R比啶（0. 004mmol/L) -花四磺酸四鈉鹽（0. 001mmol/L)水溶液和杯R比啶 (0.004mmol/L)-芘四磺酸四鈉鹽（0.001mmol/L) -ATP(0.060mmol/L)水溶液的熒 光光譜曲線圖； 圖5為隨著ATP的加入，杯吡啶（0.004mmol/L) -芘四磺酸四鈉鹽（0.001mmol/L) 水溶液熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化圖； 圖6為以ATP的濃度為橫坐標(biāo)，以385nm的熒光發(fā)射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，杯吡啶和ATP的 鍵合常數(shù)擬合圖； 圖7為以熒光光譜為測試手段，ATP在存在與不存在堿性磷酸酶CIAP(1. 5U/mL)的 情況下水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程的監(jiān)測圖； 圖8為以熒光光譜為測試手段，ATP在堿性磷酸酶CIAP(1. 5U/mL)和失活的堿性磷 酸酶CIAP(1.5U/mL)存在下水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程的監(jiān)測圖； 圖9為隨著AMP的加入，杯吡啶（0.004mmol/L) -芘四磺酸四鈉鹽（0.001mmol/L) 水溶液熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化圖； 圖10為以AMP的濃度為橫坐標(biāo)，以385nm的熒光發(fā)射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，杯吡啶和AMP的 鍵合常數(shù)擬合圖； 圖11為以熒光光譜為測試手段，ATP在堿性磷酸酶CIAP(1.5U/mL)、丁酰膽堿酯酶BChE(1.5U/mL)和胰蛋白酶Trypsin(1.5U/mL)存在下水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程的監(jiān)測 圖； 圖12為以熒光光譜為測試手段，ATP在堿性磷酸酶CIAP(1. 5U/mL)、堿性磷酸酶CIAP(1.5U/mL)和丁酰膽堿酯酶BChE(1.5U/mL)、堿性磷酸酶CIAP(1.5U/mL)和胰蛋白酶 Trypsin(1.5U/mL)存在下水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其進(jìn)程的監(jiān)測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專 業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)