專利名稱：一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種納米顆粒材料，尤其是涉及一種高強度稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法。
背景技術：
免疫分析越來越廣泛應用于生物標志物、細菌以及病毒等的檢測。而用于免疫分析的納米標記物在很大程度上決定著分析靈敏度與特異性。目前已經(jīng)發(fā)展的各種類型的納米顆粒，包括膠體金、碳黑、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒、量子點、脂質(zhì)體等，已經(jīng)表現(xiàn)出了較為優(yōu)秀的免疫分析效果。然而，這些納米標記物仍存在著自身的缺點。對于膠體金、碳黑標記物等，它們僅僅依賴于顆粒聚集而產(chǎn)生光學信號，從而在免疫層析中表現(xiàn)出的靈敏度較低。 盡管后來發(fā)展的熒光納米標記物大大提高了免疫分析的靈敏度，但是它們也存在著一些缺陷，例如，染料摻雜的熒光納米顆粒容易發(fā)生泄露、量子點具有毒性、脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差等， 并且它們的熒光強度有限，進一步提高免疫分析的靈敏度仍需做出巨大的努力。近些年來發(fā)展的稀土熒光二氧化硅納米顆粒吸引了廣大研究者們的興趣。二氧化硅具有物理剛性、化學穩(wěn)定性、溶劑中可忽略的溶脹性以及光學透性，因而十分適用于生物分析。而稀土熒光絡合物是由銪、鋱、釤等稀土離子與二酮、聯(lián)吡啶類化合物等特定的配合物形成的強熒光的絡合物，它具有以下優(yōu)異的熒光性質(zhì)①熒光壽命長。稀土熒光絡合物的熒光壽命一般為10 1000 μ S，它比一般熒光物質(zhì)以及背景熒光(約1 10 μ S)要高出5 6個數(shù)量級。②Mokes位移大，稀土絡合物的最大激發(fā)波長通常在300 380nm的紫外區(qū)，最大發(fā)射波長在500nm以上，stokes位移達250 350nm，有利于排除各種背景熒光的干擾，增強檢測的特異性。③激發(fā)光譜帶較寬，有利于增加激發(fā)能，提高標記物的比活性。④發(fā)射光譜帶窄。半峰寬小于15nm，有利于提高分辨率。⑤激發(fā)波長具有配體的特性， 即隨配體的變化而變化，發(fā)射波長則具有稀土離子的性質(zhì)，即不隨配體的變化而變化。這樣就可能采用單一激發(fā)光，獲得不同發(fā)射波長，從而實現(xiàn)多組分同時檢測。因此，將二氧化硅納米顆粒與長壽命的熒光稀土絡合物結合，可以大大提高該種標記物的免疫分析性能。目前，已有許多有關稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法的報道。中國專利 CN1400467公開一種熒光稀土絡合物硅納米顆粒類標記物及其制備方法，是通過物理摻雜或化學鍵合的手段，將熒光稀土絡合物摻雜于硅納米顆粒中，使單個硅納米顆粒摻雜多個稀土絡合物，從而具有較高的熒光強度。但該方法摻雜的稀土絡合物數(shù)量有限(過多則會造成不規(guī)則狀納米顆粒的形成)，限制了熒光強度的繼續(xù)提升。中國專利CN101225306公開一種熒光稀土絡合物硅納米顆粒的制備方法，將稀土絡合物循環(huán)鍵合在硅納米顆粒表面，從而使鍵合在其表面的熒光稀土絡合物數(shù)量大大增力口，有效地提高了熒光二氧化硅納米顆粒的熒光強度。但該種循環(huán)鍵合的方式操作繁瑣、費時費力，不利于該種標記物的廣泛應用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的方法存在的上述缺點，提供一種不僅具有操作簡單、 易于實現(xiàn)等優(yōu)點，而且熒光強度更高的稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法。本發(fā)明的技術方案是采用油包水微乳體系合成空白二氧化硅納米顆粒，并事先讓帶有功能基團的硅烷試劑和稀土離子配合物充分反應而形成前驅(qū)體，然后直接在油包水微乳體系中加入前驅(qū)體，即可將大量的稀土離子配合體修飾到每個二氧化硅納米顆粒的表面，再加入稀土離子與配合體螯合，即可形成高強度的稀土熒光二氧化硅納米顆粒。