一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)及檢測方法。該系統(tǒng)包括：(1)能夠表達(dá)E1蛋白的原核表達(dá)菌株C1感受態(tài)細(xì)胞；(2)能夠同時表達(dá)E1蛋白和Ub蛋白的原核表達(dá)菌C2感受態(tài)細(xì)胞；(3)與表達(dá)E1蛋白和Ub蛋白質(zhì)粒復(fù)制起點不同的，能夠進(jìn)行原核體外表達(dá)待測E2蛋白的質(zhì)粒P3。將P3分別轉(zhuǎn)入C1和C2感受態(tài)細(xì)胞，命名為C3CK(負(fù)對照)、C3，分別擴(kuò)大培養(yǎng)，并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后收集菌體，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡雜交；在C3樣品中檢測到待測E2蛋白遷移條帶，并且遷移大小符合Ub分子量，即可證明此待測E2具有泛素結(jié)合酶活性。該方法無需裂解細(xì)胞提取蛋白、純化蛋白，也不需要做體外反應(yīng)，非常方便、結(jié)果更穩(wěn)定。
【專利說明】
-種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種無需裂解細(xì)胞純化蛋白的、穩(wěn)定的、快速的泛素結(jié)合酶活性體外 檢測的系統(tǒng)及方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 泛素(ubiquitin，化)介導(dǎo)的26S蛋白酶體系統(tǒng)通過參與降解生長發(fā)育中不正常的 蛋白為生物提供足夠的氨基酸供應(yīng)，并通過降解一些限速步驟的蛋白來精確調(diào)節(jié)生物的生 理過程，為生物生長發(fā)育W及應(yīng)對外界環(huán)境的變化提供便利，對生物維持正常的生理功能 非常重要。泛素介導(dǎo)的26S蛋白酶體降解途徑中主要參與分子包括泛素、泛素活化酶(1113- activating enzyme化1、泛素結(jié)合酶（加 -conjugating enzyme化2、泛素連接酶（加- protein ligase)E3、26S蛋白酶復(fù)合體（26S proteasome)^及去泛素化酶 (deubiquitylating enz;ymes，DUBs)。泛素化過程是W上幾種酶協(xié)同作用的結(jié)果。首先，泛 素的C末端甘氨酸殘基在ATP存在的情況下被E1激活，激活的泛素通過硫醋鍵結(jié)合到E1的一 個半脫氨酸上;然后激活的泛素再被轉(zhuǎn)移到E2蛋白的活性半脫氨酸殘基上；隨后在E3的作 用下E2上的泛素共價結(jié)合到祀蛋白賴氨酸殘基上;運個過程不斷重復(fù)形成多泛素化蛋白。 多泛素化的蛋白經(jīng)過26S蛋白酶體進(jìn)行降解，成為單個的氨基酸殘基，同時去泛素化酶把多 泛素鏈拆解成單個的泛素，重新進(jìn)行利用。其中泛素結(jié)合酶是一類在26S蛋白酶體降解途徑 中起重要生物化學(xué)功能的蛋白。目前的研究表明，泛素結(jié)合酶是多泛素鏈組裝的關(guān)鍵因子， 控制了泛素鏈的起始和延伸，決定了底物泛素化修飾的類型和最終結(jié)果。
[0003] 對于預(yù)測為泛素結(jié)合酶的蛋白來說，對其進(jìn)行體外泛素化活性檢測，是確定其泛 素結(jié)合酶功能必不可少的，實驗結(jié)果可W為其后續(xù)的研究提供重要的線索。目前的泛素結(jié) 合酶體外泛素化反應(yīng)體系(如專利201310007041.9,發(fā)明名稱:植物體外泛素蛋白降解系統(tǒng) 及其應(yīng)用）存在如下缺點：泛素結(jié)合酶體外泛素化檢測所需的主要分子包括化、E1、E2蛋白 都需要進(jìn)行大腸桿菌體外表達(dá)，然后裂解細(xì)胞提取蛋白，有一些還需要進(jìn)行純化，純化后的 蛋白為了維持其活性需要保存在-80°C冰箱。運個過程很復(fù)雜，工作量大，容易出錯。另外傳 統(tǒng)的體外泛素化反應(yīng)檢測需要配制反應(yīng)緩沖液，將師、E1、E2等蛋白都加入反應(yīng)緩沖液中， 在一定溫度和條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)緩沖液中必須包含ATP提供能量，ATP化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定， 反應(yīng)緩沖液難W長時間保持活性;體系中加入各種蛋白的量和反應(yīng)時間和條件也不相同， 都需要各自摸索條件，工作量巨大。如果后面檢測不到泛素結(jié)合酶的活性，無法區(qū)分是由于 蛋白表達(dá)、純化、保存、凍融和反應(yīng)等步驟的問題，還是蛋白本身沒有泛素結(jié)合酶的功能，容 易造成假陰性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對W上泛素結(jié)合酶體外泛素化反應(yīng)體系存在的缺點，本發(fā)明提供了一種用于體 外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)及檢測方法。該方法無需裂解細(xì)胞提取蛋白、純化蛋白，也不 需要做體外反應(yīng)，非常方便、結(jié)果更穩(wěn)定。
