一種基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，該方法包括如下步驟：在粒徑為30?100μm、密度為1.16?3g/mL的羥基微球表面化學(xué)鍵合上一層20?100nm厚的明膠，得到包裹明膠的羥基微球；在包裹明膠的羥基微球表面修飾上抗體anti?EpCAM和anti?CD146；將病人血樣與修飾抗體的羥基微球混勻孵育得混合樣品，滴加到1.15?1.20g/mL細(xì)胞分離液的上層，離心分離后，捕獲住腫瘤細(xì)胞的微球沉積在細(xì)胞分離液底部；將捕獲住腫瘤細(xì)胞的微球使用明膠酶降解微球表面明膠，釋放腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明分選效率及純度更高，并且分選出來(lái)的腫瘤細(xì)胞能夠被釋放及培養(yǎng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞分選方法，具體涉及一種基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法。
【背景技術(shù)】
[0003]循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)是從原發(fā)腫瘤組織上脫離下來(lái)進(jìn)入到腫瘤患者外周血中的腫瘤細(xì)胞，對(duì)于腫瘤的早期診斷和治療評(píng)估有很重要的臨床研究?jī)r(jià)值。鑒于實(shí)體腫瘤患者因癌癥導(dǎo)致死亡的原因多數(shù)是因腫瘤轉(zhuǎn)移這個(gè)事實(shí)，以及血液循環(huán)系統(tǒng)中監(jiān)測(cè)到CTCs將預(yù)示著腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性，早期的循環(huán)腫瘤細(xì)胞診斷在人體腫瘤活組織檢查和判斷疾病進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。然而，血液循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs含量是極低的，轉(zhuǎn)移癌患者體內(nèi)每毫升血液中只有幾個(gè)到幾百個(gè)CTCs，卻存在著19個(gè)干擾血細(xì)胞，因此對(duì)于CTCs的富集分選是一個(gè)非常大的技術(shù)挑戰(zhàn)。CTCs的分選效果(分選效率以及分選純度)直接影響了其對(duì)病人腫瘤診斷的預(yù)判以及后續(xù)的基因檢測(cè)等，因此高的分選靈敏度、高的分選純度、高通量以及高的CTCs活性的細(xì)胞分選成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0004]近年來(lái)，越來(lái)越多的靈敏的、具有特異性的CTCs的捕獲與鑒定技術(shù)已經(jīng)逐漸發(fā)展成熟。目前，CTCs的分選機(jī)理最常用的是利用特異性抗體對(duì)其表面表達(dá)的腫瘤標(biāo)記物，如上皮細(xì)胞粘附因子(epithelial cell adhes1n molecule, EpCAM)，進(jìn)行特異性的抗原-抗體吸附達(dá)到細(xì)胞分選的目的。這些特異性識(shí)別方法均依賴(lài)于CTCs表面的EpCAM抗原表達(dá)的情況，然而研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞在迀移過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithel ia-mesenchymal transit1n, EMT)過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中CTCs表面的EpCAM或者CK抗原的表達(dá)會(huì)降低，而這些EpCAM陰性的CTCs可以揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理，而這些很重要的CTCs將會(huì)被基于ant1-EpCAM抗體的捕獲方法所遺失，導(dǎo)致了較低的CTC捕獲效率。其次應(yīng)用較為廣泛的是利用CTCs與其他血細(xì)胞的物理特性差異進(jìn)行非特異性的分選，如細(xì)胞尺寸、密度和形變等的差異性。其中密度梯度離心法，因其成本低廉和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)而被應(yīng)用在患者外周血CTCs的探測(cè)中。根據(jù)不同種類(lèi)的細(xì)胞密度不同(其中CTCs密度范圍為1.06-1.llg/mL，紅細(xì)胞密度范圍為1.10-1.15g/mL，白細(xì)胞密度范圍為1.07-1.09g/mL)，利用密度梯度離心法將細(xì)胞按照不同密度分布在離心液中。然而這種方法只能去除血樣中大量的紅細(xì)胞，由于CTCs與白細(xì)胞的密度有交叉部分，在離心分選過(guò)程中，CTCs可能會(huì)與白細(xì)胞共沉積，導(dǎo)致純度、靈敏度降低。
[0005]因此本發(fā)明在抗原-抗體特異性識(shí)別技術(shù)和密度梯度離心技術(shù)的基礎(chǔ)上引入了一種新的更有效的基于密度大小的細(xì)胞分選技術(shù)。本發(fā)明添加了一種新的腫瘤標(biāo)記物CD146，來(lái)加強(qiáng)CTCs的捕獲。作為EMT的誘導(dǎo)因子，CD146跟腫瘤細(xì)胞表面EpCAM的表達(dá)呈互補(bǔ)關(guān)系，故使用ant1-CD146抗體可以捕獲到EpCAM陰性表達(dá)的CTCs，尤其已經(jīng)經(jīng)歷過(guò)EMT過(guò)程的CTCs。本發(fā)明通過(guò)特異性識(shí)別選擇性的增大CTC密度，從而擴(kuò)大其與血細(xì)胞密度的差異性，使用一種優(yōu)化的特定密度的細(xì)胞分離液對(duì)處理過(guò)的血樣進(jìn)行分層，提高CTC分選純度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，該方法基于抗原-抗體特異性識(shí)別技術(shù)和密度梯度離心技術(shù)，其分選效率及純度更高，并且分選出來(lái)的腫瘤細(xì)胞能夠被釋放及培養(yǎng)。
