一種癌癥腫瘤抑制基因簇（tsg）的檢測(cè)方法
【專利摘要】為了能快速準(zhǔn)確的得到對(duì)癌癥發(fā)生起共同作用的腫瘤抑制基因，發(fā)明人設(shè)計(jì)了一套新的方法：首先，通過(guò)模擬隨機(jī)抽樣的方法對(duì)同一區(qū)域內(nèi)的所有基因進(jìn)行兩兩之間的關(guān)系尋找；其次，挑選出有共同發(fā)生關(guān)系的基因；然后，將這些兩兩共同發(fā)生的基因鏈接起來(lái)，形成一條鏈，鏈里的基因必須兩兩具有共發(fā)生關(guān)系；最后，結(jié)合樣本的臨床信息及表達(dá)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證一條鏈中的基因是否對(duì)癌癥的發(fā)生起到了共同的作用，這種共同的作用是否強(qiáng)于單個(gè)基因。
【專利說(shuō)明】
一種癌癥腫瘤抑制基因簇(TSG)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物信息領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及癌癥腫瘤抑制基因簇的檢測(cè)。 【背景技術(shù)】
[0002]—直以來(lái)癌癥發(fā)生的基因突變學(xué)說(shuō)始終占據(jù)癌癥發(fā)生機(jī)制學(xué)說(shuō)的主流。從1982 年鑒定出第一個(gè)可能導(dǎo)致癌癥發(fā)生的人類基因HRAS突變開(kāi)始，癌癥的研究進(jìn)入癌基因跟抑癌基因的探索和鑒定時(shí)代。早期研究主要集中于基因組區(qū)域上的單個(gè)基因突變?cè)谀[瘤發(fā)生過(guò)程起“驅(qū)動(dòng)(Driver) ”的作用，然而近期的研究發(fā)現(xiàn)，在基因組上出現(xiàn)大量頻繁發(fā)生缺失突變的腫瘤抑制基因，這些與雜合缺失相關(guān)的缺失突變也會(huì)導(dǎo)致該腫瘤抑制基因周圍基因的活性降低。研究證明基因組上大量頻繁發(fā)生大片段缺失的基因，這些基因傾向于以簇 (cluster)的形式存在(多種基因?qū)Π┌Y的發(fā)生起共同的作用)，這種共同的生物調(diào)控作用比單個(gè)基因的作用還要強(qiáng)。大規(guī)?；蚪M上的損傷可以通過(guò)共發(fā)生的癌癥基因的共同作用而起作用，而不是通過(guò)單個(gè)獨(dú)立基因發(fā)生損傷來(lái)起作用，成為癌癥發(fā)生的一種可能的機(jī)制。
[0003]分析得到候選腫瘤抑制基因的過(guò)程并不復(fù)雜，目前的分析方案也較為一致。但是怎樣從大量的候選基因中得到有共同作用的基因是現(xiàn)階段分析的一個(gè)難點(diǎn)。目前的方法主要有兩種，1)通過(guò)使用癌癥的大鼠模型系統(tǒng)和體內(nèi)RNAi等的實(shí)驗(yàn)方法，這種方法耗時(shí)較長(zhǎng)，費(fèi)用較高。2)選取已有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的腫瘤抑制基因，由于人自身存在一定的局限性，篩選出來(lái)的結(jié)果帶有一定的主觀性，而且可能不完整，同時(shí)也需要較多的人力和時(shí)間。
[0004]綜上所述，已有的研究腫瘤抑制基因的方法在前期都會(huì)得到較多的候選基因，從這些基因中挑出真正對(duì)癌癥的發(fā)生具有單一或者共同作用的基因是非常困難的。按照之前文章中報(bào)道過(guò)的方法，需要耗費(fèi)大量的人力物力。因此，本領(lǐng)域急需從大量的候選基因中得到對(duì)癌癥發(fā)生起共同作用的腫瘤抑制基因的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了能快速準(zhǔn)確的得到對(duì)癌癥發(fā)生起共同作用的腫瘤抑制基因，發(fā)明人設(shè)計(jì)了一套新的方法:
[0006]首先，通過(guò)模擬隨機(jī)抽樣的方法對(duì)同一區(qū)域內(nèi)的所有基因進(jìn)行兩兩之間的關(guān)系尋找；
[0007]其次，挑選出有共同發(fā)生關(guān)系的基因；
[0008]然后，將這些兩兩共同發(fā)生的基因鏈接起來(lái)，形成一條鏈，鏈里的基因必須兩兩具有共發(fā)生關(guān)系；
[0009]最后，結(jié)合樣本的臨床信息及表達(dá)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證一條鏈中的基因是否對(duì)癌癥的發(fā)生起到了共同的作用，這種共同的作用是否強(qiáng)于單個(gè)基因。