[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)，其特征是， 包括：（1)能夠表達(dá)E1蛋白的原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；（2)能夠同時表達(dá)E1蛋白和化蛋白的原 核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；（3)與表達(dá)E1蛋白和化蛋白質(zhì)粒復(fù)制起點不同的，能夠進(jìn)行原核體外表 達(dá)待測E2蛋白的質(zhì)粒。
[0006] 其中，（1)和(2)的原核表達(dá)菌株相同。
[0007] 其中，（1)能夠表達(dá)E1蛋白的原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞的構(gòu)建方法為:構(gòu)建能夠進(jìn)行E1 蛋白體外表達(dá)的載體質(zhì)粒(P1)，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株，此新菌株命名為C1，并用此菌 株制作感受態(tài)細(xì)胞。
[0008] 其中，（2)能夠同時表達(dá)E1蛋白和化蛋白的原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞的構(gòu)建方法為:構(gòu) 建能夠進(jìn)行師蛋白體外表達(dá)的載體質(zhì)粒(P2，P2的復(fù)制起點應(yīng)與P1不同），將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入包 含P1的原核表達(dá)菌株C1，此新菌株命名為C2,并用此菌株制作感受態(tài)細(xì)胞。
[0009] 優(yōu)選的，上述的原核表達(dá)菌株為大腸桿菌。本發(fā)明中更優(yōu)選的是采用大腸桿菌 化21(DE3)。
[0010] 本發(fā)明優(yōu)選的，El蛋白為擬南芥AtUBA2;加蛋白為擬南芥野生型單體泛素蛋白 AtUb。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的方法，其特征 是，包括W下步驟：
[0012] (1)構(gòu)建能夠進(jìn)行E1蛋白體外表達(dá)的載體質(zhì)粒(P1)，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌，此 新菌株命名為C1，并用此菌株制作感受態(tài)細(xì)胞，制得能夠表達(dá)E1蛋白的原核表達(dá)感受態(tài)細(xì) 胞；
[OOU] (2)構(gòu)建能夠進(jìn)行Ub蛋白體外表達(dá)的載體質(zhì)粒(P2，P2的復(fù)制起點應(yīng)與P1不同），將 此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入包含P1的原核表達(dá)菌株C1，此新菌株命名為C2,并用此菌株制作感受態(tài)細(xì)胞，審U 得能夠同時表達(dá)E1蛋白和化蛋白的原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；
[0014] (3)構(gòu)建待測E2蛋白的體外表達(dá)載體質(zhì)粒(P3，P3的復(fù)制起點應(yīng)與P1和P2都不同）；
[001引（4)將P3分別轉(zhuǎn)入C1和C2感受態(tài)細(xì)胞，各自挑選單克隆，并將其命名為C3CK、C3,其 中C3CK作為負(fù)對照；
[0016] (5)將C3CK和C3分別擴(kuò)大培養(yǎng)，并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后收集菌體，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡雜 交;檢測結(jié)果顯示：相比C3CK，在C3樣品中檢測到待測E2蛋白遷移條帶，并且遷移大小符合 化分子量，即可證明此待測E2蛋白具有泛素結(jié)合酶活性。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)選的，所述P1載體質(zhì)粒為pGEX-6P-1-AtUBA2;所述P2載體質(zhì)粒為 pACYCDuet-A優(yōu)b。所述P3載體質(zhì)粒的E2蛋白的原核表達(dá)載體為pCD抑uet。