[0007]為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，包括如下步驟:
(I)配制密度為1.15-1.20g/mL的細(xì)胞分離液。所述的細(xì)胞分離液包括Ficoll或Percoll細(xì)胞分離液。
[0008](2)在粒徑為30-100μπι、密度為1.16_3g/mL的羥基微球表面化學(xué)鍵合上一層20-1OOnm厚的明膠，得到包裹明膠的羥基微球。所述的羥基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA微球。
[0009](3)在包裹明膠的羥基微球表面修飾上具有特異性免疫識(shí)別腫瘤細(xì)胞功能的抗體ant 1-EpCAM和ant 1-⑶146，得到雙抗體修飾的羥基微球。
[0010](4)將病人血樣與雙抗體修飾的羥基微球混勻孵育(使微球表面修飾的抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合以捕獲住腫瘤細(xì)胞)得混合樣品，將混合樣品緩慢滴加到1.15-1.20g/mL細(xì)胞分離液的上層，離心分離后，上述微球處理過(guò)的血樣被分層，其中所有的血細(xì)胞懸浮在細(xì)胞分離液上方，所有的捕獲住腫瘤細(xì)胞的微球(CTC-beads)沉積在細(xì)胞分離液底部，從而將外周血樣中的CTC-beads完全從周?chē)难?xì)胞中分離出來(lái)，得到非常高的CTC-beads純度。
[0011](5)將收集的捕獲住腫瘤細(xì)胞的微球使用明膠酶降解微球表面明膠，釋放腫瘤細(xì)胞。
[0012]步驟(I)中所述的Percoll細(xì)胞分離液的密度優(yōu)選為1.15g/mL。從美國(guó)Sigma公司購(gòu)買(mǎi)的Percoll原液的密度是1.13g/mL，通過(guò)使用1.316g/mL的蔗糖溶液以體積比1:9的比例濃縮密度為1.13g/mL的Percoll原液得到密度為1.15g/mL的Percoll細(xì)胞分離液。
[0013]步驟(2)中所述的羥基微球優(yōu)選為粒徑為50μπι、密度1.2g/mL的二氧化硅微球。
[0014]所述的羥基微球?yàn)槎趸栉⑶驎r(shí)，步驟(2)優(yōu)選包括如下步驟:I)將二氧化硅微球加入到無(wú)水乙醇中，加熱升溫至60°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane, APS)磁力攪拌2_4h，然后經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇、去離子水離心沖洗后得到了氨基修飾的二氧化硅微球(NH2-S12)。2)將NH2-S1道新分散到去離子水中，加入戊二醛，室溫下攪拌5-20h，然后經(jīng)過(guò)去離子水離心沖洗后得到了醛基修飾的二氧化硅微球(CHO-S12)。3)將CHO-S12再次分散到明膠溶液，室溫下攪拌3-12h后用去離子水離心洗滌去除未反應(yīng)完全的明膠溶液得到表面均勻包裹上一層厚明膠的二氧化硅微球(S12OGeD0
[0015]步驟(3)優(yōu)選包括如下步驟:I)使用EDC/NHS對(duì)包裹明膠的羥基微球表面羧基進(jìn)行活化30_120min，使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solut1n, PBS)離心清洗3次。2)將I)處理的微球浸入到鏈霉親和素(streptavidin，SA)溶液中，反應(yīng)40_120min在微球表面引入鏈霉親和素，PBS離心清洗3次。3)將2)處理的微球加入到生物素化的ant1-EpCAM和ant 1-⑶146抗體溶液中，室溫下反應(yīng)I _3h，用PBS漂洗得到雙抗體修飾的羥基微球。
[0016]步驟(4)混合樣品中雙抗體修飾的羥基微球的數(shù)量?jī)?yōu)選為1.5X 105/mL。
[0017]步驟(4)中離心所用離心力優(yōu)選為40_400g。
[0018]在步驟(4)中，密度為1.2g/mL的二氧化硅微球特異性地捕獲CTCs，使用將得到密度>1.2g/mL的CTC-bead，使用密度為1.15g/mL的Percoll溶液對(duì)血樣進(jìn)行分層，在這個(gè)密度下，紅細(xì)胞很難沉降，離心后，所有血細(xì)胞懸浮在Percol I溶液上層，CTC-beads沉降在最底層，徹底地跟所有的血細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
[0019]步驟(5)中所述的明膠酶優(yōu)選為基質(zhì)金屬蛋白酶9(metalloproteinases_9, MMP-9)0
[0020]優(yōu)選的，所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，還包括對(duì)收集的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行活性鑒定步驟。
[0021]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:
(I)本發(fā)明用的二氧化硅微球密度在1.2g/mL左右，遠(yuǎn)大于腫瘤細(xì)胞和正常血細(xì)胞的密度，修飾上相應(yīng)的抗體后捕獲住腫瘤細(xì)胞，選擇性的增大了腫瘤細(xì)胞的密度，大幅擴(kuò)大了其與血細(xì)胞密度差異性，提高了腫瘤細(xì)胞的篩選純度。
[0022](2)本發(fā)明使用雙抗體(ant1-EpCAM和ant1-CD146抗體)來(lái)特異性捕獲腫瘤細(xì)胞，大大加強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的捕獲效率。
[0023](3)本發(fā)明用雙抗體修飾的Si02@Gel能特異性吸附靶細(xì)胞，而不吸附血細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTCs的特異性識(shí)別和捕獲。
[0024](4)本發(fā)明同時(shí)結(jié)合了基于細(xì)胞密度和抗原-抗體特異性識(shí)別，區(qū)分、篩選腫瘤細(xì)胞的方法。
[0025](5)本發(fā)明初次使用優(yōu)化的Percoll細(xì)胞分離液，分選得到的純度極高的腫瘤細(xì)胞。
[0026](6)本發(fā)明在二氧化硅微球表面包裹了一層明膠，在收集到捕獲腫瘤細(xì)胞的二氧化硅微球后，通過(guò)明膠酶降解即可釋放腫瘤細(xì)胞，釋放的腫瘤細(xì)胞活性不受影響。
[0027](7)本發(fā)明可以對(duì)釋放下來(lái)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行再培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞傳代并未受到影響，且驗(yàn)證了腫瘤細(xì)胞相對(duì)血細(xì)胞極強(qiáng)的無(wú)限增殖能力。
[0028](8)本發(fā)明的分選過(guò)程具有簡(jiǎn)單、方便、易操作等優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1是本發(fā)明S12OGel微球捕獲、分選和釋放細(xì)胞的示意圖。
[0030]圖2是明膠、包裹明膠后的二氧化硅微球(S12OGel)和S12微球的表征結(jié)果圖，其中a)為傅里葉紅外圖，b)為XRD圖。
[0031]圖3是S12微球和S12OGel及其捕獲腫瘤細(xì)胞的TEM和SEM圖，其中a)為S12微球TEM圖，b)為S12OGel TEM圖，c)為S12微球表面捕獲腫瘤細(xì)胞的SEM圖，d)為S12OGel表面捕獲腫瘤細(xì)胞的SEM圖。
[0032]圖4是S12微球和S12OGel對(duì)腫瘤細(xì)胞系的捕獲效率結(jié)果圖。
[0033]圖5是結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)表面EpCAM和⑶146抗原表達(dá)的測(cè)試結(jié)果圖，其中a)為兩種腫瘤細(xì)胞表面EpCAM和CD146抗原表達(dá)的共聚焦熒光圖，b)為流式結(jié)果圖，c)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)果圖。
[0034]圖6是不同抗體修飾的S12OGel對(duì)腫瘤細(xì)胞系的捕獲效率比較圖，其中對(duì)照組為未修飾任何抗體的Si02@Gel。
[0035]圖7是不同抗體修飾的S12OGel對(duì)人造CTC血樣中腫瘤細(xì)胞的捕獲效率比較圖，其中對(duì)照組為未修飾任何抗體的S12OGel。
[0036]圖8是不同密度的Percoll溶液對(duì)腫瘤細(xì)胞的分選結(jié)果圖。
[0037]圖9是CTC-beads經(jīng)Percoll細(xì)胞分離液分選前后對(duì)照?qǐng)D，a)為S12OGel選擇性的捕獲血樣中腫瘤細(xì)胞的顯微鏡明場(chǎng)圖，b)為CTC-beads經(jīng)Percoll細(xì)胞分離液離心分選后的顯微鏡明場(chǎng)圖，其中黑色箭頭所指為捕獲住的腫瘤細(xì)胞。
[0038]圖10是麗P-9降解S12OGel表面的明膠及腫瘤細(xì)胞被釋放下來(lái)的效果圖，其中a)為S12微球表面化學(xué)修飾上明膠納米顆粒的TEM圖，b)為S12OGel表面明膠被MMP-9酶降解后的TEM圖，c)為S12OGel捕獲住腫瘤細(xì)胞的顯微鏡明場(chǎng)圖，d)為S12OGel表面明膠降解后被捕獲的腫瘤細(xì)胞被釋放下來(lái)的明場(chǎng)圖。
[0039]圖11是使用三色熒光對(duì)釋放下來(lái)的腫瘤細(xì)胞以及白細(xì)胞進(jìn)行鑒定的熒光顯微圖，其中a)為純化前人造CTC血樣中投擲的腫瘤細(xì)胞跟白細(xì)胞比例圖，b)為人造CTC血樣經(jīng)捕獲、分選純化釋放后腫瘤細(xì)胞跟白細(xì)胞的比例圖。
[0040]圖12是MMP-9酶降解CTC-beads釋放下來(lái)的腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)量總結(jié)圖。
[0041]圖13是使用流式細(xì)胞儀測(cè)定釋放前后腫瘤細(xì)胞活性結(jié)果圖，其中對(duì)照組為未經(jīng)染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷捕獲釋放流程前的細(xì)胞活性為94.9%，最終經(jīng)歷捕獲和釋放后的腫瘤活性為92.5%。
[0042]圖14是釋放下來(lái)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行再培養(yǎng)的顯微鏡下的視野圖，其中上面三張圖為明場(chǎng)圖，下面二張圖為暗場(chǎng)圖。