[0010]本發(fā)明基于全基因組成對(duì)腫瘤樣本的體細(xì)胞CNV(拷貝數(shù)變異)[1]檢測(cè)結(jié)果及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析結(jié)果(FPKM)[1]進(jìn)行下游分析。
[0011]因此，本發(fā)明提供了一種獲得對(duì)癌癥發(fā)生起共同作用的腫瘤抑制基因的方法，所述方法包括步驟:
[0012]I)對(duì)于多個(gè)腫瘤患者的腫瘤組織樣本和正常組織樣本，獲得全基因測(cè)序數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量數(shù)據(jù)，以及包括患者生存時(shí)間的臨床信息和基因在所述樣本中的表達(dá)量；
[0013]2)將基因組劃分成多個(gè)子區(qū)域(例如所述子區(qū)域長(zhǎng)度為10K-10M，優(yōu)選10K-1M，更優(yōu)選100K-1M)，對(duì)于所述每個(gè)子區(qū)域，用上述全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的CNV檢測(cè)結(jié)果計(jì)算所述多個(gè)樣本中的CNV顯著性(例如采用Gscore值[2]進(jìn)行計(jì)算);
[0014]3)對(duì)CNV顯著變化(例如，對(duì)于采用Gscore值進(jìn)行計(jì)算，Gscore〉= 0.1)的子區(qū)域進(jìn)行延展，挑選出基因組上CNV顯著變化的連續(xù)子區(qū)域，作為缺失區(qū)域；
[0015]4)對(duì)每個(gè)缺失區(qū)域內(nèi)的所有基因，利用所述腫瘤組織樣本和正常組織樣本的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量數(shù)據(jù)，挑選出轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量在正常組織樣本和腫瘤組織樣本之間有顯著差異(例如成對(duì)秩和檢驗(yàn)P〈0.05)并且下調(diào)的基因，這些基因?yàn)楹蜻x的腫瘤抑制基因；
[0016]5)對(duì)于每個(gè)缺失區(qū)域，判斷兩兩基因是否同時(shí)發(fā)生缺失突變，例如按如下方式進(jìn)行:假設(shè)同時(shí)發(fā)生兩種基因丟失突變是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程，那么進(jìn)行大量(例如I萬(wàn)次以上，10
萬(wàn)次以上，......，1000000萬(wàn)次以上)隨機(jī)抽樣，對(duì)于每一次抽樣，個(gè)基因會(huì)在多個(gè)樣本中發(fā)生cnv，每次抽樣都會(huì)針對(duì)任意的兩兩基因，每次抽取的次數(shù)與該基因發(fā)生的次數(shù)相關(guān)，每次抽取都會(huì)記錄這兩個(gè)基因共同發(fā)生(即在同一個(gè)樣本中)的次數(shù)，將這個(gè)次數(shù)與實(shí)際結(jié)果相比較，將兩個(gè)基因同時(shí)出現(xiàn)的次數(shù)大于實(shí)際兩個(gè)基因共同發(fā)生的次數(shù)的結(jié)果記錄下來(lái)，將上述結(jié)果進(jìn)行累加，然后除以總的抽樣數(shù)，得到最終的P值，P值越小，說(shuō)明兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變的隨機(jī)性越小，一般認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)，認(rèn)為兩個(gè)基因是同時(shí)發(fā)生了缺失突變；
[0017]6)將每個(gè)區(qū)域內(nèi)同時(shí)發(fā)生缺失突變的基因進(jìn)行鏈接，要求在一條鏈中的基因必須是兩兩互相共發(fā)生的；
[0018]7)利用所述臨床信息和表達(dá)量的信息得到在癌癥的發(fā)生過(guò)程某個(gè)基因的表達(dá)差異(圖2中的高表達(dá)和低表達(dá))在癌癥的生存率上有顯著的差異[3]，分析上述鏈中的基因的表達(dá)與癌癥患者的生存時(shí)間的關(guān)系，如果基因共同對(duì)癌癥患者的預(yù)后有顯著的影響(例如利用基因表達(dá)的數(shù)據(jù)將癌癥患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩類(基因在該樣本中的表達(dá)量大于基因在所有樣本中的表達(dá)量的均值，則該基因在該樣本中為高表達(dá)，否則為低表達(dá))，計(jì)算每類患者在某個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的生存率(生存/死亡)如圖2，如果該基因高表達(dá)對(duì)于癌癥患者有更高的生存率，則驗(yàn)證了該基因有對(duì)癌癥患者的預(yù)后有顯著的影響)，那么它們確實(shí)是有共同的作用，如此得到所有對(duì)癌癥發(fā)生起共同作用的腫瘤抑制基因。
