本發(fā)明涉及一種熒光碳納米材料-碳點(diǎn)的制備及應(yīng)用，即以甘蔗廢糖蜜為原料，經(jīng)高溫裂解制備熒光碳點(diǎn)，并系統(tǒng)研究該碳點(diǎn)在細(xì)胞成像及日落黃的含量檢測(cè)的應(yīng)用，屬于生物材料、生物醫(yī)學(xué)和食品檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

廢糖蜜是一種黑色粘稠液體，是生產(chǎn)原糖和精糖的副產(chǎn)物。其主要成分為發(fā)酵性糖和非發(fā)酵性糖，含糖量約為45~50%。由于糖蜜具有較高的含糖量，因此常在農(nóng)副產(chǎn)品加工、食品、建筑、能源化工和輕工等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。在農(nóng)副產(chǎn)品領(lǐng)域中，糖蜜可作為輔料，添加至飼料中，有助于牲畜補(bǔ)充能量和礦物質(zhì)，促進(jìn)消化吸收，提高牲畜肉質(zhì)和牛乳產(chǎn)量。在食品領(lǐng)域中，糖蜜與氨基化合物反應(yīng)，可制備出親水性良好，著色能力強(qiáng)，安全高效的食用色素。在建筑領(lǐng)域中，水泥中添加糖蜜，可提高水泥的流動(dòng)性、凝固時(shí)間、力學(xué)強(qiáng)度等性能。在能源化工領(lǐng)域中，糖蜜通過發(fā)酵作用產(chǎn)生乙醇、丁醇等醇類，部分替代汽油，實(shí)現(xiàn)能源可持續(xù)發(fā)展。此外，糖蜜在氨基酸（亮氨酸、谷氨酸、賴氨酸等）工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛應(yīng)用。在輕工領(lǐng)域中，摻雜少量糖蜜，利用糖蜜中的單糖和蔗糖與纖維素相結(jié)合，可提高紙質(zhì)的伸張性和保濕性。由此可見，糖蜜作為添加劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)品加工、食品、建筑、能源化工和輕工等領(lǐng)域。但是通過直接或間接地改性糖蜜，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用報(bào)道未見報(bào)道。

碳點(diǎn)是一類以碳為基本結(jié)構(gòu)單元，尺寸小于20 nm，且具有良好親水性和熒光性質(zhì)的納米材料。碳點(diǎn)的熒光性質(zhì)依賴于激發(fā)波長(zhǎng)，即發(fā)射光譜可隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增加而發(fā)生明顯紅移。碳點(diǎn)具有良好的抗漂白性，在氙燈或激光共聚焦顯微鏡直接照射下，熒光強(qiáng)度基本無變化。與傳統(tǒng)的金屬量子點(diǎn)相比，碳點(diǎn)具有優(yōu)異的生物相容性?；谔键c(diǎn)顯著的特征，碳點(diǎn)可用于生物探針、藥物載體及活體成像等研究。目前有很多學(xué)者對(duì)碳點(diǎn)進(jìn)行了一系列的研究，如檢索到以下專利：

申請(qǐng)?zhí)枺?01511004716.X；申請(qǐng)人：江南大學(xué)；發(fā)明名稱：一種以米糠為碳源制備熒光碳點(diǎn)的方法；摘要：本發(fā)明公開了一種以米糠為碳源制備熒光碳點(diǎn)的方法。將米糠作為碳源，采用水熱法制備出熒光碳點(diǎn)。該方法將米糠放入馬弗爐中煅燒后，加入去離子水于反應(yīng)釜內(nèi)加熱數(shù)小時(shí)。將反應(yīng)液離心，經(jīng)濾膜過濾，再用透析袋透析后即得碳點(diǎn)溶液。本發(fā)明所用原料源于自然資源，易于獲取，且制備方法簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保。所得碳點(diǎn)具有很好的水溶性，熒光強(qiáng)度高，可適用于生物標(biāo)記、細(xì)胞成像等領(lǐng)域。