[0018] 本發(fā)明所利用的原理是：不同復(fù)制來源的質(zhì)?？蒞在同一細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 因此，將E1蛋白、郵蛋白、E2蛋白按先后順序轉(zhuǎn)入同一細(xì)菌細(xì)胞中，誘導(dǎo)相應(yīng)蛋白表達(dá)，有活 性的E2蛋白會在E1蛋白的幫助下結(jié)合化，繼而進(jìn)行蛋白印記雜交檢測，即可非常方便、可重 復(fù)的檢測E2蛋白的活性。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] (1)相比現(xiàn)有的檢測方法，應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行泛素結(jié)合酶活性檢測，可W省去裂解細(xì) 胞、提取蛋白的繁瑣步驟，減少在提取蛋白和保存蛋白W及蛋白凍融時造成的蛋白活性損 失，減少假陰性;可W省去繁復(fù)的活性檢測步驟，無需建立體外反應(yīng)體系，無需摸索反應(yīng)條 件；
[0021] (2)本發(fā)明提供的蛋白表達(dá)株系可W穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，此方法建立Cl和C2后，可針 對不同的E2進(jìn)行多次反應(yīng)，無需多次表達(dá)蛋白；
[0022] (3)本發(fā)明不僅適用于植物泛素結(jié)合酶活性的檢測，對于其它物種的泛素結(jié)合酶 活性檢測同樣適用，只需根據(jù)物種調(diào)整E1的種類即可。本發(fā)明將有力地推進(jìn)泛素結(jié)合酶功 能的研究。
【附圖說明】
[0023] 圖1為AtUBA2在化2UDE3)中誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖；從圖中可W看出：與誘導(dǎo)前相比，含 有pGEX-6P-1-AtUBA2的樣品中能夠誘導(dǎo)出A優(yōu)BA2的條帶（圖右側(cè)的箭頭所示）；其中為 誘導(dǎo)前，V'為誘導(dǎo)后，下同；
[0024] 圖2為AtUBA2和A優(yōu)b在C1大腸桿菌中共同誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖；從圖中可W看出：與誘 導(dǎo)前相比，含有pACYCDuet-AtUb和pGEX-6P-1-AtUBA2的樣品中能夠誘導(dǎo)出AtUBA2和AtUb的 條帶（圖右側(cè)箭頭所示）；
[00巧]圖3為AtUBC10、AtUBA2和At化在C2大腸桿菌中共同誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖；從圖中可W 看出：與誘導(dǎo)前相比，含有pCD抑uet-AtUBC10、pACYCDuet-AtUb和pGEX-6P-1-AtUBA2的樣品 中能夠誘導(dǎo)出AtUBA2、A優(yōu)b和AtUBClO的條帶（圖右側(cè)箭頭所示）；
[0026] 圖4為AtUBClO泛素化條帶檢測圖；從圖中可W看出：在El、Ub和AtUBClO共同表達(dá) 情況下，用蛋白印記雜交的方法檢測AtUBClO的泛素化條帶，箭頭指示的是AtUBClO的泛素 化條帶；
[0027] 圖5為AWJBC34、AtUBA2和AtUb在C2大腸桿菌中共同誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖；從圖中可W 看出：與誘導(dǎo)前相比，含有pCD抑uet-AhUBC34、pACYCDuet-AtUb和PGEX-6P-1-AtUBA2的樣品 中能夠誘導(dǎo)出AtUBA2、A優(yōu)b和AWJBC34的條帶（圖右側(cè)的箭頭所示）；
[002引圖6為AWJBC34泛素化條帶檢測圖；從圖中可W看出：在E1、Ub和AhUBC34共同表達(dá) 情況下，用蛋白印記雜交的方法檢^UAhUBC34的泛素化條帶，箭頭指示的是AWJBC34的泛素 化條帶；
[00巧]圖7為TsUBC33、AtUBA2和At化在C2大腸桿菌中共同誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖；從圖中可W 看出：與誘導(dǎo)前相比，含有pCD抑uet-TsUBC33、pACYCDuet-AtUb和pGEX-6P-1-AtUBA2的樣品 中能夠誘導(dǎo)出AtUBA2、A優(yōu)b和TSUBC33的條帶（圖右側(cè)的箭頭所示）；
[0030]圖8為TSUBC33泛素化條帶檢測圖；從圖中可W看出：在El、Ub和TSUBC33共同表達(dá) 情況下，用蛋白印記雜交的方法檢測TSUBC33的泛素化條帶，箭頭指示的是TSUBC33的泛素 化條帶。
【具體實施方式】
[0031 ] W下結(jié)合具體的實施方式進(jìn)行說明。
[0032] 各實施例的具體實施方案的通用步驟如下：
[0033] (A)大腸桿菌菌種保存方法:挑取單克隆大腸桿菌接入3mL加了適當(dāng)抗生素的LB液 體培養(yǎng)基中，200rpm，37 °C培養(yǎng)過夜，0D600達(dá)到2.0 W上，加入DMS0至終濃度7 %，液氮速凍， 保存在-70°C冰箱中備用。
[0034] (B)大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞制備：
[0035] (1)培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基（1 %膜蛋白腺，0.5 %酵母提取物，1 %化C1，去離子水配制， 高壓蒸汽滅菌）；SOB培養(yǎng)基(2 %膜蛋白腺，0.5 %酵母提取物，lOmM化C1，2.5mM KC1，lOmM MgCl2，lOmM MgS化，去離子水配制，高壓蒸汽滅菌）；