[0043]圖15是使用四色免疫化學(xué)熒光鑒定和計(jì)數(shù)癌癥患者外周血樣中捕獲到CTCs的結(jié)果圖，其中a)為CTC的熒光鑒定圖，b)為表面表達(dá)⑶146的CTC，c)為20例癌癥病人ImL血樣中捕獲到的CTC數(shù)量。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0045]本發(fā)明基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法的原理見(jiàn)圖1。在包裹明膠的二氧化娃微球Si02@Gel表面修飾上ant1-EpCAM和ant1-⑶146抗體，將修飾上雙抗的S12OGel與病人血樣混勻使微球捕獲住血樣中的腫瘤細(xì)胞，選擇性的增大腫瘤細(xì)胞密度(>1.2g/mL);將血樣滴加到密度為1.15g/mL的Percoll細(xì)胞分離液上層，離心分離后，所有的血細(xì)胞懸浮在Percoll溶液上層，捕獲腫瘤細(xì)胞的微球(CTC-beads)全部沉降在溶液底部，達(dá)到腫瘤細(xì)胞完全從血細(xì)胞中分離的目的;最后將分選提純后的CTC-beads使用MMP-9酶對(duì)二氧化硅微球表面的明膠進(jìn)行降解，CTCs從二氧化硅微球表面保持很高活性地脫離下來(lái)，得到完全純化的CTCs。
[0046]實(shí)施例1S12OGel的制備及包裹明膠前后捕獲腫瘤細(xì)胞效率的比較(I)S12OGel 的制備
稱(chēng)取0.1g尺寸為50μπι、密度為1.2g/mL的S12微球，經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇離心清洗3次后，移入錐形瓶?jī)?nèi)，加入50mL無(wú)水乙醇，置于加熱攪拌臺(tái)上;待溫度升高到600C后，滴加0.2mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，攪拌3h后在S12微球表面引入氨基得到氨基修飾的S12微球(NH2-S12)5NH2-S12分別用無(wú)水乙醇、去離子水離心洗滌3次后，重新懸浮在50mL的去離子水中，滴加0.2mL濃度為50%的戊二醛溶液，室溫下攪拌1h后在微球表面引入醛基得到醛基修飾的S12微球(CHO-S12) ； CHO-S12用去離子水離心洗滌3次后，加入40mL濃度為I%的明膠溶液，室溫下攪拌4h，去離子水離心洗滌去除未反應(yīng)完全的明膠溶液，最終得到表面均勻包裹一層明膠(厚度50nm左右)的二氧化娃微球(Si02@Gel)。
[0047 ]圖2a是明膠、包裹明膠后的二氧化硅微球(S i O2OGe I)和S i O2微球表面的官能團(tuán)的紅外光譜圖，其中S12OGel在波長(zhǎng)1635cm—1處有吸收帶，這個(gè)吸收帶屬于明膠N-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，而在S12表面無(wú)此吸收峰，說(shuō)明了S12OGel表面明膠的存在；圖2b是相應(yīng)的X射線衍射衍射圖譜，看出這三種材料都處于非晶的無(wú)定型結(jié)構(gòu)，其中S12OGel的衍射角(2Θ21.7° )相對(duì)S12的衍射角(2Θ 22.8° )有一個(gè)稍微偏移的角度并且衍射峰稍微尖銳一些。
[0048](2)Si02微球和S12OGel對(duì)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率將107-7細(xì)胞系使用01^]?配制成104/1^的濃度，加入1.5\105/1^ S12微球、S12OGel
微球，混勻，室溫孵育20min，樣品經(jīng)過(guò)脫水、固定以后，使用顯微鏡觀察比較細(xì)胞在S12和S12OGel微球上的貼附狀態(tài)。圖3為S12微球和S12OGel及其捕獲腫瘤細(xì)胞的TEM和SEM圖，S12微球通過(guò)化學(xué)鍵合上一層明膠之后，在光滑的S12微球表面形成了明膠的納米結(jié)構(gòu)。從細(xì)胞貼壁的SEM圖可以看出，光滑的S12微球襯底上細(xì)胞呈現(xiàn)球狀，可能不利于細(xì)胞捕獲在基底上;而在明膠納米顆粒基底上，細(xì)胞攤開(kāi)，伸出很長(zhǎng)的偽足，利于細(xì)胞爬片，可能會(huì)增加捕獲效率。
[0049]據(jù)此，進(jìn)一步研究微球表面納米結(jié)構(gòu)的形貌對(duì)腫瘤細(xì)胞捕獲效率的影響。將MCF-7和!1(:1'116兩種細(xì)胞系使用0腿1均配制成105/1^的濃度，分別加入1.5\105/11^ S12微球、S12OGel微球，混勻，室溫孵育20min后，顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4看出，相比S12微球，S12OGel微球?qū)δ[瘤細(xì)胞的捕獲效率提高了 25%，說(shuō)明微球表面的納米結(jié)構(gòu)對(duì)腫瘤細(xì)胞的捕獲具有增強(qiáng)作用。
[0050]實(shí)施例2腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的選擇
CTCs在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中會(huì)發(fā)生復(fù)雜的EMT過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，很多CTCs表面的EpCAM會(huì)低表達(dá)或者不表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞表面會(huì)高表達(dá)CD146抗原，因此為了提高CTCs的捕獲效率，選用抗體ant1-⑶146和ant1-EpCAM—起來(lái)開(kāi)展癌癥患者外周血中CTCs的捕獲工作。
