一種生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物菌劑，所述菌劑包括重量百分比為5～10％的PGPR菌液，所述菌劑中含有PGPR活菌量不少于1×1010CFU/ml。所述菌劑能夠制成生物發(fā)酵菌肥和種衣劑，本發(fā)明的生物菌劑，不僅對(duì)于黃瓜枯萎病等真菌病害及黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病等細(xì)菌病害具有良好的防效，還可以改善連作條件下蔬菜的生長(zhǎng)環(huán)境，增強(qiáng)蔬菜對(duì)土壤中難溶性磷的吸收和利用。從而有助于實(shí)現(xiàn)蔬菜的高產(chǎn)、安全、無公害生產(chǎn)。
【專利說明】
一種生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及到微生物菌劑，具體涉及主要成分是PGPR的生物 菌劑，并且還涉及生物菌劑包括生物發(fā)酵菌肥和種衣劑的制備方法，還涉及到生物菌劑的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著設(shè)施連作年限的增加，連作障礙日趨嚴(yán)重，土傳病原菌不斷積累，并出現(xiàn)了土 壤次生鹽漬化，養(yǎng)分失衡，重金屬污染，土壤微生態(tài)環(huán)境惡化等諸多問題，已嚴(yán)重影響了蔬 菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，連作障礙已成為制約蔬菜生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要因素，因此創(chuàng)造有利于 蔬菜生長(zhǎng)的土壤環(huán)境已成為一個(gè)亟待解決的問題。
[0003] 乙烯是植物體內(nèi)五大內(nèi)源激素之一，在較低的濃度下表現(xiàn)出明顯的生理作用，即 抑制莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、促進(jìn)莖或根的增粗和使莖橫向生長(zhǎng)三重反應(yīng)。植物一生大部分生長(zhǎng)發(fā) 育階段需要乙烯的濃度比較低，一般植物組織中乙烯含量不超過O.llpmol，只有在快要成 熟和衰老階段才合成大量的乙烯。但是在土壤鹽漬化、重金屬超標(biāo)、干旱及病原菌侵染條件 下，植物體內(nèi)乙稀合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)大量合成乙稀，持續(xù)大量合成的乙 烯可以抑制根系伸長(zhǎng)，阻礙根系生長(zhǎng)。
[0004] PGPR是根際周圍土壤中的一群自生細(xì)菌，可以通過產(chǎn)生ACC脫氨酶將乙烯合成的 直接前體ACC降解為α-丁酮酸和氨，以促進(jìn)植物根的伸長(zhǎng)，來吸取更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水分等。 Mayak等檢測(cè)無色桿菌對(duì)番茄根系的促生作用，結(jié)果顯示接種無色桿菌的番茄根系在鹽濃 度為120mM時(shí)伸長(zhǎng)了32.8_，而未接種的為27.4mm，由此可見，ACC活性菌在高鹽環(huán)境條件下 能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。滕松山等從鹽生植物堿蓬內(nèi)分離到的ACC脫氨酶活性內(nèi)生細(xì)菌SS12對(duì) 蘿卜枯萎病菌和黃瓜枯萎病菌具有拮抗作用。劉維紅等采用富集篩選法，以ACC為唯一氮源 從不同蔬菜植株根圍中采集土樣，篩選出46株ACC脫氨酶活性細(xì)菌，其中XG32菌株對(duì)番茄有 明顯的促生作用，對(duì)辣椒疫霉等植物病原體有一定的抑制作用。
[0005] 黃瓜枯萎病是黃瓜種植過程中發(fā)生的一種常見土傳病害，多在開花結(jié)果后陸續(xù)發(fā) 病，被害株最初表現(xiàn)為部分葉片或植株的一側(cè)葉片中午萎蔫下垂，似缺水狀，早晚可以恢 復(fù)，以后萎蔫葉片不斷增多，逐漸遍及全株，早晚不能復(fù)原，并很快枯死;黃瓜炭疽病近年來 發(fā)生不斷趨重，是由引進(jìn)的種子帶菌所造成的，春秋兩季均有發(fā)生，防治難度較大，對(duì)生產(chǎn) 影響巨大。黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病是近兩年黃瓜生產(chǎn)上新發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重細(xì)菌性病害，目前市場(chǎng) 上的防治細(xì)菌病害的化學(xué)殺菌劑和農(nóng)用抗生素對(duì)該病害的防治效果均不理想，亟待開發(fā)防 治該種病害的藥劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種生物菌劑，該生物菌劑主要成分是PGPR，能夠有效的 防治黃瓜枯萎病、黃瓜炭疽病、黃瓜細(xì)菌性角斑病和黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病。
[0007] 本發(fā)明還提供了該生物菌劑的制備方法，通過制成生物發(fā)酵菌肥和種衣劑來有效 的防治黃瓜枯萎病、黃瓜炭疽病、黃瓜細(xì)菌性角斑病和黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0009] 一種生物菌劑，所述菌劑包括重量百分比為5~10%的PGPR菌液，所述菌劑中含有 PGPR活菌量不少于1 X 101QCFU/ml。
[0010]優(yōu)選地，所述PGPR為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌液。