本發(fā)明包括以下步驟1)將水、油、表面活性劑、助表面活性劑混合，自發(fā)形成各向異性、透明、熱力學穩(wěn)定的分散體系，得表面帶有羥基的二氧化硅納米顆粒；2)將帶有功能基團的硅烷試劑與稀土離子配合物反應，得稀土離子配合物前驅(qū)體；3)將步驟2)制得的稀土離子配合物前驅(qū)體與四乙氧基硅烷(TEOS)混合后加入步驟1)所得的表面帶有羥基的二氧化硅納米顆粒(油包水微乳體系)中，稀土離子配合物即可鍵合至二氧化硅納米顆粒表面；稀土離子配合物前驅(qū)體含有硅氧鍵，能夠鍵合至二氧化硅納米顆粒表面，另外，四乙氧基硅烷(TE0Q可以與二氧化硅納米顆粒表面剩余未參與反應的硅羥基繼續(xù)枝接而生長出更多的表面硅羥基，以利于其進一步與稀土離子配合物前驅(qū)體發(fā)生反應。4)在油包水微乳體系中加入稀土離子，即可與固定在二氧化硅納米顆粒表面的稀土離子配合物螯合而形成具有熒光的稀土絡合物，經(jīng)丙酮封閉反應體系后，洗滌，即得產(chǎn)物稀土熒光二氧化硅納米顆粒。在步驟1)中，所述油、表面活性劑、助表面活性劑的質(zhì)量比可為3 1 1，水的用量則根據(jù)所要合成的二氧化硅納米顆粒的大小進行調(diào)整；所述水可選自超純水等；所述油可選自環(huán)己烷、正戊烷、正己烷、正庚烷、正癸烷等中的一種；所述表面活性劑可選自Triton X-100、二-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)、壬基酚聚氧乙烯醚(NP-n)等中的一種；所述助表面活性劑可選自正己醇等。在步驟幻中，所述帶有功能基團的硅烷試劑可選自3-氨丙基三甲氧基硅烷 (APTMS)、巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)、5，3-甘油酸丙烷三甲氧基硅烷(MPTMS)等中的一種，可為二氧化硅納米顆粒表面修飾上氨基、巰基、環(huán)氧基等功能性基團；所述稀土離子配合物可為螯合特定稀土離子的有機化合物，所述稀土離子配合物可選自β - 二酮類化合物、鄰菲咯啉類化合物、水楊酸類化合物、聯(lián)吡啶類化合物等中的一種。在步驟4)中，所述稀土離子可選自銪、鋱、釤、鏑等中的一種，它們能與特定的稀土離子配合物螯合而形成強熒光的絡合物；所述洗滌可采用50%的無水乙醇洗滌，其目的在于除去所得納米顆粒懸液中的有機溶劑、表面活性劑及其他雜質(zhì)等。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點1)制備過程簡單，省時省力。該種方法采用直接在油包水微乳體系中修飾稀土熒光絡合物的方法，操作簡單，易于制備。而之前報道的將稀土熒光絡合物循環(huán)鍵合在二氧化硅納米顆粒表面的方式則存在操作繁瑣，耗時耗力的問題。2)制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒熒光強度高。該種方法直接在微乳中修飾， 每個水核中所形成的單一的二氧化硅納米顆粒其表面的空間位阻小，因而可以直接與大量的稀土熒光絡合物發(fā)生鍵合，而不需要循環(huán)鍵合便可制備出高熒光強度的二氧化硅納米顆粒。因而該法制備的高強度的稀土熒光二氧化硅納米顆粒作為標記物有望進一步提高分析靈敏度，并可廣發(fā)應用于生物分析、熒光成像、醫(yī)學診斷等領域。3)制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒表面易于生物功能化。該法將帶有功能基團的硅烷試劑與稀土離子配合物事先反應形成前驅(qū)體，在此反應中，帶有功能基團的硅烷試劑是過量的，因而較多的尚未參與前驅(qū)體反應的帶有功能基團的硅烷試劑隨后則鍵合至二氧化硅納米顆粒表面，使其能夠和其他生物分子交聯(lián)而易于被生物功能化，從而有利于其在生物分析等方面的應用。4)制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒大小均一，可控性好，可以合成20nm-100nm 范圍內(nèi)不同大小的稀土熒光二氧化硅納米顆粒。該法通過調(diào)節(jié)烷烴分子的種類、表面活性劑種類以及水的用量等便可合成20nm-100nm范圍內(nèi)不同大小的稀土熒光二氧化硅納米顆粒，方便科研工作者們選取合適大小的熒光納米顆粒應用于熒光成像、生物分析等方面。綜上所述，本發(fā)明提供了一種高強度稀土熒光二氧化硅納米顆粒的簡易制備方法，即在油包水微乳體系中采用直接修飾的方式將大量的稀土熒光絡合物交聯(lián)至二氧化硅納米顆粒表面。該方法制備簡單，省時省力，所制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒熒光強度高，易于功能化，大小均一，可廣泛應用于生物分析、熒光成像以及醫(yī)學診斷等領域。