[0051 ] 本實(shí)施例研究了乳腺癌細(xì)胞MCF-7和結(jié)直腸癌細(xì)胞HCTl 16表面CD146和EpCAM的表達(dá)。用嫁接熒光素的抗體PE-ant1-CD146和APC-ant1-EpCAM來(lái)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞相應(yīng)抗原的表達(dá)，使用共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，并且對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了 RT-PCR測(cè)序，具體方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
(I)共聚焦顯微鏡觀察
將15個(gè)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在共聚小皿上，37°C、5%⑶2條件下培養(yǎng)I天后，加入1yL PE-anti_CD146( 10yg/mL)和1yL APC-ant1-EpCAM(10yg/mL)室溫下孵育1min ； PBS清洗后，加入4%多聚甲醛(PFA)室溫下將細(xì)胞固定1min JpAlOlIL DAPIUyg/mL)溶液染色來(lái)識(shí)別細(xì)胞核;使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LCS SP9 STED Leica, Germany)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5a所示，兩種腫瘤細(xì)胞均表達(dá)CD146和EpCAM這兩種抗原。
[0052](2)流式分析
將16個(gè)MCF-7和此1116細(xì)胞使用含1% BSA的I3BS溶液清洗，避免后續(xù)細(xì)胞染料非特異性吸附在細(xì)胞表面;離心去除I3BS之后，將細(xì)胞重新懸浮在在101IL PBS溶液中，加入1yLPE-anti_CD146( 10yg/mL)和(或)10yL APC-anti_EpCAM( 10yg/mL)孵育1min;經(jīng)過(guò)PBS離心清洗去除多余的染色試劑，將細(xì)胞重新懸浮在在101IL PBS溶液中，使用流式細(xì)胞儀(Accuri C6, BD B1sciences)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)未染色的細(xì)胞將作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種腫瘤細(xì)胞都高表達(dá)⑶146和EpCAM這兩種抗原(圖5b)，同時(shí)從圖5b看出，有的腫瘤細(xì)胞只表達(dá)CD146或者EpCAM。依據(jù)上述流式結(jié)果，說(shuō)明基于腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的EpCAM開(kāi)展的免疫識(shí)別CTCs的技術(shù)，將會(huì)丟失表面不表達(dá)EpCAM的CTCs，而同時(shí)利用腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的⑶146來(lái)識(shí)別CTCs理論上會(huì)加強(qiáng)CTCs的捕獲效率。
[0053](3)RT-PCR
使用反車(chē)專(zhuān)錄聚合酉每鏈反應(yīng)(reverse transcript1n-polymerase chain react1n,RT-PCR)方法、實(shí)時(shí)焚光定量PCR系統(tǒng)(StepOnePlus system)和TaqMan基因表達(dá)分析(Applied B1systems)來(lái)分析腫瘤細(xì)胞表面蛋白(如⑶146，EpCAM和E-Cadherin)的表達(dá)，結(jié)果如圖5(:所示。其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH)幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，將高表達(dá)的GAPDH作為其他蛋白表達(dá)的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種腫瘤細(xì)胞表面⑶146和EpCAM這兩種抗原的表達(dá)屬于互補(bǔ)關(guān)系。
[0054]實(shí)施例3 S12OGel表面抗體的修飾
(I)使用PBS配制0.1M 的MES(2_morpholinoethanesulfonic acid )溶液，用MES溶液配制含4mg/mL EDC(N-(3-dimethylamino propyl-N’-ethylcar-bodiimide))和6mg/mL -NHS(N-hydroxysuc-cinimide)的溶液，將 100口1^數(shù)量為I.5 X 15 Si02@Gel懸浮液跟10yL上述EDC/NHS溶液在室溫下攪拌40min，激活明膠表面的羧基，PBS離心清洗3次。
[0055](2)使用PBS配制濃度為SOyg/mL的鏈霉親和素(streptavidin, SA)溶液，將上一步處理過(guò)的微球浸入101IL SA溶液中，室溫下反應(yīng)60min，PBS離心清洗3次。
[0056](3)使用I3BS配制濃度為lOyg/mL的生物素化ant1-EpCAM溶液和lOyg/mL的生物素化ant1-⑶146溶液，將上一步處理過(guò)的微球浸入lOOyL ant1-EpCAM溶液和/或lOOyL ant1-CD146溶液中，室溫下反應(yīng)2h，得到雙抗(ant1-EpCAM和ant1-CD146)修飾的Si02@Gel、ant1-EpCAM 修飾 S12OGel 和 ant1-CD146 修飾的 S12OGel。