申請(qǐng)?zhí)枺?01511004717.4；申請(qǐng)人：江南大學(xué)；發(fā)明名稱：一種基于柚子制備熒光碳點(diǎn)的方法；摘要：本發(fā)明公開了一種基于柚子制備熒光碳點(diǎn)的方法。將柚子作為碳源，采用水熱法制備出熒光碳點(diǎn)。該方法將柚子汁置于反應(yīng)釜內(nèi)反應(yīng)數(shù)小時(shí)后，將反應(yīng)液離心，經(jīng)濾膜過濾，透析后得碳點(diǎn)溶液。本發(fā)明所用原料源于自然資源，易于獲取，且制備方法簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保。所得碳點(diǎn)具有很好的水溶性，熒光強(qiáng)度高，可適用于生物標(biāo)記、細(xì)胞成像等領(lǐng)域。

申請(qǐng)?zhí)枺?01410623730.7；申請(qǐng)人：山西大學(xué)；發(fā)明名稱：一種綠色熒光碳點(diǎn)的制備方法及在細(xì)胞成像方面的應(yīng)用；摘要：本發(fā)明提供了一種綠色熒光碳點(diǎn)的制備方法及在細(xì)胞成像方面的應(yīng)用，屬于熒光納米材料的制備和應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明具體的制備步驟如下：(1) 將花瓣粉末加入去離子水中，制得混合液；(2) 將 (1) 得到的混合液轉(zhuǎn)移到水熱反應(yīng)釜中，進(jìn)行水熱反應(yīng)；(3) 將 (2) 得到的產(chǎn)物經(jīng)過離心、透析，最終得到綠色熒光碳點(diǎn)溶液。本發(fā)明將植物花瓣作為碳源，原料廣泛易得，制備方法簡(jiǎn)單，成本低；而且制得的綠色熒光碳點(diǎn)水溶性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，可直接用于細(xì)胞成像等。

上述制備熒光碳點(diǎn)的專利的碳源依次為米糠、柚子及花瓣，但是未見以廢糖蜜為碳源制備熒光碳點(diǎn)的文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明采用的是廣西地區(qū)優(yōu)勢(shì)---廢糖蜜，充分利用廢液資源，符合變廢為寶的政策。廢糖蜜是制糖行業(yè)的廢液，價(jià)格低廉，在廣西來源廣泛。廢糖蜜多應(yīng)用于工業(yè)等其他領(lǐng)域，在生物醫(yī)學(xué)和食品檢測(cè)未見有專利報(bào)道和公開。本發(fā)明以廢糖蜜制備熒光碳點(diǎn)，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和食品檢測(cè)。廢糖蜜與其他碳源相比，最大區(qū)別是糖蜜是廢液，其次廣西是制糖大省，來源廣泛，制備方法雖然與其他的制備方法基本相似。

日落黃是一種食用著色劑，常用于飲料、糕點(diǎn)及膨化食品等，禁止用于肉類、水果及嬰兒食品等。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)于日落黃在各種食品用量作出了明確規(guī)定（GB 2760－2011 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》）。在規(guī)定用量范圍內(nèi)，日落黃對(duì)人體無明顯危害。但人體過多地?cái)z入日落黃，可能造成兒童智商低下，影響兒童肝臟和腎臟等發(fā)育，干擾體內(nèi)代謝，引起多種疾病。因此，嚴(yán)格監(jiān)管日落黃的使用，有效地檢測(cè)食品中日落黃的含量，具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述存在的問題，本發(fā)明提供一種以甘蔗廢糖蜜為原料合成熒光碳點(diǎn)的制備方法及其應(yīng)用，即以甘蔗廢糖蜜為原料，經(jīng)高溫裂解制備穩(wěn)定性高，生物相容性好，且價(jià)格低廉的熒光碳點(diǎn)。該熒光碳點(diǎn)具有良好的抗漂白性、光穩(wěn)定性和熒光性質(zhì)，可用于細(xì)胞成像。此外，該熒光碳點(diǎn)能有效地檢測(cè)日落黃的含量，將為食品添加劑中日落黃含量的檢測(cè)提供一種有效、快速的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