圖1為本發(fā)明實施例1的稀土熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡照片。 在圖1中，標尺為0.2μπι;制得稀土熒光二氧化硅納米顆粒后懸浮于乙醇中，調(diào)整濃度為 0. ang/mL，在電鏡下觀察并拍照；照片中的稀土熒光二氧化硅納米顆粒粒徑大小為60nm ； 由照片上可以看到二氧化硅納米顆粒表面凸凹不平，且具有較多暗點，表明二氧化硅納米顆粒表面鍵合了較多的熒光稀土絡合物。圖2為本發(fā)明實施例1所制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒(實線部分)及游離稀土熒光絡合物(虛線部分)的光譜圖。在圖2中，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為熒光強度；制得稀土熒光二氧化硅納米顆粒后懸浮于乙醇中，濃度稀釋至5 X 10_3mg/mL，于Varian Cary Eclipse熒光分光光度計掃描光譜；從圖2中可以看出，當稀土熒光絡合物與二氧化硅納米顆粒交聯(lián)后，其光譜圖并未出現(xiàn)顯著改變。其光譜激發(fā)光譜帶較寬，有利于有利于增加激發(fā)能，發(fā)射光譜帶較窄，半峰寬小于15nm，有利于提高分辨率。圖3為本發(fā)明實施例1所制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒在不同濃度下的熒光拍攝圖片。將所制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒懸于無水乙醇中，稀釋至不同的濃度，在紫外激發(fā)下采用帶有濾光片的相機進行熒光拍攝，可獲得二氧化硅納米顆粒的熒光亮度圖片；圖 3 中 a、b、c、d 各管的質(zhì)量濃度分別為 15mg/mL、l. 5mg/mL、0. 15mg/mL、0. 015mg/mL，可以看出在很低的質(zhì)量濃度下，稀土熒光二氧化硅納米顆粒仍然具有強烈的熒光，說明該法制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒具有很高的熒光強度。圖4為本發(fā)明實施例2的免疫分析工作曲線。在圖4中，橫坐標為乙肝表面抗原 (IU/mL)，左縱坐標為熒光強度，右縱坐標為變異系數(shù)(％)；該體系對一系列不同濃度的陽性質(zhì)控品進行檢測后，采用熒光紙條檢測儀讀值，然后根據(jù)所得數(shù)值作出工作曲線；從圖4 中可以看出，該體系的檢測范圍很廣，且檢測靈敏度很高。
圖5為本發(fā)明實施例2的免疫分析線性范圍曲線。在圖5中，橫坐標為乙肝表面抗原(IU/mL)，縱坐標為熒光強度；Y = 0. 9570X+1. 45827，R = 0. 9993 ；由圖5可以看出，該檢測體系在0. 025 50IU/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系(R = 0. 9977)。根據(jù)陰性對照加3倍的標準偏差定義為檢測限，可計算出該檢測體系的檢測限度為0. 039IU/mL，說明其檢測靈敏度極高。圖6為本發(fā)明實施例2的免疫層析結果。該體系對一系列不同濃度的陽性質(zhì)控品進行檢測后，在紫外激發(fā)下采用帶有濾光片的相機進行熒光拍攝，可獲得較為直觀的檢測結果；從圖6中試紙條的控制帶處可以看到高亮度的條帶，在檢測帶處，HBsAg濃度越高則條帶越亮。該檢測體系的靈敏度可達0. lIU/mL。
具體實施例方式以下實施例將對本發(fā)明作進一步的說明，這些實施例只是說明而不表示本發(fā)明所有的可能性。本發(fā)明并不局限于這些實施例中提到的材料、反應條件或參數(shù)，任何在相關領域具備經(jīng)驗的人，都可以按照本發(fā)明的原理和技術方案，利用其它類似材料或反應條件實現(xiàn)本發(fā)明所描述的免疫層析技術或制備出檢測試劑盒。這些并不脫離本發(fā)明描述的基本概念。因此，這些修改或者不同的應用都在本發(fā)明的覆蓋范圍之內(nèi)。實施例1 :BHHCT-Eu 二氧化硅納米顆粒的制備該實施例描述了在油包水微乳體系中制備空白二氧化硅納米顆粒，再直接在微乳體系中加入事先反應好的稀土配合物前驅(qū)體APTMS-BHHCT進行顆粒表面的修飾，再以Eu3+ 為稀土離子使其與稀土離子配合物BHHCT螯合，從而制備出稀土熒光二氧化硅納米顆粒的過程。