一種檢測(cè)lbp基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法及試劑盒，該方法包括步驟：1）設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物和測(cè)序引物；2）用特異性擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)標(biāo)本的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3）用焦磷酸測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明的方法及試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽SNP基因型，能夠滿足臨床檢驗(yàn)實(shí)際工作的需要，利于LBP基因標(biāo)簽SNP檢測(cè)預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生、發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法及試劑
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【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及適用于PCR擴(kuò)增結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]1986年Tobias首次從兔血清中分離、純化出脂多糖結(jié)合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein, LBP)，LBP 屬于 I 型急性期反應(yīng)蛋白，人 LBP 蛋白由481個(gè)氨基酸組成，并且有分泌性蛋白典型的25個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。LBP蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為60ku，蛋白質(zhì)部分是由一條50ku的單鏈多肽組成，其血漿濃度為2~7mg/L，在LPS誘導(dǎo)急性反應(yīng)后，血漿LBP濃度可明顯提高。LBP主要在肝臟合成，有研究表明，肺、腸、腎、脾等肝外組織也合成LBP，其中肺是肝外組織LBP mRNA表達(dá)量最多的器官。在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者的支氣管肺泡灌洗液中，LBP濃度是正常人的64倍。LBP不僅是一種血漿蛋白，還可作為ー種跨膜蛋白。這種膜結(jié)合LBP本身可嵌入單核細(xì)胞的胞膜中，同時(shí)促進(jìn)脂多糖(LPS)嵌入其中，抗LBP單克隆抗體并不抑制LBP的嵌入，但是可抑制LPS的嵌入及LPS誘導(dǎo)的TNF- a的產(chǎn)生，因此膜結(jié)合LBP和LPS的嵌入被認(rèn)為是LBP介導(dǎo)LPS激活單核細(xì)胞的ー個(gè)重要步驟。
[0003]單核甘酸多態(tài)性(SNP)是指染色體上單個(gè)核苷酸變異引起的群體中DNA序列多態(tài)性，具有密度高、遺傳穩(wěn)定、易于自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，被認(rèn)為是繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、微衛(wèi)星多態(tài)性之后的第三代遺傳標(biāo)記，可用于基因定位、多態(tài)性分析等方面，是研究疾病遺傳易感性、疾病診斷、藥物篩選等的常用指標(biāo)。LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)與分型，對(duì)LBP基因在健康人群的遺傳特點(diǎn)及與疾病發(fā)生、發(fā)展的遺傳關(guān)聯(lián)研究有重要意義。
[0004]關(guān)于SNP的檢測(cè)方法，目前已發(fā)展了 20余種，如直接測(cè)序法、探針雜交法、飛行質(zhì)譜分析法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法等，但因這些方法的費(fèi)用、準(zhǔn)確性和適用規(guī)模等方面的缺點(diǎn)，局限了基因多態(tài)性與疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的遺傳關(guān)聯(lián)研究。而焦磷酸測(cè)序技術(shù)是新一代基于酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的DNA序列分析技木，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將DNA單鏈上的每ー個(gè)dNTP聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。該技術(shù)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，無(wú)需電泳、DNA片段無(wú)需熒光標(biāo)記；具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量、靈敏度高等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測(cè)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的之ー在于提供一種檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其能夠 簡(jiǎn)捷、直觀、準(zhǔn)確的對(duì)LBP標(biāo)簽SNP基因型進(jìn)行檢測(cè)和判讀。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007]檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，包括以下步驟:[0008]I)特異性引物的設(shè)計(jì):根據(jù)被證實(shí)的LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，其中，所述特異性擴(kuò)增引物中的一條用生物素標(biāo)記；2)PCR擴(kuò)增:以待測(cè)標(biāo)本的DNA為模板，用步驟I)所述的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得PCR擴(kuò)增物；3)焦磷酸測(cè)序:將步驟2)所得PCR擴(kuò)增物采用堿變性使其分開成單鏈，取其中被生物素標(biāo)記的單鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，與步驟I)所述測(cè)序引物進(jìn)行雜交反應(yīng)，并分析結(jié)果以判斷所述待測(cè)標(biāo)本的靶單核甘酸是否具備多態(tài)性。本技術(shù)方案的創(chuàng)新點(diǎn)主要在首次采用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)LBP基因的單核甘酸多態(tài)性。
[0009]進(jìn)一歩，所述LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)包括:rsl780623、rsll536972和rs2232618中的ー個(gè)或多個(gè)。上述位點(diǎn)是通過(guò)如下方法獲得的:利用HapMap (http://www.hapmap.0rg) SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(HapMap Data Rel 28 Phase II+III, AuglO, on NCBI B36assembly, dbSNP bl26)下載LBP基因及其上下游IOkb范圍內(nèi)中國(guó)北京漢族人群(CHB)SNP數(shù)據(jù):1)檢索框輸入基因名查看各基因在HapMap定位，并上下游各延伸10kb，2)“Reports&Analysis” 的選項(xiàng)中選擇:Download SNP genotype data。3) “config” 中選擇中國(guó)北京漢族人群(Chinese Han Bei jing，CHB)，獲取中國(guó)北京漢族人群SOCS家族各基因及其延伸區(qū)域內(nèi)所有SNP位點(diǎn)。[0010]進(jìn)ー步，所述rsl780623位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，測(cè)序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rsll536972位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，測(cè)序引物如SEQ ID NO:6所示；所述rs2232618位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，測(cè)序引物如SEQ ID NO:9所示。詳見下表:
[0011]
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)特異性引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)被證實(shí)的LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，其中，所述特異性擴(kuò)增引物中的一條用生物素標(biāo)記； 2)PCR擴(kuò)增 以待測(cè)標(biāo)本的DNA為模板，用步驟I)所述的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得PCR擴(kuò)增物； 3)焦磷酸測(cè)序 將步驟2)所得PCR擴(kuò)增物采用堿變性使其分開成單鏈，取其中被生物素標(biāo)記的單鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，與步驟I)所述測(cè)序引物進(jìn)行雜交反應(yīng)，并分析結(jié)果以判斷所述待測(cè)標(biāo)本的靶單核甘酸是否具備多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于:所述LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)包括:rsl780623、rsl 1536972和rs2232618中的一個(gè)或多個(gè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于:所述rsl780623位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，測(cè)序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rsll536972位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，測(cè)序引物如SEQ ID NO:6所示；所述rs2232618位點(diǎn)的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下`游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，測(cè)序引物如SEQ ID NO:9 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，其特征在于:所述rsl780623位點(diǎn)、rsl 1536972位點(diǎn)和rs2232618位點(diǎn)組合進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增。
5.用于檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物，LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的焦磷酸測(cè)序引物，以及PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物篩選液、焦磷酸測(cè)序反應(yīng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于:所述特異性擴(kuò)增引物如SEQ ID NO: 1-2所示，和/或如SEQ ID N0:4_5所示，和/或如SEQ ID NO:7-8所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于:所述測(cè)序引物如SEQ ID NO: 3所示，和/或如SEQ ID NO:6所示，和/或如SEQ IDNO:9所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括標(biāo)記所述擴(kuò)增引物的生物素。
9.用于檢測(cè)LBP基因標(biāo)簽單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物，其特征在于:所述特異性引物如SEQ ID NO: 1-2所示，和/或如SEQ ID NO:4_5所示，和/或如SEQ ID N0:7_8所/Jn o
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103602753SQ201310659016
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】曾靈, 蔣建新, 張安強(qiáng), 王海燕, 杜娟, 顧瑋, 岳彩黎 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院