以甘蔗廢糖蜜為原料合成熒光碳點(diǎn)的制備方法，包括如下步驟：

（1）、稱取4.0 -6.0g的甘蔗廢糖蜜，置入聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，于240-260℃反應(yīng)11-13 h后，冷卻至室溫，得到高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜；

（2）、往高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜中再加入4-6 mL去離子水，在80-120 Hz超聲2-4 min，得到甘蔗廢糖蜜溶液；所述的甘蔗廢糖蜜是甘蔗蔗糖生產(chǎn)過程結(jié)晶分離白糖后剩余的黑色粘稠液體；

（3）、將甘蔗廢糖蜜溶液通過0.22μm 水相濾膜，反復(fù)過濾三次，收集金黃色濾液；

（4）、將金黃色濾液溶液滴入200 mL的無水乙醇中進(jìn)行沉淀，析出褐色固體，于6000 round/min的轉(zhuǎn)速下離心分離5min，收集澄清溶液，減壓除去無水乙醇后，再加入10 mL去離子水，得熒光碳點(diǎn)溶液，最后將熒光碳點(diǎn)溶液通過0.22μm水相濾膜，收集濾液，凍干，得熒光碳點(diǎn)，備用。

優(yōu)選地，以甘蔗廢糖蜜為原料合成熒光碳點(diǎn)的制備方法，包括如下步驟：

（1）、稱取5.0g的甘蔗廢糖蜜，置入聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，于250℃反應(yīng)12 h后，冷卻至室溫，得到高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜；

（2）、往高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜中再加入5 mL去離子水，在100 Hz超聲3 min，得到甘蔗廢糖蜜溶液；所述的甘蔗廢糖蜜是甘蔗蔗糖生產(chǎn)過程結(jié)晶分離白糖后剩余的黑色粘稠液體；

（3）、將甘蔗廢糖蜜溶液通過0.22μm濾膜，反復(fù)過濾三次，收集金黃色濾液；

（4）、將金黃色濾液溶液滴入200 mL的無水乙醇中進(jìn)行沉淀，析出褐色固體，于6000 round/min的轉(zhuǎn)速下離心分離5min，收集澄清溶液，減壓除去無水乙醇后，再加入10 mL去離子水，得熒光碳點(diǎn)溶液，最后將熒光碳點(diǎn)溶液通過0.22μm水相濾膜，收集濾液，凍干，得熒光碳點(diǎn)，備用。

本發(fā)明所述的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)，其X射線光電子能譜試驗(yàn)表明，碳點(diǎn)主要含有C、O元素，原子百分比分別69.26%，22.17%。

本發(fā)明所述的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)，其FT-IR表明，3400 cm^-1歸屬于-OH伸縮振動(dòng)峰；2983cm^-1歸屬于C-H伸縮振動(dòng)峰；1565cm^-1、1402cm^-1歸屬于COO^-非對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；1120cm^-1、1049cm^-1歸屬于Si-O-Si對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。

本發(fā)明所述的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)，其核磁共振氫譜¹HNMR表明，化學(xué)位移在0.92~4.25 ppm歸屬于脂肪鏈上的氫；在6.17~8.47ppm歸屬于芳香化合物上的氫。

本發(fā)明所述的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)，其核磁共振碳譜¹³CNMR表明，化學(xué)位移在8.48~68.45 ppm，179.76~182.35 ppm分別歸屬于脂肪族和芳香族上碳的特征吸收峰。

本發(fā)明所述的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)，其透射電子顯微鏡TEM表明碳點(diǎn)尺寸為4.20 nm，晶格間距為0.23 nm。