(1)油包水微乳體系中空白二氧化硅納米顆粒的制備取帶有磁石的錐形瓶，于攪拌狀態(tài)下依次加入6mL環(huán)己烷、2mL正己醇、2mL Triton X_100、0. 6ml超純水，從而形成油包水微乳體系。待溶液混勻后依次加入60 μ L氨水05% )和100 μ L TEOS,室溫下反應Mh。在氨水的催化下，TEOS在水核中發(fā)生聚合而形成空白二氧化硅納米顆粒。(2)稀土離子配合物前驅(qū)體APTMS-BHHCT的制備取7. 2mg BHHCT溶于無水乙醇中，加入4. 7μ L APTMS，立即超聲混勻，避光下反應0.證。此過程中BHHCT的磺酰氯基團同 APTMS的氨基發(fā)生反應而得到稀土離子配合物前驅(qū)體。(3)微乳中二氧化硅納米顆粒表面稀土離子配合物BHHCT的修飾將上述稀土離子配合物前驅(qū)體與20 μ L四乙氧基硅烷(TEOS)混勻后加入油包水微乳體系中，于攪拌下避光反應證，稀土離子配合物即鍵合至二氧化硅納米顆粒表面；(4) Eu3+的螯合在上述微乳中加入50 μ L Eu3+(0. 64mol/L)，繼續(xù)在避光條件下攪拌證，Eu3+即螯合于二氧化硅納米顆粒表面的BHHCT上而形成具有熒光的稀土絡合物，最后經(jīng)50%的無水乙醇洗滌3 5遍，即得產(chǎn)物稀土熒光二氧化硅納米顆粒。所制備的稀土熒光二氧化硅納米顆粒的透射電鏡照片、熒光光譜圖及熒光強度圖片見圖1 3。實施例2 稀土熒光二氧化硅納米顆粒在快速免疫層析檢測中的應用該實施例描述了以稀土熒光二氧化硅納米顆粒為標記物，以乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)為檢測模型的快速免疫層析檢測體系的實施過程。(1)稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備同實施例1。
(2)抗體的標記取0. 3mg抗-乙肝表面抗原單克隆抗體對0. 05M醋酸鈉緩沖液 (pH5. 2)透析他，之后與抗體中加入NaIO4至其終濃度為0. 01M,室溫下反應20min，使抗體糖鏈分子的羥基氧化為醛基。然后加入甘油至其終濃度為30mM，混勻，搖lOmin，以中止氧化反應。再次對抗體采用0. 05M醋酸鈉緩沖液(pH5. 2)透析他，取出后采用0. OlM碳酸鈉溶液調(diào)pH至9. O左右。取2mg稀土熒光二氧化硅納米顆粒，對25mM碳酸鹽緩沖液(pH9. 5) 洗滌兩遍，懸浮于100 μ L 50mM碳酸鹽緩沖液(pH9. 5)，與上述透析后的抗體混勻，4°C下反應1 后，用0. 5M硼氰化鈉還原乩，再加等體積的封閉液(0.05mol/L Tris 7. 8，含2% BSA、4%蔗糖)封閉6h。最后用IOmM Tris7. 8洗滌上述顆粒標記物3遍，再懸浮于100 μ L 0. 05mol/L Tris7. 8(含 O. 9% NaCl、0· 2% BSA、0. 1% NaN3)備用。(3)標記抗體的固相化將制備好的顆粒標記物采用IOmM Tris7. 8(含2%酪蛋白)按1 500稀釋，然后噴灑于作為標記物墊的玻璃纖維上，凍干備用。(4)捕獲抗體的包被取與標記抗體配對的抗-乙肝表面抗原單克隆抗體用 0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)，稀釋至ang/mL，用點膜儀在硝酸纖維素膜上劃成帶狀， 作為檢測帶；在距檢測帶0. 5cm的膜上，用lmg/mL的兔抗鼠IgG再劃一條，作為控制線。置于37°C恒溫干燥箱中烘干乩。(5)試紙條的裝配在一長方形聚氯乙烯(PVC)底板的中部貼上已包被抗-HBsAg 單克隆抗體的硝酸纖維素膜，在膜的一側貼上加樣墊和標記物墊，在膜的另一側貼上吸水紙，然后切成寬度為4mm的HBsAg檢測試紙條，裝入紙條卡槽中，再封裝入鋁箔袋，室溫下保
存?zhèn)溆谩?6)免疫層析在試紙條的樣品墊上加70 μ L待檢樣品，層析30min后，將試紙卡插入熒光紙條檢測儀進行熒光信號采集，實現(xiàn)定量分析。若膜上檢測帶與控制帶處的熒光讀值都大于10，則說明為陽性結果，檢測帶的熒光讀值越高則樣品中HBsAg的含量越高；若只有控制帶處的熒光讀值大于10，則說明待測樣本中沒有HBsAg，為陰性結果；若檢測帶與控制帶處的熒光信號讀值都小于10，則說明檢測無效，需重新試驗。采用熒光紙條檢測儀進行定量檢測的方法檢測限度為0. 039IU/mL。另外，還可通過熒光拍攝的方式判定檢測結果， 即將試紙條放于紫外燈下，再采用帶有濾光片的相機進行拍攝即可獲得試紙條的熒光拍攝圖片，若檢測帶與控制帶均出現(xiàn)熒光條帶，則為陽性結果，檢測帶的熒光條帶越亮則樣品中 HBsAg的含量越高；若只有控制帶處出現(xiàn)熒光條帶，則說明待測樣本中沒有HBsAg，為陰性結果；若檢測帶與控制帶處均無熒光條帶，則說明檢測無效，需重新試驗。采用紫外光激發(fā)下熒光成像的方法檢測靈敏度為0. lIU/mL。在本實施例中既可通過熒光紙條檢測儀進行定量檢測也可采用紫外光激發(fā)下進行熒光拍攝來獲取結果，兩種方式既可以單獨使用，也可結合起來使用以共同判定檢測結果。該檢測體系對不同濃度質(zhì)控品的免疫層析工作曲線、 線性范圍曲線和熒光拍攝結果見圖4 6。