[0011] 其中，所述菌劑可以制成生物發(fā)酵菌肥，所述菌劑由以下重量份的成分組成:PGPR 菌液5~10份、食用菌菌糠50~70份、黃粉蟲蟲糞5~25份、黃腐酸1~5份、FeS〇4 · 7H20 0.01 ~0.02份和ZnS〇4〇. 01~0.03份，其中，所述食用菌菌糠可以用草炭或生物炭代替；
[0012] 上述生物菌劑(生物發(fā)酵菌肥)的制備方法，包括如下步驟：
[0013] (1)首先制備PAF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)液和TSB液體培養(yǎng)基，所述PAF培養(yǎng)基配方為：蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培養(yǎng)液配方 為:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸銨2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4.7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg，Mo0310yg，pH值為7.2; 所述TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值為7.5;
[0014] (2)采集海邊鹽漬植物的根際土壤，稱取lg根際土放入含50ml PAF培養(yǎng)液的三角 瓶中，25°C或30°C、振蕩速度為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，富集培養(yǎng)4d后，再轉(zhuǎn)移lml 菌懸液至50ml ADF培養(yǎng)液中，繼續(xù)25°C或30°C、振蕩速度為200r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h， 用于含ACC脫氨酶活性細(xì)菌的分離純化，梯度稀釋ADF培養(yǎng)液中菌懸液，涂布于ADF固體平板 上，在溫度為28 °C的恒溫箱中培養(yǎng)72h，劃線分離，純化后-80 °C保存；
[0015] (3)將純化鑒定后的PGPR菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，溫度為28~30°C，振蕩速 度為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定菌懸液0D值達(dá)到0.8以上，菌量不少于101()CFU/ml 后，用食用菌菌糠吸附，然后再分別加入黃粉蟲蟲糞、黃腐酸、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20， 并且將含水量調(diào)成60 %后用塑料薄膜覆蓋進(jìn)行發(fā)酵直到黃粉蟲蟲糞完全腐熟，用攪拌機(jī)攪 拌均勻，裝袋，即得生物發(fā)酵菌肥。
[0016]所述生物菌劑還可以制成種衣劑，所述菌劑由以下重量份的成分組成:PGPR菌液 50~100份、營(yíng)養(yǎng)載體6~14份、娃藻土600~800份、羧甲基纖維素鈉10~20份、木質(zhì)素磺酸 鈉60~80份、聚乙烯醇10~20份、FeS〇4 · 7H20 1~2份和ZnS〇4 · 7H20 1~3份，所述營(yíng)養(yǎng)載 體由腐殖酸1~2份、谷氨酸2~5份和玉米粉3~7份組成，所述菌即中含有PGPR活菌量為1~ 2X10 10CFU/ml〇
[0017]上述生物菌劑(種衣劑)的制備方法，包括如下步驟：
[0018] (1)首先制備PAF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)液和TSB液體培養(yǎng)基，所述PAF培養(yǎng)基配方為：蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培養(yǎng)液配方 為:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸銨2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4*7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg和Mo0310yg，pH值為7.2; 所述TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值為7.5;
[0019] (2)將PGPR菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，在溫度為28~30°C、振蕩速度為200r/ min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定菌懸液0D值達(dá)到0.8以上、菌量為1~2 X 101()CFU/ml時(shí)，用所 述營(yíng)養(yǎng)載體和滅菌后的硅藻土進(jìn)行吸附，然后分別加入所述羧甲基纖維素鈉粘著劑、木質(zhì) 素磺酸鈉分散劑、聚乙烯醇成膜劑、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,混合均勻后即得種衣劑。
[0020] 所述種衣劑在使用時(shí)與種子混合攪拌均勻，使種衣劑均勻包裹在種子表面，完成 種衣劑對(duì)種子的丸化包衣處理，所述種衣劑與種子的重量比為1:10。
[0021] 所述生物菌劑用于防治黃瓜枯萎病、黃瓜炭疽病、黃瓜細(xì)菌性角斑病和/或黃瓜細(xì) 菌性莖軟腐病。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌、黃瓜炭疽病菌、黃瓜細(xì)菌性角 斑病均具有較好的防治效果，制成的種衣劑在田間防治效果試驗(yàn)中，對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐 的防治效果為62.67 %。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的生物菌劑，不僅對(duì)于黃瓜枯萎病等真菌病害及黃 瓜細(xì)菌性莖軟腐病等細(xì)菌病害具有良好的防效，還可以改善連作條件下蔬菜的生長(zhǎng)環(huán)境， 增強(qiáng)蔬菜對(duì)土壤中難溶性磷的吸收和利用。從而有助于實(shí)現(xiàn)蔬菜的高產(chǎn)、安全、無公害生 產(chǎn)。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明PGPR革蘭氏染色效果圖；