[0057]實(shí)施例4不同抗體修飾的S12OGel捕獲腫瘤細(xì)胞效率的比較
(I)使用MCF-7和HCTl 16細(xì)胞系來(lái)研究加入的ant1-CD146抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞捕獲效率的影響。
[0058]將胰酶消化下來(lái)的腫瘤細(xì)胞系經(jīng)過(guò)DMEM多步稀釋得到濃度為15個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液。將未經(jīng)過(guò)抗體修飾的1.5 X 15 S12OGel和不同抗體修飾的1.5 X 15 S12OGel分別與ImL 15個(gè)/mL細(xì)胞懸液混合30min，在Olympus IX 71顯微鏡下對(duì)懸浮液中未被捕獲的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，歸一化計(jì)算不同抗體修飾的S i 02iGe I對(duì)腫瘤細(xì)胞的回收效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，表面同時(shí)修飾ant1-EpCAM和ant1-⑶146的S12OGel對(duì)腫瘤細(xì)胞的回收效率要比單獨(dú)使用一種抗體的回收效率要高，回收效率約為90%，預(yù)示了兩種抗體的結(jié)合在癌癥患者外周血內(nèi)加強(qiáng)CTCs捕獲的可行性。而不修飾任何抗體的S12OGe I捕獲效率〈4%，說(shuō)明修飾抗體的Si02iGe I對(duì)細(xì)胞的捕獲是特異性的非物理吸附。
[0059](2)在進(jìn)行臨床病人外周血樣中CTCs的捕獲實(shí)驗(yàn)之前，先將上述腫瘤捕獲條件應(yīng)用在人造血樣中腫瘤細(xì)胞的模擬捕獲實(shí)驗(yàn)中。
[0060]首先，將一定數(shù)量的經(jīng)過(guò)羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluorescein succinimidyl ester, CFSE, 5口8/!111^)預(yù)染色的]\^^'-7和!1(71116細(xì)胞加入11111^健康人外周血中，分別制備成腫瘤細(xì)胞濃度為20、50、100和250個(gè)/mL的人造CTC血樣。接著，將未經(jīng)抗體修飾的1.5 X 15 S12OGel以及不同抗體修飾的1.5 X 15 S12OGel分別加入ImL不同濃度的人造CTC血樣中，室溫下共孵育20min，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)不同S12OGel表面捕獲到的腫瘤細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，即使在人外周血復(fù)雜的微環(huán)境條件下，表面同時(shí)修飾ant1-EpCAM和ant1-⑶146的S12OGel依然能高效率(?85%)地回收血樣中的腫瘤細(xì)胞，并且同時(shí)使用兩種抗體比單獨(dú)使用任一抗體的捕獲效率要高。進(jìn)一步驗(yàn)證了病人血中雙抗對(duì)CTCs捕獲潛在的有效性。
[0061 ]實(shí)施例5 Percoll細(xì)胞分離液的制備和優(yōu)化
在一個(gè)固定的離心力和分離液粘度下，溶液中不同顆粒的沉降速率跟顆粒的尺寸和密度有關(guān)，使用一定濃度的分離液和選擇一個(gè)固定的離心力離心一段時(shí)間后，不同顆粒將會(huì)停留在分離液的不同層。由此本實(shí)施例研究了癌癥患者外周血中各種細(xì)胞在分離液中的分層情況，其中紅細(xì)胞的密度為1.10-1.15g/mL，單核細(xì)胞(包括白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)的密度為1.07-1.09g/mL。上面選擇了一種尺寸為50μηι、密度為1.2g/mL的二氧化娃微球包裹明膠、修飾上雙抗特異性地捕獲CTCs，將得到尺寸>50μπι、密度>1.2g/mL的CTC-bead，由于CTC-bead直徑和密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于白細(xì)胞，故CTC-bead沉降速率將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于白細(xì)胞。
[0062]從美國(guó)Sigma公司購(gòu)買(mǎi)的Percoll原液的密度是1.13g/mL;使用10倍濃縮的PBS(1.075g/mL)溶液以體積比1:9的比例稀釋Percoll原液，得到密度為1.077g/mL的較低密度的Per Co 11溶液;使用2.5M( 1.316g/mL )的蔗糖溶液以體積比1:9的比例濃縮Per co 11原液，得到密度為1.15的較高密度的Percoll溶液。
[0063]往裝有2mL不同密度(1.077g/L、1.13g/mL、1.15g/mL)的Percoll細(xì)胞分離液的15mL離心管中緩慢地滴加ImL上述完成腫瘤細(xì)胞捕獲的人造CTC血樣，400g離心力下離心1min，觀察細(xì)胞的沉降情況，結(jié)果見(jiàn)圖8。細(xì)胞分離液密度在1.077-1.13g/mL范圍內(nèi)(圖8b-