本發(fā)明所述的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)，其X射線衍射XRD表明碳點(diǎn)的2θ衍射峰主要位于24.64°，具有sp²碳的結(jié)構(gòu)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是

1、本發(fā)明的熒光碳點(diǎn)是利用甘蔗廢糖蜜為原料，經(jīng)過高溫裂解制備。甘蔗廢糖蜜原料價(jià)格廉價(jià)，合成工藝簡(jiǎn)易，可發(fā)揮廣西地區(qū)優(yōu)勢(shì)（廣西是制糖大省，來源廣泛）；廢糖蜜與其他碳源相比，最大特點(diǎn)是廢糖蜜是廢液，來源廣泛，本發(fā)明將廢糖蜜制備為安全可靠的熒光碳點(diǎn)，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和食品檢測(cè)，屬于變廢為寶的領(lǐng)域。比起采用柚子及花瓣作為熒光碳點(diǎn)，不僅來源廣、成本低，制備過程工藝也較簡(jiǎn)單。

2、通過本發(fā)明的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)穩(wěn)定性高，生物相容性好，而且熒光特性優(yōu)異；本發(fā)明的碳點(diǎn)可應(yīng)用于在細(xì)胞內(nèi)成像，并能有效檢測(cè)食品添加劑中的日落黃含量。

3、本發(fā)明首次以廢糖蜜為原料合成熒光碳點(diǎn)，拓展廢糖蜜在生物醫(yī)學(xué)及食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

4、本發(fā)明所述的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)，其X射線光電子能譜試驗(yàn)表明，碳點(diǎn)主要含有C、O元素，原子百分比分別69.26%，22.17%；其FT-IR表明，3400 cm^-1歸屬于-OH伸縮振動(dòng)峰；2983cm^-1歸屬于C-H伸縮振動(dòng)峰；1565cm^-1、1402cm^-1歸屬于COO^-非對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；1120cm^-1、1049cm^-1歸屬于Si-O-Si對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；其核磁共振氫譜¹HNMR表明，化學(xué)位移在0.92~4.25 ppm歸屬于脂肪鏈上的氫；在6.17~8.47ppm歸屬于芳香化合物上的氫；其核磁共振碳譜¹³CNMR表明，化學(xué)位移在8.48~68.45 ppm，179.76~182.35 ppm分別歸屬于脂肪族和芳香族上碳的特征吸收峰；其透射電子顯微鏡TEM表明碳點(diǎn)尺寸為4.20 nm，晶格間距為0.23 nm；其X射線衍射XRD表明碳點(diǎn)的2θ衍射峰主要位于24.64°，具有sp²碳的結(jié)構(gòu)。