[0024] 圖2是引物27f/1492r擴(kuò)增的細(xì)菌16SrDNA圖譜；
[0025] 圖3是不同菌肥對(duì)黃瓜枯萎病防治效果對(duì)比圖；
[0026] 圖4不同藥物對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病防治效果對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] 下面將通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。提供這些實(shí)施例是為了能夠更 透徹地理解本發(fā)明，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。
[0030] 如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的"包含"或"包括"為一開放式用語，故應(yīng) 解釋成"包含但不限定于"。說明書后續(xù)描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃 以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán) 利要求所界定者為準(zhǔn)。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] -種生物菌劑（生物發(fā)酵菌肥），所述菌劑由以下重量份的成分組成：PGPR菌液5 份、食用菌菌糠70份、黃粉蟲蟲糞22份、黃腐酸2.96份^504*7出0 0.01份和21^040.03份， 所述嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌液含有活菌量不少于l〇1()CFU/ml。
[0033] 上述生物菌劑(生物發(fā)酵菌肥)的制備方法，包括如下步驟：
[0034] (1)首先制備PAF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)液和TSB液體培養(yǎng)基，所述PAF培養(yǎng)基配方為：蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培養(yǎng)液配方 為:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸銨2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4.7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg，Mo0310yg，pH值為7.2; 所述TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值為7.5;
[0035] (2)采集海邊鹽漬植物蘆葦、艾蒿、蒼耳或堿蓬的根際土壤，稱取lg根際土放入含 50mlPAF培養(yǎng)液的三角瓶中，25°C、振蕩速度為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，富集培養(yǎng)4d 后，再轉(zhuǎn)移lml菌懸液至50ml ADF培養(yǎng)液中，繼續(xù)25°C、振蕩速度為200r/min條件下振蕩培 養(yǎng)48h，用于含ACC脫氨酶活性細(xì)菌的分離純化，梯度稀釋ADF培養(yǎng)液中菌懸液，涂布于ADF固 體平板上，在溫度為28°C的恒溫箱中培養(yǎng)72h，劃線分離，純化后-80°C保存；
[0036] (3)將純化鑒定后的PGPR菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，溫度為28~30°C，振蕩速 度為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定菌懸液0D值達(dá)到0.8以上，菌量不少于101()CFU/ml 后，用食用菌菌糠吸附，然后再分別加入黃粉蟲蟲糞、黃腐酸、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20， 并且將含水量調(diào)成60 %后用塑料薄膜覆蓋進(jìn)行發(fā)酵直到黃粉蟲蟲糞完全腐熟，用攪拌機(jī)攪 拌均勻，裝袋，即得生物發(fā)酵菌肥。
[0037] 實(shí)施例2
[0038] 一種生物菌劑(生物發(fā)酵菌肥），所述菌劑包括重量百分比為8 %的PGPR菌液。所述 PGPR菌液為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌液。所述菌劑由以下重量份的成分組成:嗜麥芽寡養(yǎng)單胞 菌菌液8份、草炭67份、黃粉蟲蟲糞20份、黃腐酸4.97份、？6304?7出0 0.02份和2113040.01 份，所述嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌液含有活菌量不少于l〇1()CFU/ml。
[0039] 上述生物菌劑(生物發(fā)酵菌肥)的制備方法，包括如下步驟：