[0036] (2)試劑:TB溶液（lOmM Pipes，55mM MnCl2，15mM CaCl2,250mM KC1，除MnCb外所 有組分混合在一起，加去離子水溶解，用KOH調(diào)抑值到6.7，然后加入MnCl2溶解，定容后抽濾 滅菌，保存在4°C冰箱。
[0037] (3)方法：
[003引1)挑取單克隆接入3mL加了適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200巧m，37°C培養(yǎng)過 夜；
[0039] 2)將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入250mL SOB培養(yǎng)基，200-250巧ml8°C培養(yǎng)30小時，直至0D600 達(dá)到0.6;
[0040] 3)將上述細(xì)菌培養(yǎng)物放在冰上10min，4°C3000巧m離屯、lOmin;
[0041 ] 4)將沉淀用80mL預(yù)冷的TB溶液重懸，在冰上放置10min，4°C3000巧m離屯、lOmin;
[0042] 5)用20血TB重懸沉淀，加入DMS0至終濃度7%，冰上放置lOmin，分裝到1.5血離屯、 管中，每管10化L，液氮速凍，保存在-70°c冰箱中。
[0043] (C)質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞：
[0044] (1)從-7〇°C冰箱中取出一管感受態(tài)細(xì)胞，吸取化L質(zhì)粒(200ng/uL)，加入感受態(tài)細(xì) 胞中，冰上放置15min;
[0045] (2)42°C熱激90秒，立刻加入ImL LB培養(yǎng)基，37°C200巧m搖1小時；
[0046] (3)吸取1(Κ)化細(xì)菌培養(yǎng)物涂在加了合適抗生素的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)12-14 小時。
[0047] (D)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白檢測：
[004引（1)挑取(C)中平板上的陽性菌落1-2個，接種于加入了合適抗生素的5mL LB液體 培養(yǎng)基中，37 °C，200巧m，培養(yǎng)過夜；
[0049] (2)將培養(yǎng)好的菌液接種于50mL加入了合適抗生素的液體培養(yǎng)基中（用150mL錐形 瓶）中，調(diào)0D600至0.1左右(一般需加 ImL左右菌液），37°C培養(yǎng)約80min至0.4-0.6之間時，吸 取ImL菌液，12000rpm離屯、Imin，棄上清，液氮速凍，保存于-80°C超低溫冰箱，作為誘導(dǎo)前蛋 白樣品，其余菌液中加入0.1M的IPTG至終濃度為50mM，25°C培養(yǎng)，12-16小時；
[0050] (3)測量菌液的0D值，一般此時的0D600值為2.0左右。如誘導(dǎo)前為0.5,誘導(dǎo)后為 2.0，則需要吸取25化L菌液，W保證樣品中的細(xì)菌數(shù)目大致相近，12000巧m離屯、Imin，棄上 清，液氮速凍，保存于-80°C超低溫冰箱，為誘導(dǎo)后蛋白樣品；
[0化1 ] (4)取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的樣品，加7化L 1 XPBS，混勻，沸水浴4min，上樣20化，SDS- PAGE凝膠電泳；
[0052] (5)濃縮膠時電壓不高于120V，分離膠時電壓不高于180V，至藍(lán)線接近底部 (0.5cm)時關(guān)閉電源，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色觀察結(jié)果；
[0053] (6)考馬斯亮藍(lán)染色確定E1、郵和目的片段等均有表達(dá)后，將誘導(dǎo)后的蛋白樣品做 SDS-PAGE電泳，每個點樣孔上樣15化，準(zhǔn)備進(jìn)行蛋白印記雜交(Western Blot);
[0化4]化)SDS-PAGE 電泳：
[0055] (1)準(zhǔn)備電源裝置，檢測電泳裝置，注意不要漏膠；
[0056] (2)配置12%的分離膠，取分離膠約4mL，配好后用水封口，用蒸饋水覆蓋，防止膠 與空氣的接觸靜置30min，直到膠和水之間出現(xiàn)清晰分界面；
[0057] (3)配置5%濃縮膠，取分離膠約2mL，加滿整個膠槽，輕輕插入相應(yīng)規(guī)格的梳子，靜 置30min，待膠完全聚合即可準(zhǔn)備電泳；
[0058] (4)將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽加入電泳緩沖液；
[0059] (5)小屯、豎直拔去梳子，用電泳緩沖液沖洗加樣孔，趕走其中的氣泡；
[0060] (6)蛋白樣品與上樣緩沖液混合后沸水浴3-5min，冷卻后即可進(jìn)樣；
[0061 ] (7)電泳條件:穩(wěn)壓 100V; 15-30mA/板，1 -2小時；