權利要求
1.一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)將水、油、表面活性劑、助表面活性劑混合，自發(fā)形成各向異性、透明、熱力學穩(wěn)定的分散體系，得表面帶有羥基的二氧化硅納米顆粒；2)將帶有功能基團的硅烷試劑與稀土離子配合物反應，得稀土離子配合物前驅(qū)體；3)將步驟幻制得的稀土離子配合物前驅(qū)體與四乙氧基硅烷混合后加入步驟1)所得的表面帶有羥基的二氧化硅納米顆粒中，稀土離子配合物即可鍵合至二氧化硅納米顆粒表面；4)在油包水微乳體系中加入稀土離子，即可與固定在二氧化硅納米顆粒表面的稀土離子配合物螯合而形成具有熒光的稀土絡合物，經(jīng)丙酮封閉反應體系后，洗滌，即得產(chǎn)物稀土熒光二氧化硅納米顆粒。
2.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述油、表面活性劑、助表面活性劑的質(zhì)量比為3 1 1。
3.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述水選自超純水。
4.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述油選自環(huán)己烷、正戊烷、正己烷、正庚烷、正癸烷中的一種。
5.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述表面活性劑選自Triton X_100、二-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉、壬基酚聚氧乙烯醚中的一種。
6.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述助表面活性劑選自正己醇。
7.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述帶有功能基團的硅烷試劑選自3-氨丙基三甲氧基硅烷、巰丙基三甲氧基硅烷、5，3_甘油酸丙烷三甲氧基硅烷中的一種。
8.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟2、中，所述稀土離子配合物為螯合特定稀土離子的有機化合物，所述稀土離子配合物最好選自二酮類化合物、鄰菲咯啉類化合物、水楊酸類化合物、聯(lián)吡啶類化合物中的一種。
9.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述稀土離子選自銪、鋱、釤、鏑中的一種。
10.如權利要求1所述的一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述洗滌，采用50 %的無水乙醇洗滌。
全文摘要
一種稀土熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，涉及一種納米顆粒材料。將水、油、表面活性劑、助表面活性劑混合，自發(fā)形成各向異性、透明、熱力學穩(wěn)定的分散體系，得表面帶有羥基的二氧化硅納米顆粒；將帶有功能基團的硅烷試劑與稀土離子配合物反應，得稀土離子配合物前驅(qū)體；將制得的稀土離子配合物前驅(qū)體與四乙氧基硅烷混合后加入所得的表面帶有羥基的二氧化硅納米顆粒中，稀土離子配合物即可鍵合至二氧化硅納米顆粒表面；在油包水微乳體系中加入稀土離子，即可與固定在二氧化硅納米顆粒表面的稀土離子配合物螯合而形成具有熒光的稀土絡合物，經(jīng)丙酮封閉反應體系后，洗滌，即得產(chǎn)物稀土熒光二氧化硅納米顆粒。操作簡單、易于實現(xiàn)，熒光強度更高。
文檔編號C09K11/06GK102504808SQ20111032022
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權日2011年10月19日
發(fā)明者李慶閣, 王國磊, 許曄 申請人:廈門大學