[0040] (1)首先制備PAF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)液和TSB液體培養(yǎng)基，所述PAF培養(yǎng)基配方為:蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培養(yǎng)液配方 為:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸銨2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4.7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg，Mo0310yg，pH值為7.2; 所述TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值為7.5;
[0041] (2)采集海邊鹽漬植物蘆葦、艾蒿、蒼耳或堿蓬的根際土壤，稱取lg根際土放入含 50mlPAF培養(yǎng)液的三角瓶中，30°C、振蕩速度為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，富集培養(yǎng)4d 后，再轉(zhuǎn)移lml菌懸液至50ml ADF培養(yǎng)液中，繼續(xù)30°C、振蕩速度為200r/min條件下振蕩培 養(yǎng)48h，用于含ACC脫氨酶活性細(xì)菌的分離純化，梯度稀釋ADF培養(yǎng)液中菌懸液，涂布于ADF固 體平板上，在溫度為28°C的恒溫箱中培養(yǎng)72h，劃線分離，純化后-80°C保存；
[0042] (3)將純化鑒定后的PGPR菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，溫度為28~30°C，振蕩速 度為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定菌懸液0D值達(dá)到0.8以上，菌量不少于101()CFU/ml 后，用食用菌菌糠吸附，然后再分別加入黃粉蟲蟲糞、黃腐酸、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20， 并且將含水量調(diào)成60 %后用塑料薄膜覆蓋進(jìn)行發(fā)酵直到黃粉蟲蟲糞完全腐熟，用攪拌機(jī)攪 拌均勻，裝袋，即得生物發(fā)酵菌肥。
[0043] 實(shí)施例3
[0044] -種生物菌劑(種衣劑），所述菌劑由以下重量份的成分組成:PGPR菌液61份、營(yíng)養(yǎng) 載體14份、硅藻土800份、羧甲基纖維素鈉20份、木質(zhì)素磺酸鈉80份、聚乙烯醇20份、FeS04· 7H20 2份和ZnS〇4?7H20 3份，所述營(yíng)養(yǎng)載體由腐殖酸2份、谷氨酸5份和玉米粉7份組成。
[0045]上述生物菌劑(種衣劑)的制備方法，包括如下步驟：
[0046] (1)首先制備PAF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)液和TSB液體培養(yǎng)基，所述PAF培養(yǎng)基配方為:蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培養(yǎng)液配方 為:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸銨2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4*7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg和Mo0310yg，pH值為7.2; 所述TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值為7.5;
[0047] (2)將PGPR菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，在溫度為28~30°C、振蕩速度為200r/ min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定菌懸液0D值達(dá)到0.8以上、菌量為1~2 X 101()CFU/ml時(shí)，用所 述營(yíng)養(yǎng)載體和滅菌后的硅藻土進(jìn)行吸附，然后分別加入所述羧甲基纖維素鈉粘著劑、木質(zhì) 素磺酸鈉分散劑、聚乙烯醇成膜劑、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,混合均勻后即得種衣劑。
[0048] 所述種衣劑在使用時(shí)與種子混合攪拌均勻，使種衣劑均勻包裹在種子表面，完成 種衣劑對(duì)種子的丸化包衣處理，所述種衣劑與種子的重量比為1:10。
[0049] 實(shí)施例4
[0050] -種生物菌劑(種衣劑），所述菌劑由以下重量份的成分組成：嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 菌液100份、營(yíng)養(yǎng)載體10份、硅藻土787份、羧甲基纖維素鈉15份、木質(zhì)素磺酸鈉70份、聚乙烯 醇15份、FeS〇4 · 7H20 1份和ZnS〇4 · 7H20 2份，所述營(yíng)養(yǎng)載體由腐殖酸2份、谷氨酸3份和玉 米粉5份組成。
[0051 ]上述生物菌劑(種衣劑)的制備方法，包括如下步驟：
[0052] (1)首先制備PAF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)液和TSB液體培養(yǎng)基，所述PAF培養(yǎng)基配方為：蛋 白胨l〇g，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4l. 5g，K2HP〇4l. 5g和甘油10ml，pH值7.5; ADF培養(yǎng)液配方 為:KH2PO44 · Og，Na2HP〇46 · Og，MgS〇4 · 7H2〇 0 · 2g，葡萄糖2 · Og，葡萄糖酸2 · Og，梓檬酸2 · Og，硫 酸銨2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!120 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4*7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg和Mo0310yg，pH值為7.2; 所述TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇42.5g， 其pH值為7.5;