[0062] (8)將膠小屯、取下，放入考馬斯亮藍(lán)R250搖動染色2小時(視情況適當(dāng)調(diào)整），然后 考馬斯亮亮藍(lán)脫色液脫色，當(dāng)膠的背景脫色干凈后見清晰蛋白帶時拍照。
[0063] (F)蛋白質(zhì)印跡(Western blot)
[0064] (1)將膜轉(zhuǎn)移緩沖液倒入塑料平盤中。從玻璃板中取出凝膠，將其浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖 液中，剪取同樣大小的硝酸纖維素膜，一般為6X9cm，放入水中2min，然后放于膜轉(zhuǎn)移緩沖 液中。
[0065] (2)將膠放置于膜轉(zhuǎn)移緩沖液中，在黑板上放上濾紙，用玻璃棒趕走氣泡，之后放 上膠，然后將PVDF膜蓋在膠上，輕輕滾動玻璃棒趕走氣泡，然后放上濾紙及海綿，每放置海 綿或濾紙同樣均要除去氣泡。最終順序為黑板-海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿-白板。
[0066] (3)穩(wěn)壓轉(zhuǎn)膜100V，70min;在周圍堆滿冰塊，保持低溫。
[0067] (4)膜封閉：室溫下封閉緩沖液中30min，倒掉封閉緩沖液，加入雜交膜清洗液 (TBST buffer),室溫下5min，重復(fù)TBST Buffer-次；
[006引（5)倒掉TBST Buffer,加入一抗（比例根據(jù)不同的抗體調(diào)整），室溫下解育1小時； 加入TBST Buffer，室溫下5min，重復(fù)一次，加入二抗(比例根據(jù)不同的抗體調(diào)整），室溫下解 育化；
[0069] (6)洗膜:TBST buffer室溫洗膜2次，每次5min;
[0070] (7)從ECL顯色發(fā)光試劑盒中各取ImL Stock A和Stock B混合，均勻浸潤膜；用保 鮮膜封好后于Bio-Rad照膠儀器顯影。
[0071 ]實施例1.泛素結(jié)合酶活性檢測體系的建立
[0072] 建立泛素結(jié)合酶活性檢測體系的主要組分和步驟如下：
[0073] 1、表達(dá)蛋白所用大腸桿菌菌種為化21(呢3);按照具體實施方案(B)中的方法制備 BL2UDE3)感受態(tài)細(xì)胞。
[0074] 2、擬南芥AtEl選擇的是擬南芥AtUBA2，蛋白表達(dá)載體來源于參考文獻(xiàn):Qingzhen Zhao,Miaomiao Tian,Qiuling Li,Feng Cui,Lijing Liu；Bojiao Yin,Qi Xie.A plant- specific in vitro ubiqutin曰tion 曰n曰lysis system.The PI曰nt Journ曰1,2013年74卷 524-533頁。所用蛋白表達(dá)載體為PGEX-6P-1 (Novagen)。
[0075] 3、構(gòu)建擬南芥AtUb蛋白表達(dá)載體:所述蛋白表達(dá)載體為pACYCDuet (Novagen);所 述野生型單體泛素蛋白的序列來源于PET28a-At加 （Qingzhen Zhao,Miaomiao Tian, Qiuling Li,Feng Cui,Lijing Liu；Bojiao Yin,Qi Xie.A plant-specific in vitro ubiqutination analysis system.The Plant Journal,2013年74卷524-533頁）；考慮到 陽T28a-A優(yōu)b與上述質(zhì)粒PGEX-6P-1-A巧1載體中含有共同的復(fù)制起點，因此，運兩種質(zhì)粒無 法在化21 (DE3)感受態(tài)中共同表達(dá)，因此，我們將陽T28a-AtUb利用Nco I和Not I將AtUb切下 來連入pACYCDuet質(zhì)粒上，構(gòu)建能夠進(jìn)行化蛋白體外表達(dá)的載體質(zhì)粒pACYCDuet-A優(yōu)b。
[0076] 4、按照具體實施方案（C)中方法，將pGEX-6P-1-AtUBA2轉(zhuǎn)入化21(DE3)感受態(tài)細(xì) 胞，挑取1個單克隆，命名為C1，按照具體實施方案(A)中方法保存菌種，并按照具體實施方 案化）中方法誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，按照具體實施方案巧）中方法將C1誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后樣品跑蛋白 膠，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況，可W在預(yù)期位置看到明顯的AtUBA2誘 導(dǎo)表達(dá)條帶，結(jié)果見附圖1。
[0077] 5、將上述成功誘導(dǎo)E1蛋白表達(dá)的菌種按照具體實施方案(B)中的方法制備感受態(tài) 細(xì)胞備用。