附圖說明

圖1為熒光碳點(diǎn)的X射線光電子能譜（XPS）圖；

圖2為熒光碳點(diǎn)的C_1s圖譜；

圖3為熒光碳點(diǎn)的O_1s圖譜；

圖4為熒光碳點(diǎn)的紅外光譜（FT-IR）圖；

圖5為熒光碳點(diǎn)的¹HNMR圖；

圖6為熒光碳點(diǎn)的¹³CNMR圖；

圖7為熒光碳點(diǎn)的透射電子顯微鏡（TEM）圖；

圖8為熒光碳點(diǎn)的X射線衍射（XRD）圖；

圖9為熒光碳點(diǎn)的熱重分析儀（TGA）圖譜；

圖10為熒光碳點(diǎn)的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜；

圖11為激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)碳點(diǎn)熒光光譜的影響；

圖12為熒光碳點(diǎn)不同激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)下的歸一化熒光圖；

圖13為溶液pH對(duì)熒光碳點(diǎn)光譜性質(zhì)的影響；

圖14為NaCl溶液對(duì)熒光碳點(diǎn)光譜性質(zhì)的影響；

圖15為氨基酸對(duì)熒光碳點(diǎn)光譜性質(zhì)的影響；

圖16為金屬離子對(duì)熒光碳點(diǎn)光譜性質(zhì)的影響；

圖17為熒光碳點(diǎn)在Fe³⁺不同濃度下熒光光譜；

圖18為熒光碳點(diǎn)對(duì)Fe³⁺的線性關(guān)系；

圖19為熒光碳點(diǎn)抗漂白性評(píng)價(jià)；

圖20為熒光碳點(diǎn)自由基清除能力評(píng)價(jià)；

圖21為熒光碳點(diǎn)的生物相容性評(píng)價(jià)；

圖22為熒光碳點(diǎn)在細(xì)胞中成像，其溶血性質(zhì)評(píng)價(jià)；

圖23為碳點(diǎn)在MCF-7細(xì)胞內(nèi)的明場(chǎng)照片；

圖24為當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，熒光碳點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)呈藍(lán)色熒光；

圖25為當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為458nm，熒光碳點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)呈綠色熒光；

圖26為當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm，熒光碳點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)呈紅色熒光；

圖27為熒光碳點(diǎn)在日落黃不同濃度下的熒光光譜；

圖28為熒光碳點(diǎn)對(duì)對(duì)日落黃的線性關(guān)系。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

以甘蔗廢糖蜜為原料合成熒光碳點(diǎn)的制備方法，包括如下步驟：

（1）、稱取4.0 g的甘蔗廢糖蜜，置入聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，于240℃反應(yīng)13 h后，冷卻至室溫，得到高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜；

（2）、往高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜中再加入4mL去離子水，在80 Hz超聲4 min，得到甘蔗廢糖蜜溶液；所述的甘蔗廢糖蜜是甘蔗蔗糖生產(chǎn)過程結(jié)晶分離白糖后剩余的黑色粘稠液體；

（3）、將甘蔗廢糖蜜溶液通過0.22μm 水相濾膜，反復(fù)過濾三次，收集金黃色濾液；

（4）、將金黃色濾液溶液滴入200 mL的無水乙醇中進(jìn)行沉淀，析出褐色固體，于6000 round/min的轉(zhuǎn)速下離心分離5min，收集澄清溶液，減壓除去無水乙醇后，再加入10 mL去離子水，得熒光碳點(diǎn)溶液，最后將熒光碳點(diǎn)溶液通過0.22μm水相濾膜，收集濾液，凍干，得熒光碳點(diǎn)，備用。

實(shí)施例2

以甘蔗廢糖蜜為原料合成熒光碳點(diǎn)的制備方法，包括如下步驟：

（1）、稱取5.0g的甘蔗廢糖蜜，置入聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，于250℃反應(yīng)12 h后，冷卻至室溫，得到高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜；

（2）、往高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜中再加入5 mL去離子水，在100 Hz超聲3 min，得到甘蔗廢糖蜜溶液；所述的甘蔗廢糖蜜是甘蔗蔗糖生產(chǎn)過程結(jié)晶分離白糖后剩余的黑色粘稠液體；

（3）、將甘蔗廢糖蜜溶液通過0.22μm水相濾膜，反復(fù)過濾三次，收集金黃色濾液；

（4）、將金黃色濾液溶液滴入200 mL的無水乙醇中進(jìn)行沉淀，析出褐色固體，于6000 round/min的轉(zhuǎn)速下離心分離5min，收集澄清溶液，減壓除去無水乙醇后，再加入10 mL去離子水，得熒光碳點(diǎn)溶液，最后將熒光碳點(diǎn)溶液通過0.22μm水相濾膜，收集濾液，凍干，得熒光碳點(diǎn)，備用。

實(shí)施例3

以甘蔗廢糖蜜為原料合成熒光碳點(diǎn)的制備方法，包括如下步驟：

（1）、稱取6.0g的甘蔗廢糖蜜，置入聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，于260℃反應(yīng)11h后，冷卻至室溫，得到高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜；