[0053] (2)將嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，在溫度為28~30°C、振蕩 速度為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定菌懸液0D值達(dá)到0.8以上、菌量為1~2X 101()CFU/ml時(shí)，用所述營(yíng)養(yǎng)載體和滅菌后的硅藻土進(jìn)行吸附，然后分別加入所述羧甲基纖維 素鈉粘著劑、木質(zhì)素磺酸鈉分散劑、聚乙烯醇成膜劑、FeS〇4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,混合均勻 后即得種衣劑。所述種衣劑在使用時(shí)與種子混合攪拌均勻，使種衣劑均勻包裹在種子表面， 完成種衣劑對(duì)種子的丸化包衣處理，所述種衣劑與種子的重量比為1:10。
[0054]為了證明本發(fā)明的有效性，
【申請(qǐng)人】進(jìn)行了如下試驗(yàn)：
[0055] 一、PGPR菌的分離、純化和鑒定
[0056]含ACC脫氨酶活性PGPR的富集培養(yǎng):采集海邊鹽漬植物蘆葦、艾蒿、蒼耳或堿蓬的 根際土壤，稱取lg根際土于含50ml PAF培養(yǎng)液的250ml三角瓶中，25°C或30°C、200r/min振 蕩培養(yǎng)24h。第2d，轉(zhuǎn)移1 ml菌懸液至另一50mlPAF培養(yǎng)液中，同等條件下培養(yǎng)24h。第3d，從 PAF培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移lml菌懸液至50ml DF培養(yǎng)液中，相同條件下培養(yǎng)24h。第4d，再轉(zhuǎn)移lml菌 懸液至50mlADF培養(yǎng)液中，相同條件下培養(yǎng)48h，用于含ACC脫氨酶活性細(xì)菌的分離純化。梯 度稀釋（10-3-ΚΓ 7次方稀釋)ADF培養(yǎng)液中菌懸液，涂布于ADF固體平板，28 °C恒溫箱中培養(yǎng) 72h，劃線分離，純化后-80°C保存。
[0057]將純化的菌株按照東秀珠和蔡妙英編《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（1999)和中科院 微生物所編著《一般細(xì)菌常用鑒定方法》（1978)等介紹的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征和生理生化 特征的測(cè)定。菌株菌體桿狀，（0.3~0.5)μηιΧ (1.3~1.5)μηι，革蘭氏染色呈陰性，無莢膜，無 芽孢，有運(yùn)動(dòng)能力，數(shù)根鞭毛;菌落呈圓形，淡綠色，表面光滑、濕潤(rùn)、隆起(如圖1所示）。 [0058]采用細(xì)菌提取試劑盒（天根生物科技有限公司）提取細(xì)菌基因組DNA，以DNA為模 板，用通用引物27付卩14921對(duì)16510嫩序列擴(kuò)增。？〇?反應(yīng)體系為?代11^12.5以1^，1(^111〇1^· L一1引物各lyL，模板DNA lyL，以ddH20補(bǔ)足至25μΙ^ΡΟ?反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min;94°C變性 30s;55°C退火lmin;72°C延伸2min;35個(gè)循環(huán)，72°C后延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝 膠電泳分離鑒定，PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測(cè)序(如圖2所示）。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后，取一完 整序列在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)，參考相似度、同源性最高的菌株對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行分類鑒 定。經(jīng)過比對(duì)，本發(fā)明的菌株與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)相似度 為100%，可以確定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。
[0059]二、PGPR菌株產(chǎn)生ACC脫氨酶活性測(cè)定
[0060]將純化后的各菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，4°C， 5000rpm離心10min收集菌體，棄上清，用DF液體培養(yǎng)基洗滌離心兩次。將菌體重懸浮于ADF 液體培養(yǎng)基，28°C，200r/min培養(yǎng)24h，以誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶。參照Honma和Saleh方法測(cè)定 八(^脫氨酶活性。經(jīng)測(cè)定嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(3丨61101：1'0卩1101]101^3 11^11：0卩11；[1丨3)的4(^脫氨酶 活性在56~324nmol a-丁酮酸/mg/h之間，其中本發(fā)明制得的菌株ACC脫氨酶活性最高，為 324nmol a_丁酬酸/mg/h0 [0061 ] 三、PGPR耐鹽性測(cè)定