[0078] 6、按照具體實施方案(C)中方法，將pACYCDuet-AtUb轉(zhuǎn)入C1感受態(tài)細(xì)胞，挑取1個 單克隆，命名為C2,按照具體實施方案(A)中方法保存菌種，并按照具體實施方案(D)中方法 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，按照具體實施方案巧）中方法將C2誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后樣品跑蛋白膠，考馬斯亮 藍(lán)染色，脫色后觀察蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況，可W在預(yù)期位置分別看到明顯的AtUBA2和At師的 誘導(dǎo)表達(dá)條帶，結(jié)果見附圖2。
[0079] 7、將上述成功誘導(dǎo)E1蛋白和化蛋白表達(dá)的菌種按照具體實施方案(B)中的方法制 備感受態(tài)細(xì)胞備用。
[0080] C1和C2株系感受態(tài)細(xì)胞即是泛素結(jié)合酶活性檢測體系的主要組分。下一步只需將 待檢測E2構(gòu)建到與PGEX-6P-巧日pACYCDuet復(fù)制起點不一樣的蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒上，分別轉(zhuǎn) 化C1和C2感受態(tài)細(xì)胞，分別誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過蛋白印記檢測方法檢測待測E2蛋白是否有 符合E化化分子量遷移的條帶即可。
[0081] W實施例1的泛素結(jié)合酶活性檢測體系為基礎(chǔ)，分別檢測待測E2蛋白，即實施例2 的擬南芥AtUBClO、實施例3的花生AWJBC34、實施例4的鹽芥TSUBC33。
[0082] 實施例2.擬南芥AtUBClO泛素結(jié)合酶活性檢測
[0083] 1、擬南芥AtUBClO是已知具有泛素結(jié)合酶活性的E2蛋白（參考文獻(xiàn)：Qingzhen Zhao,Miaomiao Tian,Qiuling Li,Feng Cui,Lijing Liu；Bojiao Yin,Qi Xie.A plant- specific in vitro ubiqutin曰tion 曰n曰lysis system.The PI曰nt Journ曰1,2013年74卷 524-533頁），我們用此蛋白來驗證本專利中的泛素結(jié)合酶活性檢測體系是否工作。
[0084] 2、構(gòu)建擬南芥泛素結(jié)合酶AtUBClO蛋白表達(dá)載體：我們利用與PGEX-6P-1和 pACYCDuet復(fù)制起點不一樣的pCDFDuet(Novagen)質(zhì)粒作為E2蛋白原核表達(dá)載體;我們利用 EcoRI和Sail將AtUBClO構(gòu)建到pCD抑uet載體上，并在AtUBClO簇基端加上Flag標(biāo)簽，W方便 進(jìn)行蛋白印跡檢測（所用引物為如序列表SEQ NO. 3-4所示的AtUBClO-F和AtUBClO-R)，從而 構(gòu)建成能夠進(jìn)行E2蛋白體外表達(dá)的載體質(zhì)粒pCD抑uet-AtUBClO。按照具體實施方案(C)所 述方法轉(zhuǎn)入化2UDE3)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，按照具體實施方案(D)所述方法進(jìn)行誘 導(dǎo)表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的樣品按照具體實施方案化)所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯 亮藍(lán)染色，證明AtUBClO蛋白能夠成功被誘導(dǎo)表達(dá)。
[00化]3、將pCDFDuet-AtUBClO按照具體實施方案(C)所述方法分別轉(zhuǎn)入C1和C2感受態(tài)細(xì) 胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，按照具體實施方案(D)所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的 樣品按照具體實施方案化)所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明AtUBA2、 A優(yōu)b和AtUBClO蛋白均能夠被成功誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果見附圖3。
[0086] 4、將上述誘導(dǎo)前后的樣品按照具體實施方案化)所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨 后按照具體實施方案(F)中所述方法進(jìn)行蛋白印記檢測AtUBClO的位置，能夠成功檢測到 AtUBC 10的遷移帶，分子量符合AtUBC 10加上一個師分子的大小，證明本發(fā)明的中的泛素結(jié) 合酶活性檢測體系是能夠工作的。結(jié)果見附圖4。
[0087] 實施例3.花生AWJBC34泛素結(jié)合酶活性檢測