（2）、往高溫裂解后的甘蔗廢糖蜜中再加入6mL去離子水，在120Hz超聲2 min，得到甘蔗廢糖蜜溶液；所述的甘蔗廢糖蜜是甘蔗蔗糖生產(chǎn)過程結(jié)晶分離白糖后以后剩余的廢糖蜜；

（3）、將甘蔗廢糖蜜溶液通過0.22μm水相濾膜，反復(fù)過濾三次，收集金黃色濾液；

（4）、將金黃色濾液溶液滴入200 mL的無水乙醇中進(jìn)行沉淀，析出褐色固體，于6000 round/min的轉(zhuǎn)速下離心分離5min，收集澄清溶液，減壓除去無水乙醇后，再加入10 mL去離子水，得熒光碳點(diǎn)溶液，最后將熒光碳點(diǎn)溶液通過0.22μm水相濾膜，收集濾液，凍干，得熒光碳點(diǎn)，備用。

實(shí)施例2為最佳實(shí)施例，因此將實(shí)施例2所述的制備方法得到的熒光碳點(diǎn)，進(jìn)行各種結(jié)構(gòu)表征，如下表述。

將制備的碳點(diǎn)進(jìn)行X射線光電子能譜（XPS）、紅外光譜（FT-IR）、核磁共振（NMR）表征。XPS結(jié)果表明，碳點(diǎn)主要含有C、O元素，原子百分比分別69.26%，22.17%（圖1）。此外，碳點(diǎn)中含有K、Ca、Si三種元素。C_1s圖譜表明，294.4 eV、291.7 eV歸屬于O-C=O；287.2eV、283.5eV分別歸屬于C-C、C-Si、C-O、C=C（圖2）。O_1s圖譜表明O_1s在530.4 eV有特征吸收峰（圖3）。FT-IR表明，3400 cm^-1歸屬于-OH伸縮振動(dòng)峰；2983cm^-1歸屬于C-H伸縮振動(dòng)峰；1565cm^-1、1402cm^-1歸屬于COO^-非對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；1120cm^-1、1049cm^-1歸屬于Si-O-Si對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰（圖4）。¹HNMR（核磁共振氫譜）表明，化學(xué)位移在0.92~4.25 ppm歸屬于脂肪鏈上的氫；在6.17~8.47ppm歸屬于芳香化合物上的氫（圖5）。¹³CNMR（核磁共振碳譜）表明，化學(xué)位移在8.48~68.45 ppm，179.76~182.35 ppm分別歸屬于脂肪族和芳香族上碳的特征吸收峰（圖6）。XPS、FT-IR和NMR結(jié)果表明碳點(diǎn)上含有羧基、羥基官能團(tuán)。

通過透射電子顯微鏡（TEM）、X射線衍射（XRD）表征碳點(diǎn)的外觀形貌和結(jié)構(gòu)分析。TEM表明碳點(diǎn)尺寸為4.20 nm，晶格間距為0.23 nm（圖7）。XRD譜表明，碳點(diǎn)的2θ衍射峰主要位于24.64°，具有sp²碳的結(jié)構(gòu)（圖8）。