[0062]在LB培養(yǎng)基中，分別加入2%、5%、7%不同濃度的似(：1，取培養(yǎng)2411的幼齡菌種液 接種，28°C培養(yǎng)3d和7d，與未接種的對(duì)照管相比，目測(cè)生長(zhǎng)情況，如生長(zhǎng)則為陽性。結(jié)果表明 本發(fā)明菌株在含鹽量為2%、5%、7%的LB培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。
[0063]四、PGPR對(duì)病原菌的生物活性測(cè)定
[0064] 通過牛津杯法測(cè)定不同PGPR發(fā)酵液對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌、黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病 菌2種病原細(xì)菌和黃瓜枯萎病菌、黃瓜炭疽病菌2種病原真菌的抑菌活性。將活化后的病菌 和不同的PGPR分別接種于NB液體培養(yǎng)基中，于28 °C、126rpm條件下振蕩培養(yǎng)24~36h，然后 利用紫外可見分光光度計(jì)(波長(zhǎng)650nm)測(cè)量吸光度值后，調(diào)整細(xì)菌懸液的0D 65Q為0.8，濃度 約109cfu/ml。吸取100yL病原細(xì)菌懸浮液于NA平板表面，用涂布器涂勻，在每個(gè)平板上放置 3個(gè)牛津杯，往其中加入100yL的供試PGPR發(fā)酵液，每個(gè)處理重復(fù)3次，以加入3 %中生菌素可 濕性粉劑600倍液和空白培養(yǎng)基為對(duì)照，28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48~72h后測(cè)量抑菌圈直 徑。
[0065]真菌用打孔器(d = 0.6mm)在培養(yǎng)3d的菌落上打菌餅接種于PDA平板中央。有菌絲 的一面朝下，培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)皿的上下左右距離中心30mm處以十字交叉均勻旋轉(zhuǎn)4個(gè)牛 津杯，注入芽PGPR發(fā)酵液50yL，28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對(duì)照菌落菌絲即將布滿整個(gè)平板 時(shí)，測(cè)量菌落的直徑，按下面公式計(jì)算抑菌率(劉永峰等，2007)。
[0067]從表1和表2中可以看出，部分菌株如CRG-2菌株的發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌 率為85.96 %，對(duì)黃瓜炭疽病菌的抑菌率為60.24% ; JPG-4對(duì)黃瓜炭疽病菌的抑菌率為 60.24% ; AHG-6、LWG-2對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌率為85.96% ; CRG-8對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌 和黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病菌的抑菌圈直徑分別為47 · 00mm和46 · 67mm; LWG-5對(duì)黃瓜細(xì)菌性角 斑病菌的抑菌圈直徑為20mm;CRG-2對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的抑菌圈直徑為15.33mm;AHG-5 對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病菌的抑菌圈直徑為48.33mm;CRG-2對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病菌的抑菌 圈直徑為48.33_。可見所分離出來的菌株對(duì)病原真菌具有一定的抑制作用。
[0068] 表1 PGPR對(duì)病原真菌的抑菌效果
[0071] 注:表中AHG-1~AHG-6是從艾蒿根際土壤中分離出來的PGPR菌株，LWG-1~LWG-6 是從蘆葦根際土壤中分離出來的PGPR菌株，CRG-1~CRG-5和CRG-8是從蒼耳根際土壤中分 離出來的PGPR菌株，JPG-4、JPG-10、JPG-11是從堿蓬根際土壤中分離出來的PGPR菌株。下 同。
[0072] 表2 PGPR對(duì)病原細(xì)菌的抑菌效果
[0074] 五、PGPR產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA)的能力
[0075]參照Brie (1991)方法，將LB培養(yǎng)基分裝于試管中滅菌后，加入無菌色氨酸溶液 lml，接入24h培養(yǎng)菌液0. lml，培養(yǎng)12h后，吸取2ml菌液加入4ml的顯色液，觀察顏色變化，確 定PGPR產(chǎn)生IAA能力。最終鑒定結(jié)果是確定該菌株產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA)。
[0076]六、生物發(fā)酵菌肥的使用
[0077]將本發(fā)明的生物發(fā)酵菌肥與育苗基質(zhì)按不同比例施用后，測(cè)定黃瓜幼苗生長(zhǎng)性狀 (見表3)。人工接種尖孢鐮刀菌黃瓜專化型，調(diào)查發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)及測(cè)定菌肥對(duì)黃瓜 枯萎病的防治效果。
[0078]黃瓜枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：
[0079] 0級(jí)地上、地下部均無癥狀；
[0080] 1級(jí)子葉萎蔫或真葉輕微萎蔫，須根10%以下變褐；
[0081 ] 2級(jí)子葉較重萎蔫，主根變褐或須根10 %~50 %變褐；