[0019]已有的研究腫瘤抑制基因的方法在前期都會(huì)得到較多的候選基因，從這些基因中挑出真正對(duì)癌癥的發(fā)生具有單一或者共同作用的基因是非常困難的。按照之前文章中報(bào)道過(guò)的方法，需要耗費(fèi)大量的人力物力。本研究方法，巧妙的運(yùn)用數(shù)學(xué)及生物信息方法，準(zhǔn)確快速的得到共同作用的腫瘤抑制基因，并且結(jié)合臨床信息，對(duì)于腫瘤的后續(xù)治療起到了很好的指引。
【附圖說(shuō)明】
[0020]附圖中的兩幅圖示例性示出了整個(gè)研究的最終結(jié)果。
[0021]圖1.以13號(hào)染色體為例，說(shuō)明染色體上發(fā)生大片段丟失突變的基因，這些基因之間存在共發(fā)生的關(guān)系。該圖展示了人類基因組13號(hào)染色體上發(fā)生的大規(guī)模的片段丟失，與這一丟失突變相關(guān)的基因之間形成了一個(gè)簇(cluster)，它們之間的共發(fā)生關(guān)系可以通過(guò)圖2展示的結(jié)果來(lái)驗(yàn)證。
[0022]圖2.單個(gè)基因的生存曲線以及它們共同作用的生存曲線。表明本研究得到的成簇的基因之間確實(shí)具有共發(fā)生的關(guān)系，它們整體對(duì)于該種癌癥發(fā)生的促進(jìn)作用明顯大于單個(gè)基因所起的作用。而圖中的基因也都是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的跟該中癌癥發(fā)生高度相關(guān)的一些基因?！揪唧w實(shí)施方式】
[0023]本具體實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步解釋，并不是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀完本說(shuō)明書(shū)，可根據(jù)具體需要，對(duì)本實(shí)施例進(jìn)行無(wú)創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)，均受到專利法的保護(hù)。
[0024]1)樣本、數(shù)據(jù)來(lái)源:65例前列腺癌患者的腫瘤組織樣本和正常組織樣本的全基因測(cè)序據(jù)以及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，例如采用華大自主研發(fā)的cnv檢測(cè)流程[1]的數(shù)據(jù)產(chǎn)出以及 cuff links[1]軟件得到的基因的FPKM(每1百萬(wàn)個(gè)比對(duì)上參考基因組的序列中，比對(duì)到外顯子的每1K個(gè)堿基上的片段的個(gè)數(shù))作為本實(shí)施例的數(shù)據(jù)輸入；
[0025]2)將人類參考基因組(UCSC hgl9, http://hgdownload.soe.ucsc.edu/ goldenPath/hgl9/bigZips/chromFa.tar.gz)各個(gè)染色體劃分為1M的窗口，計(jì)算得到每1M 窗口內(nèi)的CNV顯著性(用GsC〇re[2]值代表)；
[0026]3)對(duì)第二步得到的窗口按照位置先后順序進(jìn)行掃描，將CNV顯著變化(Gscore〉= 〇.1)的相鄰的窗口進(jìn)行合并，得到整個(gè)基因組上頻繁發(fā)生大規(guī)模丟失的區(qū)域；
[0027]4)利用 ANNOVAR(http://www.0penb1informatics.0rg/annovar/)軟件對(duì)第三步得到的cnv區(qū)域進(jìn)行注釋，得到這些區(qū)域內(nèi)的基因列表；
[0028]5)對(duì)每個(gè)區(qū)域內(nèi)的基因在正常組織和腫瘤組織中的FPKM值進(jìn)行成對(duì)秩和檢驗(yàn)， 挑選出表達(dá)量在正常組織樣本和腫瘤組織樣本中有顯著差異(P〈〇.05)的基因列表；