c)，離心后會(huì)有相當(dāng)大數(shù)量的紅細(xì)胞沉降在分離液底層，跟CTC-beads混在一起，降低了CTCs的分選純度。細(xì)胞分離液密度為1.15g/mL時(shí)，所有血細(xì)胞懸浮在Per co 11細(xì)胞分離液上層，CTC-beads沉降在最底層，徹底地跟所有的血細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)(圖8d)。
[0064]實(shí)施例6
往裝有2mL 1.15g/mL的Percoll細(xì)胞分離液的15mL離心管中緩慢地滴加ImL上述完成腫瘤細(xì)胞捕獲的人造CTC血樣，400g離心力下離心1min后，去除上清液和懸浮的血細(xì)胞，收集離心管底部的CTC-beads用顯微鏡觀察。如圖9顯示，顯微鏡明場(chǎng)下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)Percoll細(xì)胞分離液分選之后，CTC-beads完全跟血細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)。經(jīng)過(guò)熒光染色鑒定計(jì)算得到腫瘤細(xì)胞的回收純度達(dá)到>90%。
[0065]將經(jīng)I.15g/mL Percoll細(xì)胞分離液分選的CTC-beads加入到的0.5mL經(jīng)PBS配制的MMP-9(0.1 g/mL)溶液中，37°C、5% CO2條件下孵育20分鐘，使用SEM觀察微球表面形貌，直觀驗(yàn)證了微球表面的明膠納米顆粒能被MMP-9酶溶液降解(如圖10)。同時(shí)在X81顯微鏡下觀察到腫瘤細(xì)胞從微球表面脫離下來(lái)，釋放效率>90%。通過(guò)三色免疫化學(xué)熒光鑒定，計(jì)數(shù)釋放下來(lái)的腫瘤細(xì)胞數(shù)量和白細(xì)胞的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如圖11和圖12所示，腫瘤細(xì)胞純化效率極高為?90%。
[0066]微球表面包裹的明膠經(jīng)過(guò)200仙0.lmg/mL的MMP-9酶降解20min后，MCF-7細(xì)胞從微球表面釋放下來(lái)。將釋放下來(lái)的細(xì)胞收集起來(lái)，使用含1% BSA的PBS溶液清洗，避免后續(xù)細(xì)胞染料非特異性吸附在細(xì)胞表面。離心去除PBS之后，加入50仙濃度為Syg/mL的CFSE和50yL的碘化丙碇(PI，Syg/mL)孵育1min;經(jīng)過(guò)I3BS離心清洗去除多余的染色試劑，將細(xì)胞重新懸浮在在101IL的I3BS溶液中，使用流式細(xì)胞儀(Accuri C6, BD B1sciences)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)將胰酶剛消化下來(lái)的細(xì)胞和未經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞作為對(duì)照組。圖13顯示，經(jīng)歷捕獲-釋放過(guò)程的腫瘤細(xì)胞活性與剛被胰酶消化下來(lái)的細(xì)胞活性一樣。
[0067]接著將釋放下來(lái)的細(xì)胞收集起來(lái)放入96孔板內(nèi)37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間使用CFSE/PI染色進(jìn)行活性鑒定同時(shí)觀察釋放后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果見(jiàn)圖14，說(shuō)明細(xì)胞捕獲釋放過(guò)程并未對(duì)細(xì)胞造成損傷，并且也未對(duì)細(xì)胞周期活動(dòng)產(chǎn)出明顯的影響。
[0068]實(shí)施例7
在最優(yōu)化條件下，對(duì)取自乳腺癌和結(jié)直腸癌患者的外周血開(kāi)展了CTCs的捕獲與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
[0069]從20例患者(其中乳腺癌和結(jié)直腸癌患者各10例)靜脈血管處各抽取2mL的外周血，平均分為2份，一份加入1.5 X 15個(gè)經(jīng)ant1-EpCAM修飾的S12OGel，另一份加入1.5 X 15個(gè)經(jīng) ant1-EpCAM 和 ant1-CD146 修飾的 S12OGel,共孵育 20min 后，先后經(jīng)過(guò) 2mL 1.15g/mL?6代011細(xì)胞分離液40(^離心除去外周血細(xì)胞，2001^ 0.lmg/mL MMP-9酶溶液降解微球表面明膠使CTCs跟微球脫離。將釋放后收集起來(lái)的使用四色免疫化學(xué)熒光鑒定CTCs。
[0070]四色熒光鑒定:首先用ImL4%多聚甲醛(PFA)溶液進(jìn)行固定，靜置10分鐘，用PBS沖洗;接著加入0.1% Triton-XlOO溶液ImL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿孔，靜置10分鐘，用I3BS沖洗，在加入3% BSA溶液0.5mL對(duì)非特異性位點(diǎn)進(jìn)行包被，靜置30分鐘，用PBS沖洗;PE-ant1-CD146和APC-ant1-EpCAM，ant1-CD45-FITC和ant1-CK-PE熒光染料各0.1mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，并4°C下靜置過(guò)夜；最后經(jīng)DAPI染色后利用多通道熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行CTCs觀測(cè)和計(jì)數(shù)。