[0082] 3級(jí)子葉及真葉均萎蔫，主根1/2變褐；
[0083] 4級(jí)主根大部分變褐及地上部萎蔫或枯死。

[0086] 表3菌肥對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)性狀的影響
[0087]
[0088]
[0089]從表3可以看出，在菌肥與育苗基質(zhì)按不同比例混合后，均能促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)， 提高壯苗指數(shù)。黃瓜株高在菌肥與基質(zhì)的比例為7:3時(shí)最高，為61.6cm;黃瓜莖粗在以9:1時(shí) 最粗，為0.65cm，和對(duì)照相比差異不顯著，與1:9中莖粗差異極顯著，為0.48cm，與3:7、4:6和 2:8差異顯著;黃瓜根長(zhǎng)在比例為9:1時(shí)最長(zhǎng)，為32.25cm，與其他處理的根長(zhǎng)差異達(dá)到極顯 著水平，與5:5和6:4根長(zhǎng)差異顯著;黃瓜葉片數(shù)在比例為6:4時(shí)最多，為6個(gè)，與對(duì)照2、9:1、 3:7、2:8和1:9中葉片數(shù)差異極顯著，與對(duì)照1和8:2葉片數(shù)差異顯著;黃瓜須根數(shù)在1:9時(shí)最 多，為28個(gè)，與對(duì)照2、5:5、6 :4、8:2、3:7、4:6和7:3中須根數(shù)差異極顯著，與2:8須根數(shù)差異 顯著;黃瓜第二片葉葉面積在復(fù)合基質(zhì)與土的比例為9:1時(shí)最大，為180.28cm 2,與其他比例 的育苗基質(zhì)相比葉面積差異性均達(dá)到極顯著水平;黃瓜第三片葉葉面積的比例為6:4時(shí)最 大，為179.37cm 2,與其他比例的復(fù)合基質(zhì)葉面積差異性均到達(dá)極顯著水平。綜合壯苗指數(shù) 來看，菌肥與育苗基質(zhì)的比例為9:1時(shí)壯苗指數(shù)最大，最適合黃瓜幼苗的生長(zhǎng)。
[0090] 不同菌肥對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表4和圖3,從表4可以看出， 本發(fā)明菌肥、芽孢桿菌菌肥、粘帚霉菌肥和木霉菌肥對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果分別為 70.24%、53.57%、64.29%和50.0%，從圖3中也可以看出，使用本發(fā)明菌肥對(duì)黃瓜枯萎病 的防治效果最佳。
[0091] 表4菌肥對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果
[0094]七、種衣劑的使用
[0095]將本發(fā)明的種衣劑與種子攪拌均勻，使孢子粉劑均勻包衣在種子表面，即完成生 防菌對(duì)黃瓜種子的丸化包衣處理，種衣劑與種子的重量比為1: l〇(w/w)。
[0096]將不同的化學(xué)藥劑對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的田間藥效進(jìn)行對(duì)比，通過9種化學(xué)藥 劑和2種生防菌劑對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的田間藥效看出：本實(shí)驗(yàn)所用的生防菌劑和市售 殺菌劑對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的防治效果都在65 %以下。其中溴硝醇、噻菌銅、氫溴異氰尿 酸、乙蒜素和芽孢桿菌和本發(fā)明的種衣劑防效較高，分別為63.43%、62.67%、63.43%、 61.60%、60· 00%和62.67% (見表5和圖4)。
[0097] 表5不同藥物對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的田間藥效
[0099]所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說 明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均 同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生物菌劑，其特征在于，所述菌劑包括重量百分比為5~10%的PGPR菌液，所述 菌劑中含有PGPR活菌量不少于I X 101()CFU/ml。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物菌劑，其特征在于，所述PGPR菌液為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌 液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物菌劑，其特征在于，所述菌劑由以下重量份的成分組成： PGPR菌液5~10份、食用菌菌糠50~70份、黃粉蟲蟲糞5~25份、黃腐酸1~5份、FeS〇4 · 7H20 0.01 ~0.02份和ZnS〇4 · 7H20 0.01~0.03份。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物菌劑，其特征在于，所述食用菌菌糠可以用草炭或生物炭 代替。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物菌劑，其特征在于，所述菌劑由以下重量份的成分組成： PGPR菌液50~100份、營(yíng)養(yǎng)載體6~14份、硅藻土600~800份、羧甲基纖維素鈉10~20份、木 質(zhì)素磺酸鈉60~80份、聚乙烯醇10~20份、FeS〇4 · 7H20 1~2份和ZnS〇4 · 7H20 1~3份，所 述營(yíng)養(yǎng)載體由腐殖酸1~2份、谷氨酸2~5份和玉米粉3~7份組成，所述菌液中含有PGPR活 菌量為 1 ~2 X 101()CFU/ml。