利用熱重分析儀（TGA）、紫外光譜（UV-Vis）、熒光光譜，研究碳點(diǎn)的熱穩(wěn)定性和光學(xué)性質(zhì)。TGA結(jié)果表明，200℃時(shí)，由于碳點(diǎn)中的水蒸氣蒸發(fā)，碳點(diǎn)總質(zhì)量損失了8.56%，；460℃時(shí)，碳點(diǎn)總質(zhì)量損失了35.32%；460~584℃，碳點(diǎn)恒重；900℃，碳點(diǎn)質(zhì)量損失了83.59%（圖9）。UV-Vis表明碳點(diǎn)溶液在260 nm和320 nm有明顯的特征吸收峰（圖10）。260 nm處特征吸收峰為C=C骨架組成的共軛雙鍵中的π-π*躍遷的吸收峰位置；320 nm處吸收峰為羧基中C=O發(fā)生n-π*躍遷的吸收峰位置。以狹逢寬度為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為305 nm，在390 nm處出現(xiàn)碳點(diǎn)的熒光發(fā)射峰。在紫外燈（365 nm）照射下，呈藍(lán)色熒光。配制0.25 mg/mL碳點(diǎn)水溶液，固定激發(fā)狹逢寬度為5 nm，改變激發(fā)波長(zhǎng)（280~415 nm），在295~700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描發(fā)射光譜。隨著波長(zhǎng)增大，碳點(diǎn)發(fā)射峰的最大吸收峰強(qiáng)度降低（圖11）。將碳點(diǎn)發(fā)射峰歸一化，結(jié)果表明碳點(diǎn)發(fā)射峰發(fā)生了紅移（圖12）。

熒光碳點(diǎn)的熒光性質(zhì)表征：

a.配制不同pH水溶液（pH范圍為3~12），碳點(diǎn)最終濃度為0.25mg/mL，在熒光光度計(jì)上（激發(fā)波長(zhǎng)λ_ex=309 nm）測(cè)定315-580 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射光譜（圖13）。

b.配制不同濃度的氯化鈉（NaCl）溶液，碳點(diǎn)最終濃度為0.25mg/mL，掃描碳點(diǎn)在315-580 nm波長(zhǎng)范圍的發(fā)射光譜（圖14）。

c.配制10種常見氨基酸水溶液和谷胱甘肽溶液（最終濃度為500μM），碳點(diǎn)最終濃度為0.25mg/mL，在熒光光度計(jì)上（λ_ex=309 nm）測(cè)定315-580 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射光譜（圖15）。

d.配制13種常見金屬水溶液，碳點(diǎn)最終濃度為0.25mg/mL，金屬離子濃度為500μM，在熒光光度計(jì)上（λ_ex=309 nm）測(cè)定315-580 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射光譜（圖16）。

上述結(jié)果表明，碳點(diǎn)的熒光不受溶液pH、NaCl、氨基酸影響，穩(wěn)定性好。金屬離子對(duì)碳點(diǎn)熒光性質(zhì)實(shí)驗(yàn)表明，Zn²⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cd²⁺、La³⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺對(duì)碳點(diǎn)的熒光影響較小。其中，F(xiàn)e³⁺能猝滅碳點(diǎn)的熒光。隨著Fe³⁺濃度提高，碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度降低（圖17）。Fe³⁺濃度在5~100μM時(shí)，碳點(diǎn)對(duì)Fe³⁺具有線性關(guān)系，方程為：y=0.0035x-0.0263，根據(jù)檢測(cè)限公式：LOD=3σ/S，計(jì)算出碳點(diǎn)對(duì)Fe³⁺的檢測(cè)限為3.79μM（圖18）。

光穩(wěn)定性和自由基清除活性評(píng)價(jià)：

配制13個(gè)0.25 mg/mL碳點(diǎn)溶液，分別在UV燈（365 nm）連續(xù)3 h照射下，每隔15 min取一次樣品，測(cè)定390 nm處熒光強(qiáng)度（λ_ex=309 nm）（圖19）。結(jié)果表明，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度無明顯變化，具有良好的光穩(wěn)定性。

4 mL 甲醇溶解4.0 mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），準(zhǔn)確量取1.26 mL DPPH的甲醇溶液，加入58.74 mL甲醇。移取上述DPPH溶液3 mL，加入稀釋后碳點(diǎn)溶液200μL，充分混合均勻后，DPPH最終濃度為50μM，碳點(diǎn)最終濃度為（0 ~2.0 mg/mL）靜置90 min，測(cè)定UV 在517 nm處測(cè)定紫外吸收（圖20）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EC₅₀（能使50% DPPH自由基猝滅的碳點(diǎn)有效濃度）為0.514 mg/mL，不易受自由基影響。