[0029]6)對(duì)得到的基因列表進(jìn)行過(guò)濾:首先去除發(fā)生了常見(jiàn)的和癌癥相關(guān)的點(diǎn)突變(體細(xì)胞單核苷酸突變和體細(xì)胞插入缺失突變)的基因(例如，COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)中的癌癥相關(guān)的基因列表，http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/download)，其次挑選出表達(dá)量變化跟cnv變異一致的基因，即發(fā)生了缺失的基因，表達(dá)量在腫瘤組織當(dāng)中是下調(diào)的基因；
[0030]7)經(jīng)過(guò)篩選后得到的基因，按照不同的簇區(qū)域，分別對(duì)各個(gè)區(qū)域內(nèi)的基因兩兩之間進(jìn)行共發(fā)生關(guān)系的研究:模擬1000000萬(wàn)次隨機(jī)抽樣，對(duì)于每一次抽樣的結(jié)果，每個(gè)基因會(huì)在多個(gè)樣本中發(fā)生cnv，每次抽樣都會(huì)針對(duì)任意的兩兩基因，每次抽取的次數(shù)與該基因發(fā)生的次數(shù)相關(guān)，每次抽取都會(huì)記錄這兩個(gè)基因共同發(fā)生(在同一個(gè)樣本中)的次數(shù)，將這個(gè)次數(shù)與實(shí)際結(jié)果相比較，將兩個(gè)基因同時(shí)出現(xiàn)的次數(shù)大于實(shí)際兩個(gè)基因共同發(fā)生的次數(shù)的結(jié)果記錄下來(lái)，將上述結(jié)果進(jìn)行累加，然后除以總的抽樣數(shù)，得到最終的P值，當(dāng)P〈〇.05時(shí)， 認(rèn)為兩個(gè)基因是同時(shí)發(fā)生了缺失突變；
[0031]8)基于上一步得到的關(guān)系列表，將兩兩共發(fā)生的基因連接起來(lái)，得到完全互連的基因列表。
[0032]9)繪制人類13號(hào)染色體上的cnv區(qū)域，如圖1所示，橫坐標(biāo)表示人類基因組13號(hào)染色體的位置，縱坐標(biāo)表示Gscore值，紅色區(qū)域代表擴(kuò)增的區(qū)域，藍(lán)色的區(qū)域代表缺失的區(qū)域，圖中標(biāo)注的基因?yàn)樯鲜稣业降膬蓛苫ハ喙舶l(fā)生的基因列表的示例。
[0033]10)下載已發(fā)表的前列腺癌樣本的對(duì)應(yīng)患者臨床信息(需包含患者生存時(shí)間)和基因在樣本當(dāng)中的表達(dá)[3]，利用R軟件中做生存曲線的軟件包(survival)，繪制出每個(gè)基因以及所有基因的生存曲線圖，mfit = survfit (Surv (time, status)?group)，其中，關(guān)于group的定義:對(duì)于單個(gè)基因，將基因在癌癥樣本中的表達(dá)量值與該基因在整體樣本中的表達(dá)量的均值進(jìn)行比較，大于均值的樣本group = 2 (高表達(dá))，小于均值的樣本group =I (低表達(dá))，對(duì)于鏈表中的所有基因，如果所有基因在該樣本中都是低表達(dá)的，那么整個(gè)鏈表的 group = I，否貝Ij group = 2。
[0034]由上一步的方法繪制出圖1中的基因的生存曲線，如圖2所示，橫坐標(biāo)表示復(fù)發(fā)時(shí)間，縱坐標(biāo)代表生存概率，上面的曲線代表高表達(dá)，下面的曲線代表低表達(dá)，P值代表該基因的高表達(dá)和低表達(dá)對(duì)與前列腺癌患者的生存率的影響是否存在顯著差異(P〈0.05作為顯著的閾值)。如圖所示，本發(fā)明得到的抑癌基因在高表達(dá)的時(shí)候會(huì)有較好的預(yù)后效果，并且所有基因共同作用的顯著程度大于單個(gè)基因。
[0035]參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種獲得對(duì)癌癥發(fā)生起共同作用的腫瘤抑制基因的方法，所述方法包括步驟: 1)對(duì)于多個(gè)腫瘤患者的腫瘤組織樣本和正常組織樣本，獲得全基因測(cè)序數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量數(shù)據(jù)，以及包括患者生存時(shí)間的臨床信息和基因在所述樣本中的表達(dá)量； 2)將基因組劃分成多個(gè)子區(qū)域，對(duì)于所述每個(gè)子區(qū)域，用上述全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的CNV檢測(cè)結(jié)果計(jì)算所述多個(gè)樣本中的CNV顯著性； 