6. -種如權(quán)利要求3或4所述的生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下 步驟： (1) 首先制備PAF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)液和TSB液體培養(yǎng)基，所述PAF培養(yǎng)基配方為：蛋白胨 IOg，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4 1 · 5g，K2HPO4 1 · 5g和甘油IOml，pH值7 · 5; ADF培養(yǎng)液配方為： KH2PO4 4.0g，Na2HP〇4 6.0g，MgS〇4.7H2〇 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖0|2.Og，梓檬0|2.Og，硫 酸銨2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!1 20 111^，!138031(^8， MnS〇4.H2〇11.19yg，ZnS〇4*7H2〇124.6yg，CuS〇4.5H2〇 78.22yg，Mo〇3lOyg，pH{tS7.2; 所述TSB液體培養(yǎng)基的配方為：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2耶〇4 2.5g，其 pH 值為 7.5; (2) 采集海邊鹽漬植物的根際土壤，稱取Ig根際土放入含50ml PAF培養(yǎng)液的三角瓶中， 25°C或30°C、振蕩速度為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，然后富集培養(yǎng)4d后，再轉(zhuǎn)移Iml菌 懸液至50ml ADF培養(yǎng)液中，繼續(xù)25°C或30°C、振蕩速度為200r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h，用 于含ACC脫氨酶活性細(xì)菌的分離純化，梯度稀釋ADF培養(yǎng)液中菌懸液，涂布于ADF固體平板 上，在溫度為28 °C的恒溫箱中培養(yǎng)72h，劃線分離，純化后-80 °C保存； (3) 將純化鑒定后的PGPR菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，溫度為28~30°C，振蕩速度為 200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定菌懸液OD值達(dá)到0.8以上，菌量不少于10 1()CFU/ml后， 用食用菌菌糠吸附，然后再分別加入黃粉蟲蟲糞、黃腐酸、FeSO4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,并且 將含水量調(diào)成60%后用塑料薄膜覆蓋進(jìn)行發(fā)酵直到黃粉蟲蟲糞完全腐熟，用攪拌機(jī)攪拌均 勻，裝袋，即得生物發(fā)酵菌肥。7. -種如權(quán)利要求5所述的生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： (1)首先制備PAF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)液和TSB液體培養(yǎng)基，所述PAF培養(yǎng)基配方為：蛋白胨 IOg，酪蛋白水解物l〇g，MgS〇4 1 · 5g，K2HPO4 1 · 5g和甘油IOml，pH值7 · 5; ADF培養(yǎng)液配方為： KH2PO4 4.0g，Na2HP〇4 6.0g，MgS〇4.7H2〇 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖0|2.Og，梓檬0|2.Og，硫 酸銨2.(^和微量元素0.11111，所述微量元素每1001111中包含？6304.7!1 20 111^，!138031(^8， MnS〇4.H20 11.19yg，ZnS〇4.7H20 124.6yg，CuS〇4.5H20 78.22yg和MoO3 10yg，pH值為 7.2;所述TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.58和1(2即〇4 2.5g，其 pH 值為 7.5; (2)將PGPR菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，在溫度為28~30°C、振蕩速度為200r/min的 條件下振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定菌懸液OD值達(dá)到0.8以上、菌量為1~2 X 101()CFU/ml時(shí)，用所述營(yíng) 養(yǎng)載體和滅菌后的硅藻土進(jìn)行吸附，然后分別加入所述羧甲基纖維素鈉粘著劑、木質(zhì)素磺 酸鈉分散劑、聚乙烯醇成膜劑、FeSO 4 · 7H20和ZnS〇4 · 7H20,混合均勻后即得種衣劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述種衣劑在使用時(shí)與種子 混合攪拌均勻，使種衣劑均勻包裹在種子表面，完成種衣劑對(duì)種子的丸化包衣處理，所述種 衣劑與種子的重量比為1:10。9. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的生物菌劑的用途，其特征在于，所述生物菌劑用于防治 黃瓜枯萎病、黃瓜炭疽病、黃瓜細(xì)菌性角斑病和/或黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病。
【文檔編號(hào)】A01P1/00GK105950509SQ201610362310
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】賀字典, 高玉峰
【申請(qǐng)人】河北科技師范學(xué)院