[0088] 1、構(gòu)建花生AWJBC34原核蛋白表達(dá)載體:花生AWJBC34來源于栽培品種魯花14的轉(zhuǎn) 錄組測序結(jié)果，其氨基酸序列如序列表SEQ N0.1所示；由于據(jù)預(yù)測AWJBC34是一個跨膜蛋 白，為增加蛋白的可溶性，我們將AhUBC34跨膜域去掉，用EcoRI和Sail將AhUBC34構(gòu)建到 pCDFDuet載體上，并通過引物（所用引物為如序列表SEQ NO . 5-6所示的AhUBC34-F和 AWJBC34 Δ TM-R)擴(kuò)增在AWJBC34蛋白C端加上Flag標(biāo)簽，W方便進(jìn)行蛋白印跡檢測，從而構(gòu) 建成能夠進(jìn)行E2蛋白體外表達(dá)的載體質(zhì)粒pCDFDuet-AhUBC34。將pCDFDuet-AhUBC34按照具 體實施方案(C)所述方法轉(zhuǎn)入化2UDE3)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，按照具體實施方案(D) 所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的樣品按照具體實施方案化)所述方法進(jìn)行SDS- PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明AWJBC34蛋白能夠成功被誘導(dǎo)表達(dá)。
[0089] 2、將pCDFDuet-AhUBC34按照具體實施方案(C)所述方法分別轉(zhuǎn)入C1和C2感受態(tài)細(xì) 胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，按照具體實施方案(D)所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的 樣品按照具體實施方案化)所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明AtUBA2、 A優(yōu)b和AWJBC34蛋白均能夠被成功誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果見附圖5。
[0090] 3、將上述誘導(dǎo)前后的樣品按照具體實施方案化)所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨 后按照具體實施方案(F)中所述方法進(jìn)行蛋白印記檢測AhUBC34的位置，能夠成功檢測到 AWJBC34的遷移帶，分子量符合AWJBC34加上一個化分子的大小，證明AWJBC34具備泛素結(jié)合 酶活性。結(jié)果見附圖6。
[0091] 實施例4.鹽芥TSUBC33泛素結(jié)合酶活性檢測
[0092] 1、構(gòu)建鹽芥TSUBC33原核蛋白表達(dá)載體：鹽芥TSUBC33來源于山東型鹽芥（NCBI Ref erence Sequence: XM_006402032.1)，其氨基酸序列如序列表SEQ NO. 2所示；由于據(jù)預(yù) ^UTsUBC33是一個跨膜蛋白，為增加蛋白的可溶性，我們將TSUBC33跨膜域去掉，用EcoRI和 5曰(：1將了3冊〔33構(gòu)建到口〔0抑116*載體上，并通過引物(所用引物為如序列表569^.7-8所示 的TSUBC33-F和TSUBC33 Δ TM-R)擴(kuò)增在TSUBC33蛋白C端加上Flag標(biāo)簽，W方便進(jìn)行蛋白印 記檢測，從而構(gòu)建成能夠進(jìn)行E2蛋白體外表達(dá)的載體質(zhì)粒pCDFDuet-TsUBC33。將pCDFDuet- TSUBC33按照具體實施方案(C)所述方法轉(zhuǎn)入化21(呢3)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，按照具 體實施方案(D)所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的樣品按照具體實施方案化)所述方 法進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明TSUBC33蛋白能夠成功被誘導(dǎo)表達(dá)。
[0093] 2、將pCDFDuet-TsUBC33按照具體實施方案(C)所述方法分別轉(zhuǎn)入C1和C2感受態(tài)細(xì) 胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，按照具體實施方案(D)所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的 樣品按照具體實施方案化)所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明AtUBA2、 A優(yōu)b和TSUBC33蛋白均能夠被成功誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果見附圖7。
[0094] 3、將上述誘導(dǎo)前后的樣品按照具體實施方案化)所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨 后按照具體實施方案(F)中所述方法進(jìn)行蛋白印記檢測TSUBC33的位置，能夠成功檢測到 TsUBC33的遷移帶，分子量符合TsUBC3巧日上一個化分子的大小，證明TsUBC33具備泛素結(jié)合 酶活性。結(jié)果見附圖8。