3)對(duì)CNV顯著變化的子區(qū)域進(jìn)行延展，挑選出基因組上CNV顯著變化的連續(xù)子區(qū)域，作為缺失區(qū)域； 4)對(duì)每個(gè)缺失區(qū)域內(nèi)的所有基因，利用所述腫瘤組織樣本和正常組織樣本的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量數(shù)據(jù)，挑選出轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量在正常組織樣本和腫瘤組織樣本之間有顯著差異并且下調(diào)的基因，這些基因?yàn)楹蜻x的腫瘤抑制基因； 5)對(duì)于每個(gè)缺失區(qū)域，判斷兩兩基因是否同時(shí)發(fā)生缺失突變； 6)將每個(gè)區(qū)域內(nèi)同時(shí)發(fā)生缺失突變的基因進(jìn)行鏈接，要求在一條鏈中的基因必須是兩兩互相共發(fā)生的； 7)利用所述臨床信息和表達(dá)量的信息得到在癌癥的發(fā)生過(guò)程某個(gè)基因的表達(dá)差異在癌癥的生存率上有顯著的差異，分析上述鏈中的基因的表達(dá)與癌癥患者的生存時(shí)間的關(guān)系，如果基因共同對(duì)癌癥患者的預(yù)后有顯著的影響，那么它們確實(shí)有共同的作用，如此得到所有對(duì)癌癥發(fā)生起共同作用的腫瘤抑制基因。2.權(quán)利要求1的方法，所述子區(qū)域長(zhǎng)度為10K-10M，優(yōu)選10K-1M，更優(yōu)選100K-1M。3.權(quán)利要求1的方法，所述CNV顯著性采用Gscore值進(jìn)行計(jì)算。4.權(quán)利要求3的方法，所述CNV顯著變化是Gscore〉=0.1。5.權(quán)利要求1的方法，所述轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量在正常組織樣本和腫瘤組織樣本之間有顯著差異為成對(duì)秩和檢驗(yàn)P〈0.05。6.權(quán)利要求1的方法，判斷兩兩基因是否同時(shí)發(fā)生缺失突變按如下方式進(jìn)行:假設(shè)同時(shí)發(fā)生兩種基因丟失突變是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程，那么進(jìn)行大量隨機(jī)抽樣，優(yōu)選I萬(wàn)次以上，10萬(wàn)次以上，......，最優(yōu)選1000000萬(wàn)次以上，對(duì)于每一次抽樣，個(gè)基因會(huì)在多個(gè)樣本中發(fā)生crw，每次抽樣都會(huì)針對(duì)任意的兩兩基因，每次抽取的次數(shù)與該基因發(fā)生的次數(shù)相關(guān)，每次抽取都會(huì)記錄這兩個(gè)基因共同發(fā)生的次數(shù)，將這個(gè)次數(shù)與實(shí)際結(jié)果相比較，將兩個(gè)基因同時(shí)出現(xiàn)的次數(shù)大于實(shí)際兩個(gè)基因共同發(fā)生的次數(shù)的結(jié)果記錄下來(lái)，將上述結(jié)果進(jìn)行累加，然后除以總的抽樣數(shù)，得到最兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變的隨機(jī)性P，如果P〈0.05，則兩個(gè)基因是同時(shí)發(fā)生了缺失突變。7.權(quán)利要求1的方法，基因?qū)Π┌Y患者的預(yù)后有顯著的影響通過(guò)如下方式確認(rèn):利用基因表達(dá)的數(shù)據(jù)將癌癥患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩類，計(jì)算每類患者在某個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的生存率，如果該基因高表達(dá)對(duì)于癌癥患者有更高的生存率，則驗(yàn)證了該基因?qū)Π┌Y患者的預(yù)后有顯著的影響。8.權(quán)利要求1的方法，對(duì)于高表達(dá)和低表達(dá)兩類，基因在該樣本中的表達(dá)量大于基因在所有樣本中的表達(dá)量的均值，則該基因在該樣本中為高表達(dá)，否則為低表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105986007SQ201410508691
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月11日
【發(fā)明人】蘇紅, 劉棟兵, 彭麗花
【申請(qǐng)人】深圳華大基因股份有限公司