ant1-⑶45-FITC在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)綠色熒光用于識(shí)別白細(xì)胞，ant1-CK-PE在綠光激發(fā)下發(fā)橙紅色熒光用于識(shí)別腫瘤細(xì)胞，DAPI在紫外光激發(fā)下呈藍(lán)色用于染細(xì)胞核。其中所有DAPI+/CD45-/EpCAM+或者DAPI+/CD45-/CD146+的細(xì)胞均視為CTC;而所有DAPI+/CD45+的細(xì)胞視為白細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示，從乳腺癌患者和結(jié)直腸癌患者的ImL外周血樣中，均捕獲到了CTCs，并且經(jīng) ant1-EpCAM 和 ant1-CD146 修飾的 S12OGel 比單獨(dú)修飾 ant1-EpCAM 的 S12OGel捕獲和鑒定到的CTCs要多，說(shuō)明了ant1-CD146能捕獲到患者血樣中低表達(dá)或者不表達(dá)EpCAM的CTCs，這些捕獲到的CTCs對(duì)臨床研究腫瘤迀移具有非常重要的研究?jī)r(jià)值。
[0071]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)配制密度為1.15-1.20g/mL的細(xì)胞分離液；所述的細(xì)胞分離液包括Ficol I或Percol I細(xì)胞分離液； (2)在粒徑為30-100μπι、密度為1.16-3g/mL的羥基微球表面化學(xué)鍵合上一層20-100nm厚的明膠，得到包裹明膠的羥基微球;所述的羥基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球； (3)在包裹明膠的輕基微球表面修飾上抗體ant1-EpCAM和ant1-CD146，得到雙抗體修飾的羥基微球； (4)將病人血樣與雙抗體修飾的羥基微球混勻孵育得混合樣品，將混合樣品滴加到1.15-1.20g/mL細(xì)胞分離液的上層，離心分離后，捕獲住腫瘤細(xì)胞的微球沉積在細(xì)胞分離液底部； (5)將收集的捕獲住腫瘤細(xì)胞的微球使用明膠酶降解微球表面明膠，釋放腫瘤細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟(I)中所述的細(xì)胞分離液為的密度為1.15g/mL的PercolI細(xì)胞分離液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:密度為1.15g/mL的Percoll細(xì)胞分離液通過(guò)使用1.316g/mL的蔗糖溶液以體積比1:9的比例濃縮密度為1.13g/mL的Percoll原液得到。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟(2)中所述的羥基微球是粒徑為50μπι、密度為1.2g/mL的二氧化硅微球。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:所述的羥基微球?yàn)槎趸栉⑶驎r(shí)，步驟(2)包括如下步驟: 1)將二氧化硅微球加入到無(wú)水乙醇中，加熱升溫至60°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷磁力攪拌2-4h，然后經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇、去離子水離心沖洗后得到了氨基修飾的二氧化硅微球； 2)將氨基修飾的二氧化硅微球重新分散到去離子水中，加入戊二醛，室溫下攪拌5-20h，然后經(jīng)過(guò)去離子水離心沖洗后得到了醛基修飾的二氧化硅微球； 3)將醛基修飾的二氧化硅微球再次分散到明膠溶液，室溫下攪拌3-12h后用去離子水離心洗滌去除未反應(yīng)完全的明膠溶液得到表面均勻包裹上一層明膠的二氧化硅微球。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟(3)包括如下步驟: 1)使用EDC/NHS對(duì)包裹明膠的羥基微球表面羧基進(jìn)行活化30-120min，使用I3BS離心清洗3次； 2)將I)處理的微球浸入到鏈霉親和素溶液中，反應(yīng)40-120min在微球表面引入鏈霉親和素，PBS離心清洗3次； 3)將2)處理的微球加入到生物素化的ant1-EpCAM和ant1-⑶146抗體溶液中，室溫下反應(yīng)l-3h，用PBS漂洗得到雙抗體修飾的羥基微球。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟(4)混合樣品中雙抗體修飾的羥基微球的數(shù)量為1.5 X 105/mL。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟(4)中離心所用離心力為40-400g。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟(5)中所述的明膠酶為基質(zhì)金屬蛋白酶9。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于雙抗及細(xì)胞密度的高特異性高純度的腫瘤細(xì)胞分選方法，其特征在于:包括對(duì)收集的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行活性鑒定步驟。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK105950558SQ201610366839
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】趙興中, 黃琴琴, 蔡博
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)