在體外評(píng)價(jià)熒光碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性和成像：

乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）以每孔10000的密度接種于96孔板，在37℃、CO₂濃度為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的碳點(diǎn)溶液（0.4~4.0 mg/mL）共孵育24 h，以培養(yǎng)基RPMI-1640作為對(duì)照，然后加入水溶性四氮唑（WST-1），孵育4 h后，吸去培養(yǎng)基，加入DMSO，在酶標(biāo)儀上搖晃2 min，波長(zhǎng)為450nm測(cè)吸光值。WST結(jié)果表明，碳點(diǎn)濃度在0.4~4 mg/mL范圍內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，MCF-7成活率均高于80%，表明碳點(diǎn)具有良好的生物相容性（圖21）。

為了評(píng)價(jià)碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞膜破壞程度，本發(fā)明進(jìn)行了溶血實(shí)驗(yàn)（圖22）。用pH=7.4的磷酸緩沖溶液（PBS），加入至人血中，離心（1500 round/min，10 min），洗滌六次，用PBS稀釋至人的紅血球細(xì)胞（HRBC）濃度為4×10⁸個(gè)/mL。加入200μ L含HRBC的PBS，600μL PBS和不同濃度的碳點(diǎn)溶液，以PBS和去離子水作為陰性和陽性對(duì)照，37℃下孵育2 h，離心（1500 round/min，10 min），取上層澄清溶液，利用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定溶液吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以PBS作為陰性對(duì)照時(shí)，血紅細(xì)胞膜未受到破壞，溶液為澄清透明。當(dāng)以去離子水為陽性對(duì)照時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)滲透壓變大，細(xì)胞膜被破壞，血紅蛋白分子溢出，溶液變成紅色。經(jīng)過酶標(biāo)儀測(cè)定，碳點(diǎn)濃度在0.2 ~2.0mg/mL范圍內(nèi)，溶血率均低于國(guó)家藥典規(guī)定的溶血度不超過5%的標(biāo)準(zhǔn)，即碳點(diǎn)具有良好的生物安全性。

將2×10⁴個(gè)MCF-7細(xì)胞接種在15 mm內(nèi)徑的激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，并在含10% FBS（V/V）的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，使其貼壁生長(zhǎng)。加入0.5 mg/mL碳點(diǎn)溶液，并在 37℃繼續(xù)孵育 4 h。孵育結(jié)束后，加入一定量 4%多聚甲醛在 4 ℃孵育 10 min，并用 PBS 清洗 3 遍。細(xì)胞固定后，用 PBS 清洗 3 遍。調(diào)節(jié)激光共聚焦的激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)碳點(diǎn)在MCF-7細(xì)胞內(nèi)拍照。圖23為細(xì)胞MCF-7明場(chǎng)照片。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm激發(fā)時(shí)，碳點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)呈藍(lán)色熒光，且大量碳點(diǎn)在細(xì)胞質(zhì)中（圖24）。分別以458 nm和514 nm激發(fā)時(shí)，碳點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)呈綠色熒光（圖25）和紅色熒光（圖26）。

熒光碳點(diǎn)對(duì)日落黃檢測(cè)：

配制含有不同濃度日落黃的0.1 mg/mL碳點(diǎn)溶液，測(cè)定315-580 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射光譜。隨著日落黃濃度提高，碳點(diǎn)溶液的強(qiáng)度降低（圖27）。日落黃濃度在10~50μM，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度具有線性變化，方程為：y=0.9486x+6.0695，根據(jù)檢測(cè)限公式：LOD=3σ/S，計(jì)算出碳點(diǎn)對(duì)日落黃含量檢測(cè)限為0.098μM（圖28）。