[0095]本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的 原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，運些變化和改 進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物 界定。
【主權(quán)項】
1. 一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)，其特征是，包括：（1)能夠表達(dá)El蛋白的 原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；（2)能夠同時表達(dá)E1蛋白和Ub蛋白的原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；（3)與表 達(dá)E1蛋白和Ub蛋白質(zhì)粒復(fù)制起點不同的，能夠進(jìn)行原核體外表達(dá)待測E2蛋白的質(zhì)粒，上述 (1)和(2)的原核表達(dá)采用的菌株相同。2. 如權(quán)利要求1所述的一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)，其特征是，所述（1) 能夠表達(dá)E1蛋白的原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞的構(gòu)建方法為:構(gòu)建能夠進(jìn)行E1蛋白體外表達(dá)的載 體質(zhì)粒P1，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株，此新菌株命名為C1，并用此菌株制作感受態(tài)細(xì)胞。3. 如權(quán)利要求2所述的一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)，其特征是，所述(2) 能夠同時表達(dá)E1蛋白和Ub蛋白的原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞的構(gòu)建方法為:構(gòu)建能夠進(jìn)行Ub蛋白 體外表達(dá)的載體質(zhì)粒P2,將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入包含P1的原核表達(dá)菌株C1，此新菌株命名為C2,并用 此菌株制作感受態(tài)細(xì)胞;P2的復(fù)制起點與P1不同。4. 如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)，其特 征是，所述原核表達(dá)菌株為大腸桿菌。5. 如權(quán)利要求4所述的一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)，其特征是，所述原核 表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21 (DE3)。6. 如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)，其特 征是，所述E1蛋白為擬南芥AtUBA2。7. 如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的一種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的系統(tǒng)，其特 征是，所述Ub蛋白為擬南芥野生型單體泛素蛋白AtUb。8. -種用于體外檢測泛素結(jié)合酶活性的方法，其特征是， (1) 根據(jù)權(quán)利要求2所述制得能夠原核表達(dá)E1蛋白的C1感受態(tài)細(xì)胞； (2) 根據(jù)權(quán)利要求3所述制得能夠同時原核表達(dá)E1蛋白和Ub蛋白的C2感受態(tài)細(xì)胞； (3) 構(gòu)建待測E2蛋白的體外表達(dá)載體質(zhì)粒P3;P3的復(fù)制起點與P1和P2都不同； (4) 將P3分別轉(zhuǎn)入C1和C2感受態(tài)細(xì)胞，各自挑選單克隆，并將其命名為C3CK、C3,其中 C3CK作為負(fù)對照； (5) 將C3CK和C3分別擴(kuò)大培養(yǎng)，并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后收集菌體，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡雜交;檢 測結(jié)果顯示:相比C3CK，在C3樣品中檢測到待測E2蛋白迀移條帶，并且迀移大小符合Ub分子 量，證明此待測E2蛋白具有泛素結(jié)合酶活性。
【文檔編號】C12R1/19GK106011042SQ201610326713
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】崔鳳, 李國衛(wèi), 劉譯陽, 韓燕 , 趙慶臻, 徐國鑫
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心